Name: Die Tauchdruck der Zellen auf eine modifizierte Oberfläche mit einem Continuous Flow Microspotter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 29 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie Fibroblasten mit einem Continuous Flow Microspotter auf serumbeschichtete Oberflächen drucken. Diese Methode ermöglicht präzise Zellarrays für verbesserte Arzneimittelscreenings und Zytotoxizitätsanalysen.

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Die Autoren bedanken sich bei Chris Morrow, um technische Unterstützung zu bestätigen. Die Finanzierung wurde durch die NIH SBIR (R43) zu gewähren 1R43GM101859-01 (MPI) GRANT10940803.

1. Zellkultur Vorbereitung <ol><li> Bewahren NIH/3T3 Zelle Aktien in flüssigem Stickstoff bis zur Verwendung. </li><li> Vorbereitung komplette Medien NIH/3T3-Zellen mit Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum, 10 mM HEPES-Puffer, 50 Einheiten / ml Penicillin und 50 &amp;mgr; g / ml Streptomycin ergänzt. </li><li> Auftauen Zellen für 2-3 min in einem Schüttelwasserbad bei 37 ° C </li><li> Die Zellen in 5 ml Vollmedium und Zentrifugation bei 1.500 × g für 3 min. </li><li> Entfernen Sie den Zellüberstand, ohne das Zellpellet zu stören. </li><li> Resuspendieren der Zellen in 5 ml Medium und zählen Zellen mit einer Zählkammer. <ol><li> Entfernen Sie 10 ul der Zellsuspension und in ein 0,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Werden 10 ul Trypanblau zu der Zellsuspension zugegeben und mit der Spitze der Pipette. </li><li> Je 10 ul der gefärbten Zellen in einer Zählkammer Kammer. </li><li> Zählen von Zellen in Hämozytometers bei 10-facherVergrößerung. <ol><li> Zählen Sie die lebenden Zellen (kleine, weiße Kugeln) für 4 der 9 großen Quadraten. Nur zählen die lebenden Zellen, die dunkelblau von der Trypanblau-Färbung nicht angezeigt. </li><li> Berechnen der Anzahl der Zellen pro Quadrat großen, was die Anzahl der Zellen x 10 4 Zellen / ml in der ursprünglichen Zellsuspension. </li><li> Samenzellen in einer Dichte von 1 × 10 5 Zellen / ml mit insgesamt 5 ml in jeden Kolben T25. </li></ol></li><li> Kulturzellen um 70% bis 80% Konfluenz vor Beginn der Experimente. Aktualisieren Medien alle 2-3 Tage oder nach Bedarf. </li></ol></li></ol> 2. Printing Oberflächenvorbereitung <ol><li> Mark ein Rechteck mit Marker auf dem Boden einer Gewebekultur-behandelt Polystyrol (TCTPS) 12-Well-Platte die Größe der Druckkopf (7 mm x 19 mm). </li><li> Je 50 ul fetales Rinderserum in die rechteckige Fläche und breitete sie über den gesamten Bereich mit der Spitze. </li><li> Verlassen Sie die Petrischalein einem sterilen Biosicherheit Kapuze O / N, damit das Serum vor Ort vollständig trocknen. Diese Platten sollten bereit nicht mehr als 2 Tage vor benutzen können. </li></ol> 3. Tauchdruck <ol><li> Spülen Sie den Druckkopf mit