Mikrofluidik-Plattform zur Messung der Neutrophilen-Chemotaxis von Rohboden Vollblut

Diese mikrofluidische Technologie zielt darauf ab, die Funktionalität menschlicher Neutrophiler direkt aus einem Tropfen Blut auf einer Plattform zu messen, die gemultiplext werden kann. Die zentrale Beladekammer dient als Vollblutquelle und dient auch als Senke für die Chemo-Lockstoffgradienten, die sich aus den 16 fokalen chemotaktischen Kammern bilden. Die einzigartige mechanische Filtration der roten Blutkörperchen ermöglicht es, die Funktion von Neutrophilen im natürlichen Kontext von Blut-, Zell- und Biochemiekomponenten zu untersuchen.

Die Bifurkation zwischen einem Kanal, der zur fokalen chemotaktischen Kammer führt, und einem Kanal, der aus dem Gerät austritt, ermöglicht die Quantifizierung und Modulation der Richtungsabhängigkeit migrierender Neutrophilen. So können die Ergebnisse zeigen, wie aktiv wandernde Neutrophile leicht an eingeschlossenen roten Blutkörperchen vorbeiwandern und sich im Laufe der Zeit in großer Zahl ansammeln. Ein einzigartiges Merkmal unserer mikrofluidischen Geräte ist, dass sie sehr einfach herzustellen und einzurichten sind.

Sie bestehen aus einer Schicht aus PDMS, die auf einen mikrofabrizierten Wafer gegossen wird, den wir auf eine Glasboden-, Single- oder Multi-Well-Platte kleben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass nur ein Tropfen Vollblut benötigt wird. Die Geräte können mit Standardpipetten verwendet werden, haben keine beweglichen Teile, benötigen keine Schläuche oder externe Spritzenpumpen.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf klinische Anwendungen im Vergleich zu unseren, die mit herkömmlichen Techniken erforderlich sind. Unser Ansatz dauert Minuten vom Zeitpunkt der Blutentnahme bis zu den Neutrophilenmigrationstests. Die neuartigen Kämme zur Filtration roter Blutkörperchen verhindern, dass Erythrozyten die aktive Wanderung von Neutrophilen blockieren und unterscheidet diese Methode von anderen mikrofluidischen Methoden.

Dazu muss das Blut entnommen werden, bevor die Chemotests durchgeführt werden. Das mechanische Verklemmen von roten Blutkörperchen und -kanälen zeichnet unsere Technologie aus und ermöglicht die Untersuchung von Neutrophilen in unserer physiologischen Umgebung von Vollblut, einschließlich Serum und Blutplättchen. Die Technologie ist also präzise und einfach zu bedienen und kann unser Verständnis der Rolle von Neutrophilen und dem angeborenen Immunsystem C bei Gesundheit und Krankheit erheblich verbessern.

Stellen Sie den Master-Mold-Wafer her, um die Migrationskanäle gemäß den Anweisungen des Herstellers zu definieren Erstes Muster. Die erste drei Mikrometer große negative Fotolackschicht auf Epoxidbasis strukturiert dann die zweite 50 Mikrometer-Schicht, um die Zellbeladung und die Chemokinkammern zu definieren. Nun zu den gegossenen Polymethyl-Soan-Geräten: 20 Gramm PDMS mit zwei Gramm Initiator fünf Minuten lang kräftig mischen.

Gießen Sie das PDMS vorsichtig auf den gemusterten Wafer und entgasen Sie es eine Stunde lang in einem Vakuum-Desikkate. Anschließend werden die PDMS-Mikrofluidik-Geräte mindestens drei Stunden lang in einem 65 Grad Celsius heißen Ofen gebacken und ausgehärtet. Um sicherzustellen, dass das PDMS bei der richtigen Temperatur gebacken wird, überwachen Sie unbedingt die interne Ofentemperatur mit einem Thermometer.

Stanzen Sie die zentralen Vollblut-Ladekammern mit einem Durchmesser von 1,5 Millimetern aus. Stanzen Sie auch ganze Donut-förmige Geräte mit einem Durchmesser von 5,0 Millimetern aus. Entfernen Sie die Partikel mit Klebeband von den Donut-Geräten.

Spülen Sie anschließend eine Multi-Well-Platte mit entionisiertem Wasser ab und trocknen Sie sie mit Stickstoff, nachdem Sie die Platte fünf Minuten lang in einen 60 Grad Celsius heißen Ofen gestellt haben. Sauerstoff-Plasma-Behandlung für 35 Sekunden. Dann die Donut-Geräte und das Sauerstoffplasma hinzufügen.

Erneut 35 Sekunden lang behandeln. Schieben Sie die Geräte vorsichtig in die Vertiefungen der Platte und backen Sie sie mit den geklebten Geräten auf einer 80 Grad Celsius heißen Platte 10 Minuten lang. Nach der Sauerstoffplasmabehandlung ist das Gerät hydrophil und Kapillareffekte können die Grundierung der kleinen Kanäle im Gerät fördern.

Mischen Sie für die Chemolockstofflösung fünf Mikroliter 10 mikromolare FMLP mit fünf Mikrolitern einem Milligramm pro Milliliter Fibronektin und 490 Mikrolitern HBSS. Pipettieren Sie die Chemo-Lockstofflösung langsam in die Vollblut-Ladekammerpipette und weitere 20 Mikroliter des Chemo-Lockstoffs um die Außenseite des Geräts. Legen Sie den Teller für 15 Minuten in ein Trockenmittel.

