Name: A Novel Stretching-Plattform für Anwendungen in der Zell-und Gewebe Mechanobiologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 16 min 46 s
Description: Erfahren Sie, wie eine neuartige anisotrope Dehnungsplattform zur Untersuchung von Einzelzellreaktionen auf mechanische Deformation und zur Quantifizierung mechanischer Gewebe-eigenschaften eingesetzt wird.

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DT wurde von einem Postdoc-Stipendium von le Fonds de Recherche du Québec-Nature et Technologies (FQRNT) und eine MITACS Elevate Strategische Fellowship unterstützt. CMC wurde von einem Postdoc-Stipendium von le Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) und Ernest und Margaret Ford Kardiologie dotierten Forschungsstipendium an der University of Ottawa Heart Institute unterstützt. EOB wurde durch Betriebskostenzuschüsse MOP80204 von der kanadischen Institut für Gesundheitsforschung (CIHR) und T6335 aus der Herz-und Schlaganfall-Stiftung von Ontario unterstützt. Die CIHR und Medtronic kollektiv EOB mit einem Peer-Review-Research Chair (URC # 57093). AEP wird durch die Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Entdeckung Grant, NSERC Discovery Accelerator Supplement finanziert und dankt der Unterstützung des Canada Research Chairs (CRC)-Programm und einer früh Researcher Award aus der Provinz Ontario.

