A Novel Stretching-Plattform für Anwendungen in der Zell-und Gewebe Mechanobiologie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Neuartigkeit einer isotropen Dehnungsplattform zu demonstrieren, die zur Untersuchung der Reaktionen einzelner Zellen auf komplexe mechanische Verformungen und zur Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften biologischer Gewebe verwendet werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst die flexible Membran hergestellt und diese Membran auf einem Satz Klemmen montiert wird. Der zweite Schritt besteht darin, C zwei C 12-Zellen über Nacht auf der Membran zu kultivieren und am nächsten Tag die Klemmen auf der Streckplattform zu montieren.

Als nächstes wird in einer zweiten Reihe von Experimenten thorakales Aortengewebe aus einem Mausmodell abgestoßen und von jeglichem Bindegewebe gereinigt. Dann wird das Aortengewebe mit einem anderen Satz Klemmen auf der Streckplattform montiert. Letztendlich wird die Streckplattform verwendet, um eine Verformung in Zellen entlang zweier orthogonaler Richtungen zu induzieren, die mit einem inversen Mikroskop quantifiziert werden kann.

Alternativ wird ein Kraftaufnehmer in die Dehnungsvorrichtung integriert, um die Gewebesteifigkeit zu messen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber den bestehenden Techniken, wie z.B. der uni-tatsächlichen oder biaxialen Zelldehnung, besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, die Verformung in zwei orthogonalen Richtungen in einer transparenten Membran, an der die Zellen befestigt sind, unabhängig voneinander zu kontrollieren und somit die Bildgebung lebender Zellen zu ermöglichen. Mikroskopie auch eine sorgfältige Konstruktion eines anderen Satzes von Klemmen.

Mit der Integration eines viersträngigen Benutzers auf der Plattform können wir 10 Zelltests an biologischem Gewebe durchführen, um ihre mechanischen Eigenschaften zu quantifizieren. Dieses Video stellt die Biaxial Stretching Platform vor, eine speziell angefertigte Apparatur, mit der die Auswirkungen der Substratverformung auf zellulärer Ebene untersucht und Zugversuche an biologischem Gewebe durchgeführt werden können. Das Design und die Merkmale der biaxialen Dehnungsplattform werden im begleitenden Manuskript ausführlich beschrieben, um die Auswirkungen der mechanischen Verformung einzelner Zellen zu untersuchen, muss zunächst ein flexibles und transparentes Substrat hergestellt werden, auf dem Zellen haften können.

Um dieses Verfahren zu beginnen, pipettieren Sie 500 Mikroliter einer fluoreszierenden Mikrosphärenlösung in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es bei 16.200 Gs 10 Minuten lang, verwerfen Sie das Supernat und fügen Sie 500 Mikroliter Isopropanol hinzu, gefolgt von fünf Minuten Vortexen. Stellen Sie das Fläschchen über Nacht im Dunkeln beiseite, damit sich am nächsten Morgen große Partikelaggregate absetzen können, und geben Sie das SNAT vorsichtig in ein sauberes Mikrozentrifugenfläschchen. Diese Raupenlösung kann zur Herstellung von mehr als fünf Substraten verwendet werden, da die Raupenlösung in den nächsten drei Tagen weiter sedimentiert.

Es ist wichtig zu vermeiden, dass Resus das Pellet suspendiert. Gießen Sie 0,5 Gramm des mit dem PDMS-Kit gelieferten Härtungsmittels in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenfläschchen. Fügen Sie 15 Mikroliter fluoreszierende Kügelchen hinzu und wirbeln Sie sie eine Minute lang ein

Wiederholen Sie dies noch fünfmal, um insgesamt 90 Mikroliter Perlen hinzuzufügen. Wiegen Sie 10 Gramm PDMS, fügen Sie 0,5 Gramm des Härters hinzu, ergänzt mit fluoreszierenden Kügelchen und mischen Sie es mindestens 12 Minuten lang. Verwenden Sie anschließend die Transferpipette, um vier Milligramm des PDMS mit Perlen in eine kreuzförmige Form SUH 2050 zu übertragen, die zuvor mit Standard-Fotolithographietechniken hergestellt wurde.

