Die Tauchdruck der Zellen auf eine modifizierte Oberfläche mit einem Continuous Flow Microspotter

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, drei T-3-Fibroblasten auf eine serumbeschichtete Oberfläche zu drucken. Dies wird erreicht, indem das Serum zunächst auf einer Gewebekulturoberfläche voradsorbiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine Suspension von Fibroblasten mit einem Continuous-Flow-Microspotter auf die Oberfläche zu drucken, gefolgt von einer zweistündigen Inkubation der Zellen bei 37 Grad Celsius.

Anschließend werden gedruckte Zellen sowie Zellen, die durch Standard-Zellkulturen ausgesät wurden, mit Propidiumiodid gefärbt und zum Vergleich unter einem inversen Mikroskop visualisiert. Letztendlich wird die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Lebensfähigkeit, Dichte und Morphologie der Zellen zu relevanten Zeitpunkten zu beurteilen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Pin-Druck besteht darin, dass der Druckkopf eine Versiegelung über der Oberfläche bildet, so dass Zellen gedruckt werden können, während sie in Zellmedien eingetaucht sind.

Während das submerged printing von Zellen nützlich ist, um neue Wirkstoffkandidaten auf Sicherheit und Wirksamkeit zu untersuchen, ist das submerged printing im Allgemeinen auch für andere Anwendungen nützlich. Wir können zum Beispiel neue Wirkstoffkandidaten gegen Gewebeschnitte analysieren oder sie als Modell für Organsysteme nutzen. Zum Beispiel ein Leberprofusionsmodell.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da beim Ansaugen des Druckers und des Zelldrucks keine Luft in die Leitungen eindringen kann oder zum Zelltod führen kann. Um mit dem Auftauen zu beginnen, tauen Sie drei T-Zellen für zwei bis drei Minuten in einem Schüttelwasserbad bei 37 Grad Celsius auf. Die Zellen werden erneut in fünf Millilitern des vollständigen Mediums suspendiert und drei Minuten lang bei 1500 g zentrifugiert.

Entfernen Sie den Zellüberstand, ohne das Zellpellet zu stören. Dann werden die Zellen in fünf Millilitern Medium erneut suspendiert und 10 Mikroliter der Zellsuspension in ein 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter Triamblau in die Zellsuspension und rühren Sie mit der Spitze der Pipette 10 Mikroliter der gefärbten Zellen in eine Hämozytometerkammer.

Bevor Sie die Zellen mit 10-facher Vergrößerung zählen, zählen Sie die lebenden Zellen, die kleinen weißen Kugeln ähneln, für vier der neun großen Quadrate. Zählen Sie nur die lebenden Zellen, die nicht dunkelblau von dem trippenblauen Fleck erscheinen. Berechnen Sie die durchschnittliche Anzahl der Zellen pro großem Quadrat, was die Anzahl der Zellen multipliziert mit 10.000 Zellen pro Milliliter in der ursprünglichen Zellsuspension ergibt.

Anschließend werden Zellen mit einer Dichte von 100.000 Zellen pro Milliliter mit insgesamt fünf Millilitern in jedem T 25-Kolben gesät. Kultivieren Sie die Zellen auf eine Flüssigkeit zwischen 70 und 80 %, bevor Sie mit den Experimenten beginnen. Um die Druckoberfläche vorzubereiten, markieren Sie mit einem Marker ein Rechteck in der Größe des Druckkopfes auf der Unterseite eines mit Gewebekultur behandelten Polystyrols 12.

Well pipettieren Sie 50 Mikroliter fötales Rinderserum in die rechteckige Fläche und verteilen Sie es über den gesamten Bereich. Lassen Sie die Well-Platte mit der Spitze über Nacht in einer sterilen Biosicherheitshaube, damit der Serumfleck vollständig trocknen kann. Um mit dem Drucken unter Wasser zu beginnen, spülen Sie den Druckkopf mit destilliertem Wasser aus.

Füllen Sie dann eine 60-Millimeter-Petrischale mit destilliertem Wasser und docken Sie den Druckkopf mit einer pneumatischen Pumpe zwei Minuten lang mit destilliertem Wasser durch jede der Leitungen durch die Leitungen. Entsorgen Sie dann das Wasser aus der Petrischale und füllen Sie sie mit sauberem Wasser. Bewegen Sie anschließend den Druckkopf dreimal im Wasser auf und ab.

Docken Sie die Druckkopfmitte über den serumbeschichteten Punkt in der vorbereiteten 12-Well-Platte. Grundieren Sie dann den Druckkopf mit Prewarm. Komplette Medien mit 300 Mikrolitern pro Kanal.

Wenn Sie mehrere Drucke durchführen, fügen Sie zusätzlich zu der Wasserspülung zwischen den Drucken eine Bleichspülung hinzu. Drucken Sie die suspendierten Zellen in einer Konzentration von 50.000 Zellen pro Milliliter und bei 60 Mikrolitern pro Minute auf die Oberfläche. 100 Mikroliter pro Kanal.

