Harmonic Nanopartikel für Regenerative Forschung

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist das in vitro Monitoring von kardialen Perlenclustern, die aus humanen embryonalen Stammzellen gewonnen werden, in 3D-Echtzeit und mit hoher räumlicher Auflösung. Dies wird erreicht, indem embryonale Stammzellen zunächst kultiviert und vermehrt werden, bis sie Embry-Körper bilden. Anschließend werden die schlagenden Cluster präpariert und auf porösen POLYTETRAFLUORETHYLEN- oder PTFE-Filtern plattiert, wodurch sie als Langzeitluft gehalten werden können.

Flüssigkulturen, die dann Cluster schlagen, werden mit harmonischen Nanopartikeln markiert, um eine Echtzeit-Multiphotonenmikroskopie durchzuführen. Die erzielten Ergebnisse ermöglichen die Analyse der räumlichen Verlängerung und Häufigkeit von Herzkontraktionen auf mikroskopischer Ebene. Der Hauptvorteil dieser Nanopartikel besteht also darin, dass man jede Wellenlänge verwenden kann, insbesondere Infrarot, so dass man tiefer in das Gewebe eindringen kann und sie auch über die Zeit sehr stabil sind.

So können wir unsere langen Prozesse über lange Zeiträume überwachen. Diese Stammzellkulturmethode kann helfen, zentrale Fragen auf dem Gebiet der funktionellen Kontraktion von Kardiomyozyten in drei Dimensionen zu beantworten. Insbesondere die kardiale Reifung und das Tissue Engineering.

Individuell neue Krankheitsmethode sollte sich darüber im Klaren sein, dass das Markierungsverfahren mit harmonischen Nanopartikeln nur für die Multiphotonenmikroskopie verwendet werden kann und nicht auf andere Arten von bildgebenden Systemen übertragen werden kann. Die Idee, harmonische Nanopartikel zu verwenden, hatten wir erstmals im Jahr 2005. Diese Nanopartikel bieten Vorteile gegenüber Fluoreszenzfarbstoffen und Quantenpunkten.

Tatsächlich verschwindet ihr Signal nicht mit der Zeit und sie können verwendet werden, um sich entwickelnde Proben über lange Zeiträume zu überwachen. Die visuelle Demonstration der Probenvorbereitung ist entscheidend für die Effizienz und Reproduzierbarkeit der verschiedenen Schritte, insbesondere bei der Durchführung von Arzneimitteltests, und könnte auch auf verschiedene Gewebe oder Krankheiten angewendet werden. Modellierung von Geweben.

Nach der Kultivierung und Expansion menschlicher embryonaler Stammzellen oder ESCs gemäß dem Textprotokoll und der Inkubation mit warmer Kollagenase, vier für 10 Minuten, sammeln Sie die Koloniefragmente in zwei Millilitern frischer Differenzierung, Medium oder TM und zentrifugieren Sie drei Minuten lang bei 115-facher Schwerkraft. Kultur, die Koloniefragmente in Suspension in extrem niedrigen Anhängen. Sechs Vertiefungsplatten für vier Tage, damit sie Embryokörper oder Ebs bilden können.

Plattieren Sie dann das neu gebildete EBS 15 bis 30 Tage lang auf 0,1 % gelatinebeschichteten 24-Well-Platten, bis schlagende Cluster auftreten. Entfernen Sie das PBS und dissoziieren Sie die Kolonien mit Acutus nach dem Zentrifugieren und Reanimation in einzelne Zellen, wobei Sie die Zellen in einer DM-Mediumplatte von zwei Millilitern pro Agro suspendieren. Gut kammern und einen Tag lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Sammeln Sie das neu gebildete EBS und die Platte drei pro Vertiefung auf 0,1 %ige gelatinebeschichtete 24-Well-Platten nach zwei bis vier Wochen in Kultur. Identifizieren Sie Cluster schlagender Kardiomyozyten und disparieren Sie sie mit einer länglichen, scharf geschnittenen Pastenpipette manuell. Lagern Sie vier PTFE-Filter pro Einsatz ein und setzen Sie jeden in eine Vertiefung mit einer Platte mit sechs Vertiefungen ein.

Nachdem Sie jeweils einen Milliliter TM hinzugefügt haben, fügen Sie jeweils ein präpariertes Schlagcluster auf jeden PTFE-Filter hinzu. Um die Cluster zu beschriften, geben Sie die PTFE-Filter mit den Schlagclustern in eine 3,5 Zentimeter große Glasbodenschale. Fügen Sie einen Milliliter Nanopartikel der zweiten harmonischen Generation bei 50 Mikrogramm pro Milliliter hinzu und inkubieren Sie 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um eine nichtlineare optische Bildgebung durchzuführen.