Das Werkzeug hat eine Höhe von 320 Mikrometern und eine Fläche von 13,4 Quadratzentimetern und kann 428 Mikroliter oder 440 Milligramm PDMS enthalten. Das PDMS härtet zwei Stunden bei 80 Grad Celsius aus. Nach dem Aushärten das Substrat von der Form abziehen, kann das Substrat zwei Wochen lang in einer Petrischale bei Raumtemperatur aufbewahrt werden, ohne dass sich seine mechanischen Eigenschaften signifikant verändern. Gießen Sie PDMS-Tröpfchen in eine Petrischale mit einer Endgröße von etwa vier Millimetern Durchmesser, härten Sie sie zwei Stunden lang kopfüber bei 80 Grad Celsius aus, die Schale muss auf dem Kopf stehend gehalten werden, um zu verhindern, dass die Tropfen während des Aushärtungsprozesses flach werden.

Diese Verankerungsmerkmale können wochenlang in einer Petrischale aufbewahrt werden. Behandeln Sie das Substrat und acht Verankerungsmerkmale mit Luftplasma, binden Sie die Merkmale an jedem Ende des Substrats in einem Abstand von vier Millimetern von der quadratischen Vertiefung auf dem Substrat, um die Membran an den Klemmen zu befestigen. Wickeln Sie jedes Ende des Substrats um den zylindrischen Teil der Nut der Klemmen und befestigen Sie es mit den beiden Stellschrauben von oben.

Schrauben Sie die vier Klemmen auf den Klemmhalter. Gießen Sie dann PDMS an die Schnittstelle zwischen dem Substrat und dem gerillten Teil der Klemmen. Verteilen Sie das nicht ausgehärtete PDMS mit einem 1,5-Millimeter-Inbusschlüssel um das gerillte zylindrische Teil.

Gießen Sie PDMS in die Rillen, bis es durch Kapillarwirkung vollständig gefüllt ist, und härten Sie die Anordnung zwei Stunden lang bei 80 Grad Celsius aus, bevor Sie die Zellen auf die Membran säen. Luftplasma. Behandeln Sie die gesamte Baugruppe, um das Substrat zu sterilisieren und zu funktionalisieren, um eine Kollagenbeschichtung zu ermöglichen.

Funktionalisieren Sie den Bereich des Substrats, in dem die Zellen mit einem Milliliter 0,02 molare Essigsäure, ergänzt mit 16 Mikrogramm pro Milliliter Rattenschwanzkollagen, bei Raumtemperatur für eine Stunde besiedelt werden. Die gewünschte endgültige Kollagendichte beträgt fünf Mikrogramm pro Quadratzentimeter. Spülen Sie das Substrat nach einer Stunde dreimal mit Phosphatpuffer ab und lassen Sie es mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur trocknen. 40 Mikroliter Nährmedium zugeben, ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin.

Streptomycin mit 2000 Zellen im mittleren Teil des Substrats, um eine Fläche von einem Quadratzentimeter zu bedecken. In diesem Beispiel beträgt die Zelldichte 20 Zellen pro Quadratzentimeter. Die Zelldichte kann jedoch je nach experimenteller Anforderung verändert werden.

Legen Sie die gesamte Baugruppe in einen Standard-Zellkulturinkubator, wobei das Substrat nach oben zeigt und der Tropfen des Kulturmediums mit den Zellen darauf liegt. Die Anordnung muss mindestens drei Stunden lang mit dem Substrat nach oben gelagert werden, damit sich die Zellen fest daran anheften und eine Verdunstung verhindern können. 30 Mikroliter warmes Kulturmedium werden in den Tropfen auf dem Substrat gegeben.

Drehen Sie die gesamte Anordnung nach drei Stunden alle 45 Minuten in eine Petrischale, die mit frischem Kulturmedium gefüllt ist, um das Substrat einzutauchen und über Nacht zu inkubieren, damit sich die Zellen am nächsten Tag vermehren können. Montieren Sie das Setup an einem Mikroskop mit inversem Phasenkontrast oder Fluoreszenzmikroskop. Montieren Sie die Klemmsubstratbaugruppe auf der biaxialen Streckplattform, und die Motoren füllen die Petrischale in der Petrischale-Heizung mit einer frisch zubereiteten HEP-gepufferten Salzlösung.

Diese physiologische Lösung wird verwendet, um die Zellen auf dem Mikroskoptisch zu halten, indem sie die normale Gewebeblutumgebung nachahmt. Die gleiche biaxiale Dehnungsplattform kann auch zur Quantifizierung der Steifigkeit kleiner Gewebeproben verwendet werden. In dieser Demonstration werden isolierte Maus-Aorten verwendet.

Entfernen Sie das Zwerchfell, den Brustkorb und die Lungenlappen von der euthanasierten Maus, um das Risiko einer Schädigung des Gewebes zu minimieren. Halten Sie das Herz an der Aorta befestigt und vermeiden Sie es, das Gefäß direkt, aber manipuliert zu berühren. Mit dem Herzen.

