Name: Harmonic Nanopartikel für Regenerative Forschung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-01T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: Erfahren Sie die Markierung humaner embryonaler Stammzellen mit harmonischen Nanopartikeln für die Echtzeit-Mehrphotonenmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung kardialer Kontraktionen in 3D.

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Die Autoren möchten die teilweise Finanzierung aus dem Europäischen FP7 Forschungsprojekt NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) und dem INTERREG IV-France Schweiz NAOMI Projekt bestätigen.

1., Kultur und Erweiterung des menschlichen ESC <ol><li> Vorbereitung der Zellausbreitungsmedium (PM genannt), die Knockout DMEM, ergänzt mit 20% Knockout Serum, 1% MEM nicht-essentielle Aminosäuren, 1% L-Glutamin 200 mM, 1% Penicillin-Streptomycin und 3,5 ul β-Mercaptoethanol. </li><li> Auftauen menschlichen ESC (hES) in 8 ml PM-Medium und zentrifugieren 5 min bei 115 x g DMSO-Gefriermedium ergänzt verwerfen. </li><li> 1 ml der PM-Medium mit 10 mM Rock-Hemmstoff, um Apoptose zu verhindern und das Überleben der Zellen zu verbessern, auf dem Auftauen (nur 24 Stunden Inkubation). </li><li> Hinzufügen basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) mit dem PM in der gewünschten Konzentration (4-10 ng / ml) für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz. </li><li> Plate Die HES an bestrahlten menschlichen Vorhaut-Feeder-Zellen (γHFF) (Fig. 1A), die zuvor in einer Konzentration von 2 x 10 4 Zellen / cm 2 ausplattiert. </li><li> Medium täglich ändern und, falls erforderlich, Teile von c zu entfernenolonies beginnen zu differenzieren durch Aspiration mit einer länglichen scharf geschnittenen Pasteur Pipette. </li><li> Einmal in der Woche, Passage Kolonien enzymatisch: <ol><li> Medium entfernen und waschen Kolonien mit 2 ml PBS. </li><li> Entfernen PBS und inkubiert sie mit 0,5 ml pro Vertiefung von warmem Kollagenase IV auf 1 mg / ml für 10 min bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Sammeln Kolonie Fragmente in 2 ml neue PM und Zentrifuge bei 115 g für 3 min. </li></ol></li><li> Alternativ können Kolonien mechanisch durch Abkratzen agiert werden: <ol><li> Medium entfernen und waschen Kolonien mit 2 ml PBS. </li><li> Manuelles kratzen Kolonien mit der StemPro EZPassage Rollenschälgerät (Abbildung 1B). </li><li> Kolonie-Fragmente zu sammeln und zu zentrifugieren dann 3 min bei 115 · g, um den Überstand zu entfernen. </li><li> Plattenfragmente auf γHFF oder verarbeiten sie zur Differenzierung in Embryoidkörpern (EVG). </li></ol></li></ol> 2. Menschen ESC DifferenzierungProtokoll <ol><li> Bereiten Sie das Differenzierungsmedium (DM) mit Knockout DMEM mit 2% Hyclone Serum, 1,0% MEM Non-Essential Amino Acids, 1,0% L-Glutamin 200 mM, 1% Penicillin-Streptomycin, 3,5 ul β-Mercaptoethanol. </li><li> Medium entfernen und waschen Kolonien mit 2 ml PBS. </li><li> EB Bildung der Kolonie Fragmente in Suspension: <ol><li> Entfernen PBS und inkubiert sie mit 0,5 ml pro Vertiefung von warmem Kollagenase IV auf 1 mg / ml für 10 min bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Sammeln Kolonie Fragmente in 2 ml neuen DM und Zentrifuge bei 115 g