Verwenden von Label-freien optischen Biosensoren zur Modulation von Kaliumkanälen durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren erkennen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Modulation von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren durch Kaliumkanäle nachzuweisen, wobei markierungsfreie optische Biosensoren mit Resonanzwellenlängen-Grading verwendet werden, um dies zu erreichen. Unveränderte HEK 293-Zellen und HEK 293-Zellen, die stabil den ratenativ durch Natrium aktivierten Kaliumkanal Slack B exprimieren, werden in eine 384-Well-Optik-Biosensorplatte eingesetzt und über Nacht inkubiert. Anschließend wird eine Basislinienmessung der Masse in der Nähe der Plasmamembran durchgeführt, und Agonisten endogener G-Protein-gekoppelter Rezeptoren oder GPCR werden zugegeben. Im letzten Schritt wird die Signaländerung infolge der GPCR-Aktivierung gemessen und die Modulation dieser Antwort durch den Kaliumkanal berechnet.

Abschließend kann diese Methode dabei helfen, zentrale Fragen in den Bereichen Neurowissenschaften und zelluläre Signalübertragung zu beantworten, indem sie Signalmechanismen zwischen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren und Kaliumkanälen quantitativ misst. Die Hauptvorteile dieser Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden zur Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Kanälen und Proteinen, beispielsweise Co-Immunpräzipitationsassays, bestehen darin, dass der Assay an lebenden Zellen durchgeführt werden kann. Er erfordert nicht die Verwendung exogener Markierungen, die die Struktur des wechselwirkenden Proteins verändern könnten.

Und schließlich können Sie innerhalb lebender Zellen die Wechselwirkungen in Echtzeit verfolgen. Obwohl diese Methode Einblicke in die Signalübertragung zwischen GPCRs und Kaliumkanälen ermöglichen kann, lässt sie sich auch zur Untersuchung zellulärer Reaktionen nutzen, die sich aus ligandeninduzierten Veränderungen der Zelladhäsion und -ausbreitung, Toxizität, Proliferation, Migration sowie aus jeglichen Änderungen der Nähe der Plasmamembran zum optischen Biosensor ergeben.

Die Technik hat außerdem das Potenzial, bei der Entdeckung neuer therapeutischer Ansätze für Krankheiten, die durch Ionenkanal- oder Rezeptorabnormalitäten verursacht werden – wie beispielsweise viele Kanalopathien – eingesetzt zu werden, da sie als Hochdurchsatzmethode zur Untersuchung der Wirkungen pharmakologischer Wirkstoffe auf Kanalproteine genutzt werden kann. Proteinwechselwirkungen. Uns kam die Idee, diese Methode anzuwenden, als wir erkannten, dass es notwendig war, einen Assay zu entwickeln, der Kanalproteinwechselwirkungen in lebenden Zellen untersuchen kann.

Beginnen Sie mit der Beschichtung der 384er-Well-Optik-Biosensorplatte, indem Sie die Titandioxidplatte 15 Minuten lang mit jeweils 20 Mikrolitern steriler, zellkulturgeeigneter Wasser pro Vertiefung benetzen. Anschließend waschen Sie die Platte einmalig mit jeweils 50 Mikrolitern Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung oder PBS pro Vertiefung unter Verwendung eines 16-Kanal-Pipettiersystems.

Fügen Sie anschließend 20 µL einer hergestellten Fibronectin-Arbeitslösung in jede Vertiefung ein, bevor Sie zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubieren, um nach der Inkubation die extrazelluläre Matrix oder ECM zu bilden. Spülen Sie die Platte einmal mit jeweils 50 µL PBS pro Vertiefung und geben Sie danach 40 µL einer hergestellten Ovalbumin-Arbeitslösung in jede Vertiefung.

Die Platte über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren, um die Platte nach der Bindung von Ovalbumin zu blockieren. Die Platte dreimal mit je 50 Mikrolitern PBS pro Mulde waschen. ECM-beschichtete Platten können bis zu vier acht Stunden bei vier Grad Celsius gelagert werden.

