Name: Drug-induzierte Sensibilisierung der Adenylatzyklase: Assay Straffung und Miniaturisierung für Small Molecule-und siRNA-Screening-Anwendungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Lernen Sie eine zellbasierte cAMP-Sensibilisierungsmethode für Hochdurchsatz-Screening mit kryokonservierten Zellen und HTRF-Technologie. Dieser Assay ermöglicht die schnelle Identifizierung molekularer Signalwege.

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Die Autoren danken Herrn Richard Zink und Todd Wiernicki für methodische Ausbildung und Assay-Führung zu bestätigen. Wir danken auch John Paul Spence für sorgfältiges Lesen und redaktionelle Vorschläge. Diese Arbeit wurde von der National Institute of Health MH 060397, Brain and Behavior Research Foundation, und Eli Lilly and Company über den Lilly Research Award-Programm (LRAP) unterstützt.

1. Ausbau und Kryokonservierung von Zellen bereit Assay <ol><li> Kultur CHO-K1-DRD 2L (CHO-D 2L) Zellen auf einer 15 cm 2-Zellkulturschale in Ham-F12-Medium mit 1,0 &amp;mgr; M L-Glutamin, 800 &amp;mgr; g / &amp;mgr; l G418, 300 &amp;mgr; g / &amp;mgr; l Hygromycin, 100 u / ul ergänzt Penicillin, 100 &amp;mgr; g / &amp;mgr; l Streptomycin und 10% fötalem Rinderserum (FBS). </li><li> Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2, bis die Zellen 90-95% konfluent. Waschen der Zellen mit 10 &amp;mgr; l phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) geerntet und die Zellen durch Zugabe von 3 ul Zelldissoziationspuffer für 5 min bei 37 ° C. Resuspendieren der Zellen mit 12 ul der Kulturmedien und zählen Zellen mit Trypanblau-Ausschluss. </li><li> Zentrifugieren der Zellsuspension bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Absaugen des Überstandes und Resuspendieren des Zellpellets in 5 ul Gefriermedien (10% Dimethylsulfoxid, 90% FBS). Verdünnte Zellsuspension, um die gewünschte Zellkonzentration (z. B. 1-20 × 10 6 Zellen / &amp;mgr; l) zu erreichen. </li><li> Aliquot 1,0 ul Zelllösung zu jeder Kryoröhrchen. Die Kryoröhrchen in einen Zellgefrierbehaelter Inkubation bei -80 ° C über Nacht. Übertragen Sie die Kryoröhrchen in einen flüssigen N 2-Tank für langfristige Lagerung. </li></ol> 2. Plating Assay Bereit Cells (und umge Transfektion Option) <ol><li> Schnell auftauen eine gefrorene Kryoröhrchen von Zellen in einem 37 ° C Wasserbad. Sobald Zellen werden aufgetaut, übertragen Sie die Zellen auf eine 15 ul konische Röhrchen mit 9 ul Opti-MEM, und mischen durch Umdrehen der Röhre 3-5x. </li><li> Zentrifugieren der Zellen bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur. Saugen Sie den Überstand und resuspendieren in 1 ul Opti-MEM. </li><li> Zählen der Zellen unter Verwendung von Trypanblau-Ausschluss, um die Zellviabilität zu bestimmen, und löst die lebensfähigen Zellen nach Bedarf (z. B.. 3 x 10 5 Zellen / &amp;mgr; l Konzentration) inOpti-MEM. Platte 10 ul / Vertiefung von Zellen in einer Gewebekultur-behandelten 384-Well-Platte mit einer Mehrkanalpipette. </li><li> Machen serielle Verdünnungen von cAMP in Opti-MEM um eine Standardkurve für die Schätzung cAMP-Produktion der Zellen zu generieren (gemäß der Empfehlungen des Herstellers - siehe Abschnitt 7). In 10 ul / Vertiefung der cAMP-Standards auf die Platte. Hinweis: eine einzelne Standardkurve kann auf einem separaten Teller oder leere Brunnen auf einer der Testplatten hergestellt werden. </li><li> Zentrifugieren der Platte bei 100 × g für 15 Sekunden bei Raumtemperatur und bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 1 Stunde. </li></ol> 3. Reverse-siRNA-Transfektion Option * Dieser Abschnitt ist optional und relevante auf 3. <ol><li> Bereiten Sie eine Lösung von siRNA in RNase-freiem ddH2O (zB 0,4 pmol / ul). In 5 ul einzelnen Vertiefungen von 384-Well-Platte, und die Platte Zentrifuge bei 