für 3 min. </li><li> Kultur sie in Suspension in Ultra-Low-Befestigung 6-Well-Platten (2 ml pro Well) für 4 Tage (Abbildung 1C). </li><li> Sammeln und Platte die neu gebildeten EBs auf 0,1% Gelatine beschichtete 24-Well-Platten (ca. 3 EVG / well) (Abbildung 1D). </li></ol></li><li> Alternativ gezwungen Aggregation von Einzelzellen in EVG mit der Aggrewell Platte: <ol><li> PBS und entfernendistanzieren Kolonien in einzelne Zellen mit Accutase (0,5 ml / Vertiefung). </li><li> Zentrifuge und resuspendieren Zellen in DM auf 1,2 x 10 6 / ml. </li><li> 2 ml pro Aggrewell Kammer für 1 Tag (Abbildung 1B). </li><li> Sammeln neugebildeten EBs (Fig. 1C) und der Platte sie auf 0,1% Gelatine beschichteten 24-well-Platten (etwa 3 EBs / Vertiefung). </li><li> Ändern DM alle 2-3 Tage bis zum Erscheinen des Schlagens Cluster von Kardiomyozyten (15-30 Tage). </li></ol></li></ol> 3. Klima flüssigen 3D-Kulturen von Beating Cluster und Markierung mit HNPs <ol><li> Identifizieren und manuell sezieren Cluster schlagen Kardiomyozyten (1D), in der Regel nach 2-4 Wochen der Kultur erscheinen, mit einem länglichen scharf geschnittenen Pasteur Pipette. </li><li> Kaution 4 PTFE-Filter pro Einsatz, der auf einem 6-Well-Platte (Abb. 1F) gestellt werden. </li><li> 1 ml der DM Medium auf der Oberseite des each gut. </li><li> In einem seziert schlagen Cluster auf jedem PTFE-Filter (1E), maximale 4/well, dh 24 Aggregaten pro Platte (1F). </li><li> Ändern DM Medium alle 2-3 Tage. </li><li> Um die Cluster zu markieren, entfernen Sie die PTFE-Filter, der die Prügel-Cluster und legte es auf 3,5 cm Glasbodenschale (170 um dick). </li><li> 1 ml HNP in einer Konzentration von 50 ug / ml für 30 min. </li></ol> 4. Nichtlinearen optischen Imaging <ol><li> Probenvorbereitung. Nach HNP-Kennzeichnung (siehe Schritt 3.6), Transfer entweder ganz früh differenzier HeBS oder Herz-Schlagen-Cluster (bei Kontraktion Aussehen seziert) auf PTFE-Filter über einen 170 um dicke Glasbodenschale mit der Arbeitsabstand von hoher numerischer Apertur Zielen vereinbar. Alternativ tragen Sie eine Direktbeschichtung gegen Cluster auf die Glasbodenschale mit 0,1% Gelatine vor, beschichtet. </li><li> Über Proben einall-in-one-Mikroskop mit Inkubationskammer eine stabile Temperatur, Feuchtigkeit und CO 2-Regelung über längere Zeit ausgestattet. </li><li> Nach der ersten Inspektion, Bild der Probe über Weitfeld-Bildgebung unter Beleuchtung mit weißem Licht, um Strukturen von Interesse innerhalb differenzierten EBs oder aktive Schlagen Cluster, die für weitere Untersuchungen ausgewählt werden identifizieren. </li><li> Wenn die Zelle Autofluoreszenz von NADH und SH aus HNPs gleichzeitig erworben werden müssen, eine kürzere Laser-Anregungswellenlänge (zB 720 nm), um die molekulare Absorption entsprechen. Verwenden einen schmalen Bandpassfilter bei spektralen halben Anregungswellenlänge zentriert ist (dh λ = 360 ± 10 nm) bis SH erfassen, und eine weitere, um Autofluoreszenz zu detektieren. </li><li> Erstens eine schnelle, niedrige Auflösung, dreidimensionale Scan, um die Gesamt Morphologie des Herzcluster erneut, und wählen Sie eine Bildebene innerhalb der Cluster-Volume mit mehreren sichtbaren HNP durchführens. </li><li> Wenn nötig, ändern Sie die Anregungswellenlänge