Der Einsatz von Gas-Chromatographie zu Änderungen der Zusammensetzung der Fettsäuren in Rattenlebergewebe während der Schwangerschaft Analysieren

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Fettsäurezusammensetzung der Leber zu analysieren. Dazu wird zunächst eine Leberprobe abgewogen und homogenisiert. Der zweite Schritt besteht darin, das gesamte Lipid aus der homogenisierten Leberprobe zu extrahieren.

Anschließend werden die einzelnen Lipidklassen wie z.B. Cholesterinester mittels Festphasenextraktion getrennt. Der letzte Schritt ist die Ifizierung und Ableitung der Lipidklassen in Fettsäuremethylester. Letztendlich wird mit Hilfe der Gaschromatographie gezeigt, wie sich die Fettsäurezusammensetzung von Geweben nach einem ernährungsphysiologischen Eingriff verändern oder durch Veränderungen des physiologischen Zustands wie z.B. eine Schwangerschaft beeinflusst werden kann.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die Zusammensetzung von Gewebefettsäuren geben kann, kann sie auch auf andere Probentypen wie Öl, Samen und Lebensmittel angewendet werden. Im Allgemeinen können Benutzer, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da einige Teile des Protokolls manuelle Geschicklichkeit und Übung erfordern, wie z. B. die wiederholte Sammlung von oberen und unteren Phasen. Das Verfahren wird von Hena, Fisk und Annette West, einer Technikerin und Doktorandin aus unserem Labor, vorgeführt.

Schneiden Sie zuerst etwa 100 Milligramm gefrorene Leber und wiegen Sie das Gewebe. Legen Sie das Taschentuch in ein Plastikröhrchen in einem Eiskübel und fügen Sie 0,5 Milliliter eiskaltes, 0,9%iges Natriumchlorid hinzu. Homogenisieren Sie dann das Gewebe und geben Sie es in ein Glasröhrchen mit Schraubverschluss.

Verwenden Sie weitere 0,3 Milliliter 0,9 % Natriumchlorid, um das restliche Gewebe in das Glasröhrchen mit Schraubverschluss zu übertragen. Anschließend werden 100 Mikrogramm Cholesterin heta dechen standard, gelöst in zwei zu eins, trockenes Chloroform zu Methanol in das Röhrchen gegeben, gefolgt von weiteren fünf Millilitern derselben Lösungsmittellösung, die 50 Milligramm pro Liter butyliertes Hydroxytoluol enthält. Nachdem Sie einen Milliliter eines molaren Natriumchlorids hinzugefügt haben, verschließen Sie das Röhrchen und mischen Sie die Probe gründlich, indem Sie sie vortexen, bis sie gleichmäßig aussieht.

Zentrifugieren Sie dann die Probe bei 1000 mal G für 10 Minuten mit geringer Pause bei Raumtemperatur. Wenn Sie fertig sind, sammeln Sie die untere Phase mit einem Glas an ihrer Pipette vorbei und geben Sie sie in ein neues Glasröhrchen mit Schraubverschluss. Anschließend trocknen Sie die Probe unter Stickstoff bei 40 Grad Celsius.

Schließen Sie an dieser Stelle den SPE-Tank an eine Vakuumpumpe an und setzen Sie eine Aminopropylkieselsäure-SPE-Kartusche auf den Tank. Legen Sie ein neues Glasröhrchen mit Schraubverschluss mit den Bezeichnungen TAG und CCE in das Tankgestell unter der Säule, um die erste Fraktion aufzufangen. Lösen Sie den Gesamtlipidextrakt in einem Milliliter trockenem Chloroform auf und mischen Sie die Probe durch Vortexen.

Übertragen Sie anschließend die Probe mit einer Glaspastenpipette in die Säule und lassen Sie die Flüssigkeit unter der Schwerkraft in das Schraubverschlussröhrchen tropfen. Wenn die Flüssigkeit nicht mehr aus der Säule tropft, entfernen Sie die restliche Flüssigkeit durch Vakuum. Als nächstes eluieren Sie die TAG- und CE-Fraktion, indem Sie die Säule zweimal mit einem Milliliter trockenem Chloroform unter Vakuum waschen.

Wenn die gesamte Flüssigkeit aus der Säule ausgetreten ist, trocknen Sie die TAG- und CE-Fraktion unter Stickstoff bei 40 Grad Celsius. Setzen Sie eine neue Aminopropylkieselsäure-SPE-Kartusche auf den SPE-Tank und legen Sie ein Glasröhrchen mit Schraubverschluss in die Tankwanne unter der Kartusche, um den Abfall aufzufangen. Waschen Sie die Säule dreimal mit einem Milliliter trockenem Hexan unter Vakuum.

Waschen Sie die Säule nach dem Ausschalten des Vakuums mit einem letzten Milliliter H-Hexan unter der Schwerkraft. Nachdem das Abfallrohr durch ein neues Schraubglasröhrchen mit der Bezeichnung CE ersetzt wurde, lösen Sie die getrocknete TAG- und CE-Fraktion in einem Milliliter trockenem Hexan auf und mischen Sie die Probe durch Vortexen. Übertragen Sie dann die Probe mit einem Glaspass oder einer Pipette in die Säule und lassen Sie die Flüssigkeit unter der Schwerkraft durch die Säule tropfen.

Wenn die Flüssigkeit nicht mehr aus der Säule tropft, entfernen Sie die restliche Flüssigkeit unter Vakuum unter Vakuum. Waschen Sie die Säule zweimal mit einem Milliliter trockenem Hexan, um das CE zu eluieren, und trocknen Sie die gesammelte Fraktion unter Stickstoff bei 40 Grad Celsius. Anschließend werden 0,5 Milliliter trockenes Toluol zur abgetrennten CE-Fraktion gegeben und die Probe durch Vortexen vermischt.