100 g für 15 sec bei Raumtemperatur. </li><li> Verdünnen Lipofectamine 2000 in Opti-MEM mit einem Faktor von 0,006 (z. B. hinzufügen 6 ul Lipofectamine 2000 bis 1000 ul Opti-MEM) und mischen durch Pipettieren von oben und unten. </li><li> Inkubieren Lipofectamin 2000/Opti-MEM Lösung für 5 min bei Raumtemperatur. Mit 5 ul der verdünnten Lösung Lipofectamin 2000/Opti-MEM einzelnen Vertiefungen 384-Well-Platte, das bereits siRNA. Zentrifugieren der Platte bei 100 × g für 15 s bei Raumtemperatur. </li><li> Inkubiere die Platte für 30 min bei Raumtemperatur. </li><li> Plattentest bereit Zellen, wie oben (Abschnitt 2) beschrieben. Zentrifugieren der Platte bei 100 × g für 15 s bei Raumtemperatur. </li><li> Zurück zu Testplatte befeuchteten Inkubator bei 37 ° C (5% CO 2) für 48-96 h, wie für gezielte Gen-knock down (siehe Diskussion) bestimmt. </li></ol> 4. Small Molecule Screening <ol><li> Verdünnen Sie das Medikament von Interesse (zB. Kleinmolekül-Inhibitoren) in Opti-MEM, um die gewünschten Endkonzentrationen 6X. Serielle Verdünnungen können mit Handpipetten oder ein Liquid-Handling-Station abgeschlossen sein. </li><li> Add 2,5 ul / Vertiefung der Testverbindung oder Puffer Fahrzeugs (z. B. DMSO) enthält, an der Seite der Vertiefungen mit einer Mehrkanalpipette. </li><li> Zentrifugieren der Platte bei 100 × g für 15 Sekunden bei Raumtemperatur (Inkubation ist optional). </li></ol> 5. Persistent Agonist-Behandlung <ol><li> Vorbereitung einer 600 nM (dh. 6-fache der gewünschten Endkonzentration von 100 nM) Lösung von Quinpirol in Opti-MEM. </li><li> In 2,5 ul / Vertiefung der 600 nM Quinpirol Lösung an der Seite der Brunnen mit einer Mehrkanalpipette. </li><li> Zentrifugieren der Platte bei 100 × g für 15 Sekunden bei Raumtemperatur und bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für 2 Stunden. </li></ol> 6. Die Stimulation der cAMP-Akkumulation <ol><li> Während der 2-stündigen Inkubation bereiten die stimulatiauf Lösung in Opti-MEM. Die Stimulation Lösung von 40 &amp;mgr; M Forskolin enthielt 2 &amp;mgr; M 3-Isobutyl-1-methyxanthine (IBMX) und 4 &amp;mgr; M Spiperon (alle Konzentrationen in Schritt 6 werden 4-fache der gewünschten Endkonzentration). </li><li> Mit 5 &amp;mgr; l / Well der Stimulationslösung auf die Seite der Vertiefungen mit einer Mehrkanalpipette. </li><li> Zentrifugieren der Platte bei 100 × g für 15 Sekunden bei Raumtemperatur, und bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li></ol> 7. Abschrecken und Abschätzung der cAMP-Akkumulation <ol><li> Produktion von cAMP durch die Zellen unter Verwendung des cAMP dynamischen 2-Kit nach den Anweisungen des Herstellers gemessen. Kurz gesagt, rekonstruieren anti-cAMP-Cryptat und cAMP-d2 in destilliertem Wasser. Einfrieren aliquotiert bei -20 ° C für die kurzfristige Lagerung. </li><li> Verdünnen Sie ein Aliquot von anti-cAMP-Cryptat und ein Aliquot der cAMP-D2 separat in der Lyse-Puffer gemäß den Anweisungen des Herstellers, um Arbeitslösungen zu machen. </li><li> Add 10 ul / Vertiefung der Anti-cAMP-Cryptat Arbeitslösung und 10 ul / Vertiefung des cAMP-d2 Arbeits Lösung für das 384-Well-Platte mit einer Mehrkanalpipette. </li><li> Zentrifugieren der Platte bei 100 × g für 15 Sekunden bei Raumtemperatur, und bei Raumtemperatur für 1 Stunde. </li><li> Lesen Sie die Platte in einem Fluoreszenz-Plattenlesegerät (Einstellung für Empfindlichkeit Auto-Skalierung) unter Verwendung einer Anregung von 337 nm und Messung der Emissionen bei 620 nm und 665 nm pro fertigt Anweisungen. </li><li> Nehmen ratiometrische Analyse zu beurteilen cAMP-Standardkurve pro fertigt Anweisungen. Mit den sich daraus ergebenden Werte, extrapolieren die geschätzte cAMP-Akkumulation in den Testvertiefungen mit Datenanalyse-Software. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

