Super-Resolution Imaging neuronaler Dense-Core-Vesikel
2. Juli 2014
Wir beschreiben, wie die photoaktivierte Lokalisationsmikroskopie (PALM)-basierte Studien von Vesikeln in festen, kultivierten Neuronen zu implementieren. Schlüsselkomponenten unseres Protokolls gehören Kennzeichnung Vesikel mit photoconvertible Chimären, sammeln spärlich abgetasteten RAW-Bilder mit einer superauflösende Mikroskopie-System, und die Verarbeitung der RAW-Bilder, eine Super-Resolution-Bild zu erzeugen.
Das allgemeine Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen mit Superauflösung zu erhalten, die wichtige Aspekte der Vesikelorganisation mit einer Auflösung aufklären, die mit herkömmlicher Fluoreszenzmikroskopie sonst nicht erreichbar wäre. Dies wird erreicht, indem zunächst Hippocampus-Neuronen mit DNA transduziert werden, die photokonvertierbare Chimären von Vesikel-Inhaltsstoffen kodiert. Im zweiten Schritt werden mit dem Superauflösungs-Mikroskopiesystem spärlich abgetastete Rohbilder aufgenommen.
Anschließend werden die Rohbilder verarbeitet, um ein Bild mit verbesserter Auflösung zu erzeugen. Im letzten Schritt werden die Daten quantifiziert, um die Organisation der Vesikel aufzuklären. Letztendlich können Linienprofile der Punktintensität verwendet werden, um den Abstand der Vesikel zur Vesikelbreite zu vergleichen und somit zu bestimmen, ob die Vesikel nahe genug beieinander liegen, um einen Verbund zu bilden, unter Verwendung dieses Verfahrens.
Die Einzelfarben-Photoaktivierungs-Lokalisierungsmikroskopie oder PALM kann verwendet werden, um die Organisation von Organellen in den meisten Arten kultivierter Zellen zu untersuchen. Um das Super-Auflösungs-Bildgebungssystem für die Bildaufnahme zu starten, schalten Sie zunächst die Stromzufuhr zur Bogenlampe ein. Danach schalten Sie den System-PC und die Komponentenschalter an der Fernbedienung ein.
Schalten Sie nach dem Einschalten des Mikroskop-Tablets den Computer ein und starten Sie die Software. Erweitern Sie das Fenster mit dem Startstatus, um zu überprüfen, ob das System normal geladen wird, und wählen Sie im Anmeldedialog die Option „System starten“. Um die Probe für die Visualisierung zu positionieren, öffnen Sie die vordere und obere Abdeckung des Lasersicherheitsschranks und kippen Sie den Durchlichtarm, um Zugang zum Objekttisch und zu den Objektiven zu erhalten.
Als Nächstes geben Sie Öl auf das Alpha Plan APO Chromat 100x-Objektiv für die totale interne Reflexion, Fluoreszenz oder das TIRF-Objektiv. Wählen Sie dann ein Objektiv mit niedriger Vergrößerung für den ersten Fokussierschritt. Bringen Sie nun die Probe auf dem Objekttisch an und fahren Sie das Objektiv zur Probe hin hoch.
Überwachung der Objektivposition mithilfe der X-, Y-, Z-Funktion des Steuerungs-Tablets. Anhalten, wenn sich das Objektiv in der Nähe der Fokushöhe befindet. Zum Visualisieren der Probe und zum Feinjustieren des Fokus.
Senken Sie den Lichtarm ab und schließen Sie die Zugangspanele vollständig. Gehen Sie dann im Register „Locate“ auf das Okularvergrößerungssymbol, um ein Schema des Lichtwegs aufzurufen. Wählen Sie „Trans on“ und vergewissern Sie sich, dass im Schema das durchgehende Licht von der Lampe dargestellt wird, das auf die Probe trifft. Schauen Sie in die Okulare und fokussieren Sie die Zellen mithilfe des Steuerungstabletts als Leitfaden.
Danach, um die Zellen zu identifizieren, die DRA zwei exprimieren, reflektiertes Licht und den für die Beobachtung der grünen Emission von den zwei geeigneten Filter wählen. Mithilfe von reflektiertem Licht geringer Intensität den Deckglaser abscannen, bis eine gesunde, helle Zelle gefunden wird, und anschließend die Software zur Erfassung der PALM-Daten konfigurieren. Zum Reiter „Acquisition“ (Erfassung) wechseln und mithilfe des Experiment Managers die entsprechende experimentelle PALM-Erfassungskonfiguration laden.