1. Mechanische Verformung von Einzelzellen <ol><li> Die Herstellung einer PDMS Substrat mit Embedded Leuchtstoffperlen Vor der Herstellung des Substrats werden fluoreszierenden Mikrosphären in einer Wasserlösung in Isopropanol suspendiert zu Wulst Mischen in PDMS aufgrund der hydrophoben Natur zu verbessern. <ol><li> Pipette 500 ul von fluoreszierenden Mikrokugeln in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 16.200 × g für 10 min. </li><li> Überstand verwerfen und fügen Sie 500 ul Isopropanol folgte mit 5 min von Vortex. Setzen Sie die Fläschchen beiseite über Nacht im Dunkeln, damit keine großen Partikel-Aggregate zu sedimentieren. </li><li> Am nächsten Morgen, entfernen Sie vorsichtig den Überstand in ein sauberes Mikro Fläschchen. Dieser Bead-Lösung kann verwendet werden, um mehr als 5 Substrate herzustellen. HINWEIS: Die Bead-Lösung wird sich weiterhin für die nächsten 3 Tage zu sedimentieren. Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, Resuspendieren des Pellets. </li><li> Pour 0,5 g des Härters bereitgestelltmit dem PDMS-Kit in einem 1,5-ml-Mikro Fläschchen mit einem wissenschaftlichen Gleichgewicht. Durch die aufeinanderfolgenden Schritten, fügen Sie insgesamt 90 ul-Perlen (in sechs 15 ul Ergänzungen), Vortexen für 1 Minute zwischen jeder Zugabe. Beiseite stellen. </li><li> Gewicht von 10 g PDMS und Mischen für mindestens 12 min mit 0,5 g des Härters mit fluoreszierenden Kügelchen ergänzt. </li><li> Fabrizieren eine SU-8 2050 Kreuzform mit Standard-Photolithographietechniken folgenden Anweisungen des Herstellers. Die verwendete Form weist eine Höhe von 320 um und einer Fläche von 13,4 cm 2 (Fig. 3). Die Form kann 428 ul oder 440 mg PDMS enthalten. </li><li> Pour 400 mg des PDMS mit Perlen in der kreuzförmigen Form mit Hilfe einer Transferpipette und Heilung für 2 Stunden bei 80 ° C. Nach dem Aushärten Abziehen des Substrats von der Form (Fig. 5A). Das Substrat kann in einer Petrischale bei Raumtemperatur für 2 Wochen ohne eine signifikante Änderung in seiner mechanischen Eigenschaften gehalten werden. </li&gt; <li> Gießen Tröpfchen PDMS (Härter: PDMS mit einem Verhältnis von 1,20) in einer Petrischale mit einer endgültigen Größe von etwa 4 mm im Durchmesser und härten sie auf den Kopf für 2 h bei 80 ° C (Fig. 5B). Diese Verankerungs Merkmale können in einer Petrischale für Wochen aufbewahrt. HINWEIS: Halten Sie die Schüssel auf den Kopf, um die Tropfen aus Abflachung während der Aushärtung zu verhindern. </li><li> Air-Plasma-Behandlung (30 sec bei 30 W) das Substrat und 8 Verankerung Funktionen. Binden die Eigenschaften an jedem Ende des Substrats in einem Abstand von 4 mm von der quadratischen Gedankenstrich auf dem Substrat (Fig. 5C) vorhanden. </li></ol></li><li> Montage Membrane auf den Schellen <ol><li> Wickeln Sie jedes Ende des Substrats um die gerillten zylindrischen Teil der Klemmen und befestigen Sie sie mit den zwei Befestigungsschrauben von oben (2B und 5D-E). </li><li> Schrauben Sie die 4 Klammern auf dem Klemmhalter und gießen PDMS (Verhältnis 1:20) mit einem Einweg-transfer Pipette an der Schnittstelle zwischen dem Substrat und der genuteten zylindrischen Teil der Klammern. Verbreiten Sie die nicht ausgehärteten PDMS rund um den genuteten zylindrischen Teil mit einem 1,5 mm-Sechskantschlüssel. </li><li> Gießen PDMS (1:20) in die Nuten, bis sie vollständig durch Kapillarwirkung gefüllt und die Anordnung zu härten bei 80 ° C für 2 h (Fig. 5F). </li></ol></li><li> Impfen Zellen auf der Membran <ol><li> Air-Plasma-Behandlung (30 sec bei 30 W) die ganze Versammlung zu sterilisieren und zu funktionalisieren, die das Substrat für die Kollagenbeschichtung ermöglichen. </li><li> Funktionalisieren den Bereich des Substrats, wo Zellen mit 1 ml 0,02 M Essigsäure mit 16 ug / ml Rattenschwanzkollagen bei Raumtemperatur 1 h ergänzt ausgesät werden. Die gewünschte endgültige Kollagendichte ist 5 ug / cm 2. </li><li> Mit Phosphatpuffer spülen Substrat 3x und lassen Sie es trocken bei Raumtemperatur für mindestens 10 min. </li><li> 40 &amp;mgr; l Kulturmedium mit 10% fötalem Rinder seru ergänztm und 1% Penicillin-Streptomycin enthält 2.000 Zellen in dem zentralen Abschnitt des Substrats, um eine Fläche von 1 cm 2 bedecken (Zelldichte: 20 Zellen / mm 2). Zelldichte nach Versuchsanforderungen verändert werden. </li><li> Setzen Sie die gesamte Anordnung in einem Standardzellkulturbrutschrank bei dem das Substrat nach oben mit dem Tropfen Kulturmedium, Zellen darauf. HINWEIS: Die Montage muss das Substrat nach oben für mindestens 3 Stunden, damit Zellen zu fest an sie gehalten werden. Um die Verdampfung zu verhindern, wird 30 ul warmes Kulturmedium in den Tropfen auf dem Substrat alle 45 min während 3 h zugegeben. </li><li> Nach 3 Stunden, drehen die ganze Versammlung in eine Petrischale mit frischem Kulturmedium gefüllt, um das Substrat untertauchen und Inkubation über Nacht, sodass die Zellen zu vermehren. </li><li> Am nächsten Tag vorzubereiten HEPES-gepufferter Salzlösung (HBSS, 20 mM Hepes, 120 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 0,8 mM MgSO 4, 1,8 mM CaCl 2, 11,1 mM dextrose). Den pH-Wert auf 7,4. HINWEIS: Die HBSS-Lösung muss täglich frisch hergestellt