In einer Bemühung, Studien heterologer Sensibilisierung zu erleichtern, haben wir ausgiebig unseren früheren Methode, die zu einer stromlinienförmigen modifizierten &quot;Mix und lesen&quot;-Format, das änderbare Hochdurchsatz-Screening-und Wirkungsprüfung ist. Die wesentlichen Änderungen in unserem Protokoll kann wie folgt zusammengefasst werden: 1) die Verwendung von kryokonservierten Zellen als &quot;Assay-ready&quot;-Reagenzien, 2) die Miniaturisierung des Assays in 384-Well-Format, und 3) die Verwendung des HTRF-Me...

Eine adaptive Adenylatzyklase (AC) Signal Antwort als hetero-oder Super-Sensibilisierung bekannt wurde zuerst im Labor von Nobelpreisträger Dr. Marshall Nirenberg entdeckt. Dr. Nirenberg vorgeschlagen, dass die beobachtete erhöhte AC Reaktionsfähigkeit nach chronischer δ-Opioid-Rezeptor-Aktivierung war ein Mechanismus, bei Opiat-Toleranz und Abhängigkeit 1 beteiligt. Neben chronischen δ-Opioid-Rezeptor-Aktivierung tritt diese neuroadaptive Antwort von AC-Signalisierung auch nach anhaltenden Aktivierung von mehreren anderen Gai / o-gekoppelten Rezeptoren 2. Bemerkenswerterweise sind viele dieser Rezeptoren mit Schmerzen, neuropsychiatrischen und neurologischen Störungen verbunden und umfassen μ / κ-Opioid-, D 2/4 Dopamin, 5-HT 1A und M 2/4 2-Muskarinrezeptoren. Neben Dr. Nirenberg die Erkenntnisse, eine große Zahl von Hinweisen existiert Verknüpfung Sensibilisierung der AC-Signalisierung, um chronische Opioid-Rezeptor-Aktivierung sowohl <em&gt; in vitro und in vivo 3-7. Sensibilisierung von AC hat auch mit einer Vielzahl von Erkrankungen, die D 2-Rezeptoren wie Dopamin wie Schizophrenie und Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht worden (für eine Übersicht siehe Referenz 2). Trotz der potentiellen Bedeutung der Sensibilisierung, der genaue Mechanismus (en) mit persistierender G ☐ i / o-gekoppelten Rezeptor-Aktivierung, die zu einer erhöhten Reaktionsfähigkeit AC weitgehend unbekannt führt verbunden. Diese Studien liefern die Begründung für die Untersuchung der Mechanismen zur Sensibilisierung der Adenylatzyklase als wichtige neurobiologische Ziel. Ebenso sollte die physiologische Relevanz der AC Signal 8 und die Bedeutung, die den einzelnen AC-Isoformen in dieser adaptive Reaktion halten auch erkannt, 2,9,10 werden. Im Rahmen der Forschung, die allgemeinen Merkmale mit heterologen Sensibilisierung der rekombinante Isoformen von AC zugeordnet parallel jene Eigenschaften described zur Untersuchung der endogenen Isoformen von AC. Insbesondere frühere Forschung hat festgestellt, dass die Aktivierung von Gai / o Proteine ​​und anschließende Freisetzung / Umlagerung βγ-Untereinheiten sind wichtige Voraussetzungen für die Rezeptor-induzierte Sensibilisierung aller AC-Isoformen. Darüber hinaus lassen sich mehrere Studien, dass die Signalisierung von Proteinkinasen und Gβγ-Untereinheiten sind in 2,11-13 Sensibilisierung beteiligt. Individuelle ACs zeigen auch einzigartigen und unterschiedlichen Mustern 12 Sensibilisierung. Zum Beispiel wird persistent Exposition von D 2-Rezeptoren Agonisten Sensibilisierung AC1 und AC8 Ca 2 + / Calmodulin-Stimulation 14,15 zugeordnet, wohingegen die eng verwandte AC3 nicht sensibilisiert 2. AC2, AC4, und AC7 sind eng miteinander verbunden, jedoch nur PKC-Aktivität stimuliert AC2 kräftig nach längerer Einwirkung von D 2-Rezeptoren sensibilisiert Agonisten 7,14,16,17. Zusätzlich AC5 und AC6 zeigen eine deutliche Grad der Heterologen Sensibilisierung für Gas-und Forskolin-stimulierte