Nach der Übertragung von markierten HEBs oder kardialen schlagenden Clustern in eine Bildgebungskammer verwenden Sie die Weitfeldbildgebung unter Weißlichtbeleuchtung, um interessante Strukturen innerhalb von differenziertem EBS oder aktiven schlagenden Clustern zu identifizieren. Führen Sie einen schnellen, dreidimensionalen Scan mit niedriger Auflösung durch, um die Gesamtmorphologie des Herzclusters zu rekonstruieren, und wählen Sie eine Bildebene innerhalb des Clustervolumens mit mehreren sichtbaren Nanopartikeln der zweiten Harmonischen aus, die in Echtzeit überwacht werden sollen. Die kardialen Clusterkontraktionen versetzen den optischen Scanner des Mikroskops in den schnellsten Modus und ermöglichen so die Aufnahme von zweidimensionalen Bildern mit mehreren Hertz.

Analysieren Sie die Bilder mit der MATLAB-Software gemäß dem hier gezeigten Textprotokoll, bevor Sie die Schwebungsaktivität bewerten. Die Charakterisierung der nichtlinearen optischen Reaktion der PTFE-Filter wird durchgeführt, um sicherzustellen, dass die Fluoreszenz des blanken Substrats gegenüber Photonen sehr schwach ist und die Messung der relevanten biologischen Proben und die Emission aus isolierten Proben nicht verhindern kann. Nanopartikel der zweiten Harmonischen können leicht durch Abbildung durch das Substrat im Epi-Detektionsmodus erfasst werden.

In dieser Abbildung sind Nanopartikel der zweiten harmonischen Generation, die mit Herzstrukturen und EBS markiert sind, dargestellt. Die roten, gelben und grünen Farben entsprechen der NADH-Autofluoreszenz, während die intensiven blauen Flecken der zweiten Harmonischen von isolierten Nanopartikeln der zweiten Harmonischen stammen. Beachten Sie den guten optischen Kontrast und die relativ spärliche Markierung im Vergleich zu Quantenpunkten oder Aufwärtskonversions-Nanopartikeln.

Diese Abbildung zeigt eine Schnittansicht eines Nanopartikels der zweiten harmonischen Generation, die als kardialer Schlagcluster markiert sind. Wie in diesem Film gezeigt, werden die 3D-Strukturen mit hoher Geschwindigkeit aufgezeichnet, um das Kontraktionsmuster in der zweiten Zelle zu überwachen. Nanopartikel zur Erzeugung von Harmonischen aggregieren, um eine hohe Erfassungsgeschwindigkeit für die Auflösung der NP-Bewegung aufrechtzuerhalten.

Die Gesamtempfindlichkeit der Erfassung war nicht ausreichend, um die Autofluoreszenz der Zellen mit der Emission der zweiten Harmonischen aus der Erzeugung der zweiten Harmonischen aufzuzeichnen. Die Bildanalyse von Nanopartikeln, die an Filmbildern durchgeführt wird, zeigt, dass die Verschiebung innerhalb desselben Herzclusters in der Größenordnung von wenigen Mikrometern liegt und die Frequenz für die Bewegung der Nanopartikel in und außerhalb der einfachen zweiten Harmonischen konstant ist. Wenn Sie die Zellvorbereitungstechnik beherrschen, können das Wettcluster, die Dissektion, die Luftflüssigkeitskultur und das Lammen in 24 bis 36 Stunden durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird.

Gerade bei dieser Technik müssen offene Luftkontakte vermieden werden, um Kontaminationen zu vermeiden. Im Anschluss an dieses Verfahren kann man andere Methoden wie elektrophysiologische Aufzeichnungen mit mehreren Elektrodenarrays anwenden, um zusätzliche Fragen wie die Korrelation von Aktionspotentialprofilen mit der Schwebungsfrequenz in drei Dimensionen zu beantworten. Unsere neuartige Technik, die auf der Detektion des nichtlinearen Signals durch harmonische Nanopartikel basiert, kann für in vivo-Studien weiterentwickelt werden, die die für die Bildgebung verwendeten Wellenlängen infizieren und ein tieferes Eindringen in Gewebe ermöglichen.

Eine mögliche Entwicklung könnte die Integration von Stammzellstrukturen für Anwendungen in der regenerativen Medizin sein.