Platzieren Sie nach dem Zelldruck den Druckkopf links angedockt an der Oberfläche und den Verteiler in einem Zellkultur-Inkubator. Zwei Stunden lang auf 5 % Kohlendioxid und 37 bis Grad Celsius einstellen. Entfernen Sie nach der zweistündigen Inkubation den Druckkopf und setzen Sie den Deckel auf die Kulturschale.

Der Zeitpunkt, zu dem der Druckkopf entfernt wird, gilt als Zeitpunkt der Null-Stunde. Zum Vergleich wird auch eine Standard-Zellkultur durchgeführt. Geben Sie einen Milliliter vorwärmtes Medium in eine der 12-Well-Platten mit Serumflecken, nehmen Sie dann einen Milliliter der restlichen Zellsuspension und pipettieren Sie ihn in eine einzelne Vertiefung der 12-Well-Platte.

Dadurch entsteht eine Kultur mit 50.000 Zellen in der Schale. Legen Sie die Zellkulturplatte für zwei Stunden bei 37 Grad Celsius in einen Inkubator. Beginnen Sie nach der zweistündigen Inkubation mit der Zeitmessung, um die Konsistenz zwischen gedruckten und Seeding-Proben zu gewährleisten.

Dies wird als Zeitpunkt der Stunde Null angesehen. Nach 0, 2, 24 und 48 Stunden bereiten Sie die Zellen aus jeder der beiden Methoden für die Bildgebung vor, indem Sie sie mit Propidiumiodid färben, das nur in den Zellkern toter Zellen eingebaut wird. Spülen Sie die Zellen zunächst dreimal vorsichtig mit einem Milliliter phosphatgepuffter Kochsalzlösung mit Kalzium und Magnesium, um Ablagerungen zu entfernen.

Geben Sie als Nächstes einen Milliliter des vorwärmten Nährmediums in jedes Kulturgefäß und dann einen Mikroliter Propidiumiodid. Inkubieren Sie die mit Propidiumiodid gefärbten Zellen 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, bevor Sie die Zellen mit einem inversen Mikroskop bei 10-facher und 40-facher Vergrößerung abbilden. Entsorgen Sie die Zellen schließlich in einem geeigneten Behälter für biologische Gefahren.

Die Fibroblasten-Zelllinie, NIH drei T drei Zellen wurden auf eine untergetauchte Oberfläche gedruckt oder ausgesät. Nach dem Drucken und Aussäen wurden die Zellen visualisiert, um die Dichte und Morphologie zu relevanten Zeitpunkten zu beurteilen. Die Bilder zeigten, dass die Zellen zu jedem Zeitpunkt und bei jeder Vergrößerung nahezu identische Phänotypen besitzen.

Basierend auf diesen Zahlen wurde festgestellt, dass der effektive Druck minimal ist. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde mit Hilfe einer Propidiumiodid-Färbung beurteilt und zeigte, dass sich die Lebensfähigkeit der gedruckten Zellen zu jedem Zeitpunkt nicht signifikant von der der sitzenden Zellen unterschied. Der Hauptunterschied zwischen den beiden Methoden, die Zellen an der Oberfläche zu befestigen, ist die Dichte der Zellen.

Die Dichte der gedruckten Zellen nimmt zum Zeitpunkt von zwei Stunden sowohl in sitzenden als auch in gedruckten Zellen um über 50 % ab. Weitere Studien sind gerechtfertigt, um die Ursache für diesen Rückgang zu ermitteln. Die Gesamtverhältnisse der gedruckten Dichte im Vergleich zu geseedeten Dichten sind jedoch nach wie vor deutlich höher.

Die gedruckte Zelldichte in der Durchflusszelle war zu jedem Zeitpunkt etwa 10-mal so dicht wie die ausgesäten Zellen, wenn man bedenkt, dass die Zellen mit der gleichen Dichte wie die Aussaat gedruckt wurden, jedoch in einer kleineren Fläche. Zum letzten Zeitpunkt haben die Zellen die gleiche Dichte, was wahrscheinlich auf die Zellmotilität und den begrenzten Ressourcenverbrauch zurückzuführen ist. Seit ihrer Entwicklung hat diese Technik den Weg für Forscher in den Bereichen der Arzneimittelforschung geebnet, um die Auswirkungen der Toxizität und Wirksamkeit von Arzneimitteln auf Zellen und Krebs, Aids, Herzerkrankungen und andere stark nachgefragte Bereiche zu untersuchen.

Durch den Einsatz des submersen Zelldrucks in Verbindung mit anderen Technologien wie Adhärenz und programmierbarer Zelladhäsion können wir die Reichweite der Technik auf Suspensionszellen ausdehnen, um die Wirkstoffforschung und das Entwicklungsscreening zu erweitern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein solides Verständnis dafür haben, wie Sie Zellen mit unserer Unterwasserdrucktechnik drucken können.