cAMP-Akkumulation nach der Aktivierung von D 2-Rezeptoren 14,18-20, scheinen aber in ihrer Forderung nach Gβγ-Untereinheit-AC Wechselwirkungen unterscheiden 21. Obwohl die meisten Studien der AC Sensibilisierung Modellzelllinien (zum Beispiel HEK293-Zellen, die einzelne AC-Isoformen) verwendet wird, scheint es, daß diese Ergebnisse zu übersetzen nativen neuronalen Zellmodellen 4,22. In jüngerer Zeit können die Auswirkungen der AC-Isoform-selektive niedermolekulare Inhibitoren in HEK293-Zellen, die AC-Isoformen identifiziert auch in vivo Verhaltensstudien 23 übersetzt werden. Das Fehlen eines identifizierten molekularen Mechanismus für die heterologe Sensibilisierung spiegelt wahrscheinlich die Komplexität des adaptiven Reaktion sowie die einzigartigen regulatorischen Eigenschaften der einzelnen AC-Isoformen 12. Die Aufklärung solcher Komplexität wird durch die Verwendung von umständlich Methodik t kompliziertHut hat akademischen Forschern aus der Verwendung unvoreingenommene Ansätze beschränkt. Zum Beispiel beteiligt unseren früheren mechanistischen Studien den Einsatz von kontinuierlich kultiviert zellulären Modellen mit 24 - und 48-Loch-Gewebekultur Format 15. Kultivierte Zellen wurden typischerweise für 48 Stunden gezüchtet und dann auf Agonisten Drogenbehandlung (2-18 h), gefolgt von einer Reihe von Zellen wäscht und Inkubationen (Fig. 1) unterzogen. AC-Isoform-spezifische Akkumulation von cAMP Protokolle wurden dann verwendet, gefolgt von einer Messung der cAMP-Anhäufung unter Verwendung einer arbeits-und zeitaufwendig [3 H] cAMP-Bindemethode 15,24. Die Dauer vom Beginn bis zum Abschluss für jeden Assay benötigt im allgemeinen insgesamt vier bis fünf Tagen von Zelle Plattierung Datenanalyse (Abb. 1). Die Anwendung der neuen Technologien und Automatisierung hat zu deutlichen Verbesserungen für die Sensibilisierung Studien in der Industrie-und HTS-Mittelstellung geführt. Zum Beispiel kann eine Gruppe arbeitet mit dem Nationalen Zentrum für Chemical Genomics berichtet eine zweitägige HTS-Assay-Verfahren zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren des μ-Opioidrezeptor-induzierte Sensibilisierung in 1536 25-well Format. Der vorliegende Artikel beschreibt unsere Bemühungen um eine HTS-Assay für die Untersuchung der heterologen Sensibilisierung unter Verwendung von Technologien, die in den meisten akademischen Forschungseinrichtungen verfügbar sind, zu entwickeln. Diese Strategie wurde durch Einbringen der Verwendung von kryokonservierten Zellen aus Zellmodellen heterolog exprimieren, die D-2-Dopamin-Rezeptor in Kombination mit endogenen oder einzelne rekombinante Adenylatcyclase-Isoformen (CHO-oder HEK-D 2L-AC6 / D 2 l) gelöst. Um unsere Durchsatz zu verbessern, haben wir unsere neu gestaltete 48-Loch-Sensibilisierung Assay (ca.&gt; 20 Stufen über 4-5 Tage) zu einem Fünf-Schritt-, Einzel-Tagestest in 384-Well-Format, das im Wesentlichen &quot;zu mischen und zu lesen&quot; war. Das neue Format verwendet einen handelsüblichen homogene zeitaufgelöste Fluoreszenz (HTRF)-Assay, die cAMP-acc messenumulation in intakten Zellen mit einem Multi-Mode-Plattenlesegerät. Der Assay ist robust und zugänglich für Kleinmolekül-Screening, und kann wirksam angewendet, um nach Inhibitoren von heterologen Sensibilisierung screenen. Zusätzlich stellen wir Daten, die den Einsatz dieses Tests mit reverser Transfektion von siRNA zur gezielten oder genomweite siRNA-Bibliothek-Screening mit nur geringfügiger Modifikation des allgemeinen Ansatzes ermöglicht.

