DNBS / TNBS Colitis-Modelle: Einblicke in chronisch entzündlichen Darmerkrankungen und Effekte von Nahrungsfett

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine alternative und kostengünstige Methode zur Untersuchung von entzündlichen Darmerkrankungen oder IBD unter Verwendung von DY, Nitro, Benzol, Zonsäure oder DNBS anzubieten. Dies wird durch die erste intrarektale Verabreichung von DNBS durch sanftes Einführen in den Anus erreicht. Im zweiten Schritt werden Gewebeschnitte des Dickdarms für das histologische Screening und zur Beurteilung der Myeloperoxidase-Aktivität der DNBS-belasteten Gewebe entnommen, schließlich können die Auswirkungen von Nahrungsölen auf Gewichtsverlust und Kolitis sowohl mit makroskopischen als auch mit mikroskopischen Methoden bewertet werden.

Der Hauptvorteil dieser Materie gegenüber dem bestehenden Dextron-Natriumsulfat-Verfahren besteht darin, dass das DNBS-Verfahren einfach durchzuführen, kostengünstiger und hochgradig reproduzierbar ist. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der IBD-Forschung zu beantworten, z. B. welche Rolle Stress und Depression beim Wiederauftreten von IBD spielen oder welche Mechanismen bei Darmverletzungen und -reparaturen zugrunde liegen. Für die rektale Installation von DNBS bei Mäusen beginnen Sie mit dem Anbringen einer Ein-Milliliter-Spritze an einer 19-Gauge-Nadel. Ausgestattet mit einem Katheter aus Polyethylen 50 aspirieren Sie dann frisch zubereitetes DNBS in den Katheter.

Tragen Sie anschließend Tränengel auf eine anästhesierte Maus auf und üben Sie mit den Fingerspitzen sanften Druck auf das hintere Ende des Tieres aus, um den im distalen Dickdarm vorhandenen Stuhl zu entfernen. Injizieren Sie nun eine kleine Menge der DNBS-Lösung, um den Dickdarm für ein leichteres Einführen zu schmieren, während Sie den Katheter sanft intrarektal etwa drei bis vier Zentimeter einführen. Sobald der Katheter an Ort und Stelle ist, injizieren Sie 100 Mikroliter DNBS oder ein gleiches Volumen von 50 % Ethanol für die Kontrolltiere.

Positionieren Sie dann den Tierkopf 90 Sekunden lang nach unten, um einen Verlust der Reagenzien zu vermeiden. Füttern Sie die Tiere nach der Verabreichung von DNBS mit 8 % Saccharosewasser in 0,2 % Kochsalzlösung, um eine Austrocknung in der ersten Woche zu verhindern. Sorgfältige tägliche Überwachung des Tieres auf Gewichtsverlust, Dehydrierung oder Stress für die Dauer des Experiments, d. h. zum gewünschten Zeitpunkt.

Nach der DNBS-Provokation öffnen Sie die Bauchhöhle des eingeschläferten Tieres und entfernen den gesamten Dickdarm. Öffnen Sie dann den Darm in Längsrichtung. Makroskopische Schleimhautgeschwüre sollten etwa zwei bis drei Zentimeter proximal vom distalen Ende des Dickdarms beobachtet werden.

Sammeln Sie 0,5 Zentimeter lange Schnitte proximal der Stelle der maximalen makroskopischen Schädigung bei den Versuchstieren und Segmente des Dickdarms aus den entsprechenden anatomischen Stellen der Kontrolltiere. Frieren Sie dann 0,5 Zentimeter von einem Kontroll- und 1D-NBS-behandelten Schnitt in flüssigem Stickstoff ein, um die Myeloperoxidase-Aktivität zu beurteilen, und fixieren Sie die anderen Abschnitte in 10 % neutraler gepufferter Form über Nacht oder histologische Analyse. Am nächsten Morgen waschen Sie das Formalin-Fixgewebe mit 70%igem Ethanol und legen Sie es in eine Kassette, um es an eine histologische Einrichtung zu senden, wo es in Paraffin eingebettet und mit Hämatin und Eoin für die histologische Bewertung gefärbt wird.

Bewerten Sie dann mindestens drei Gewebeschnitte von jedem Tier unter einem Lichtmikroskop, um die histologischen Schadenswerte für jede Gruppe zu bestimmen. Um die Myeloperoxidase-Aktivität des DNBS-herausgeforderten Gewebes zu testen. Homogenisieren Sie zunächst das Snap-Frozen-Kontroll- und Versuchsgewebe in Myeloperoxidase-Homogenisierungspuffer, um ein 50-Milligramm-Dickdarmsegment pro Milliliter Homogenisierungspuffersuspension zu erhalten. Dann aliquotieren Sie die homogenisierte Lösung in Portionen von einem Milliliter und zentrifugieren sie zwei Minuten lang bei 10.000 mal g und vier Grad Celsius.

