Harmonic Nanopartikel für Regenerative Forschung

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht in der In-vitro-Überwachung von aus humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten schlagenden Herzzellaggregaten in 3D, in Echtzeit und mit hoher räumlicher Auflösung. Dies wird erreicht, indem zunächst embryonale Stammzellen kultiviert und expandiert werden, bis sie Embryoidkörper bilden. Anschließend werden die schlagenden Aggregate isoliert und auf porösen POLYTETRAFLUOROETHYLEN- oder PTFE-Filtern platziert, wodurch eine langfristige Kultur an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche ermöglicht wird.

Flüssigkulturen mit schlagenden Zellaggregaten werden anschließend mit harmonischen Nanopartikeln markiert, um eine Echtzeit-Mehrphotonenmikroskopie durchzuführen. Die erhaltenen Ergebnisse ermöglichen die Analyse der räumlichen Dehnung und Frequenz von Herzkontraktionen auf mikroskopischer Ebene. Der Hauptvorteil dieser Nanopartikel liegt also darin, dass man jede Wellenlänge nutzen kann, insbesondere Infrarot, wodurch eine tiefere Gewebepenetration möglich ist, und zudem sind sie über längere Zeit sehr stabil.

So können wir unsere langen Prozesse über Zeiträume hinweg überwachen. Diese Stammzellkultur-Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der funktionellen Kontraktion von Kardiomyozyten in drei Dimensionen zu beantworten. Insbesondere zur Herzmuskelreifung und Gewebeengineering.

Personen, die neue Krankheitsmethoden anwenden, sollten beachten, dass das Markierungsverfahren mit harmonischen Nanopartikeln ausschließlich für die Multiphotonen-Mikroskopie geeignet ist und nicht auf andere Arten von Bildgebungssystemen übertragen werden kann. Wir hatten 2005 erstmals die Idee, harmonische Nanopartikel zu verwenden. Diese Nanopartikel weisen Vorteile gegenüber fluoreszenten Farbstoffen und Quantenpunkten auf.

Tatsächlich verlieren ihre Signale im Laufe der Zeit nicht an Intensität, und sie können zur Überwachung sich entwickelnder Proben über längere Zeiträume verwendet werden. Die visuelle Darstellung der Probenvorbereitung ist entscheidend für die Effizienz und Reproduzierbarkeit der einzelnen Schritte, insbesondere bei der Durchführung von Arzneimitteltests, und könnte ebenfalls auf verschiedene Gewebe oder Krankheiten angewendet werden. Gewebemodellierung.

Nach der Kultivierung und Ausdehnung menschlicher embryonaler Stammzellen oder ESCs gemäß dem Textprotokoll und der Inkubation mit warmer Kollagenase viermal für jeweils 10 Minuten sammeln Sie die Kolonie-Fragmente in zwei Millilitern frischem Differenzierungsmedium oder DM und zentrifugieren bei 115 × g für drei Minuten. Kultivieren Sie die Kolonie-Fragmente vier Tage lang im Suspensionskulturverfahren in Ultra-Low-Attachment-Platten mit sechs Vertiefungen, um die Bildung von Embryoidkörpern oder EBs zu ermöglichen.

Dann die neu gebildeten EBS auf mit 0,1 % Gelatine beschichteten 24-Loch-Platten 15 bis 30 Tage lang inkubieren, bis schlagende Zellverbände erscheinen. Die PBS entfernen und mit Acutase die Kolonien nach einer Zentrifugation und Resuspension in Einzelzellen aufspalten, wobei die Zellen in DM-Medium resuspendiert und je Agar zwei Milliliter pro Kammerplatte verwendet werden. Einen Tag bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Sammeln Sie die neu gebildeten EBS und platzieren Sie jeweils drei pro Bohrung in 24-Loch-Platten mit 0,1 % Gelatine-Beschichtung nach zwei bis vier Wochen Kultur. Identifizieren Sie Ansammlungen schlagender Kardiomyozyten und dissezieren Sie diese manuell mit einer langgestreckten, scharf abgeschnittenen Pasteurpipette. Geben Sie vier PTFE-Filter pro Insert ein und stellen Sie jedes in eine Bohrung einer 6-Loch-Platte.

Nachdem je ein Milliliter DM hinzugefügt wurde, einen isolierten pulsierenden Cluster auf jeden PTFE-Filter gegeben. Um die Cluster zu markieren, überführen Sie die PTFE-Filter mit den pulsierenden Clustern in eine 3,5 cm Glasbodenkammer. Geben Sie einen Milliliter Second-Harmonic-Generation-Nanopartikel mit einer Konzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, um die nichtlineare optische Bildgebung durchzuführen.