<table><tbody><tr><td>CHO-K1-DRD2L Zellen</td><td>DiscoveRx</td><td>930579C2</td><td></td></tr><tr><td>Ham' s F12 Medien</td><td>VWR</td><td>SH30026fs</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>VWR</td><td>SH3007003</td><td></td></tr><tr><td>G418</td><td>Sigma</td><td>A1720</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycin</td><td>Fisher</td><td>50-230-5556</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>15 cm Schalen</td><td>BD Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Zelldissoziationspuffer</td><td>Life Technologies</td><td>13150016</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Life Technologies</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Kryofläschchen</td><td>Fisher</td><td>976171</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>TC-behandelte 384-Well-Platten</td><td>Perkin-Elmer</td><td>6007688</td><td></td></tr><tr><td>HTRF cAMP Dynamic 2 Kit</td><td>Cisbio Bioassays</td><td>62AM4PEB</td><td>http://www.htrf.com/camp-cell-based-assay</td></tr><tr><td>Synergy 4</td><td>Biotek</td><td>H4MLFPTAD</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6</td><td>GraphPad Software</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthin</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td></td></tr><tr><td>(&plusmn;)Quinpirol</td><td>Sigma</td><td>Q111</td><td></td></tr><tr><td>Spiperon</td><td>Sigma</td><td>S7395</td><td></td></tr><tr><td>Clozapin</td><td>Sigma</td><td>C6305</td><td></td></tr><tr><td>Haloperidol</td><td>Sigma</td><td>H1512</td><td></td></tr><tr><td>S-(-)Sulpirid</td><td>Sigma</td><td>S112</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Leben Technologien</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Wasser-, DNase- und RNase-frei</td><td>MP Biomedicals</td><td>821739</td><td></td></tr><tr><td>Gas siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>custom siRNA Non-targeting siRNA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>control Dharmacon</td><td>D-001206-14-20</td><td></td></tr><tr><td>siGlo Red</td><td>Dharmacon</td><td>D-001630-02</td><td></td></tr></tbody></table>

drug-induzierte sensibilisierung der adenylatzyklase: assay straffung und miniaturisierung für small molecule-und sirna-screening-anwendungen

Drug-induced Sensitization of Adenylyl Cyclase: Assay Streamlining and Miniaturization for Small Molecule and siRNA Screening Applications

Sensibilisierung von Adenylylcyclase (AC) Signal wurde in einer Vielzahl von neuropsychiatrischen und neurologischen Störungen, einschließlich Drogen-und Parkinson-Krankheit in Verbindung gebracht. Akute Aktivierung von Gai / o-gebundenen Rezeptoren hemmt AC-Aktivität, während die anhaltende Aktivierung dieser Rezeptoren führt zu heterologe Sensibilisierung von AC-und erhöhten intrazellulären cAMP. Frühere Studien haben gezeigt, dass diese Verbesserung der AC Ansprechempfindlichkeit sowohl in vitro als auch in vivo nach der chronischen Aktivierung von mehreren Arten von Gai / O-verknüpften Rezeptoren, Dopamin-D 2 und μ-Opioid-Rezeptoren beobachtet. Obwohl heterologe Sensibilisierung AC wurde vor vier Jahrzehnten berichtet, wobei der Mechanismus (en), die dieses Phänomen zugrunde liegen, bleiben weitgehend unbekannt. Der Mangel an mechanistische Daten vermutlich spiegelt die Komplexität, die mit dieser Anpassungsreaktion beteiligt, was darauf hindeutet, dass nonbiased Konzepte könnten helfen, zu identifizierenten die molekularen Signalwege in heterologen Sensibilisierung von AC beteiligt. Frühere Studien haben Kinase und Gbγ Signalisierung als überlappende Komponenten, die die heterologe Sensibilisierung von AC regeln verwickelt. Um einzigartige und zusätzliche Ziele mit überlappenden Sensibilisierung der AC zu identifizieren, ist die Entwicklung und Validierung eines skalierbaren Sensibilisierung cAMP-Assay für mehr Durchsatz benötigt. Bisherige Ansätze zur Sensibilisierung Studium sind in der Regel schwerfällig mit kontinuierlichen Zellkultur-Wartung sowie eine komplexe Methode zur Messung der cAMP-Akkumulation, die mehrere Waschschritte beinhaltet. Somit wäre die Entwicklung eines robusten Test auf Zellbasis, die für Hochdurchsatz-Screening (HTS) in einem 384-Well-Format verwendet werden können zukünftige Studien erleichtern. Mit zwei D 2-Dopaminrezeptor-Zellmodellen (dh. CHO-D 2L und HEK-AC6 / D 2L), haben wir unsere 48-Well-Assay-Sensibilisierung (&gt; 20 Schritte 4-5 Tage) zu einem Fünf-s umgewandelttep, Tag-Assay in 384-Well-Format. Dieses neue Format ist offen für kleine Molekül-Screening, und wir zeigen, dass dieser Assay-Design kann auch leicht für Reverse Transfektion von siRNA in Erwartung von gezielten siRNA-Bibliothek-Screening verwendet werden.

