Zell-basierte Therapie bei Herzinsuffizienz in Rat: Doppel Thorakotomie für Herzinfarkt und Epikardiale Implantation von Zellen und Biomatrix

Ziel dieses Verfahrens ist es, eine doppelte Thorakotomie an Ratten durchzuführen, um eine Koronaligatur und Epikardapplikation durchzuführen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Thorakotomie im vierten Interkostalraum durchgeführt wird. Als nächstes wird die linke anteriore absteigende Koronararterie oder LAD ligiert.

Zwei Wochen später wird dann eine zweite Thorakotomie am fünften Interkostalraum durchgeführt. Abschließend werden die Zellen und die Matrix auf die Oberfläche des infarktierten schlagenden Herzens aufgebracht. Letztendlich wird eine Echokardiographie durchgeführt, um die Herzfunktion zu beurteilen, und die Histologie wird durch Messungen der Infarktgröße durchgeführt.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Sternotomie besteht darin, dass es sich um einen minimalinvasiven Ansatz handelt, der zeigt, dass das Verfahren und ine Lopez Mitarbeiter aus unserem Labor entsandt wird. Alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Empfehlungen der F-E-L-A-S-A und dem Schweizer Tierschutzgesetz behandelt. Nachdem Sie eine Ratte ausgeblutet und die Oberschenkelknochen gemäß dem Textprotokoll isoliert und gereinigt haben, schneiden Sie mit einer Schere beide Spitzen der Knochen ab.

Um das Knochenmark zu spülen, injizieren Sie steriles PBS in den Kern des Knochens und sammeln Sie das Knochenmark in einem 15-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie das entnommene Knochenmark sieben Minuten lang bei 300 mal G. Entfernen Sie das Supinat mit drei Millilitern Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen. Suspendieren Sie das Pellet, inkubieren Sie die Suspension eine Minute lang bei Raumtemperatur, bevor Sie sich nach der Wiederbelebung erneut sieben Minuten lang bei 300 G drehen.

Suspendieren des Pellets in sterilem Nährmedium. Geben Sie zusätzliches Zellkulturmedium in einen 150-Milliliter-Kulturkolben und säen Sie die Zellen am zweiten Tag der Inkubation aus. Wechseln Sie das Medium, um nicht adhäsive Zellen zu entfernen, und tauschen Sie das Medium zwei bis drei Wochen lang jeden zweiten Tag aus, bis die gewünschte Zelldichte erreicht ist.

Um die erste T-Thorakotomie durchzuführen, beginnen Sie mit dem Wiegen der Ratte und stellen Sie die Parameter des Beatmungsgeräts entsprechend ein. Der Lüftungsabfluss wird automatisch definiert. Rasieren Sie dann den linken Teil des Brustkorbs, schalten Sie ein Heizkissen ein und stellen Sie es auf 37 Grad Celsius ein.

Nachdem Sie die Ratte gemäß dem Textprotokoll betäubt haben, führen Sie eine Zehen- oder Schwanzkneifung durch, bevor Sie die Ratte mit einem 14-Gauge-IV-Katheter in Rückenlage auf das Heizkissen legen, intubieren Sie das Tier und verbinden Sie dann den Intubationskatheter mit einem Nagetierbeatmungsgerät. Programmiert für 2,5 Liter Sauerstoff pro Minute, 2,5 % Fluor, ein Atemzugvolumen von zwei Millilitern und eine Atemfrequenz von 90 Atemzügen pro Minute. Nachdem Sie eine Spritze mit Buprenorphin 0,1 Milligramm pro Kilogramm subkutan vorbereitet haben, injizieren Sie ein Drittel der Lösung und verwenden Sie dann 1% Betadin-Lösung, um den Bereich zu desinfizieren.

Als nächstes schneiden Sie die Haut senkrecht zum Brustbein des vierten Interkostalraums ein und trennen Sie die drei Schichten des Brustmuskels. Öffnen Sie dann den vierten Interkostalraum zwischen den Rippen vier und fünf. Verwenden Sie einen kleinen Retraktor, um die Rippen zu spreizen und das Herz freizulegen.

Öffnen Sie dann vorsichtig das Perikard und lokalisieren Sie die linke anteriore absteigende Koronararterie oder LAD und verwenden Sie eine 7,0-Naht, um sie vier Millimeter unterhalb des Vorhofs zu ligieren. Steuern Sie dann die Farbänderung des ischämischen Bereichs mit drei Nullnähten, die ungefähr und distal vom Brustbein positioniert sind. Machen Sie zwei Stiche, die zum Schließen des Interkostalraums verwendet werden.