Entfernen Sie das Wachstumsmedium sowohl von nicht resezierten HEK 293-Zellen als auch von HEK 293-Zellen, die stabil Slack B exprimieren und wie im Textprotokoll beschrieben kultiviert wurden. Geben Sie dann Trypsin hinzu, um die Zellen von der Platte zu lösen. Sammeln Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 1000 × g für eine Minute.

Entfernen Sie das Trypsin-Medium und resuspendieren Sie die Zellen in Wachstumsmedium. Bestimmen Sie mithilfe eines Hämozytometers oder eines automatischen Zellzählgeräts die Zellkonzentration, um die Effekte der Verdunstung während der Inkubation zu minimieren, und verdünnen Sie die Zellen, um die gewünschte Anzahl Zellen pro Vertiefung zu erreichen. Verwenden Sie für diese Experimente ein Volumen von 50 Mikrolitern Wachstumsmedium mit 1000 Zellen pro Vertiefung.

Wurden auf den Biosensor pipettiert, nachdem 50 Mikroliter der verdünnten Zellen in jedes Wells gegeben wurden; die angesiedelten Zellen über Nacht in Wachstumsmedium bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 inkubieren lassen. Um den Resonanzwellenlängen-Gradierungs- (RWG-) optischen Biosensor-Assay vorzubereiten, das Wachstumsmedium von den Zellen nach der Inkubation entfernen.

Waschen Sie die Zellen einmal mit Hank’s abgepuffertem Salzlösung und geben Sie anschließend 25 Mikroliter der Lösung zu jeder Probe hinzu. Stellen Sie die Biosensorplatte auf den Bind-Scanner und lassen Sie die Zellen eine bis zwei Stunden lang auf Raumtemperatur equilibrieren. Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine separate Verbindungsplatte vor, aus der während des Assays die gewünschten Liganden zur Biosensorplatte hinzugefügt werden.

Für diese Assays wurden 25 Mikroliter Lösung, die die Verbindung enthielt, zu jedem Brunnen der Biosensorplatte hinzugefügt, sodass sich ein Gesamtvolumen von 50 Mikrolitern ergab. Um den RWG-optischen Biosensor-Assay durchzuführen, nehmen Sie mit dem Scannersystem eine Basislinienmessung der Brunnen A1 bis P12 vor, die die Hälfte der 384-Brunnen-Platte darstellen. Verwenden Sie eine maximale Auflösung von 3,75 Mikrometern pro Pixel für die zentralen 1,5 Millimeter jedes Brunnens mithilfe der Bind-Scan-Software; dieser Basislinien-Scan dauert ungefähr 30 Minuten.

Fügen Sie dann 25 µL der Verbindungslösungen in jede Vertiefung für die Vertiefungen A1 bis P12 hinzu. Nehmen Sie anschließend eine Basislinienmessung der Vertiefungen A13 bis P24 vor. Nach der Basislinienmessung dieser Vertiefungen fügen Sie 25 µL der Verbindungslösungen in jede der Vertiefungen A13 bis P24 hinzu.

Als letzten Schritt nehmen Sie eine Messung nach der Zusatzstoffzugabe für die Vertiefungen A1 bis P12 vor und wiederholen Sie dies für die Vertiefungen A13 bis P24. Um die Assaydaten zu analysieren, öffnen Sie die Bindungs-Assay-Daten für die Basislinienmessung in Windows und klicken Sie auf die Schaltfläche „Raster-Editor“, um die Zellselektion zu aktivieren. Die Software berechnet vom Benutzer definierte Kenngrößen; öffnen Sie dazu die Plugins, darunter den Zellfinder, und legen Sie die Parameter für Basislinie oder Funktion im Zellfinder so fest, dass die Zellen vom Hintergrund des Biosensors unterscheidbar sind.