Teil I. Die Entwicklung einer 384er heterologe Sensibilisierung Test zur Identifizierung von niedermolekularen Inhibitoren mit einem kommerziell erhältlichen Zellmodell. Um heterologe Sensibilisierung in einem Zellmodell zu untersuchen, haben wir eine Reihe von Verbesserungen, die es uns ermöglicht, den Test in einem &quot;Mix und lesen&quot;-Format zu optimieren. Einige der wichtigsten Änderungen sind unten markiert ist, und werden ausführlicher in der Erörterung beschriebe...

Persistent Aktivierung inhibierenden G-Protein-gekoppelten Rezeptoren führt Sensibilisierung von Adenylylcyclase-Signalisierung. Um die wesentlichen molekularen Signalwege zu identifizieren, sind nonbiased Ansätze notwendig, aber diese Strategie erfordert die Entwicklung einer skalierbaren zellbasierten Assay-cAMP-Sensibilisierung. Hier beschreiben wir eine Sensibilisierung Assay für Kleinmolekül-und siRNA-Screening.

Drug-induzierte Sensibilisierung der Adenylatzyklase: Assay Straffung und Miniaturisierung für Small Molecule-und siRNA-Screening-Anwendungen

Sensitization of adenylyl cyclase (AC) signaling has been implicated in a variety of neuropsychiatric and neurologic disorders including substance abuse ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen eintägigen zellbasierten zyklischen AMP-Sensitivierungs-Assay für Hochdurchsatz-Screening-Anwendungen zu entwickeln, einschließlich des Screenings chemischer Bibliotheken. Dies wird erreicht, indem zunächst zuvor hergestellte, assayfertige, kryokonservierte Zellen aufgetaut und ausplattiert werden. Der zweite Schritt besteht darin, Testsubstanzen oder Antagonisten zu den Zellen hinzuzufügen, gefolgt von der Zugabe des Adenylatzyklase-sensibilisierenden Wirkstoffs.Als Nächstes wird ein Adenylatzyklase-Aktivator in Gegenwart eines Phosphodiesterase-Inhibitors hinzugefügt, um die Anreicherung von cyclischem AMP zu stimulieren. Der letzte Schritt besteht darin, die Reaktion mit homogener zeitlich aufgelöster Fluoreszenz oder HTRF-Detektion von zyklischem AMP in Lysepuffer zu stoppen und anschließend die Fluoreszenz zu messen. Letztendlich ermöglicht die Verwendung von kryokonservierten Zellen und der HTRF-Technologie zur Messung von zyklischem AMP die Durchführung eines eintägigen Sensibilisierungsassays für die Screening-Untersuchung kleiner Moleküle.Die Idee für diesen Ansatz entstand ursprünglich, als wir daran interessiert waren, mittels Hochdurchsatz-Screening die receptorvermittelte heterologe Sensibilisierung einer dentalen Cyclase zu untersuchen. Zwei zentrale Techniken, die hier verwendet werden, sind der Einsatz kryokonservierter Zellen als direkt verfügbare Reagenzien und das homogene Zeitmessverfahren. Für die essentiellen Assay-Kits zur Messung von zyklischem KMP können die hier verwendeten grundlegenden Methoden helfen, zentrale Fragen der Zellsignaltransduktion und der Wirkstoffforschung mithilfe zellbasierter Assays zu beantworten. Beginnen Sie damit, CHO-D2L-Zellen auf einer 15 cm Zellkulturschale gemäß dem im Text beschriebenen Protokoll zu kultivieren, und inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2, bis die Zellen 90 bis 95 % konfluent sind. Waschen Sie anschließend die Zellen mit 10 Millilitern gepufferter Kochsalzlösung (phosphatgepufferter Salzlösung, PBS) und lösen Sie die Zellen mit drei Millilitern Puffer zur Zelldissoziation nach einer fünfminütigen Inkubation bei 37 Grad Celsius ab.Nachdem die Zellen durch Zugabe von 12 Milliliter Kulturmedium resuspendiert wurden, zählen Sie die Zellen mithilfe der Trypanblau-Ausschlussmethode. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension fünf Minuten bei Raumtemperatur mit 500 × g. Anschließend den Überstand abpipettieren und das Zellpellet in fünf Milliliter Gefriermittel resuspendieren. Nach Verdünnung der Zellsuspension zur Erreichung der gewünschten Zellkonzentration je eine Milliliter Zelllösung in jede Kryoröhre abfüllen. Die Kryoröhren über Nacht in einem Zellgefriergenerator bei minus 80 Grad Celsius inkubieren.Am folgenden Tag überführen Sie die Kryo-Röhrchen in einen flüssigen Stickstofftank zur Langzeitlagerung. Um zellbasierte Assays durchzuführen, tauen Sie zunächst ein gefrorenes Kryo-Röhrchen mit Zellen in einem Wasserbad mit 37 Grad Celsius schnell auf. Sobald die Zellen aufgetaut sind, überführen Sie sie in ein 15-Milliliter-Konischrohr, das neun Milliliter Optimum enthält, und mischen Sie durch dreimaliges bis fünfmaliges Umstülpen des Rohrs. Anschließend zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 Gs für fünf Minuten. Bei Raumtemperatur aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen in einem Milliliter Optimum.Zählen Sie die Zellen unter Verwendung der Trypanblau-Ausschlussmethode, um die Zellviabilität zu bestimmen, bevor Sie die lebensfähigen Zellen gegebenenfalls verdünnen. Geben Sie optimalerweise 10 µL Zellen pro Vertiefung in eine Gewebekultur behandelte 384-Vertiefungs-Platte unter Verwendung einer Mehrkanalpipette. Stellen Sie serielle Verdünnungen von cyclischem A MP und Optimum her, um eine Standardkurve zur Abschätzung der Produktion von cyclischem A MP durch die Zellen zu erzeugen. Geben Sie 10 Mikroliter pro Vertiefung der cyclischen A MP-Standards in die Platte. Zentrifugieren Sie die Platte bei 100 ×g für 15 Sekunden bei Raumtemperatur und inkubieren Sie sie eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2.Für ein Screening mit kleinen Molekülen verdünnen Sie zunächst den gewünschten Wirkstoff in optimalem Maß auf das Sechsfache der gewünschten Endkonzentrationen. Die serielle Verdünnung kann mit Handpipetten oder einer Flüssigkeitsmanipulationsstation durchgeführt werden. Geben Sie 2,5 Mikroliter pro Vertiefung der Testverbindung oder des Puffers mit Trägersubstanz hinzu.Tragen Sie die Lösung mit einer Mehrkanalpipette an die Wand der Vertiefungen auf und zentrifugieren Sie die Platte 15 Sekunden bei 100 ×g. Für die andauernde Agonistenbehandlung bei Raumtemperatur stellen Sie eine 600 Nanomolar-Lösung von Quinparol und Optimum her und geben anschließend 2,5 Mikroliter pro Vertiefung der 600 Nanomolar-Quinparol-Lösung an die Wand der Vertiefungen. Zentrifugieren Sie die Platte erneut mithilfe einer Mehrkanalpipette, bevor Sie sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit 5 % CO2 inkubieren.Während der zweistündigen Inkubation bereiten Sie die Stimulationslösung gemäß der schriftlichen Anleitung in Optimum vor. Geben Sie nach Zentrifugation der Platte wie zuvor und einerstündigem Inkubieren bei Raumtemperatur mit einer Mehrkanalpipette jeweils fünf Mikroliter der Stimulationslösung pro Vertiefung an die Wand der Vertiefungen. Die Produktion von cyclischem aMP durch die Zellen wird mithilfe des cyclic AMP Dynamic 2-Kits gemäß Herstelleranleitung gemessen. Kurzgefasst: Rekonstituieren Sie anti-cyclic AMPK crypt und cyclic AMPD 2 in destilliertem Wasser. Verdünnen Sie je ein Aliquot von anti-cyclic AMPK crypt und ein Aliquot von cyclic AMPD 2 getrennt im Lysepuffer gemäß Herstelleranleitung, um Arbeitslösungen herzustellen. Um die Anreicherung von cyclischem aMP in der 384-Loch-Platte zu stoppen, geben Sie 10 Mikroliter pro Vertiefung der anti-cyclic AMP crypt 8-Arbeitslösung und 10 Mikroliter pro Vertiefung der cyclic AMPD 2-Arbeitslösung