und bei 37 º C während des Experiments gehalten. Diese physiologische Lösung wird verwendet, um die Zellen auf dem Objekttisch durch Nachahmung der normalen Gewebe / Blut-Umgebung aufrechtzuerhalten. </li><li> Montieren Sie das Set-up auf invertierten Phasenkontrast-oder Fluoreszenzmikroskop Montieren Sie die Klemme-Substrat-Baugruppe auf der BAXS Plattform und Motoren. Füllen Sie die Petrischale in der Petrischale Heizung mit HEPES-Puffer (2D). </li></ol></li></ol> 2. Steifigkeit Messung der Kleinkaliber Schiffe <ol><li> Vorbereitung <ol><li> Krebs physiologischer Lösung: Eine Lösung von 118,1 mM NaCl, 11,1 mM D-Glucose, 25 mM NaHCO 3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4 und 2,5 mM CaCl 2. Den pH-Wert auf 7,4 und mit Sauerstoff der Lösung mit Carbogen medizinisches Gas (95% O 2/5% CO 2) für 30 min. HINWEIS: Der Krebs-Löauf muss täglich frisch hergestellt und bei 37 º C während des Experiments gehalten. Diese physiologische Lösung wird verwendet, um die lebendig Gewebe durch Nachahmung der normalen Gewebe / Blut-Umgebung aufrechtzuerhalten. </li><li> Sammeln Instrumentierung für die Zerlegung und mechanische Beurteilung der Aorten-Behälter: chirurgische Schere, Pinzette gebogen, Mikro-Scheren, chirurgische Binokular, 50 ml Polypropylenzentrifugenröhrchen, 10 ml und serologischen Pipetten. Das chirurgische Verfahren und Experiment keine sterilen Bedingungen. Montieren Sie die Klemmen des BAXS Plattform zusammen mit der Wägezelle vorher. </li></ol></li><li> Tissue Isolierung und Dissection Alle Experimente mit Labortieren haben, die von der Animal Care und Verwenden Ausschuss der Nutzer Institution, die mit der Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren der der Nutzer entspricht &quot;Land genehmigt werden. <ol><li> Führen Maus Euthanasie mit der Inhalation von 99% CO 2 (7 psi)in einer Plexiglaskammer (6A). </li><li> Offene Maus Bauch und schneiden Sie die Brustaorta, die Maus zu bluten. </li><li> Entfernen Sie die Blende, den Brustkorb und die Lungenlappen (6B). HINWEIS: Um die Gefahr einer Beschädigung des Gewebes zu minimieren, halten das Herz, die Aorta befestigt und vermeiden direktes Berühren des Schiffes, aber mit dem Herzen manipulieren. </li><li> Entfernen des Herzens, der Aortenwurzel und der Aorta durch leichtes Schneiden zwischen dem Behälter und der Wirbelsäule. HINWEIS: Führen Sie keine Dehnung im Behälter während der Exzision herbeiführen, um die innere Struktur des Gewebes intakt (6C) zu halten. </li><li> Sofort tauchen und halten das Herz und die Aorta in Krebs-Lösung. </li><li> Schneiden und sorgfältig waschen die Aorta in Krebs-Lösung, um alle Blutgerinnsel zu entfernen. Entfernen Bindegewebe mit Mikro-Schere, Pinzette und chirurgische Binokular (6D-E). HINWEIS: Bewahren Sie alle Schiffslänge und verwenden Sie die aortic Wurzel, das Schiff Ausrichtung zu bestimmen. </li></ol></li><li> Schiff Dimension Ermittlung und Montage Um die Steifigkeit des Behälters zu bestimmen, werden die entladenen Behälterabmessungen erforderlich und kann mit einem kalibrierten Mikroskop bestimmt werden. <ol><li> Schneiden Sie ein Aorten-Ring von etwa 2 mm in der Länge und präzise die Länge messen mit einem kalibrierten Mikroskop-Einstellung (6F-G). Setzen Sie dieses Segment beiseite in Krebs-Lösung. </li><li> Geschnitten andere Aortaring so klein wie möglich zwischen den einzelnen Segmenten 2 mm (6F). Diesen kleinen Segment auf einem Mikroskopglasobjektträger mit dem Lumen nach oben und messen die Wandstärke mit einem kalibrierten Mikroskopeinstellung (6H). </li><li> Füllen Sie die Petrischale auf der BAXS Plattform mit Krebs-Lösung und der Aorta 2 mm Ringsegment auf der Ziehstifte (in 4C eingelassen) einfügen. </li></ol></li></ol> ge = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. PDMS-Substrat Fertigung und Montage. A) Nach dem Aushärten wird das Substrat vorsichtig von den SU-8 2050 Form geschält und beiseite stellen in einer Petrischale. B) Verankerung Funktionen von PDMS und helfen, das Substrat, auf die Sicherung Schellen. C) Substrat mit Verankerungs Funktionen bereit für die Montage. D) Das Substrat wird auf den 4 Klemmen, die dann auf dem Klemmhalter montiert sind (siehe Kasten) montiert. E) Detailaufnahme der auf den 4 Klemmen montiert Substrat. F ) Verfahren des Gießens PDMS in der Nut unterhalb des Substrats. Der Pfeil zeigt die PDMS langsam füllt die Nut durch Kapillarwirkung. 454fig6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Abbildung 6. Vorbereitung und Isolierung der thorakalen Aorta. A) Vorbereitung chirurgischer Instrumente und die eingeschläfert Maus. B) Durch eine Längsbauchschnitt, der Brustkorb-und Lungen Lobs entfernt werden. C) Die Aorta ist sorgfältig mit dem Herzen zu manipulieren entfernt das Gewebe. D) Das Herz und die Aorta in Krebs physiologischen Lösung setzen. Die Aorta wird durch Entfernen aller Bindegewebe gereinigt. E) Detaillierte Abbildung zeigt das Herz und die Aorta. F) Aorta-Segment für Steifigkeit Beurteilung zusammen mit kleinen Segmenten zur Dickenmessung verwendet. GH) Die genaue Länge (G) und Dicke (H) von jeweils Gefäßsegmente werden mit einem inversen Mikroskop und ein Analyseprogramm ausgewertet.