Ziehen Sie die distale Naht fest. Klemmen Sie den Abluftschlauch des Beatmungsgeräts zwei Sekunden lang fest, um den Brustkorb aufzublasen und einen Pneumothorax zu vermeiden. Ziehen Sie dann die zweite Naht fest.

Positionieren Sie die Muskelschichten wieder an Ort und Stelle. Verwenden Sie dann fünf Nullnähte, um die Haut mit 1%iger Betadine-Lösung zu verschließen. Desinfizieren Sie die Naht und injizieren Sie die restliche Buprenorphinlösung.

Schalten Sie das Anästhesiesystem aus und entfernen Sie den Intubationskatheter. Halten Sie die Ratte ein bis zwei Stunden lang in einem Käfig unter einer warmen Lampe, bevor Sie sie in eine IVC-Einheit zurückbringen. Zwei Wochen nach der ersten Thorakotomie ist die Heilung abgeschlossen und eine Narbe ist kaum noch sichtbar.

Befolgen Sie das zuvor in diesem Video beschriebene Verfahren zur Vorbereitung der Ratte auf die Operation, schneiden Sie die Haut senkrecht zum Brustbein am fünften Interkostalraum ein. Trennen Sie die drei Muskelschichten und öffnen Sie den fünften Interkostalraum zwischen den Rippen fünf und sechs. Verwenden Sie einen kleinen Retraktor, um die Rippen zu spreizen und das Herz freizulegen.

Wenn es eine gewisse Anhaftung gibt, verwenden Sie eine feine Zange, um sie vorsichtig zu lösen. Suchen Sie als Nächstes den Infarktbereich, der als blasser Bereich unter der Ligatur erscheint. Führen Sie bei Bedarf ein 10 Zentimeter langes Stück Sieben-Null-Naht an der Spitze ein und ziehen Sie vorsichtig daran, um den linken Ventrikel besser sichtbar zu machen.

Dann werden Zellen und Matrix auf die Oberfläche des ischämischen Bereichs des Herzens aufgetragen. Nach dem Pelletieren viermal 10 auf die sechs Zellen, wie im Textprotokoll beschrieben, die Palette auf das Herz auftragen, bevor Sie es mit einem Fibrindichtmittel abdecken. Die Klebeschicht fixiert die Zellen an der Oberfläche des Herzens.

Nach dem Entfernen des Nahtstücks aus der Scheitelposition vernähen und desinfizieren die Muskelschichten das Tier wieder an Ort und Stelle. Wie weiter oben im Video gezeigt, wie hier gezeigt. Nach chirurgischen Eingriffen verloren die Tiere an Gewicht und erholten sich schnell, bevor sie unabhängig von der angewandten Behandlung an Gewicht zunahmen. Wie in dieser Kaplan-Grafik gezeigt, ist die Überlebensrate nach der ersten T-Thorakotomie hoch, Tiere, die mit Fibrin und/oder Zellen behandelt wurden, zeigten niedrigere Überlebensraten als andere Gruppen, wie in dieser Grafik zu sehen ist.

Trotzdem blieben die Gesamtüberlebensraten nach einer Sekunde hoch. Die Thorakotomie und die Behandlung der Herzfunktion wurden durch Echokardiographie beurteilt. Diese repräsentativen M-Mode-Bilder für gesunde und infarzierte Tiere zeigen, dass die LV-Wandkontraktilität zwei Wochen nach der LAD-Ligation aufgehoben ist. Eine fraktionierte Verkürzung wurde zwei Wochen nach der LAD-Ligation bei insgesamt 104 Tieren aufgezeichnet.

Die Häufigkeitsverteilung zeigt einigermaßen reproduzierbare Methoden mit einem Variationskoeffizienten von 17 %Diese Abbildung zeigt eine grafische Darstellung der Herzfunktion anhand der gemessenen Ejektionsfraktion zwei und sechs Wochen nach der LAB-Operation. Die Herzfunktion nimmt in diesem Zeitraum weiter ab. In dieser Zeit findet auch ein Herzumbau statt, der sich hier durch eine Zunahme der LV-Volumina sowohl in der Schwester als auch in der Diastole darstellt. Schließlich zeigten goldene Färbungen auf Herzschnitten, dass sich fibrotisches Gewebe und schließlich eine transmurale Narbe sechs Wochen nach der LAD-Ligatur entwickelten. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 30 bis 40 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine minimalinvasive Doppelthorakotomie durchführen.