frei optischen Eigenschaften der Probe am besten entsprechen oder Photobleaching, Foto-Schäden und Bild tiefer in Gewebe mit einem IR-Wellenlänge (dh 790 nm) zu vermeiden und die zweite Harmonische Filter ersetzen entsprechend (dh 395 nm ). Optimierung der Einstellungen des Laserimpulses Vorverdichter bei der Arbeitswellenlänge der Wahl durch die Maximierung der zweiten harmonischen Signal der HNPs auf die Probe aufgebracht. </li><li> Um in Echtzeit überwachen die Herzkontraktionen Cluster, stellen Sie das Mikroskop optischen Scanner im schnellsten Modus wie Resonanzmodus, so dass mit hoher Geschwindigkeit Erwerb von zweidimensionalen Bildern. </li><li> Wählen Sie die Einstellungen als beste Kompromiss zwischen Bildkontrast und die Erfassungsgeschwindigkeit, wie etwa: <ul type="disc"><li> Scan Mittelung: 4 </li><li> Pixelverweilzeit: 0,1 Mikrosekunden </li><li> Bildrate: 3,75 Bilder pro Sekunde (fps) </li></ul></li><li> Laserleistung wird nach Brennfleck s eingestelltize-und Scan-Geschwindigkeit. 50 mW (gemessen am Eingang des Objektivs) ist ein typischer Wert für 0,1 us Pixelverweilzeit und Plan APO 20x NA 0,75 Ziel die Erhaltung der Lebensfähigkeit der Zellen. </li></ol> 5. Bildanalyse <ol><li> Axial-Kalibrierung. Wählen Sie ein einzelnes HNP auf einer blanken Substrat abgeschieden. Die Scharfeinstellung (dh der axialen Position des Nanopartikels) zur Maximierung der Intensität SH. Variieren, in einer kontrollierten Art und Weise die axiale Position des Mikroskoptisches, um die Kalibrierungskurve, die SH-Intensität als Funktion der HNP erhalten von der Fokalebene versetzt sind. Der Ausgang dieses Kalibrierungsverfahren für den Plan APO 20X 0,75 NA Objektiv in 4C angegeben. </li><li> Wählen Sie in allen Video-Frames vorhanden HNPs und bestimmen deren periodische Bewegungen. Dieses Verfahren kann leicht automatisiert werden, zum Beispiel durch einen eigenen Code auf der Suche nach maximaler Intensität Signal-Spots in einem definierten Bereich von Interesse undunter verschiedenen Rahmen verbindet sie (ein Beispiel-Code in Matlab R2009 b mit Hilfe der Funktion &quot;Region Requisiten&quot; der Image Processing Toolbox geschrieben wird vorgelegt). </li><li> Bewerten Sie die Quantifizierung der Out-of-Plane-Verschiebungen, mit nicht-kontinuierlich nachvollziehbar HNPs sich entlang der optischen Achse, durch die Umwandlung ihrer Intensität Modulationen in ganz verschiedenen Rahmen in axiale Verschiebung anhand der Eichkurve in Schritt 5.1 fest verbunden. Beachten Sie, dass diese Prozedur ermöglicht den Zugriff auf axiale Bewegungen, aber nicht verwendet werden, um die absolute Richtung (nach oben oder unten) zu bestimmen. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Anwendung der Nanotechnologie zur Stammzellforschung ist ein relativ neues, aber rasch wachsenden Bereich. Wie durch verschiedene Übersichtsartikel zu diesem Thema erwähnt, kann die Verwendung von Nanopartikeln verwendet werden, um verschiedene Aufgaben zu erfüllen Forschung, die von Zellverfolgung (sowohl in vitro als auch in vivo), um die intrazelluläre Abgabe von Proteinen und Genen, nicht zuletzt die Schaffung biomimetische zellulären Umgebungen für Vorzugs Stimulation / Hemmung der spezifischen Differe...

