Langzeit-Intravitalimmunfluoreszenz-Imaging von Gewebematrix Bestandteile mit Epifluoreszenz und Zwei-Photonen-Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist die intravitale Immunfluoreszenzbildgebung des Ohrs von Melanommäusen, um die Dynamik der Matrixkomponenten des Tumorgewebes zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Mausohr mit GFP-exprimierenden B 16 F 10 Melanomzellen beimpft wird. Als nächstes wird eine Operation am Mausohr durchgeführt, um die ventrale von der dorsalen Ohrhaut zu trennen und das Tumorgewebe freizulegen.

Dann wird eine Immunfärbung auf dem freiliegenden Gewebe des Hinterohrs durchgeführt. Schließlich wird das Tier für die intravitale Bildgebung vorbereitet. Letztendlich wird die Fluoreszenz-Stereomikroskopie oder Multiphotonenmikroskopie eingesetzt, um die Lokalisation und das dynamische Verhalten von Tumorzellen und ihren Matrixbestandteilen darzustellen.

Der Hauptvorteil dieser Technik im Vergleich zu den anderen Live-Bildgebungsverfahren besteht darin, dass wir die dynamischen Wechselwirkungen von Tumorzellen mit stromaassoziierten Zellen wie Immunzellen abbilden können, aber im Kontext von fibrillärer und netzartiger extrazellulärer Matrix. Diese Methode kann Ihnen also helfen, zentrale Fragen im Bereich der Tumorbiologie zu beantworten, z. B. wie Tumorzellen mit ihrer physikalischen Mikroumgebung interagieren, was wiederum wichtige Erkenntnisse über den Verlauf von Tumoren liefern kann. Ein Teil des Verfahrens wird von Vita Kki, einem leitenden Wissenschaftler unseres Labors, demonstriert. Um Tumorzellen für die Injektion vorzubereiten, beginnen Sie mit der Kultivierung von B 16 F 10 GFP-Melanomzellen.

Nach dem Zentrifugieren der Zellen werden sie in ein 1,5-Milliliter-Einor-Röhrchen überführt und erneut geschleudert, alle Überstände mit Ausnahme einer dünnen Schicht Medium, die knapp über dem Pellet verbleibt, entfernt, die Zellen in eine dicke Zellaufschlämmung resuspendiert, um die Zellaufschlämmung in ein Volumen von 10 Mikrolitern zu laden. Hamilton-Spritze. Entfernen Sie die Spitzenkappe von einer angebrachten 33-Gauge-Nadel und laden Sie 20 Mikroliter der Aufschlämmung auf die Spitzenkammer.

Ziehen Sie dann den Kolben zurück, bis fünf Mikroliter Aufschlämmung in die Spritze geladen sind. Nachdem Sie eine C 57 black six Maus mit injizierbarer Anästhesie betäubt haben, rasieren Sie den Mauskopf, entfernen Sie die Haare auf dem Kopf und um das Ohr herum und spülen Sie ihn mit Wasser ab. Fixieren Sie mit Klebeband den proximalen Rand des Ohrs an der Spitze eines Zeigefingers.

Führen Sie die Hamilton-Spritzennadel zwischen die dorsale Dermis und den Knorpel des Ohrs einer C 57 black six-Maus ein, die etwa zwei bis drei Millimeter proximal bis distal in das Ohr eindringt. Injizieren Sie die Zellaufschlämmung und ziehen Sie die Nadel langsam von der Haut zurück. Lassen Sie die Tumorzellen im Laufe von sieben bis neun Tagen einen soliden Tumor bilden, indem Sie ein Fluoreszenzmikroskop verwenden, um das Tumorwachstum zu verfolgen.

Nachdem Sie die Maus mit einer Mischung aus befeuchtetem Sauerstoff und Iso-Fluor betäubt haben, legen Sie die Maus auf ein 37 Grad Celsius heißes Heizkissen und kneifen Sie sie sanft in die Zehen. Um zu bestätigen, dass das Tier ausreichend betäubt ist. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf und halten Sie die Maus während des gesamten Eingriffs auf einem rektalen Thermistor-gesteuerten Heizkissen.

Platzieren Sie als Nächstes das tumortragende Ohr vorsichtig auf einem Stapel Objektträger. Fixieren Sie dann mit kleinen Streifen Klebeband die vorderen und hinteren Ränder des Ohres mit einem Skalpell am Stapel, schneiden Sie die Bauchhaut des Ohres entlang der Antihelix der Ohrmuschel ab. Entfernen Sie die Bänder mit Hilfe einer gebogenen Pinzette vom Ohr.