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die hier vorgestellten BAXS Plattform ermöglicht zahlreiche Experimente in der Studie von Mechanobiologie aus Untersuchungen von Einzelzellen zu ganzen Geweben. Außerdem ist die Plattform hoch flexibel und konfigurierbar, so dass für zahlreiche mechanische Stimulationsexperimente und multiaxiale Zugversuch. Die Plattform ermöglicht auch die Aufrechterhaltung von Zellen und Geweben unter physiologischen Bedingungen und ermöglicht die gleichzeitige Mikroskopie während des Streckens Experimenten. Die beiden in den vorherig...

Die mechanische Mikro spielt eine wichtige Rolle in vielen Zellfunktionen wie Proliferation, Migration und Differenzierung, die eine tiefgreifende Wirkung auf die Entwicklung und die Homöostase von Geweben und auch Krankheiten 1-6 haben. Im Laufe der Jahre eine Vielzahl von experimentellen Werkzeuge werden verwendet, um mechanisch zu stimulieren Zellen oder Geweben zu messen und mechanischen Eigenschaften von biologischem Gewebe mit dem Ziel der Erhöhung der unser Verständnis der Grund Mechanobiologie und Untersuchung der Entstehung und Progression von Krankheiten 6-17. Allerdings muss man oft auf verschiedenen experimentellen Vorrichtungen, um die Ziele einer bestimmten Untersuchung zu erreichen. Dieser Artikel stellt eine Einzel-, Multi-Funktions-, biaxiale Streckung (BAXS)-Plattform, die für die Studien, die die Rolle zu untersuchen, dass die mechanischen Eigenschaften und mechanische Kräfte spielen in der Biologie an der sub-zellulären, ganze Gewebelängenskalen erlaubt. Die BAXS Plattform ermöglicht nicht nur für die quantification der mechanischen Eigenschaften von Geweben isoliert, sondern erleichtert auch die Fähigkeit, einfache, komplexe und dynamische Spannungsfeldern auf lebende Zellen, um ihre Reaktion auf Strecken, die in vivo auftritt verstehen anzuwenden. Die Plattform BAXS behält auch die Fähigkeit lebender Zellen Mikroskopie bei der mechanischen Prüfung und Störungen auf Zellen und Gewebe durchzuführen. Die BAXS Plattform ist ein custom-built Vorrichtung, die verwendet werden können, um die Wirkung der Substratdeformation auf zellulärer Ebene zu untersuchen und durchzuführen, Zugversuche an biologischen Geweben (Abb. 1A). Eine Aluminium Heizvorrichtung wurde hergestellt, um eine Standard-10-cm-Petrischale aufzunehmen und irgendwelche physiologischen Lösungen aufrechterhalten bei 37 ° C mit einem Temperaturregler und Kapton Heizer (Fig. 1B). Diese BAXS Plattform auf einem invertierten Phasenkontrast und / oder Fluoreszenzmikroskop integriert werden und ermöglicht die gleichzeitige Bildgebung (Fig. 1C).Kurz gesagt, die BAXS Plattform besteht aus vier linearen Schwingspulenmotoren, von denen die beweglichen Teile auf Miniatur-Linearbewegung-Kugellager gleitet entlang von zwei senkrechten Achsen (Fig. 1D) ausgerichtet montiert ist. Ein Linearstellstufe zu jeder der vier Motoren angebracht, um die vertikale Bewegung des Spannsystems, mit (1E) werden können. Die Position jedes Motors wird durch einen optischen Codierer mit einer Auflösung von 500 nm (Fig. 1F) überwacht. Alle vier Motoren sind unabhängig voneinander mit einer Bewegungssteuerung, die optische Encoder-Feedback, Bewegungsbefehle (1G) ausführen gesteuert. Ein LabVIEW-Schnittstelle bietet die volle Kontrolle über die Verschiebungsgröße, Geschwindigkeit und Beschleunigung jedes Motors, um vollständig anpassbar, statische und dynamische Verformung der Zellen oder Gewebeproben zu generieren. Die Einrichtung zur Verformung in Zellen zu induzieren Technik wird erreicht, indem einfach allowing Zellen fest an einem flexiblen und transparenten Substrat zu haften und dann Strecken dieses Substrat mit den vier Motoren der BAXS Plattform. Die Plattform ermöglicht die Montage BAXS jeder maßgeschneiderten Satz von Klammern, um das Substrat auf den Schwingspulenmotoren befestigen. Zu diesem Zweck haben wir eine Reihe von Klemmen, um die ein flexibles und transparentes Substrat, Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellt ist, kann angebracht werden (Fig. 2A-C und Fig. 3). Da die Klemmen werden physiologischen Lösungen ausgesetzt werden, wurden alle Teile aus rostfreiem Stahl gefertigt, um für die Sterilisation zu ermöglichen. Diese Klemmen sind sorgfältig entworfen, um das Substrat so nahe wie möglich an dem Mikroskopobjektiv zu bringen, um die Bildqualität zu verbessern und gleichzeitig eine Minimierung der Belastung des Substrats während des Streckens (Fig. 2D). Das gleiche BAXS Plattform kann auch verwendet werden, um die Steifheit der kleinen Gewebeproben zu quantifizieren, unter Verwendung eines geeigneten Satzes von Klemmen mit ADAPted Träger für die Gewebeproben und einer Lastzelle, um Kräfte zu überwachen. Verschiedene Ansätze werden können, um ein Gewebe zu den BAXS Plattform Motoren montieren; in diesem Fall werden die Edelstahl-Insekten minutiens Stifte durch die Öffnung des Gefäßgewebe um Zugversuche (Fig. 4A-B) führen zu haken. Alternativ für dicke Gewebe ohne eine natürliche Öffnung, Gewebekanten können entweder in der Position mit den Klemmen an den Schwingspulenmotoren angebracht oder mit kleinen Glasobjektträger mit biologischen Kleber verklebt und an die Motoren mit den Klemmen befestigt gehalten werden. Um Zug-Tests durchführen, ein Miniatur-Wägezelle ist erforderlich und kann leicht auf die Plattform BAXS Motoren eingebaut und verwendet, um die während einer Streckzyklus (4C) auf das Gewebe wirkenden Kraft zu messen. Da die BAXS Plattform von vier Motoren besteht, die Einführung einer zweiten Lastzelle erlaubt es, Zugprüfmaschine entlang zweier orthogonaler Richtungen durchzuführen. Diese Fähigkeit ermöglicht es, quantify die mechanische Steifigkeit eines einzelnen Gewebe entlang zwei senkrechten Richtungen im gleichen Experiment. Wichtig ist, dass in allen Konfigurationen, die Zellen oder Gewebeproben von Interesse sind immer in einem temperaturkontrollierten Bad, das für den Benutzer zugänglich ist, gehalten. Diese Fähigkeit ermöglicht die Einführung von pharmakologischen Mitteln während der Proben Strecken, um die zeitliche Antwort der Probe zu untersuchen. Zusätzlich, da die optische Achse des umgekehrten Mikroskop unbehindert bleibt, sind immer noch alle Formen der Mikroskopie für den Benutzer verfügbar. Schließlich wird, wie alle vier Motoren der BAXS Plattform unabhängig ist es möglich, in hohem Maße konfigurierbar Spannungsfeldern auf die Probe von Interesse anzuwenden. In vivo Zellen und Gewebe ausgesetzt sind komplex und anisotrope Streckung, angemessener nachgeahmt in dieser Plattform gegen sein kann zu herkömmlichen einachsigen Dehnung Plattform 7,13,15,18,19. Darüber hinaus sind die physikalischen Eigenschaftender Dehnungsfeld kann dynamisch während eines Experiments geändert werden. Diese Fähigkeiten ermöglichen es dem Benutzer, den Zell-und Gewebeebene als Reaktion auf eine große Anzahl von komplexen, anisotropen, zeitlich und räumlich variierenden Spannungsfelder zu prüfen. Dieser Artikel beschreibt die Vorteile und Grenzen der BAXS Plattform sowie sein Design, Funktionsprinzipien und die experimentellen Details für einzelne Zelle und ganze Gewebe Experimenten. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Übersicht der BAXS-Plattform. A) Top Blick auf die BAXS Plattform, welche die vier Schwingspulenmotoren. B) Detailaufnahme der Petrischale Heizung Die Plattform kann auf einem inversen Mikroskop live-montiert werden verwendet, um Zellen und Gewebe bei 37 ° C C zu halten) Cell Imaging Experimente während der Dehnung.D) Detailaufnahme des Schwingspulenmotor; der bewegliche Teil der Plattform. E) Detaillierte Abbildung des linearen Positionierungsstufe ermöglicht vertikale Verschiebung der Spannsystemen. F) Detailaufnahme des optischen Encoder, der Echtzeit-Position des Motors bietet der Bewegungssteuerung. G) Detailaufnahme der Motion-Controller, der die vier optischen Encoder-Eingänge und Stromausgänge zu den vier Schwingspulenmotoren. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig2highres.jpg" width="500" /> 2. Spannsystem für Zellstreckexperimente. AB) Bilder, welche die Details der zur Herstellung der PDMS-Substrat zu den Schwingspulenmotoren für die Dehnung. C) Das Substrat wird um den zylindrischen Teil der Klemme mit seiner Verankerung featur gewickelt befestigen Schellenes sitzt in der Nut an der Spitze. Dann wird das Substrat mit den Stellschrauben, die das Substrat schieben / Verankerung Features in die obere Nut D) Illustration der BAXS Plattform mit die Klammern halten das Substrat an Ort und Stelle gesichert.. Der Einschub zeigt eine Detailansicht des Substrats mit Zellen daran befestigt sitzt direkt über einem Deckglas und dem Mikroskopobjektiv. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig3highres.jpg" width="500" /> 3. Stückmaterialien der Membran und ihre Spannsystem. Zeichnungen, die die Abmessungen der Hauptteile integriert werden, um die biaxiale Streckung Plattform Zellexperimente durchzuführen. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig4highres.jpg" width="500" /> 4. Exreichlich von einem Spannsystem für Steifigkeit Beurteilung der Kleinkalibergefäße. AB) Detailbilder des Spannsystems verwendet, um eine Verformung in einem 1 mm Durchmesser Maus Aorta zu induzieren. Edelstahl-Pins wurden sorgfältig in offene Dreiecke geformt, dass das Schiff auf beide Pins gleiten. C) Illustration der BAXS Plattform mit die Klammern halten das Schiff und eine Lastzelle zwischen der feststehenden Motor und der linken Klammer befestigt. Der Einschub zeigt eine detaillierte Draufsicht des auf den Stiften montiert Gefäß.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 kg</td><td>Das in diesem Protokoll verwendete Verhältnis von Base zu Vernetzer beträgt 20:1. Mischen Sie eine laminare Haube ein, um zu verhindern, dass Staub Ihre Haut verunreinigt.</td></tr><tr><td>FluoSpheres fluoreszierende Mikrosphären</td><td>Invitrogen</td><td>F8810</td><td>Vor Licht schützen.</td></tr><tr><td>Lineare Schwingspule</td><td>Moticont</td><td>LVCM-051-051-01</td><td>Die motro wird in zwei Teilen (Magnet und Spule) geliefert. Er muss auf einem Kugellagersystem montiert werden, um funktionsfähig zu sein.</td></tr><tr><td>Kugelgelagerter</td><td>Schlitten Edmund Optics</td><td>NT37-360</td><td>Miniatur- und kleine Linearführungen mit Kugellager</td></tr><tr><td>Linearer Positioniertisch</td><td>Edmund Optics</td><td>38-960</td><td>Zentrierantrieb 1,25" quadratische lineare Verschiebungstische</td></tr><tr><td>Optischer Encoder</td><td>GSI microE systems</td><td>Mercury II 1600S -</td><td>Reflektierender Inkrementalgeber</td> mit 0,5 μm Auflösung.</tr><tr><td>Motion Controller</td><td>Galil</td><td>DMC-2143(DIN)-DC48 mit AMP-20440</td><td>4-Achsen-Controller mit einem 4-Achsen-Verstärker</td></tr><tr><td>Wägezelle</td><td>Honeywell</td><td>31 niedrige</td><td>Miniatur-Wägezelle mit einem Bereich von 0-150 g</td></tr><tr><td>Insektenminutiens Pins (0,20 mm)</td><td>Pin Service Austerlitz Insektenstifte</td><td></td><td>Edelstahlstifte, die in einer offenen Dreiecksform gebogen sind</td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Micro Chem</td><td>SU-8 2050</td><td>Permanenter Epoxid-Negativ-Fotolack. Von Hitze und Licht fernhalten</td></tr><tr><td>Luft-Plasma-Behandlungssystem</td><td>Glowresearch</td><td></td><td>Autoglow Sauerstoff-Plasma-System</td></tr><tr><td>Rattenschwanz-Kollagen</td><td>Invitrogen</td><td>A10483-01</td><td>Kollagen I, Rattenschwanz 5 mg/ml</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td>DNA-spezifischer Fluoreszenzfarbstoff. Im Kühlschrank aufbewahren.</td></tr><tr><td>Kapton (Polyimidfolie) isolierte flexible Heizelemente</td><td>omega.ca</td><td>KHLV-0504/(10)-P</td><td>28 V flexible Heizkörper; kann mit einem 24 V</td></tr><tr><td>1/16 DIN Autotune Temperatur- und Prozessregler</td><td>geliefert werden omega.ca</td><td>CN63200-R1-LV</td><td>Temperaturregler; Versorgung mit 24 V.</td></tr><tr><td>DMEM-Kulturmedium</td><td>Hyclone</td><td>SH3024301</td><td>Dulbecco' s modifizierte 30 Eagle Medium. Halten Sie bei 4 &#176; C</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Hyklon</td><td></td><td>SV30010</td><td>Halten Sie den Bestand eingefroren. Die Lösung bei 4 &#176;C weiterarbeiten.</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Hyklon</td><td>SH3039603C</td><td>Tiefgefroren aufbewahren.</td></tr><tr><td>Trypsin 0,05%</td><td>Hyklon</td><td>SH30236,02</td><td>Tiefgefroren aufbewahren. Verdau von Zellanheftungsproteinen für die Subkultivierung</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Wisent Inc</td><td>330-050-EL</td><td>HEPES-gepufferte Salzlösung&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>HEPES-gepufferte Salzlösung / Krebs physiologische Lösung</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>HEPES-gepufferte Salzlösung / Krebs physiologische Lösung</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td>HEPES-gepufferte Salzlösung / Krebs physiologische Lösung</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-500</td><td>HEPES-gepufferte Salzlösung / Krebs physiologische Lösung</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td>HEPES-gepufferte Salzlösung / Krebs physiologische Lösung</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-1</td><td>Krebs physiologische Lösung</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>Krebs physiologische Lösung</td></tr><tr><td>Carbogen 95% O2/5% CO2</td><td>Lindle</td><td>DIN:02154749</td><td>Krebs physiologische Lösung Oxygenierung</td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td>Mikrotubuli Depolymerisationsmittel</td></tr><tr><td>Cytochalasin-D</td><td>Sigma</td><td>C8273</td><td>Aktinfilamente Depolymerisationsmittel</td></tr><tr><td>Anti-&alpha;- SMA-FITC</td><td>Sigma</td><td>F3777</td><td>Zur Färbung und Quantifizierung des Gehalts an glatten Muskelzellen</td></tr><tr><td>Picrosirius-Rotfärbung</td><td>Fluka</td><td>43665</td><td>Zur Färbung und Quantifizierung des Kollagengehalts</td></tr></tbody></table>