Lineare Mikroskopiesysteme, die dank ihrer inhärenten dreidimensionalen Schneidefunktionen ausgelöst zunehmend die Nachfrage nach fotostabilen Fluorophore mit Zwei-Photonen-Absorptionsbanden im nahen Infrarot. Nur in den letzten paar Jahren, um die Entwicklung der Fluoreszenz-basierten Etiketten (Farbstoffe, Quantenpunkte Up-Converting-Nanopartikel), eine unterschiedliche bildgebende Methode ist die Verwendung einer neuen Familie von Natur aus nicht-linearen Nanopartikel als Etiketten zu nutzen, dh ergänzen Harmonische Nanopartikel (HNPs), die speziell für Multiphotonenmikroskopie entwickelt wurden. Diese Etiketten, basierend auf nicht-zentrosymmetrischen anorganischen Kristallen, ausüben optischen Kontrast Erzeugen des SH der Anregungsfrequenz: z. B. durch Umsetzen einer Fraktion von Nahinfrarot-Pulsanregungslicht (λ = 800 nm) in sichtbares blaues Licht (λ / 2 = 400 nm) . Mehrere Autoren in der jüngsten Vergangenheit haben verschiedene Materialien getestet, darunter Eisen Fe Jodat (IO <sub&gt; 3) 3 1, Kaliumniobat (KNbO 3) 2, Lithiumniobat (LiNbO 3) 3, Barium-Titanat (BaTiO 3) 4,5-, Kalium-Titanyl-Phosphat (KTiOPO &amp;sub4;, KTP) 6-8, und Zinkoxid (ZnO ) 5,9,10. Verglichen mit Fluoreszenzsonden, HNPs besitzen eine Reihe von attraktiven Eigenschaften, wie vollständiger Abwesenheit von Bleichen und blinkt, schmalen Emissionsbanden, Anregungswellenlängen-Abstimmbarkeit (von Ultraviolett bis Infrarot), Orientierung Gewinnungsfähigkeit und kohärente optische Antwort. Diese einzigartigen Eigenschaften wurden kürzlich in zwei umfassende Überprüfung Papiere 11,12 erklärt. Die Möglichkeit der Arbeit in den infraroten Spektralbereich, die Bildtiefe erhöht sich durch die Minimierung Streuung und Absorption, drastisch begrenzt Beispielfoto Abbau 13,14. Darüber hinaus ist die unendlich Foto-stabiles Signal von HNPs garantiert macht sie zu idealen Sonden für die langfristige Zellverfolgung, die ichist besonders attraktiv für die regenerative Medizin-Anwendungen 15. In diesem Experiment sichtbar gemacht werden Protokolldetails für in-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) mit nicht funktionalisierten HNPs Verfügung gestellt. Die Synthese und Herstellung von kolloidalen Suspensionen in einer früheren Veröffentlichung und die darin aufgeführten 16 und geht über den Umfang dieser Arbeit. Methoden zur Untersuchung von hESC Multi-Photonen-Mikroskopie und deren Differenzierung in Herz Cluster (als langfristige Klimaflüssigkulturen gepflegt) werden vorgestellt. Menschliche ESC lassen kann innerhalb sog. Embryoid Bodies (EBs) auf zwei verschiedenen Wegen, entweder durch EB Bildung von Kolonie-Fragmente in Suspension oder alternativ Zwangs Aggregation von einzelnen Zellen in EBs mit der Aggrewell Platte, wie in 1A dargestellt zu unterscheiden . Kultivierung schlagen Cluster von Herzzellen von Polytetrafluorethylen (PTFE), poröse Filter facilitates ihre langfristige Wartung für weitere Untersuchungen (z. B. elektrophysiologischen Messungen von Aktionspotentialen). Die Anregungsquelle des Rastermikroskops ist in der Lage, ultrakurze Pulse (mit einer Pulsdauer kleiner als 300 fs bei der Probe), um die Spitzenleistung benötigt, um zweite harmonische Bildgebung HNPs zuführen erreichen liefern. Zum Beispiel, die häufigste Quelle für fs-Bildgebung verwendet werden abstimmbaren Ti: Saphir-Laser. Alternativ können andere Ultrakurzpulslaser eingesetzt werden, beispielsweise mit Erbium-Ionen-17 Chrom Forsterit 18 oder Ti: Saphir-gepumpten optischen parametrischen Oszillatoren Infrarot. Das Mikroskop mit einem Objektiv mit vorzugsweise einem relativ hohen numerischen Apertur ausgestattet werden. Sehr wichtig ist, vor der Messung, und jedes Mal, wenn die Ziel ersetzt wird, ist es zwingend notwendig, in den Aufbau (Linsen), die die vorliegende Dispersion durch Optimieren der Einstellungen des Laserimpulses Vorverdichter an der Arbeits minimierenWellenlänge der