Menschliches Knorpelgewebe Herstellung unter Verwendung von dreidimensionalen Inkjet-Drucktechnologie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein dreidimensionales menschliches Knorpelgewebe zu konstruieren, um die Machbarkeit des 3D-Gewebedrucks unter Verwendung eines modifizierten thermischen Tintenstrahldruckers mit gleichzeitiger Photopolymerisation zu testen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein kommerziell erhältlicher Hewlett Packard Desk Jet 500 Thermo-Tintenstrahldrucker und 5 1 16 2 6, eine Mono-Farbtintenpatrone, zu einem Biodrucker modifiziert werden. Der zweite Schritt besteht darin, einen einfachen 3D-Druckschritt und eine langwellige UV-Lampe zu kombinieren, um eine sofortige Polymerisation der eingespritzten Biotinte während des Herstellungsprozesses zu ermöglichen.

Als nächstes wird die Biotinte hergestellt, indem expandierte menschliche Gelenkchondrozyten in 10%iger Polyethylenglykollösung bei 5 Millionen Zellen pro Milliliter suspendiert werden. Der letzte Schritt besteht darin, das Knorpelgewebe Schicht für Schicht mit gleichzeitiger Photopolymerisation zu drucken. Letztendlich konfokale Mikroskopie und Histologie.

Die Färbung wird verwendet, um die gleichmäßige Verteilung der gedruckten Chondrozyten in einem 3D-Hydrogel und die hervorragende Produktion der extrazellulären Knorpelmatrix im homogenen Neo-Knorpel während der Kultur zu zeigen. Der Hauptvorteil dieser Technologie gegenüber bestehenden Maßnahmen wie Polymerisation nach manueller Herstellung oder Sitzzellen nach dem Scan für die Herstellung besteht darin, dass die gedruckten Zellen präzise an die taktile Stelle abgegeben werden und in der Matrix in Position bleiben. Anstatt aufgrund der Schwerkraft an den Boden des Gerüsts zu denken, bildet es eine homogene Patrone.

Die in diesem Video gezeigte Druckermodifikation basiert auf einem Hewlett Packard Desk Jet 500 Thermo-Tintenstrahldrucker und einer 5 1 6 2 6 a schwarzen Tintenpatrone. Entfernen Sie zunächst die obere Kunststoffabdeckung des Druckers und lösen Sie das Bedienfeld vorsichtig von der Abdeckung. Trennen Sie die drei Kabelverbindungen zwischen dem oberen Teil und der Basis des Druckers.

Entfernen Sie dann den oberen Teil des Druckers von der Basis. Als Nächstes werden die kleinen Kunststoff- und Gummiteile, aus denen das Druckkopfreinigungssystem besteht, vom oberen Teil des Druckers entfernt. Entfernen Sie den Boden des Papierfachs mit Federn.

Die Metallplatte, die den Papiereinzug aus Kunststoff abdeckt, muss ebenfalls entfernt werden. Außerdem muss der Papiereinzugsbalken aus Kunststoff an der mittleren Position des Einzugsrads abgeschnitten und die beiden Papiereinzugsräder entfernt werden. Für die Zwecke dieses Videos wurden diese Komponenten bereits entfernt.

Nachdem Sie Staub und Schmutz mit Luft- und Ethanoltüchern aus der Dose entfernt haben, befestigen Sie den oberen Teil des Druckers an der Basis, bevor Sie UV-Strahlung verwenden. Sterilisieren Sie den modifizierten Drucker mindestens zwei Stunden lang in einer Laminar-Flow-Haube. Um die Tintenpatrone zu modifizieren, schneiden Sie zuerst die Kappe ab.

Leeren Sie die Tinte mit einer Handsäge und entfernen Sie den Filter, der den unteren Vertiefungsbehälter der Patrone abdeckt. Spülen Sie die Patrone gründlich mit fließendem Leitungswasser aus, um die Tintenreste zu entfernen. Beschallen Sie die Kartusche 10 Minuten lang in entionisiertem Wasser.

Untersuchen Sie die Patrone, um sicherzustellen, dass die Tinte vollständig entfernt wurde. Besprühen Sie die Kartusche zur Sterilisation gründlich mit 70 % Ethanol, gefolgt von sterilisiertem deionisiertem Wasser. Richten Sie schließlich eine langwellige UV-Lampe über der Druckplattform ein, um eine gleichzeitige Photopolymerisationskapazität zu gewährleisten.

Messen Sie die UV-Intensität an der Druckplattform mit einem UV-Lichtmessgerät. Passen Sie den Abstand zwischen der UV-Lampe und der Druckerplattform so an, dass die Intensität am Druckmotiv zwischen vier und acht Milliwatt pro Quadratzentimeter liegt. Dieser Abstand zwischen der Lampe und der Druckerplattform sollte etwa 25 Zentimeter betragen.

Die Bio-Tinte wird aus humanen Chondrozyten hergestellt, um Chondrozyten in einer Monolayer-Platte zu expandieren. 5 Millionen humane Chondrozyten in jeden T 1 75 Gewebekulturkolben für die Zellexpansion In DMEM ergänzt mit 10 % Kälberserum und einer x Penicillin-Streptomycin-Glutamin-Kulturzelle bei 37 Grad Celsius mit befeuchteter Luft mit 5 % Kohlendioxid. Wechseln Sie das Kulturmedium alle drei Tage, bis die Zellen zu 85 % konfluent sind.