a novel stretching-plattform für anwendungen in der zell-und gewebe mechanobiologie

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Werkzeuge, die die Anwendung von mechanischen Kräften, um Zellen und Gewebe oder die Quantifizierung zu ermöglichen kann die mechanischen Eigenschaften von biologischem Gewebe haben sich zum Verständnis der Grund Mechanobiologie beigetragen. Diese Techniken wurden intensiv genutzt, um zu zeigen, wie die Entstehung und Progression von verschiedenen Krankheiten sind stark von mechanischen Signale beeinflusst. Dieser Artikel stellt eine multifunktionale biaxiale Streckung (BAXS)-Plattform, die entweder mechanisch stimulieren können einzelne Zellen oder zu quantifizieren, die mechanische Steifigkeit des Gewebes. Die BAXS Plattform besteht aus vier Schwingspulenmotoren, die unabhängig voneinander gesteuert werden können. Einzelne Zellen können auf einem flexiblen Substrat, das an die Motoren so dass man die Zellen, um komplexe, dynamische und räumlich variierenden Dehnungsfeldern aus befestigt werden kann, kultiviert werden. Umgekehrt wird durch den Einbau eines Kraftlastzelle, kann man auch eine Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften des Primärgeweben, wie sie Deformationszyklen ausgesetzt sind.In beiden Fällen muss eine richtige Satz von Klemmen entwickelt und montiert, um den Motoren BAXS Plattform, um fest zu halten das flexible Substrat oder das Gewebe von Interesse sein. Die BAXS Plattform auf einem inversen Mikroskop, um die gleichzeitige Durchlicht und / oder Fluoreszenzabbildung durchzuführen, um die strukturelle oder biochemische Reaktion der Probe während des Streckens Experimente untersuchen montiert werden. Dieser Artikel enthält experimentelle Details der Gestaltung und Nutzung des BAXS Plattform und präsentiert die Ergebnisse für einzelne Zelle und ganze Gewebestudien. Die BAXS Plattform wurde verwendet, um die Verformung der Kerne in Einzel Maus Myoblasten Zellen in Reaktion zu messen, um Stamm-Substrat und die Steifigkeit der isolierten Maus-Aorten messen. Die BAXS Plattform ist ein vielseitiges Werkzeug, mit verschiedenen optischen Mikroskopie, um neue Erkenntnisse zu den mechanobiological subzellulärer, Zell-und Gewebespiegel bieten ganze kombiniert werden können.