destilliertem Wasser. <ol><li> Füllen Sie eine 60 mm Petrischale mit destilliertem Wasser und docken Sie den Druckkopf auf die Oberfläche. </li><li> Fließen destilliertem Wasser durch jede der Leitungen für 2 min bei 150 ul / min unter Verwendung einer Luftpumpe. </li><li> Entsorgen Sie das Wasser aus der Petrischale und füllen Sie es mit sauberem Wasser. </li><li> Bewegen Sie den Druckkopf nach oben und unten im Wasser 3-mal. </li></ol></li><li> Docken Sie den Druckkopf über das Zentrum Serum beschichteten Stelle in der vorbereiteten 12-Well-Platte. </li><li> Minister der Druckkopf mit vorgewärmter komplette Medien-, 300 ul pro Kanal. </li><li> Druck suspendierten Zellen bei einer Konzentration von 50.000 Zellen / ml auf die Oberfläche und 60 &amp;mgr; l / min, 100 &amp;mgr; l pro Kanal. </li><li> Setzen Sie den Druckkopf, links gegen die angedocktFläche und der Verteiler in einem Zellkulturbrutschrank mit 5% CO 2 und 37 ° C für 2 h eingestellt. </li><li> Nach 2 h Inkubation, entfernen Sie den Druckkopf und legen Sie den Deckel auf der Kulturschale. Der Zeitpunkt, zu dem der Druckkopf entfernt wird als der Zeitpunkt 0 Stunden. </li></ol> 4. Standard-Zellkultur <ol><li> 1 ml vorgewärmtes Medium einem Serum-spotted TCTPS 12-Well-Platte in Schritt 2 hergestellt. </li><li> Nehmen Sie 1 ml der restlichen Zellsuspension aus Schritt 2 und Pipette in einer einzigen Vertiefung einer 12-Well-Platte TCTPS. Dies wird eine Kultur, die 50.000 Zellen in der Schale zu produzieren. </li><li> Platzieren der Zellkulturplatte in einem Inkubator bei 37 ° C für 2 Stunden. </li><li> Nach dem 2-stündigen Inkubation beginnen Timing; Konsistenz zwischen gedruckten und Aussaat Proben, wird dies als der Zeitpunkt 0 Stunden. </li></ol> 5. Kultur Visualisierung <ol><li> Nach 0, 2, 24 und 48 h Aufnahmezellen von jeder der beiden Methoden doben und Bild escribed mit einem Standard-Umkehrmikroskop. <ol><li> Färben die Zellen mit Propidiumiodid, einen roten Fluoreszenzfarbstoff, der nur in den Zellkern von toten Zellen aufgenommen. <ol><li> Vorsichtig spülen die Zellen 3-mal mit 1 ml Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung mit Calcium und Magnesium (PBS + +), um alle Ablagerungen zu entfernen. </li><li> 1 ml vorgewärmtes PBS + + jedem Kulturgefäß. </li><li> 1 &amp;mgr; l Propidiumjodid-Stammlösung (1 mg / ml) zu jeder Kulturgefäß. </li><li> Inkubieren der Zellen mit Propidiumiodid gefärbt bei 37 ° C für 10 min. </li></ol></li><li> Bild die Zellen mit einem inversen Mikroskop mit 10-facher und 40-facher Vergrößerung. </li></ol></li><li> Entsorgen Sie die Zellen in einem geeigneten Behälter für biologischen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren sind Mitarbeiter und Aktionäre der Wasatch Mikrofluidik, die Reagenzien und / oder Instrumente in dieser Handschrift verwendet wird, erzeugt.