Wenn das Popup-Menü mit der Abfrage zum Einschalten der Laser erscheint, klicken Sie auf Ja, um dann das Bild der Zelle in der Kameraebene zu fokussieren. Wählen Sie lediglich die 488-Spur aus. Passen Sie die Aufnahmeparameter wie den E-M-C-C-D-Verstärkungsfaktor an und wählen Sie anschließend die kontinuierliche Aufnahme.
Als Nächstes stellen Sie die Anzeige auf die gewünschte Helligkeit ein und bewegen Sie das Objektiv, bis das Bild auf dem Bildschirm scharf ist. Klicken Sie anschließend auf die Schaltfläche „Snap“, um ein herkömmliches Weitfeldbild aufzunehmen, und speichern Sie das Bild. Um die TURF-basierte Beleuchtung auf der 488-Spur einzurichten, wählen Sie TURF auf der Epi-TURF-Schaltfläche aus.
Um die turf-basierte Beleuchtung zu optimieren, wählen Sie die kontinuierliche Aufnahme aus und justieren Sie den Turf-Winkel so lange heller, bis der Hintergrund plötzlich dunkler wird und das Präparat in nur einer Ebene fokussiert werden kann. Wechseln Sie zur 561-Spur mit ausgeschaltetem 405-Nanometer-Laser. Stellen Sie die E-M-C-C-D-Verstärkung auf etwa 200 und die Belichtungszeit auf etwa 50 Millisekunden ein.
Wählen Sie den Emissionsfilter, der im roten Bereich überträgt, und stellen Sie die Laserintensität auf etwa 40 % ein. Überprüfen Sie erneut den Turf-Winkel für die 561-Spur. Um die Hintergrundfluoreszenz zu reduzieren, beleuchten Sie die Probe, bis der Hintergrund verblasst. Verwenden Sie dazu die 561-Spur, wobei ausschließlich der 561-Laser aktiviert ist.
Um die PALM-Daten zu sammeln, schalten Sie den 405-Nanometer-Laser für die 561-Spur ein und stellen Sie die Intensität des 405-Lasers auf etwa 0,01 % ein. Um das berechnete PALM-Bild während der Aufnahme zu überwachen, erweitern Sie das Menü für Online-Verarbeitungsoptionen und aktivieren Sie Online-Verarbeitung PALM, um mit den Standardparametern zu verarbeiten. Klicken Sie auf „Experiment starten“, um die Aufnahme zu beginnen. Überwachen Sie während der Datensammlung visuell die Photo-Umwandlung und erhöhen Sie die Intensität des photochemisch umwandelnden 405-Nanometer-Lasers. Wenn die photochemische Umwandlung nachlässt, beenden Sie den Vorgang.
Wenn nach einer Erhöhung der Laserintensität keine weitere photochemische Umwandlung erfolgt, klicken Sie auf „aktuellen Schritt beenden“. Um das Experiment abzuschließen, speichern Sie die Datei. Um die gespeicherten Bilder zu verarbeiten, klicken Sie auf den Reiter „Verarbeitung“, erweitern Sie das Methodenmenü und erweitern Sie das PALM-Untermenü.
Wählen Sie erneut Palm aus den vier Unteroptionen aus. Wählen Sie das geeignete Bild, sodass es im Anzeigefenster erscheint. Erweitern Sie die Methodenparameter und klicken Sie auf „Auswählen“, um das Bild einzugeben, erweitern Sie das Einstellungsfeld und wählen Sie „Standard“, um die Peak-Erkennung und -Lokalisierung mit den Standardoptionen durchzuführen.
Drücken Sie im Bearbeitungs-Tab auf „Anwenden“, um das PALM-Bild zu berechnen, das in einem separaten Tab im Anzeigefenster erscheint, um schlecht erfasste Komponenten in den Daten zu filtern. Nutzen Sie das Nyquist-Abtasttheorem und das Werkzeug „PALM-Ausreißer entfernen“, um Peaks in Bereichen zu löschen, in denen der mittlere Abstand zwischen den Peaks, kleines d, zu groß ist, um eine Vesikel mit Durchmesser D im PALM-Bild des Anzeigefensters aufzulösen. Klicken Sie auf „Auswählen“, um das Bild einzugeben, und dann auf „Anwenden“. Das neue Bild erscheint in einem separaten Tab im Anzeigefenster, um schlecht lokalisierte Flora.Fours zu filtern.
Wechseln Sie zum PAL-Filter-Tab und beschränken Sie die akzeptierte Flora. Vier Lokalisierungsgenauigkeiten mit einem Sigma von weniger als 35 Nanometern. Um einen Anzeigemodus für das PAL-Bild zu wählen, wechseln Sie zum PAL-Rendering-Tab, wählen Sie eine Pixelauflösung und den gewünschten Anzeigemodus aus.