Handy Stretching Die BAXS Plattform verwendet, um die mechanische Antwort des Kerns in einzelne Maus-Myoblasten-Zellen (C2C12) auf ein Substrat eine Verformung von 25% exponiert wurden. Myoblasten-Zellen werden in Muskelgewebe gefunden und werden ständig mechanischen Dehnung und Kompression in vivo ausgesetzt wird. Die Form und die mechanischen Eigenschaften des Zellkerns haben gezeigt, eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression und Transkriptionsaktiv...

Wir stellen in diesem Artikel ein neues Streck Plattform, die verwendet werden können, um einzelne Zellantworten auf komplexe anisotropen biaxiale mechanische Verformung zu untersuchen und zu quantifizieren, die mechanischen Eigenschaften von biologischen Geweben.

A Novel Stretching-Plattform für Anwendungen in der Zell-und Gewebe Mechanobiologie

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Neuheit einer anisotropen Dehnungsplattform zu demonstrieren, die zur Untersuchung der Reaktion einzelner Zellen auf komplexe mechanische Verformungen und zur Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften biologischer Gewebe verwendet werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst die flexible Membran hergestellt und auf einer Reihe von Klemmen befestigt wird. Der zweite Schritt besteht darin, C zwei C 12-Zellen über Nacht auf der Membran zu kultivieren und am folgenden Tag die Klemmen auf der Dehnungsplattform zu montieren.Anschließend werden in einem zweiten Experimentansatz thorakale Aortengewebe von einem Mausmodell entnommen und von sämtlichen Bindegeweben befreit. Danach wird das Aortengewebe mithilfe eines anderen Klammersystems auf der Dehnplattform befestigt. Letztendlich dient die Dehnplattform dazu, eine Deformation der Zellen entlang zweier zueinander orthogonaler Richtungen hervorzurufen, die mittels eines umgekehrten Mikroskops quantifiziert werden kann.Oder alternativ wird ein Kraftaufnehmer in die Devorrichtung integriert, um die Gewebesteifigkeit zu messen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber beste

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

In diesem Protokoll, zeigen wir die Herstellung eines Mikroaktor Reihe von vertikal versetzt zum Thema, die die Technologie basiert, und wie diese Basistechnologie können modifiziert werden, um High-Throughput-mechanisch dynamischen Zellkultur in beiden zweidimensionalen und dreidimensionalen Kultur durchzuführen Paradigmen.