Die hier beschriebene 3D-Mikrofluid-Drucktechnologie ist einzigartig in der Lage, Druck mikrofluidisch Arrays von Zellen in einer Flüssigkeit gut gefüllt, dh ein unter Wasser Oberfläche. Durch Bedrucken untergetauchten Oberflächen können Zellmikroarrays erzeugt werden, die die physiologisch relevanten zellularen Phänotyps von Zellen als auch die Fähigkeit, Zellen in den Boden einer einzelnen Vertiefung 4 multiplexen aufrechtzuerhalten. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass mikrofluidisch Dr...

Jüngste Fortschritte in der Pharmaindustrie haben zu einem verstärkten Interesse im Umgang mit zellulären Mikroarrays in der Arzneimittelforschung für Wirkstoff-Screening und Analyse cytotoxicological 1,2,3 geführt. Die Entwicklung von in-vitro-Assays mit hohem Durchsatz und Screening-Methoden unter Verwendung von Zellmikroarrays würde die schnelle und kostengünstige Entwicklung von Wirkstoffkandidaten sowie Voraus die grundlegenden Verständnis der Zelle 1,4 erleichtern. Der traditionelle Ansatz für Screening mit Zellen verwendet herkömmliche Well-Platte-Plattformen; jedoch ist dieser Ansatz aufgrund der hohen Kosten, begrenzte Durchsatz und begrenzte Fähigkeit zur quantitativen Informationen über Zell-Funktion 1,5 begrenzt. Aufgrund dieser Einschränkungen ist die Forschung in der Zell-Microarray-Technologien aufkeimenden für molekularbiologische Charakterisierung, Tissue Engineering und Drug-Screening 1,6. Die Vorteile der zellulären Mikroarrays sind kleinere Proben Nutzung, minimale Effekte vonzellulären Phänotyps Heterogenität Maskierungsinformationen, und vor allem die Fähigkeit, mehr Tests für Anwendungen mit hohem Durchsatz 1,7,8 automatisieren. Die Pharmaindustrie nutzt derzeit Hochdurchsatz-zellbasierten Screening-Assays mit 2D-Zellmonolayer-Kulturen für Wirkstoff-Screening in Mikrotitervertiefung Platten 9. Multiplex-Zellen in die Vertiefungen von Mikrotiterplatten bietet das Potential für höhere Durch mit einzigartigen Experimentiermöglichkeiten. Ferner können die aktuellen Technologien für Mobilmicroarrays um die Zellen zu trocknen, die den Phänotyp der Zellen drastisch verändern können aus in vivo 10,11. Um diese Probleme zu überwinden, die MFCA wurde entwickelt und ist in Fig. 1 gezeigt. Das Design der Fluidik MFCA 3D ermöglicht die Druckkopfspitze in Fig. 1 in ein Bad abgesenkt und gegen die Oberfläche zusammengedrückt, um eine Dichtung zu bilden. Die weiche Silikonspitze des Druckkopfes verhält sich wie einDichtung und einen reversiblen Dichtung bildet. Die MFCA Technologie ist einzigartig geeignet, mit untergetauchten Oberflächen, die für beide Zellkulturen und Gewebeschnitt Systeme erforderlich Schnittstelle, und es ist schwierig oder unmöglich mit den meisten anderen Ansätzen. Pins oder Tintenstrahldruck wird nicht funktionieren, und 2D-Mikrofluid-Geräte sind nicht für die Abscheidung oder Schnittstellen mit großen Arrays von diskreten Stellen geeignet. Ferner werden durch die Miniaturisierung und die Lokalisierung des Experiments - der zellulären Mikroarray - der MFCA windet die große Probleme mit der Hochdurchsatz-zellbasierten Screening-Assays verbunden. Die CFM verwendet 3D-Kanal-Netzwerke zu Zyklus kleines Volumen Flüssigkeitsproben über mikroskopische Ort Stellen auf einer Oberfläche 12,13. Durch das Drucken mit Durchfluss sind Biomoleküle, Zellen und anderen Reagenzien in einer flüssigen Umgebung während des gesamten Druckprozesses beibehalten, so dass der Druck von empfindlichen Biomoleküle und Zellen ohne Kontakt mit Luft, die die aktuelle Zelle Drucktechniken behindert. Es ist auch möglich, direkt aus rohem Material, wie Hybridom-Überständen oder sofern ein Erfassungsmechanismus auf der Array-Oberfläche zu drucken. Das Ziel dieser Handschrift ist es, im Detail die untergetauchten Druck von beiden Zelltypen auf eine Oberfläche zu erklären.

<table><tbody><tr><td>Kontinuierlicher Durchfluss-Microspotter</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIH/3T3-Zellen</td><td>ATCC</td><td>CRL-1658</td><td></td></tr><tr><td>Dubbleco's Modified Eagle Medium</td><td>Invitrogen</td><td>11965-092</td><td>Basismedien für Zellen</td></tr><tr><td>HEPES-Puffer</td><td>Invitrogen</td><td>15630-080</td><td>Zellmedienadditiv (pH-Wert kontrollieren)</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Invitrogen</td><td>11360-070</td><td>Zusatzstoff für Zellmedien</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Additiv für Zellmedien</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Invitrogen</td><td>15250-061</td><td>Färben von Zellen zum Zählen</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Fisher</td><td>267110</td><td>Zellkammer zum Zählen von Zellen</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS100</td><td>Nikon</td><td></td><td>Zur Überprüfung von Zellen</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TE2000-U</td><td>Nikon</td><td></td><td>Zum Sammeln von Bildern</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (mit Calcium und Magnesium)</td><td>Invitrogen</td><td>14040-133</td><td>Spülen der Zellen vor dem Passieren und vor der Färbung mit PI</td></tr><tr><td>TrypLE Express&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>A12177-01</td><td>Zur Entfernung von Zellen von der Oberfläche</td></tr></tbody></table>

die tauchdruck der zellen auf eine modifizierte oberfläche mit einem continuous flow microspotter

The Submerged Printing of Cells onto a Modified Surface Using a Continuous Flow Microspotter