Ziehen Sie vorsichtig die ventrale Dermis und den Knorpel von der dorsalen Dermis ab. Verwenden Sie den Ringerpuffer, um das Ohr zu waschen und eine Immunfluoreszenzfärbung durchzuführen. Tragen Sie primäre Antikörper, die auf extrazelluläre Matrixmoleküle in Blockierungspuffer abzielen, auf das exponierte Ohr auf und legen Sie einen Deckbogen darauf.

Inkubieren Sie 15 Minuten lang, bevor Sie etwa fünf Milliliter Ringers-Puffer verwenden, um das Ohr zweimal zu waschen. Geeignete Sekundärantikörper oder Streptokokken Aden in Blockpuffer appellieren. Tragen Sie einen Deckslip auf und inkubieren Sie ihn 15 Minuten lang, bevor Sie ihn zweimal waschen. Falten Sie wie zuvor den offenen Hautbereich in das EM mencia conki und trocknen Sie die äußere ungeöffnete Ohrdermis mit sterilen Tüchern.

Legen Sie das Ohr auf einen Stapel Objektträger und tragen Sie 0,5 Mikroliter chirurgischen Kleber auf die vorderen und hinteren Rückenkanten auf, um es für eine kurzfristige Bildgebung von zwei Stunden oder weniger zu immobilisieren. Geben Sie frisch zubereiteten sterilen Puffer als Sorbat-Ringer-Puffer auf das immobilisierte Ohr und bringen Sie ein Deckglas auf. Verwenden Sie dann ein fluoreszierendes Stereomikroskop mit zwei Linsen, um das Ohr abzubilden.

Für die Langzeitbildgebung. Platzieren Sie den Auslass einer Nadel, die an einem Reservoir mit einem Sorbatringer befestigt ist, etwa 0,5 Zentimeter vom Ohr entfernt unter dem Deckschieber. Verwenden Sie eine Schlauchpumpe mit einer Geschwindigkeit von einem Mikroliter pro Minute, um den Puffer ständig in die Kammer zu fördern.

Öffnen Sie die Erfassungssoftware. Passen Sie die Verstärkung, die Fluoreszenzintensität, die Vergrößerung und die Belichtungszeit, mehrere Felder, die Tumorzellen enthalten, sowie gefärbte extrazelluläre Matrixproteine an, um eine intravitale Bildgebung mittels Multiphotonenmikroskopie mit Silikonfett durchzuführen. Beginnend an der Basis des Ohrs.

Bauen Sie eine kreisförmige Wand von etwa zwei Zentimetern Durchmesser und zwei bis drei Millimetern Höhe um das Ohr herum. Füllen Sie den Kreis mit einem Sorbatringer. Stellen Sie die Maus auf den Tisch auf ein Heizkissen, stellen Sie sie auf 37 Grad Celsius ein und konfigurieren Sie die Einstellungen des Mikroskops gemäß dem Textprotokoll.

Wie in dieser Abbildung gezeigt, können viele Strukturen anhand ihrer Morphologie nach der Immunfärbung unterschieden werden. Für Basalmembrankomponenten wie Kollagen vier oder Prolean vor allem Strukturproteine, die normalerweise nicht mit SHG nachgewiesen werden können. Die klassische Matrix-Detektionsmethode kann visualisiert werden.

Zum Beispiel fanden wir heraus, dass Zehner und C an verschiedenen Stellen des Tumorstromas von fibrillären Kollagenkräften abgelagert werden, die sich in der Tumormikroumgebung entwickeln, können zu einer Ausdehnung oder Kontraktion der Tumormatrix und in der Folge zu einem Umbau des Tumorgefäßsystems ähnlich der Wundheilung führen. Hier zeigen wir, dass wir Zwei-Photonen-Zeitraffermikroskopie durchführen können, während wir gleichzeitig immunomarkierte Tenas und C-Matrizen mit minimalem Photobleaching von Fluor-Vierern abbilden, selbst bei hoher Photonendichte zur Photonenmikroskopie. In diesem Video klebten Tumorzellen, die auf der freiliegenden Dermis überlagert waren, die mit Kollagen 4 vorgefärbt war, am Gewebe und begannen in Gruppen, kollektiv entlang der Basalmembran von Blutgefäßen und Fettstellen zu wandern.

Sobald Sie das gesamte Verfahren zum Öffnen des Ohrs und zur Immunfärbung gemeistert haben, dauert es zwei Stunden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie intravitale Immunfärbungen durchführen, um Zellmatrix-Wechselwirkungen in Tumoren mit Hilfe von Epi-Fluoreszenz oder Zwei-Photonen-Mikroskopie zu untersuchen.