Übertragen Sie als nächstes 100 Mikroliter jedes Aliquots in einzelne Küvetten und fügen Sie 2,9 Milliliter PBS hinzu, die mit IDE, Dihydrochlorid und Wasserstoffperoxid ergänzt werden, und mischen Sie kräftig. Messen Sie abschließend die Absorptionsrate mit einem Spektralphotometer bei 460 Nanometern. Nach intrarektaler Provokation mit DNBS, wie gerade gezeigt.

Ein signifikanter Gewichtsverlust wird nach 48 Stunden bei Ratten beobachtet, die mit Fisch- oder Rapsöl supplementiert wurden, und nach 72 Stunden bei Ratten, die mit Distelöl ergänzt wurden. Der beobachtete maximale Gewichtsverlust tritt nach 48 Stunden bei Fischöl, supplementierten Ratten und nach 72 Stunden bei Ratten auf. Ergänzt mit Raps- oder Distelöl.

Gewichtszunahme setzte nach 72 Stunden wieder ein und fünf Tage nach der Verabreichung durch DNBS zeigten die mit Fischöl und Distelöl behandelten Gruppen ein Körpergewicht, das ihren Ausgangswerten ähnelte. Kontrollratten, die mit den diätetischen Ölen supplementiert und mit intrarektalem Ethanol konfrontiert wurden, nahmen während des gesamten fünftägigen Studienzeitraums stetig an Gewicht zu. Die Darmschäden, die durch DNBS verursacht werden, können weit verbreitet sein.

Der Bereich der maximalen Schädigung ist jedoch bei Ratten im Allgemeinen auf die distalen sechs Zentimeter des Dickdarms und bei Mäusen auf die distalen drei Zentimeter lokalisiert. Bei näherer histologischer Beurteilung wird eine ausgedehnte Epithelschädigung beobachtet, einschließlich der Bildung von Geschwüren, Neutrophilen- und Lymphozyteninfiltration, Schleimmangel und Ödemen. Obwohl diese histologischen Anzeichen von Entzündungen und Gewebeschäden in allen drei Gruppen mit diätetischen Ölergänzungen nach Provokation mit DNBS offensichtlich sind, ist die schwerste Schädigung in der Distelölgruppe zu beobachten, gefolgt von der Rapsölgruppe.

Während Ratten in der Fischölgruppe eine minimale Epithelschädigung und eine begrenzte Infiltration von Entzündungszellen in die Mukosa cosa aufweisen. Unterschiede in der histologischen Schädigung zwischen den Proben können quantifiziert werden, um einen besseren Vergleich zwischen den Gruppen zu ermöglichen. Die Grafik veranschaulicht die histologischen Schadenswerte für die drei diätetischen Ölgruppen während der DNBS-Kolitis.

Wie in den gefärbten Abschnitten h und e zu sehen ist, weist die mit Distelöl versetzte Gruppe das größte Ausmaß der Schädigung auf, gefolgt von der Gruppe der Rapsöle. Während die Fischölgruppe die geringste Schädigung aufweist, kann das Ausmaß des Infiltrats von Entzündungszellen, insbesondere von Neutrophilen, durch Durchführung eines Myeloperoxidase-Aktivitätsassays weiter untersucht werden. Wie von den histologischen Schadenswerten zu erwarten.

Die Bewertung der Myeloperoxidase-Aktivität in Rattendickdarm am fünften Tag nach der DNBS-Exposition zeigt eine Zunahme der Aktivität in allen drei Gruppen mit der größten Myeloperoxidase-Aktivität, die in der Distelölgruppe beobachtet wurde, gefolgt von der Rapsölgruppe und der Fischölgruppe. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, Mäuse leicht zu betäuben und die DNBS-Dosen nach ihrer Entwicklung zu optimieren. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der entzündlichen Darmerkrankungen den Weg, um Mechanismen zur Kontrolle von Darmentzündungen in Tiermodellen für CED zu erforschen.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit DNBS extrem gefährlich sein kann, daher sollten bei der Zubereitung der Lösung immer Vorsichtsmaßnahmen wie Schutzkleidung, Handschuhe, Schutzbrille und Gesichtsbekleidung getragen werden.