Das Drucken von Zellen für Microarray-Anwendungen birgt erhebliche Herausforderungen, einschließlich des Problems der Aufrechterhaltung des physiologisch relevanten Zellphänotyps nach dem Drucken, der schlechten Organisation und Verteilung der gewünschten Zellen und der Unfähigkeit, Medikamente und/oder Nährstoffe an die Zielbereiche im Array zu liefern. Unsere mikrofluidische 3D-Drucktechnologie ist in der Lage, Arrays von Zellen automatisiert und gemultiplext auf untergetauchte Oberflächen zu versiegeln und zu drucken. Das Design der 3D-Fluidik des Microfluidic Cell Array (MFCA) ermöglicht es, die Druckkopfspitze in eine mit Flüssigkeit gefüllte Vertiefung oder Schale abzusenken und gegen eine Oberfläche zu drücken, um eine Dichtung zu bilden. Die weiche Silikonspitze des Druckkopfes verhält sich wie eine Dichtung und ist in der Lage, durch Druck oder Rückzug eine reversible Abdichtung zu bilden. Andere Zellendrucktechnologien, wie z. B. Pin- oder Tintenstrahldrucker, sind nicht in der Lage, in getauchten Anwendungen zu drucken. Der Druck unter getauchter Oberfläche ist unerlässlich, um Phänotypen von Zellen zu erhalten und diese Zellen auf einer Oberfläche zu überwachen, ohne die Eigenschaften der Materialoberfläche zu beeinträchtigen. Durch das Bedrucken von Unterwasseroberflächen werden Zell-Microarrays hergestellt, die ein Wirkstoffscreening und eine Bewertung der Zytotoxizität in einer Vielzahl von Bereichen ermöglichen, darunter Krebs, Diabetes, Entzündungen, Infektionen und Herz-Kreislauf-Erkrankungen.

Die Fibroblasten-Zelllinie NIH/3T3-Zellen wurden gedruckt oder auf eine eingetauchte Oberfläche ausgesät. Die Zellen wurden in einer Dichte von 5 × 10 4 Zellen pro ml gezüchtet. Zellen wurden mit herkömmlichen Zellkulturtechniken angeimpft. Zellen wurden unter Verwendung eines großformatigen, zwölf Druckkopf-Durchflusszelle, wo die Kanäle sind größer (~ 500 &amp;mgr; m) als die CFM für Proteine ​​und andere Biomoleküle gedruckt. Die Zellen wurden aufgedruckt oder auf eine beschichtete Oberfläche Serum ausgesä...

Diese 3D-Mikrofluidik-Drucktechnologie druckt Arrays von Zellen auf untergetauchte Oberflächen. Wir beschreiben, wie Arrays von Zellen mikrofluidisch in 3D-Durchflusszellen auf untergetauchte Oberflächen gebracht werden. Durch das Bedrucken von submersen Oberflächen wurden Zell-Microarrays hergestellt, die ein Wirkstoffscreening und die Beurteilung der Zytotoxizität in einer Vielzahl von Bereichen ermöglichen.

Die Tauchdruck der Zellen auf eine modifizierte Oberfläche mit einem Continuous Flow Microspotter

The printing of cells for microarray applications possesses significant challenges including the problem of maintaining physiologically relevant cell ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, drei T drei Fibroblasten auf eine mit Serum beschichtete Oberfläche zu drucken. Dies wird erreicht, indem zunächst Serum auf eine Gewebekultur-Oberfläche präadsorbiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, eine Suspension von Fibroblasten mithilfe eines Mikrospotter mit kontinuierlichem Durchfluss auf die Oberfläche aufzutragen, gefolgt von einer Inkubation der Zellen bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden. Anschließend werden sowohl gedruckte Zellen als auch über Standardzellkultur ausgesäte Zellen mit Propidiumiodid gefärbt und unter einem umgekehrten Mikroskop zum Vergleich visualisiert. Abschließend wird die Zellviabilität, -dichte und -morphologie zu relevanten Zeitpunkten mittels Fluoreszenzmikroskopie beurteilt. Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden wie Pin-Druck besteht darin, dass der Druckkopf eine Dichtung über der Oberfläche bildet, wodurch Zellen unter Flüssigkeit in Zellkulturmedien gedruckt werden können.Während das untergetauchte Drucken von Zellen nützlich ist, um neue Wirkstoffkandidaten auf Sicherheit und Wirksamkeit zu testen, eignet sich das untergetauchte Drucken im Allgemei

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Mikrokontaktdruck ausgiebig in die Muster von Proteinen und anderen Molekülen auf Materialoberflächen eingesetzt. Wir zeigen die wichtigsten Schritte dieses Prozesses, Stanz-Muster von Fibronektin auf Glas.

Mikrokontaktdrucken von Proteinen für Zellbiologie

Selbstorganisierte Monoschichten (SAMs) aus langkettigen Alkan Thiolen auf Gold gebildet ist gut definierten Substraten für die Bildung von Protein-Muster-und Zell-Entbindung. Mikrokontaktdruck von Hexadecanthiol mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempel durch Verfüllung mit folgten einem Glykol-terminierte Alkanthiol Monomer erzeugt ein Muster, bei dem Protein und Zellen adsorbieren nur den Stempel Hexadecanthiol Region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Eine Beschreibung der Methoden benutzt, um einen HP DeskJet 500 Drucker in einen bioprinter konvertieren. Der Drucker verarbeiten kann lebende Zellen, die transiente Poren in der Membran bewirkt. Diese Poren können verwendet werden, um kleine Moleküle, einschließlich fluoreszierender G-Actin, in die gedruckte Zellen einzubauen.