Nachdem markierte HEBs oder schlagende Herzkardiomyozyten-Cluster in eine Bildgebungskammer überführt wurden, verwenden Sie die Weitfeldbildgebung unter Weißlichtbeleuchtung, um die Strukturen von Interesse innerhalb differenzierter EBS oder aktiver schlagender Cluster zu identifizieren. Führen Sie einen schnellen, niedrig aufgelösten dreidimensionalen Scan durch, um die Gesamtmorphologie des kardialen Clusters zu rekonstruieren, und wählen Sie eine Bildebene innerhalb des Cluster-Volumens mit mehreren sichtbaren Nanopartikeln der zweiten harmonischen Generation aus, um diese in Echtzeit zu überwachen. Die Kontraktionen des kardialen Clusters setzen den optischen Scanner des Mikroskops in den schnellsten Modus, wodurch die Akquisition zweidimensionaler Bilder mit mehreren Hertz ermöglicht wird.

Analysieren Sie die Bilder mithilfe der MATLAB-Software gemäß dem schriftlichen Protokoll, wie hier dargestellt, bevor Sie die Schlagaktivität bewerten. Die Charakterisierung der nichtlinearen optischen Antwort der PTFE-Filter wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Photonenfluoreszenz des bloßen Substrats sehr schwach ist und nicht die Messung der relevanten biologischen Proben sowie der Emission von Isolaten stört. Die zweite Harmonische erzeugende Nanopartikel können leicht durch Abbildung durch das Substrat im Epi-Erkennungsmodus erfasst werden.

In dieser Abbildung sind mit Second-Harmonic-Generierung-Nanopartikeln markierte Herdstrukturen und EBS als Klinge dargestellt. Die roten, gelben und grünen Farben entsprechen der NADH-Autofluoreszenz, während die intensiven blauen Second-Harmonic-Signale von isolierten Second-Harmonic-Generierung-Nanopartikeln stammen. Beachten Sie den guten optischen Kontrast und die vergleichsweise spärliche Markierung im Vergleich zu Quantenpunkten oder Upconversion-Nanopartikeln.

Diese Abbildung zeigt eine Schnittansicht eines mit Second-Harmonic-Generation-Nanopartikeln markierten pulsierenden Herzzellverbunds. Wie in diesem Film gezeigt, werden die 3D-Strukturen mit hoher Geschwindigkeit aufgezeichnet, um den Kontraktionsverlauf in der zweiten Zelle zu verfolgen. Die Harmonische-Generation-Nanopartikel aggregieren, um eine hohe Aufnahmegeschwindigkeit aufrechtzuerhalten und die NP-Bewegung aufzulösen.

Die allgemeine Erfassungsempfindlichkeit war nicht ausreichend, um die Autofluoreszenz der Zelle mit der Emission der zweiten Harmonischen aus der Erzeugung der zweiten Harmonischen aufzuzeichnen. Die Bildanalyse von Nanopartikeln, die an Filmsequenzen durchgeführt wurde, zeigt, dass innerhalb desselben Herzzellverbunds die Verschiebungen in der Größenordnung weniger Mikrometer liegen und die Frequenz für die Bewegung der Nanopartikel in und aus der Ebene der zweiten Harmonischen konstant ist. Wenn man die Zellpräparationstechnik beherrscht, können die Dissektion des bevorzugten Zellverbunds, die Luft-Flüssig-Kultur und das Abtrennen innerhalb von 24 bis 36 Stunden durchgeführt werden, sofern dies ordnungsgemäß erfolgt.

Vor allem bei dieser Technik müssen offene Luftkontakte vermieden werden, um Kontaminationen zu verhindern. Mit dieser Vorgehensweise können weitere Methoden angewandt werden, wie beispielsweise elektrophysiologische Ableitungen mittels Mehrfachelektrodenarrays, um zusätzliche Fragen zu beantworten, etwa die Korrelation von Aktionspotentialprofilen mit der Schlagfrequenz in drei Dimensionen. Unsere neuartige Technik, die auf der Detektion des nichtlinearen Signals durch harmonische Nanopartikel basiert, kann für in-vivo-Studien weiterentwickelt werden, da die zur Bildgebung verwendeten Wellenlängen eine tiefere Penetration in Gewebe ermöglichen.

Eine mögliche Entwicklung könnte darin bestehen, die Integration aus Stammzellen abgeleiteter Strukturen für Anwendungen in der regenerativen Medizin zu verfolgen.