hinzu.Platzieren Sie die Platte mit einem Mehrkanalpipettiergerät erneut in eine Zentrifuge und zentrifugieren Sie sie 15 Sekunden lang bei Raumtemperatur mit 100 × g. Anschließend inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Messen Sie die Fluoreszenz in einem Fluoreszenz-Plattenreader mit einer Anregungswellenlänge von 337 Nanometern und erfassen Sie die Emission bei 620 Nanometern und 665 Nanometern gemäß den Herstelleranweisungen. Wenden Sie eine verhältnisbasierte Analyse an, um die Standardkurve für cyclisches AMP gemäß den Herstelleranweisungen auszuwerten. Schätzen Sie anhand der erhaltenen Werte die akkumulierte Menge an cyclischem AMP in den Testansätzen mithilfe einer Datenanalyse-Software ab.Kryokonservierte CHO-D2L-Zellen wurden direkt in 384-Well-Assayplatten ausgesät, um zu demonstrieren, dass Sensibilisierungsassays im 384-Well-Format durchgeführt werden können, wodurch die Anzahl der Arbeitsschritte von mehr als 20 auf fünf reduziert wird. Die Studien zeigten, dass eine zweistündige Vorbehandlung mit Quin Perol die anschließend vierfach stimulierte cAMP-Akkumulation in abhängiger Weise von der Dosis verstärkt, was mit einer heterologen Sensibilisierung übereinstimmt. Die zweite Versuchsreihe untersuchte, ob dieser neue vereinfachte Assay zur Bewertung von Inhibitoren der Sensibilisierung eingesetzt werden kann.Die anfänglichen Ergebnisse zeigten, dass eine Vorbehandlung mit Haloperidol oder Peron prototypischen D2-Antagonisten die durch Quinparol induzierte Sensibilisierung der vierfach stimulierte cAMP-Akkumulation vollständig verhinderte. Diese Methode wurde anschließend verwendet, um die Wirksamkeit einer Reihe von D2-Antagonisten zu bewerten, um zu prüfen, ob diese Verbindungen die Sensibilisierung ähnlich wie in den vorherigen Ergebnissen hemmen. Diese Studien zeigten, dass die D2-Antagonisten die agonisteninduzierte Sensibilisierung in dosisabhängiger Weise inhibierten.Das nächste Ziel bestand darin, einen Sensibilisierungs-Assay in 384-Well-Format zu entwickeln, der für skalierbare Reverse-Transfektions-SiRNA-Bibliotheksscreenings verwendet werden kann, wie im Textprotokoll beschrieben. Die Ergebnisse zeigten, dass die Exposition der Zellen gegenüber dem Agonisten Quinparol für zwei Stunden zu einer deutlichen Steigerung der vierfachen Schädel- und stimulierte cAMP-Akkumulation führte. Die erhöhte Akkumulation von cAMP bei sowohl 100 Nanomolar als auch 300 Nanomolar Vierschädelin war im Vergleich zu mit Fahrzeug behandelten Zellen um mehr als das 15-Fache gesteigert. Die Reverse-Transfektion von GSS-siRNA in D2-Rezeptor-exprimierende Zellen blockiert die agonisteninduzierte Sensibilisierung der Adenylatzyklase. Wenn der D2-Rezeptor-Agonist Quin Perol zugesetzt und zyklisch inkubiert wurde, wurde die cAMP-Akkumulation stimuliert und mittels HTRF mit 15-facher Sensitivierung gemessen; die Antwort wurde um 94 % reduziert. Sobald der Assay beherrscht ist, kann dieser innerhalb von weniger als acht Stunden durchgeführt werden, sofern er ordnungsgemäß nach dieser Anleitung durchgeführt wird. Andere Signalmoleküle wie IP1 und Phospho-ERK können ebenfalls gemessen werden, um zusätzliche Rezeptorsignalwege zu untersuchen.

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Drug-induzierte Sensibilisierung der Adenylatzyklase: Assay Straffung und Miniaturisierung für Small Molecule-und siRNA-Screening-Anwendungen (Video) | JoVE Journal

Drug-induzierte Sensibilisierung der Adenylatzyklase: Assay Straffung und Miniaturisierung für Small Molecule-und siRNA-Screening-Anwendungen

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