Geben Sie einen Milliliter eines zuvor hergestellten Methylierungsreagenzes zu der in trockenem Toluol gelösten Probe. Verschließen Sie dann das Röhrchen fest und mischen Sie: Erhitzen Sie die Probe vorsichtig zwei Stunden lang bei 50 Grad Celsius. Sobald die Proben auf Raumtemperatur abgekühlt sind, fügen Sie einen Milliliter Neutralisationslösung hinzu.

Als nächstes fügen Sie der Probe ein trockenes Hexan hinzu Nach dem Vortexen zentrifugieren Sie die Proben zwei Minuten lang bei 250 mal G mit geringer Pause bei Raumtemperatur. Wenn du fertig bist, sammelst du die obere Fame-Phase und überträgst sie in eine neue Einweg-Glasröhre ohne Schraubverschluss. Trocknen Sie die gesammelte Fame-Probe unter Stickstoff bei 40 Grad Celsius.

Nachdem Sie einen Abfallschlauch in den SPE-Tank und eine Kieselgel-SPE-Kartusche auf den Tank gelegt haben, waschen Sie die Säule dreimal mit einem Milliliter trockenem Hexan unter Vakuum und einem Milliliter trockenem Hexan unter Schwerkraft. Nach der Entnahme der Abfälle wird gewaschen. Geben Sie einen neuen Abfallschlauch in den Tank und lösen Sie dann die CE-Fame-Probe in einem Milliliter trockenem Hexan auf.

Nachdem Sie die Probe durch Vortexen gemischt haben, übertragen Sie sie mit einem Glaspass oder einer Pipette in die Säule. Sobald die Flüssigkeit unter Schwerkraft durch die Säule getropft ist, waschen Sie die Säule dreimal mit einem Milliliter Hexan unter Vakuum. Entfernen Sie als Nächstes die Waschabfälle und setzen Sie ein neues Schraubverschlussrohr mit der Aufschrift CE Fame in den Tank ein.

Eluieren Sie die CE-Fame-Fraktion mit zwei Ein-Millilitern 95 bis fünf trockenem Hexan zu d-Ethylether. Anschließend trocknet man die gesammelte Fraktion unter Stickstoff bei 40 Grad Celsius, löst die getrocknete Fraktion in 75 Mikrolitern trockenem Hexan auf und mischt die Probe durch Vortexen, nachdem die Probe durch Vortexen vermischt wurde. Übertragen Sie es nach Wiederholung des vorherigen Schritts in ein GC-Fläschchen für die automatische Probe.

Analysieren Sie die Probe auf einem Gaschromatographen, wenn das Protokoll erfolgreich befolgt wurde. Es sollte ein Chromatogramm mit klaren symmetrischen, gut definierten Peaks und mit minimalem Hintergrundrauschen erhalten werden, wie hier dargestellt. Wenn eine Kontamination aufgetreten ist, zeigt das Chromatogramm zusätzliche Peaks und zeigt unsymmetrische oder verzerrte Peaks, wie hier gezeigt.

Eine Kontamination durch freies Cholesterin tritt beim Ausführen von Fame aus CE auf, es sei denn, das Cholesterin wird entfernt. Die Verwendung einer vorbereiteten Kalibriermischung ermöglicht die Identifizierung des Fams in der Probe. Die Kalibrierungsmischung wird mit den gleichen Geräteeinstellungen wie die Proben durchgeführt, so dass das Chromatogramm mit der Probe verglichen und die Peaks anhand ihrer Retentionszeiten identifiziert werden können, wie hier dargestellt.

Der 16 Null-Peak ist hier hervorgehoben, um den Vergleich der Retentionszeiten von der Kalibriermischung im oberen Chromatogramm mit den Fettsäuren zu veranschaulichen. In der unteren Probenspur wird die korrekte Markierung der Fettsäuren als Peakbereich verwendet, um den Prozentsatz der spezifischen Fettsäuren innerhalb der Gesamtmenge zu berechnen. Nachdem die Daten gesammelt wurden, ist es sinnvoll, sie auf Ausreißer zu untersuchen, wie hier gezeigt.

Ausreißerproben können dann weiter untersucht und die Extraktion und/oder Analyse bei Bedarf wiederholt werden. Wie hier gezeigt, wird der Ruhm in der Leber CE der Ratte als Prozentsatz der Gesamtfettsäuren in der Leber CE beschrieben. Diese Daten beschreiben die CE-Fettsäuren in der Leber von jungfräulichen oder trächtigen Ratten, die 20 Tage lang mit einer von drei verschiedenen Diäten gefüttert wurden.

Die statistische Analyse mit Hilfe von Innova mit zwei Faktoren zeigt signifikante Auswirkungen von Ernährung und Schwangerschaft auf den Anteil mehrerer Fettsäuren sowie signifikante Wechselwirkungen zwischen Ernährung und Schwangerschaft. Zur Veranschaulichung: Der Onsäuregehalt von Leber-CE bei trächtigen Ratten wird stärker von der Ernährung beeinflusst als der von jungfräulichen Weibchen. Mit dieser Technik können bei korrekter Durchführung 20 Proben pro Tag von Anfang bis Ende durchgeführt werden.

Einmal gemeistert, kann die Chargenverarbeitung von Proben den Durchsatz erhöhen und die in einer Woche verarbeitete Menge verdoppeln. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Fettsäurezusammensetzung einzelner Lipidklassen mittels Festphasenextraktion und Gaschromatographie analysieren können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lösungsmitteln äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Arbeiten in Abzügen und das Tragen geeigneter PSA getroffen werden sollten.