Erstellen Transient Zelle Membranporen Mit einem Standard-Inkjet-Drucker

Ein Verfahren zur Montage von Klebstoff und löslichen Gradienten in einer Mikroskopie Kammer für lebende Zellmigration Studien beschrieben. Die gebaute Umwelt verbindet Antifouling Oberflächen und Kleber Tracks mit Lösung Steigungen und ermöglicht somit ein, um die relative Bedeutung von Leitlinien Hinweise zu bestimmen.

Erstellen Adhesive und löslichen Farbverläufe for Imaging Cell Migration mit Fluoreszenz-Mikroskopie

In diesem Artikel präsentieren wir ein Mikrofluidik-Chip für Einzelzellanalyse. Es ermöglicht die Quantifizierung der intrazellulären Proteine, Enzyme, Cofaktoren und zweiten Boten mittels Fluoreszenzassays oder Immunoassays.

Eine mikrofluidische Chip für die vielseitige chemische Analyse von Einzelzellen

Zellkultursubstrate, funktionalisiert mit mikroskaligen Mustern biologischer Liganden, haben einen immensen Nutzen im Bereich des Tissue Engineering. Hier demonstrieren wir die vielseitige und automatisierte Herstellung von Gewebekultursubstraten mit mehreren, mikrostrukturierten Poly(ethylenglykol)-Bürsten und präsentieren orthogonale Chemien, die eine räumlich präzise und ortsspezifische Immobilisierung von biologischen Liganden ermöglichen.

Herstellung von komplexen Kultursubstrate verwenden Robotic Mikrokontaktdrucken (R-mCP) und Sequential Nucleophile Substitution

Wir präsentieren ein Protokoll zur Durchführung einer subtraktiven Musterung von lebenden Zellmonoschichten auf einer Oberfläche. Dies wird durch eine lokale und selektive Lyse adhärenter Zellen mit einer mikrofluidischen Sonde (MFP) erreicht. Das aus lokalen Regionen gewonnene Zelllysat kann für die nachgelagerte Analyse verwendet werden, was molekulare Profiling-Studien ermöglicht.

Schnelle Subtraktive Patterning von Live Cell-Schichten mit einer Mikrofluidik-Probe

Dieses Protokoll beschreibt eine Bioprinting-Methodik, die ein automatisiertes robotergestütztes Abscheidesystem verwendet, das geätzte topographische Leitfäden mit der präzisen Abscheidung einer Zelle mit Hydrogel-Biotinte verbindet. Die gedruckten Zellen werden direkt auf die geätzten Merkmale aufgebracht und sind in der Lage, diese zu erfassen und sich daran zu orientieren.

Automatische Robotic Dosiertechnik für Oberflächen Ausrichtungs- und Bioprinting von Zellen

Dieser Bericht beschreibt eine einfache, leicht durchzuführende Technik, die Niederdruckvakuum verwendet, um mikrofluidische Kanäle mit Zellen und Substraten für die biologische Forschung zu füllen.

Eine vielseitige Methode von Patterning Proteinen und Zellen

Wir beschreiben ein einfaches lithographischen Verfahren für die Immobilisierung von gen-Länge DNA-Molekülen auf einer Fläche, die zur zellfreien gen Ausdruck Experimente auf Biochips durchführen können.

Funktionale Oberfläche-Immobilisierung von Genen mit mehrstufigen Strang Verschiebung Lithographie

Diese Methode soll die Mechanismen veranschaulichen, mit denen extrazelluläre Matrix-Cues wie Substratsteifigkeit, Proteinzusammensetzung und Zellmorphologie Schwann-Zell(SC)-Phänotyp regulieren.

Vorbereitung von tunable Extracellular Matrix Microenvironments zur Bewertung der Schwann Cell Phänotyp Specification

Erfahren Sie, wie Sie Fibroblasten mit einem Continuous Flow Microspotter auf serumbeschichtete Oberflächen drucken. Diese Methode ermöglicht präzise Zellarrays für verbesserte Arzneimittelscreenings und Zytotoxizitätsanalysen.

Die Tauchdruck der Zellen auf eine modifizierte Oberfläche mit einem Continuous Flow Microspotter

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