In diesem Bild ist ein repräsentatives Palm-Endprodukt der Abbildung und Verarbeitung eines neuronalen Vesikels mit dichtem Kern (DCV) in Rot dargestellt. Die lateralen Koordinaten der lokalisierten Florafours in Weiß werden im Centro-Anzeigemodus gezeigt, und das Super-Auflösungs-Bild des zugehörigen Vesikels wird im Gaußschen Anzeigemodus dargestellt. In dieser zweiten Abbildung sind analoge Weitfeldaufnahmen in Grün und Palm-Aufnahmen in Rot des Soma und der proximalen Fortsätze eines hippocampalen Neurons nach acht Tagen im In-vitro-Kultur, das tpa, ein danger two, exprimiert, dargestellt.
Wichtige Merkmale der Bilder sind die umfangreiche Eins-zu-eins-Übereinstimmung und Überlappung in Gelb zwischen den Punktstrukturen und den konventionellen sowie PALM-Bildern. Die deutlich geringere Größe der PALM-Punktstrukturen und die gelegentliche Auflösung einer einzelnen Punktstruktur im Weitfeld in mehrere PALM-Punktstrukturen. Hier ein PALM-Bild von D cvs entlang eines Teils eines Fortsatzes eines zweiten hippokampalen Neurons, das tpa exprimiert.
DENDRA zwei wird gezeigt. Beachten Sie den kleinen Durchmesser und das homogene Erscheinungsbild der Punktstrukturen sowie die seltene Beobachtung eng benachbarter Punktstrukturen, die putative DCV-Cluster darstellen. In dieser letzten Abbildung ist eine einfache quantitative Methode dargestellt, um zu bestimmen, ob zwei oder mehr CVS nahe genug beieinander liegen, um einen Cluster zu bilden.
Linienprofile der Punktintensitäten werden wie in den Diagrammen gezeigt erstellt und können anschließend zur Quantifizierung des DCV-Abstands und der DCV-Breite verwendet werden. Wenn der Abstand die Breite deutlich übersteigt, berühren sich die DCVs nicht. Wenn hingegen der Abstand etwa der Breite entspricht, könnten die DCVs gemäß diesen Kriterien in Kontakt stehen. Basierend auf diesen Kriterien wurden die DCVs auf diesem Bild als nicht in Kontakt eingestuft, während die DCVs auf diesem Bild als in Kontakt eingestuft wurden, nachdem dieses Verfahren angewendet wurde.
Andere Methoden, wie der zweifarbige Palm, können verwendet werden, um die relative Lokalisation unterschiedlicher Strukturen zu untersuchen.
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Übersicht
In diesem Artikel wird ein Protokoll zur Durchführung der photoaktivierten Lokalisierungsmikroskopie (PALM) zur Untersuchung der Vesikelorganisation in fixierten, kultivierten Neuronen beschrieben. Die Methode ermöglicht es Forschern, Fluoreszenzbilder mit Superauflösung zu erhalten, die Details über die Anordnung von Vesikeln offenbaren, die mit herkömmlicher Fluoreszenzmikroskopie nicht sichtbar sind.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Zellbiologie
- Super-Auflösungsmikroskopie
Hintergrund
- Vesikel spielen eine entscheidende Rolle bei der neuronalen Kommunikation.
- Das Verständnis der Vesikelorganisation ist entscheidend, um Einblicke in die synaptische Funktion zu gewinnen.
- Konventionelle Mikroskopie verfügt nicht über die Auflösung, um Vesikeldynamiken effektiv untersuchen zu können.
- Die photoaktivierte Lokalisierungsmikroskopie (PALM) bietet eine Lösung, indem sie bildgebende Verfahren mit Super-Auflösung bereitstellt.
Zweck der Studie
- Aufklärung der Organisation von Vesikeln in Neuronen.
- Vergleich von Vesikelabstand und -breite mithilfe von Liniendiagrammen der Intensität punktförmiger Strukturen.
- Verbesserung des Verständnisses von Vesikelclustern und deren Bedeutung für die synaptische Übertragung.
Verwendete Methoden
- Transfektion von hippocampalen Neuronen mit DNA, die photoconvertierbare Chimären kodiert.
- Sammlung spärlich abgetasteter Rohbilder mithilfe eines Super-Auflösungs-Mikroskopiesystems.
- Verarbeitung der Rohbilder zur Erzeugung von Super-Auflösungs-Bildern.