Wahl. Dieses Verfahren, das in dem Protokoll beschrieben, stellt sicher, dass der Laserimpuls ist so nah wie möglich an der zu transformieren begrenzter Dauer (dh kürzesten wie möglich) in der Brennebene und maximiert die Probe nichtlinearen Antwort. Das Ziel des am Ende des Protokolls beschriebenen Bildanalyse ist die Identifizierung und Verfolgung in 3D HNPs Bewegungen mit den rhythmischen Kontraktionen des Herz schlagen Cluster verbunden. Tracking-Nanopartikel in der Bildebene wird einfach durch Ermittlung ihrer Positionen in aufeinanderfolgenden Filmrahmen realisiert. Informationen über eine axiale Bewegung zu extrahieren, ist eine vorherige Kalibrierung der Intensität nichtlinearen Antwort als eine Funktion der axialen Verschiebung zwingend. Beachten Sie, dass für Langzeitmessungen, eine aktive Steuerung der interferometrischen Probe axialen Position ist erforderlich, um die Gültigkeit der Kalibrierungskurve in Gegenwart von thermischen und / oder mechanischen Drifts zu halten. Die auf trac welche hier HNPse gegen Zellen innerhalb Aggregate werden auf Kaliumniobat Oxid (KNbO 3) auf, aber auch andere zur Verfügung nichtlineare Nanomaterialien sind im Detail in der Arbeit von Staedler et al 16 prüft. Die nichtlineare optische Effizienz der meisten der bisher untersuchten Nanomaterialien sind sehr vergleichbar. Die Wahl für KNbO 3 wurde im Wesentlichen durch die gute Stabilität der kolloidalen Lösung und ihre gute Biokompatibilität auf mehreren menschlichen Zelllinien auch bei ziemlich hohe Konzentration und lange Expositionszeiten 16 getestet motiviert. Angesichts der Neuartigkeit der für diese Arbeit eingesetzten Nanomaterialien werden die wichtigsten Merkmale der HNPs im Vergleich zu fluoreszierenden / lumineszierende Biomarker in einer kurzen ursprünglichen Computer-Videoanimation von den Autoren klar gezeigt.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop-Inkubator</td><td>OKO LAB</td><td>UNO Paket (obere Stufe)</td><td>37 &deg; C, 5 % CO2, mit Feuchtigkeit</td></tr> versorgtes <tr><td>Multiphotonenmikroskop</td><td>Nikon</td><td>AR1-MP</td><td></td></tr><tr><td>Schnelles Scannen, vier Descan-Detektoren</td><td></td><td></td><td></td>ohne Photomultiplier</tr><tr><td>Filter SHG und Autofluoreszenz</td><td>Semrock</td><td>FF01-360/12-25</td><td></td></tr><tr><td>FF01-395/11-25&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FF02-485/20-25</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskopobjektive</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CFI Plan Fluor 10X</td><td></td><td></td><td>NA 0,30, WD 16 mm</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo 20X</td><td></td><td></td><td>NA 0,75, WD 1,0 mm, VC</td></tr><tr><td>CFI Apo 40X</td><td></td><td></td><td>NA 1,25, WD 0,18 mm &lambda; S, Nano-Crystal Coat</td></tr><tr><td>Rhock Inhibitor&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>Y-27632</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>MEM, nicht-essentielle Aminosäuren&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>1140</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase IV&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17104-019</td><td></td></tr><tr><td>Walzenzieher-Werkzeug&nbsp;</td><td>StemPro EZPassage, Invitrogen</td><td>23181-010</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>S11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Aggrewell-System&nbsp;</td><td>StemCell Technologies</td><td>27845</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Serum&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platten&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>24-Well-Platten&nbsp;</td><td>Nunclon</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Filter aus Polytetrafluorethylen (PTFE)</td><td>Millipore</td><td>NA76/25</td><td></td></tr><tr><td>Einsätze</td><td>Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr></tbody></table>