Exportieren Sie die Zellenkarten-Datei, die die Zellenfinder-Daten für die Basislinienmessung enthält. Wiederholen Sie diese Schritte für die Daten nach der Zugabe der Substanz. Öffnen Sie anschließend die Basislinien- oder Plugin-Software und importieren Sie die Zellenkarte aus der Basislinienmessung.

Die Software berechnet die Verschiebung des Spitzenwellenlängenwerts oder PWV zwischen Hintergrund- und Nach-Verbindung-Daten. Wählen Sie „delta cell mean“, um die mittlere Verschiebung des PWV für Zellen auszugeben. Die Daten können anschließend in Microsoft Excel exportiert werden, um weitere Analysen durchzuführen.

Slack b stabil transfiziert, HEK 2 93. Zellen und Kontroll-unkorrigierte HEK 2 93-Zellen wurden mit 1000 Zellen pro Vertiefung in 384-Vertiefungs-Platten mit ECM-beschichteten RWG-Biosensoren ausgesät, Dichtegradientenkarten der Masse wurden vor und 30 Minuten nach Zugabe der Verbindung mit dem Bind-Scan erstellt.

Die in Rot dargestellten Softwarebereiche repräsentieren Pixel, die als Zellen identifiziert wurden, und gelbe Linien, die die Zellen vom grauen Plattenhintergrund abgrenzen. Die Bind-View-Software wurde verwendet, um die Verschiebung der PWV nach Zugabe eines GPCR-Agonisten zu bestimmen, indem die PWV nach der Substanzzugabe von der Ausgangs-PWV subtrahiert wurde. Dies wird durch einen Farbverlauf veranschaulicht, wobei Rot eine positive Verschiebung des Spitzenwellenlängenwerts und Blau keine Veränderung darstellt.

Der endogene M1-muskarinerge Rezeptor gegenüber Carbachol wurde sowohl auf nichtresektierte Kontrollzellen vom Typ HEK 293 als auch auf HEK 293-Zellen, die stabil Slack B exprimieren, angewendet und führte im Vergleich zu den Kontrollzellen zu einer positiven Zunahme des Spitzenwellenlängenwerts. Die mit Slack B transfizierten Zellen wiesen eine stärkere Zunahme des Spitzenwellenlängenwerts auf. S-F-L-L-R-NH₂, Trifluoracetatsalz, und das terminale Thrombinrezeptor-aktivierende Pentapeptid, das agonistische Aktivität gegenüber dem endogenen GPCR-Protease-aktivierten Rezeptor 1 zeigt, zeigten ebenfalls unterschiedliche Reaktionen in nichtresektierten und Slack-B-transfizierten Zellen.

Diese Ergebnisse zeigen, dass das Vorhandensein des Slack-B-Kanals die Verschiebung der PWV, die bei der Aktivierung endogener G-PCR in den K-Zellen auftritt, signifikant erhöht, und belegen die Durchführbarkeit dieser Methode zur Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen Kanalproteinen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man einen markierungsfreien optischen Biosensor-Assay entwickelt und durchführt. Sobald die Technik beherrscht ist, kann sie innerhalb von zwei Tagen durchgeführt werden, sofern die Zellen und Reagenzien sorgfältig vorbereitet wurden, während Sie diesen Vorgang durchführen.

Es ist wichtig zu beachten, dass Assay-Parameter wie die Anzahl der zu säenden Zellen, die Inkubationszeit der Liganden usw. für verschiedene Zelllinien optimiert werden müssen. Nachdem Sie dieses Verfahren durchgeführt haben, können Sie andere Methoden wie R und KI verwenden, um herauszufinden, welche spezifischen Proteine für die beobachtete Signaländerung erforderlich sind. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit menschlichen Zellkulturen äußerst gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie die Arbeit in einer Biosicherheitshaube sollten stets getroffen werden, wenn dieses Verfahren durchgeführt wird.