- Quantifizierung der Daten zur Analyse der Vesikelorganisation.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Abbildung der Vesikelorganisation in Super-Auflösung.
- Die quantitative Analyse lieferte Erkenntnisse über die Vesikelaggregation.
- Linienprofile zeigten Zusammenhänge zwischen Vesikelabstand und -breite auf.
- Die Ergebnisse tragen zu einem besseren Verständnis synaptischer Mechanismen bei.
Schlussfolgerungen
- Das auf PALM basierende Protokoll eignet sich zur Untersuchung der Vesikelorganisation.
- Die abbildungsbasierte Super-Auflösung liefert wertvolle Einblicke in die neuronale Funktion.
- Zukünftige Studien können auf dieser Methodik aufbauen, um synaptische Dynamiken weiter zu erforschen.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Mithilfe der Super-Auflösungs-Bildgebung lässt sich die präzise Charakterisierung subzellulärer Strukturen unterhalb der Beugungsgrenze ermöglichen und damit eine entscheidende Lücke bei der Zielvalidierung für die Arzneimittelforschung in der Neurowissenschaft schließen. Durch die Auflösung der Organisation von Vesikeln mit dichtem Kern im Nanometerbereich unterstützt dieses Verfahren die mechanistische Risikominimierung synaptischer Zielstrukturen und erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Identifizierung von Leitverbindungen. Es stellt ein krankheitsrelevante System zur Bewertung der Wirkung von Substanzen auf den Vesikeltransport und die Freisetzungsapparatur bereit.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Visualisierung der Vesikelorganisation mit einer Auflösung von <250 nm.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die biologische Risikominimierung durch direkte Beobachtung des Aggregationszustands von dichtkernhaltigen Vesikeln.
- Wissenschaftlicher Wert: Klärt die Beteiligung von Signalwegen an Mechanismen der synaptischen Vesikel Freisetzung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erstellt validierte neuronale Modelle für das High-Content-Screening von Modulatoren, die die Vesikeldynamik beeinflussen.
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert quantitative, reproduzierbare Messgrößen durch die Linienprofilanalyse der Punktintensität und -trennung.
- Wissenschaftlicher Wert: Etabliert die Standardisierung von Assays durch definierte Photoaktivierungs- und Bildgebungsparameter.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verwendet ein krankheitsrelevantes hippocampales Neuronensystem, das auf synaptische Dysfunktionsphänotypen ausgerichtet ist.
- Wissenschaftlicher Wert: Bietet translative Biomarker-Potenziale durch Metriken zur Vesikel-Trennung, die mit der Freisetzungswahrscheinlichkeit korrelieren.
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem die Wirkung von Substanzen auf die Vesikel-Clustering quantifiziert wird.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie vor der Optimierung von Leitverbindungen eine Überprüfung des Target-Engagements mit Super-Auflösung in neuronalen Modellen ermöglicht.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung von Vesikeltransportwegen durch direkte nanoskalige Visualisierung.
- Screening: Ermöglicht die Bereitschaft für Assays mittels sparsamer Stichprobenahme und Super-Auflösungs-Bildgebung von photoveränderbarem Transportgut.
- Analytik: Erzeugt quantitative Messungen abhängiger Variablen (Punktseparation, Breite) zum Vergleich von Bedingungen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität durch ein hippocampales Neuronenmodell, das für Gedächtnis- und kognitive Störungen relevant ist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert eine wiederverwendbare Super-Auflösungs-Fähigkeit für mehrere vesikelassoziierte Zielstrukturen über verschiedene Neurowissenschaftsprogramme hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit, indem die mechanistische Uneindeutigkeit bei der vesikelvermittelten Signalübertragung verringert wird.
- Operativer Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Protokolle zur Photoaktivierung und Bildverarbeitung.
- Strategischer Wert: Verbessert Entscheidungen über Fortführung oder Abbruch, indem strukturelle Nachweise einer Zielmodulation bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung basierend auf Phänotypen der Vesikelorganisation.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Super-Auflösungs-Mikroskopie und im Umgang mit photoveränderlichen Proteinen.
- Benötigt ein Super-Auflösungs-Mikroskopiesystem mit 405 nm-, 488 nm- und 561 nm-Laserlinien.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams bei der Bildaufnahme und bei den Bildverarbeitungsparametern voraus.
- Beinhaltet Anpassungsüberlegungen für verschiedene neuronale Modelle und Vesikel-Inhaltsstoffe.
- Umfasst praktische Einschränkungen wie Photobleichen und die Markierungseffizienz, die die Signaldichte beeinflussen.