Verwende Zellen aus derselben Passage. Bereiten Sie die Polyethylenglykol-, DL- oder Peda-Lösung vor. Peda wird in PBS bis zu einer Endkonzentration von 10 Gew.-% pro Volumen gelöst.

Den Photoinitiator I 2 9 5 9 bis zu einer Endkonzentration von 0,05 Gew.-% pro Volumenfilter zugeben. Sterilisieren Sie die Lösung, wenn die kultivierten menschlichen Chondrozyten zu 85 % konfluent sind. Sammeln Sie die Zellen, nachdem Sie die Zellkonzentration berechnet haben.

Übertragen Sie das Volumen der Zellsuspension, das zur Vorbereitung der Bio-Suspension benötigt wird, bei 5 Millionen Zellen pro Milliliter für fünf Minuten in eine konische Röhrchenzentrifuge bei 1200 U/min. Um die Zellen zu pelletieren, aspirieren Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen in der vorbereiteten Pega-Lösung, um die Biotinte zu bilden. Um diesen Vorgang zu starten, schalten Sie den Drucker und den Laptop mit Microsoft Word ein und erstellen Sie ein Druckmuster eines ausgefüllten Kreises mit einem Durchmesser von vier Millimetern.

Setzen Sie die Kunststoffform in den Drucker ein. Passe die Position des Musters an und stelle sicher, dass es genau in die Kunststoffform gedruckt wird. Berechnen Sie die Anzahl der Drucke, die erforderlich sind, um die gewünschte Dicke des Gerüsts zu erreichen.

Für eine Höhe von vier Millimetern sind 220 Drucke erforderlich, um das gewünschte Gerüst zu erstellen. Legen Sie die Bio-Tinte in die Tintenpatrone ein. Decken Sie die Patrone mit Aluminiumfolie ab, um sie vor direkter UVV-Exposition zu schützen.

Senden Sie während des Druckens den Druckbefehl an den Drucker. Wenn der Drucker zu drucken beginnt, ziehen Sie am Papiersensor, um den Druckvorgang fortzusetzen. Wenn kein Papier durch den Drucker läuft, sollte der gesamte Druckvorgang für ein Gerüst mit einem Durchmesser von vier Millimetern und einer Höhe von vier Millimetern weniger als vier Minuten dauern.

Übertragen Sie gedruckten Neo-Knorpel auf eine 24-Well-Platte und geben Sie 1,5 Milliliter Nährmedium in jede Well. Um die Lebensfähigkeit der Zellen zu bewerten, inkubieren Sie den gedruckten Neo-Knorpel in lebendtoter Lebensfähigkeit. Zytotoxizität Arbeitslösung bei Raumtemperatur für 15 Minuten im Dunkeln, schneiden Sie das mit Zellen beladene Hydrogel in zwei Hälften Nachdem Sie Fluoreszenzbilder des Schnittbereichs aufgenommen haben, lassen Sie einen verblindeten Beobachter lebende und tote Zellen in fünf zufällig aufgenommenen Bildern zählen, um die Lebensfähigkeit der Zellen zu berechnen.

Auf diesem Foto ist ein repräsentativ gedrucktes Neo-Knorpelgewebe mit einem Durchmesser von vier Millimetern und einer Höhe von vier Millimetern zu sehen, das auf den Eigenschaften des modifizierten Thermal Inkjet Druckers basiert. Bei einem Konstrukt dieser Größe betrugen das Volumen und die Dicke jeder gedruckten Schicht während des schichtweisen Aufbaus 0,23 Mikroliter bzw. 18 Mikrometer. Der gesamte Druckprozess zum Aufbau des Neoknorpelgewebes dauerte weniger als vier Minuten.

Diese Bilder zeigen Chondrozyten, die mit grünen und orangefarbenen Fluoreszenzfarbstoffen markiert sind. Panel A zeigt eine gleichmäßige Zellverteilung der gedruckten Chondrozyten im 3D-Gerüst. Aufgrund der gleichzeitigen Photopolymerisation des umgebenden Gerüsts während der Zellabscheidung wurde der Druck- und Photopolymerisationsprozess in vier Minuten mit einer Zellviabilität von 90 % abgeschlossen. Im Gegensatz dazu zeigt Panel B, dass die Zelle ohne gleichzeitige Photopolymerisation nicht an ihren ursprünglich abgelagerten Stellen verharrte, sondern aufgrund der Schwerkraft auf die untere horizontale Grenzfläche sank.

Es dauerte 10 Minuten UV-Exposition auf das Gel, ein Konstrukt von der gleichen Größe wie ein A mit einer Zellviabilität von 63% Safran und o Die Färbung der gedruckten Chondrozyten im PEG-Hydrogel zeigt eine allmählich erhöhte Prot-Glykanproduktion während der Kultur, was auf den kongenen Phänotyp der gedruckten Chondrozyten in 3D und die Bildung eines homogenen Neoknorpels hinweist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen modifizierten Thermotintenstrahldrucker verwenden können, um dreidimensional berechnetes Gewebe mit gleichmäßiger Zellverteilung in einem 3D-Gerüst zu erstellen.