harmonic nanopartikel für regenerative forschung

Harmonic Nanoparticles for Regenerative Research

In diesem Experiment sichtbar gemacht werden Protokolldetails für in-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) mit zweiten Harmonischen Nanopartikel (HNPs) vorgesehen ist. Letztere sind eine neue Gruppe von Sonden kürzlich zur Markierung von biologischen Proben für Mehrphotonenabbildungs ​​eingeführt. HNPs der Lage sind, eine Verdoppelung der Frequenz der Anregungslicht durch die nichtlinearen optischen Prozeß der Erzeugung der zweiten Harmonischen, ohne Beschränkung auf die Anregungswellenlänge. Multi-Photonen-basierte Methoden für die hESC Differenzierung in Herz Cluster (als langfristige Klimaflüssigkulturen gepflegt) werden im Detail vorgestellt. Insbesondere ist Beweis, wie die intensive zweiten Harmonischen (SH) Emission von isolierten HNPs während der 3D-Überwachung von Herzgewebe zu schlagen in 3D gezeigt maximieren. Die Analyse der entstandenen Bilder, 3D-Verschiebungsmuster abzurufen ist auch beschrieben.

Vor der Bewertung der Schlagaktivität durch konfokale Bildgebung wurde eine sorgfältige Charakterisierung der nichtlinearen optischen Antwort der PTFE-Filter durchgeführt wird, entweder allein oder in Gegenwart von HNPs bei hoher Konzentration (1 mg / ml). Es wurde sichergestellt, dass: i) die blanke Substrat Zwei-Photonen-angeregten Fluoreszenz ist sehr schwach und kann nicht die Messung der relevanten biologischen Proben zu verhindern, und ii) das SH-Emission aus isolierten HNPs kann leicht durch Abbilden durch das Su...

Protokolldaten werden für in vitro-Markierung humaner embryonaler Stammzellen, die mit der zweiten Harmonischen erzeugenden Nanopartikeln bereitgestellt. Methoden zur Untersuchung von hESC Multi-Photonen-Mikroskopie und deren Differenzierung in Herz Cluster werden ebenfalls vorgestellt.