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

Ein neuartiges Bildgebungsprotokoll wurde entwickelt, das einen speziellen motorbetriebenen mechanischen Aktuator verwendet, um die Messung von Echtzeitreaktionen auf mechanische Dehnung in lebenden Zellen zu ermöglichen. Das für die Mechanobiologie relevante System kann Dehnungen von bis zu 20 % aufbringen und ermöglicht gleichzeitig eine Bildgebung nahezu in Echtzeit mit konfokaler oder Rasterkraftmikroskopie.

Live Cell Imaging bei Mechanical Stretch

Die Zelldifferenzierung wird durch eine Vielzahl von Mikroumgebungsfaktoren reguliert, einschließlich der beiden Matrixzusammensetzung und Substratmaterialeigenschaften. Wir beschreiben hier eine Technik unter Verwendung von Zellmicroarrays in Verbindung mit Traktionskraftmikroskopie sowohl Zelldifferenzierung und biomechanischen Zell-Substrat-Wechselwirkungen als Funktion der Mikroumgebungskontext zu bewerten.

Ein Hochdurchsatz-Zellarray-Plattform für korrelative Analyse von Zelldifferenzierung und Zugkräften

Hier stellen wir ein mechanikbasiertes Protokoll vor, um den Spaltknoten-Anschluss 43 zu stören und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die endotheliale Biomechanik durch Beobachtung von Traktionen und interzellulären Spannungen zu messen.

Störende Endothelial Biomechanik über Connexin 43 Strukturelle Störung

Die vorgestellte Methode beinhaltet das einachsige Dehnen von 3D-Weichhydrogelen, die in Silikonkautschuk eingebettet sind, während eine konfokale Live-Mikroskopie ermöglicht wird. Die Charakterisierung der externen und internen Hydrogelstämme sowie die Faserausrichtung werden demonstriert. Das entwickelte Gerät und Protokoll kann die Reaktion von Zellen auf verschiedene Belastungsregime beurteilen.

Kontrollierte Dehnung von 3D-Hydrogelen unter Live-Mikroskopie-Bildgebung

Diese Studie stellt ein neues Protokoll vor, um mechanische Kraft direkt auf den Zellkern durch magnetische Mikroperlen auszuüben, die in das Zytoplasma abgegeben werden, und simultane Live-Zell-Fluoreszenzbildgebung durchzuführen.

Kombination von 3D-Magnetkraftaktor und multifunktionaler Fluoreszenzbildgebung zur Untersuchung der Kernmechanobiologie

Hier wird eine Methode zur mechanischen Phänotypisierung einzelner Zellen unter Verwendung einer elektronikbasierten mikrofluidischen Plattform namens Mechano-Node-Pore Sensing (Mechano-NPS) vorgestellt. Diese Plattform hält einen moderaten Durchsatz von 1-10 Zellen / s aufrecht und misst gleichzeitig die elastischen und viskosen biophysikalischen Eigenschaften der Zellen.

Mechano-Node-Pore Sensing: Eine schnelle, markierungsfreie Plattform für viskoelastische Multiparameter-Einzelzellmessungen

Hier präsentieren wir ein vielseitiges äquibiaxiales Streckgerät, das pneumatisch betätigt wird und mit der hochauflösenden Mikroskopie kompatibel ist.

Äquibiaxiales Stretching-Gerät für die konfokale Fluoreszenzmikroskopie mit lebenden Zellen mit hoher Vergrößerung

Hier stellen wir ein neuartiges Gerät vor, das isotrope und uniaxiale Dehnungswellenformen auf Zellen anwendet und gleichzeitig Kultur auf Substraten mit abstimmbarer Steifigkeit und anpassbaren Proteinmatrizen unterstützt. Diese einfache, wirtschaftliche Plattform ermöglicht es Forschern, zu untersuchen, wie mechanische Hinweise die zelluläre Funktion sowohl in grundlegenden Studien als auch in krankheitsrelevanten Kontexten regulieren.

Eine neuartige Plattform für in vitro zelluläre Dehnung und Bildgebung

Selbstorganisierte Monoschichten (SAMs) aus langkettigen Alkan Thiolen auf Gold gebildet ist gut definierten Substraten für die Bildung von Protein-Muster-und Zell-Entbindung. Mikrokontaktdruck von Hexadecanthiol mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempel durch Verfüllung mit folgten einem Glykol-terminierte Alkanthiol Monomer erzeugt ein Muster, bei dem Protein und Zellen adsorbieren nur den Stempel Hexadecanthiol Region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

Erfahren Sie, wie eine neuartige anisotrope Dehnungsplattform zur Untersuchung von Einzelzellreaktionen auf mechanische Deformation und zur Quantifizierung mechanischer Gewebe-eigenschaften eingesetzt wird.

A Novel Stretching-Plattform für Anwendungen in der Zell-und Gewebe Mechanobiologie

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