Wenden Sie ein Vakuum an das Gerät an, um das Gerät mit Chemo-Lockstofflösung zu grundieren. Entfernen Sie die Platte aus dem Trockenmittel und bestätigen Sie die Benetzung des Gerätekanals, indem Sie die Größe der Luftblase allmählich verringern. Waschen Sie dann die Vollblutladekammer und die Außenseite des Geräts gründlich, um überschüssige Chemo-Lockstofflösung zu entfernen.

Als nächstes wird ein Gradient des Chemolockstoffs von jeder der fokalen chemotaktischen Kammern zum Gerätezentrum erzeugt. Injizieren Sie vorsichtig 100 Mikroliter PBS in das Loch, so dass sich ein Tröpfchen PBS auf der Oberseite des Geräts bildet. Kippen Sie die Platte und pipettieren Sie einen Milliliter PBS um das Gerät herum, um die Flüssigkeit am Boden der Vertiefung zu sammeln, die Flüssigkeit abzusaugen und den PBS-Waschgang dreimal zu wiederholen.

Füllen Sie als Nächstes jede Vertiefung mit Medien, um die Geräte einzutauchen, und lassen Sie 15 Minuten warten, bis sich der Gradient stabilisiert hat. Pipettieren Sie dann langsam zwei Mikroliter Vollblut in jede Vollblut-Ladekammer. Für die Blutentnahme aus dem Finger die Hände mit Wasser und Seife waschen.

Trocknen Sie die Haut als gerinnungshemmende Fleckenlösung. Fügen Sie einen Milliliter 0,2 % HSA und 10 Mikroliter 32,4 Mikromolare Haken hinzu. Färben Sie einen Fleck auf ein Heparin-Blutentnahmeröhrchen, stechen Sie in den Finger des gesunden Spenders und wischen Sie den ersten Tropfen Blut weg.

50 Mikroliter Blut in die gerinnungshemmende Fleckenlösung einfüllen und vorsichtig mischen. Richten Sie die Biokammer auf 37 Grad Celsius, 80 % Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 ein. Starten Sie sofort die Zeitrafferbildgebung mit 10-facher oder höherer Vergrößerung für eine aussagekräftige statistische Analyse. Verfolgen Sie manuell mindestens 50 Neutrophile in jeder Probe.

Zählen Sie die Zellen, die im Laufe der Zeit in die fokalen Chemotaxiskammern gelangen. Berechnen Sie dann mit Bild J die Neutrophilengeschwindigkeiten im Kanal zwischen WBLC und FCC. Um dann die Richtungsabhängigkeit der Neutrophilen zu quantifizieren, zählen Sie die Anzahl der Zellen, die die Bifurkation passieren, und berechnen Sie das Verhältnis zwischen der Anzahl der Zellen, die sich in Richtung der fokalen Chemotaxiskammern drehen, und den Zellen, die das Gerät verlassen.

Zellen, die nicht gerichtet sind, folgen nicht dem chemotaktischen Gradienten und wandern daher in gleicher Anzahl in Richtung FCC und Austrittskanal. In diesem Experiment wurde der Vollblut-Chemotaxis-Assay für Neutrophile validiert, indem die Akkumulation von Neutrophilen in Richtung eines FMLP-Gradienten gemessen wurde. Die Ergebnisse bestätigen, dass die roten Blutkörperchen vom Filtrationskamm eingefangen werden, während die Neutrophilen aktiv aus dem Vollblut auswandern können.

Der stabile lineare Chemo-Lockstoffgradient, der durch das mikrofluidische Vollblutgerät gebildet wurde, wurde mit FSE-markiertem Dextran bestätigt und die Fluoreszenzwerte wurden über die Zeit gemessen. Die Ergebnisse, die mit der neuartigen WB-Chemotaxis-Plattform erzielt wurden, zeigen, dass Neutrophile aus allen Blutquellen mit gleichbleibender Geschwindigkeit und mit ähnlichen Gesamtmigrationszellen wandern. Wichtig ist, dass dieses System die Quantifizierung der Neutrophilen ermöglicht und somit die Chemotaxis von der Chemo-Kinesis unterscheidet. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als 10 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Der Einbau unseres Geräts in eine 12- oder 24-Well-Platte unter Verwendung von Standard-Reinraumtechniken, -einrichtungen und -einrichtungen sowie das gleichzeitige Screening mehrerer Bedingungen. Mit dieser Technik sind wir in der Lage, die Geschwindigkeit und Richtungsabhängigkeit von Neutrophilen auf Einzelzellebene zu messen. Im Gegensatz zu herkömmlichen Methoden, bei denen die Zellmigration gemessen wird, denken Sie daran, das mikrofluidische Gerät sorgfältig zu grundieren und beide Proben langsam zu laden, damit die Erythrozyten nicht über das com des Geräts hinaus gedrückt werden.

Das beschriebene Protokoll ist besonders nützlich für die Messung vorübergehender chemotaktischer Defizite bei Neutrophilen, da es wiederholte Probenahmen über mehrere Zeitpunkte ermöglicht, könnte aber auch an die Messung der Migration anderer Zelltypen aus verschiedenen Modellorganismen angepasst werden. Diese Methode kann Einblicke in vorübergehende Veränderungen der Neutrophilenfunktionalität bei Patienten mit verschiedenen Erkrankungen geben, die mit einer höheren Inzidenz von Infektionen verbunden sind, einschließlich Traumapatienten, Patienten nach größeren Operationen und Krebspatienten, die eine Chemotherapie erhalten.