Harmonic Nanopartikel für Regenerative Forschung

In this visualized experiment, protocol details are provided for in vitro labeling of human embryonic stem cells (hESC) with second harmonic generation ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht in der In-vitro-Überwachung von aus humanen embryonalen Stammzellen abgeleiteten schlagenden Herzzellaggregaten in 3D, in Echtzeit und mit hoher räumlicher Auflösung. Dies wird erreicht, indem zunächst embryonale Stammzellen kultiviert und expandiert werden, bis sie Embryoidkörper bilden. Anschließend werden die schlagenden Aggregate isoliert und auf porösen POLYTETRAFLUOROETHYLEN- oder PTFE-Filtern platziert, wodurch eine langfristige Kultur an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche ermöglicht wird.Flüssigkulturen mit schlagenden Zellaggregaten werden anschließend mit harmonischen Nanopartikeln markiert, um eine Echtzeit-Mehrphotonenmikroskopie durchzuführen. Die erhaltenen Ergebnisse ermöglichen die Analyse der räumlichen Dehnung und Frequenz von Herzkontraktionen auf mikroskopischer Ebene. Der Hauptvorteil dieser Nanopartikel liegt also darin, dass man jede Wellenlänge nutzen kann, insbesondere Infrarot, wodurch eine tiefere Gewebepenetration möglich ist, und zudem sind sie über längere Zeit sehr stabil.So können wir unsere langen Prozesse über Zeiträume hinweg überwachen. Diese Stammzellkultur-Methode kann dabei helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der funktionellen Kontraktion von Kardiomyozyten in drei Dimensionen zu beantworten. Insbesondere zur Herzmuskelreifung und Gewebeengineering.Personen, die neue Krankheitsmethoden anwenden, sollten beachten, dass das Markierungsverfahren mit harmonischen Nanopartikeln ausschließlich für die Multiphotonen-Mikroskopie geeignet ist und nicht auf andere Arten von Bildgebungssystemen übertragen werden kann. Wir hatten 2005 erstmals die Idee, harmonische Nanopartikel zu verwenden. Diese Nanopartikel weisen Vorteile gegenüber fluoreszenten Farbstoffen und Quantenpunkten auf.Tatsächlich verlieren ihre Signale im Laufe der Zeit nicht an Intensität, und sie können zur Überwachung sich entwickelnder Proben über längere Zeiträume verwendet werden. Die visuelle Darstellung der Probenvorbereitung ist entscheidend für die Effizienz und Reproduzierbarkeit der einzelnen Schritte, insbesondere bei der Durchführung von Arzneimitteltests, und könnte ebenfalls auf verschiedene Gewebe oder Krankheiten angewendet werden. Gewebemodellierung.Nach der Kultivierung und Ausdehnung menschlicher embryonaler Stammzellen oder ESCs gemäß dem Textprotokoll und der Inkubation mit warmer Kollagenase viermal für jeweils 10 Minuten sammeln Sie die Kolonie-Fragmente in zwei Millilitern frischem Differenzierungsmedium oder DM und zentrifugieren bei 115 × g für drei Minuten. Kultivieren Sie die Kolonie-Fragmente vier Tage lang im Suspensionskulturverfahren in Ultra-Low-Attachment-Platten mit sechs Vertiefungen, um die Bildung von Embryoidkörpern oder EBs zu ermöglichen.Dann die neu gebildeten EBS auf mit 0,1 % Gelatine beschichteten 24-Loch-Platten 15 bis 30 Tage lang inkubieren, bis schlagende Zellverbände erscheinen. Die PBS entfernen und mit Acutase die Kolonien nach einer Zentrifugation und Resuspension in Einzelzellen aufspalten, wobei die Zellen in DM-Medium resuspendiert und je Agar zwei Milliliter pro Kammerplatte verwendet werden. Einen Tag bei 37 Grad Celsius inkubieren.Sammeln Sie die neu gebildeten EBS und platzieren Sie jeweils drei pro Bohrung in 24-Loch-Platten mit 0,1 % Gelatine-Beschichtung nach zwei bis vier Wochen Kultur. Identifizieren Sie Ansammlungen schlagender Kardiomyozyten und dissezieren Sie diese manuell mit einer langgestreckten, scharf abgeschnittenen Pasteurpipette. Geben Sie vier PTFE-Filter pro Insert ein und stellen Sie jedes in eine Bohrung einer 6-Loch-Platte.Nachdem je ein Milliliter DM hinzugefügt wurde, einen isolierten pulsierenden Cluster auf jeden PTFE-Filter gegeben. Um die Cluster zu markieren, überführen Sie die PTFE-Filter mit den pulsierenden Clustern in eine 3,5 cm Glasbodenkammer. Geben Sie einen Milliliter Second-Harmonic-Generation-Nanopartikel mit einer Konzentration von 50 Mikrogramm pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten bei 37 Grad Celsius, um die nichtlineare optische Bildgebung durchzuführen.Nachdem markierte HEBs oder schlagende Herzkardiomyozyten-Cluster in eine Bildgebungskammer überführt wurden, verwenden Sie die Weitfeldbildgebung unter Weißlichtbeleuchtung, um die Strukturen von Interesse innerhalb differenzierter EBS oder aktiver schlagender Cluster zu identifizieren. Führen Sie einen schnellen, niedrig aufgelösten dreidimensionalen Scan durch, um die Gesamtmorphologie des kardialen Clusters zu rekonstruieren, und wählen Sie eine Bildebene innerhalb des Cluster-Volumens mit mehreren sichtbaren Nanopartikeln der zweiten harmonischen Generation aus, um diese in Echtzeit zu überwachen. Die Kontraktionen des kardialen Clusters setzen den optischen Scanner des Mikroskops in den schnellsten Modus, wodurch die Akquisition zweidimensionaler Bilder mit mehreren Hertz ermöglicht wird.Analysieren Sie die Bilder mithilfe der MATLAB-Software gemäß dem schriftlichen Protokoll, wie hier dargestellt, bevor Sie die Schlagaktivität bewerten. Die Charakterisierung der nichtlinearen optischen Antwort der PTFE-Filter wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Photonenfluoreszenz des bloßen Substrats sehr schwach ist und nicht die Messung der relevanten biologischen Proben sowie der Emission von Isolaten stört. Die zweite Harmonische erzeugende Nanopartikel können leicht durch Abbildung durch das Substrat im Epi-Erkennungsmodus erfasst werden.In dieser Abbildung sind mit Second-Harmonic-Generierung-Nanopartikeln markierte Herdstrukturen und EBS als Klinge dargestellt. Die roten, gelben und grünen Farben entsprechen der NADH-Autofluoreszenz, während die intensiven blauen Second-Harmonic-Signale von isolierten Second-Harmonic-Generierung-Nanopartikeln stammen. Beachten Sie den guten optischen Kontrast und die vergleichsweise spärliche Markierung im Vergleich zu Quantenpunkten oder Upconversion-Nanopartikeln.Diese Abbildung zeigt eine Schnittansicht eines mit Second-Harmonic-Generation-Nanopartikeln markierten pulsierenden Herzzellverbunds. Wie in diesem Film gezeigt, werden die 3D-Strukturen mit hoher Geschwindigkeit aufgezeichnet, um den Kontraktionsverlauf in der zweiten Zelle zu verfolgen. Die Harmonische-Generation-Nanopartikel aggregieren, um eine hohe Aufnahmegeschwindigkeit aufrechtzuerhalten und die NP-Bewegung aufzulösen.Die allgemeine Erfassungsempfindlichkeit war nicht ausreichend, um die Autofluoreszenz der Zelle mit der Emission der zweiten Harmonischen aus der Erzeugung der zweiten Harmonischen aufzuzeichnen. Die Bildanalyse von Nanopartikeln, die an Filmsequenzen durchgeführt wurde, zeigt, dass innerhalb desselben Herzzellverbunds die Verschiebungen in der Größenordnung weniger Mikrometer liegen und die Frequenz für die Bewegung der Nanopartikel in und aus der Ebene der zweiten Harmonischen konstant ist. Wenn man die Zellpräparationstechnik beherrscht, können die Dissektion des bevorzugten Zellverbunds, die Luft-Flüssig-Kultur und das Abtrennen innerhalb von 24 bis 36 Stunden durchgeführt werden, sofern dies ordnungsgemäß erfolgt.Vor allem bei dieser Technik müssen offene Luftkontakte vermieden werden, um Kontaminationen zu verhindern. Mit dieser Vorgehensweise können weitere Methoden angewandt werden, wie beispielsweise elektrophysiologische Ableitungen mittels Mehrfachelektrodenarrays, um zusätzliche Fragen zu beantworten, etwa die Korrelation von Aktionspotentialprofilen mit der Schlagfrequenz in drei Dimensionen. Unsere neuartige Technik, die auf der Detektion des nichtlinearen Signals durch harmonische Nanopartikel basiert, kann für in-vivo-Studien weiterentwickelt werden, da die zur Bildgebung verwendeten Wellenlängen eine tiefere Penetration in Gewebe ermöglichen.Eine mögliche Entwicklung könnte darin bestehen, die Integration aus Stammzellen abgeleiteter Strukturen für Anwendungen in der regenerativen Medizin zu verfolgen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

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Nutzung von Plasmonic und Photonic Crystal Nanostrukturen für verbesserte Mikro-und Nanopartikel-Manipulation

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Regulierung des Schwann-Zellwachstums durch ein gepulstes elektrisches Feld im Nanosekundenbereich für die periphere Nervenregeneration in vitro

Erfahren Sie die Markierung humaner embryonaler Stammzellen mit harmonischen Nanopartikeln für die Echtzeit-Mehrphotonenmikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung kardialer Kontraktionen in 3D.

Harmonic Nanopartikel für Regenerative Forschung

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