Entfernen Sie das Herz, die Aortenwurzel und die thorakale Aorta, indem Sie vorsichtig zwischen dem Gefäß und der Wirbelsäule schneiden, um die innere Struktur des Gewebes intakt zu halten. Achten Sie darauf, dass das Gefäß während des Schnitts nicht gedehnt wird. Tauchen Sie das Herz und die Aorta sofort in Krebslösung ein und halten Sie es in Krebslösung, die täglich zubereitet und während der Experimente bei 37 Grad Celsius gehalten wird.

Schneiden Sie die Aorta und waschen Sie sie vorsichtig in Krebslösung, um Blutgerinnsel zu entfernen, indem Sie unter einem chirurgischen Präpariermikroskop arbeiten. Entfernen Sie das Bindegewebe mit einer Mikroschere und einer Pinzette. Es ist wichtig, die gesamte Gefäßlänge beizubehalten und die Aortenwurzel zur Bestimmung der Gefäßausrichtung zu verwenden.

Die Abmessungen des unbeladenen Behälters werden benötigt, um die Steifigkeit des Behälters zu bestimmen. Schneiden Sie einen etwa zwei Millimeter langen Aortenring ab und messen Sie dessen Länge mit einer kalibrierten Mikroskopeinstellung genau. Lassen Sie dieses Segment in Krebs Lösung beiseite.

Schneiden Sie anschließend zwei kleine Aortenringe aus den Abschnitten der Aorta ab, die nach der Entfernung des zwei Millimeter langen Segments übrig bleiben. Ein Ring aus dem Abschnitt der Aorta vor dem Zwei-Millimeter-Segment und ein weiterer Ring aus dem Abschnitt der Aorta. Nach dem Zwei-Millimeter-Segment legen Sie beide Aortenringe mit dem Lumen nach oben auf einen Objektträger und messen die Wandstärke mit einer kalibrierten Mikroskopeinstellung.

Mit diesen beiden Ringen wird die Aortenwanddicke gemessen und gemittelt. Füllen Sie die Petrischale auf der biaxialen Streckplattform mit Krebslösung und führen Sie das zwei Millimeter lange Aortenringsegment auf die Zugstifte ein. In diesem Protokoll wurde die biaxiale Dehnungsplattform verwendet, um die mechanische Reaktion des Zellkerns in einzelnen Maus-Myoblastenzellen zu untersuchen, die einer Substratverformung von 25% Verschiebungsverformung ausgesetzt waren.

In diesen repräsentativen Ergebnissen sind Beziehungen zwischen der Durchführung von Standard- und reiner einachsiger Dehnung dargestellt. Fluoreszierende Perlen werden im ersten Frame des Videos manuell ausgewählt und von einem Frame zum anderen verfolgt, bis die maximale Dehnung in horizontaler und vertikaler Richtung erreicht ist. Ein MATLAB-Skript berechnet automatisch die Komponenten des grünen Dehnungstensors für jedes Bild und erstellt eine Kalibrierungskurve der Dehnung in Bezug auf die motorische Verschiebung.

In diesen Diagrammen entsprechen die blauen und roten Linien der Komponente des grün gespannten Heers entlang der horizontalen bzw. vertikalen Richtung. Diese Ergebnisse verdeutlichen die Fähigkeiten der biaxialen Streckplattform, eine Verformung im Substrat entlang zweier orthogonaler Richtungen zu induzieren. Zusätzlich zu den standardmäßigen uniaxialen oder biaxialen EQU-Dehnungsfeldern kann die biaxiale Streckplattform komplexe Dehnungsfelder im Substrat induzieren.

Tafel G zeigt, dass das Strecken desselben Substrats um vier Millimeter entlang der x-Achse und das leichte Strecken entlang der Y-Achse um 1,5 Millimeter, rot hervorgehoben, ein reines einachsiges Feld ohne Druckverformung im Substrat erzeugt. Tafel, H zeigt, dass das Strecken des Substrats entlang der x-Achse um 3,5 Millimeter eine Verformung von 25 % und eine Druckverformung von 7 % erzeugt, wenn die Enden des Substrats entlang der vertikalen Achse fixiert sind, rot hervorgehoben Mit der Möglichkeit, während der Dehnung eine Mikroskopie-Bildgebung für lebende Zellen durchzuführen, wurden die Zellkerne mit einem lebenden Zellfluoreszenzfarbstoff gefärbt, der die DNA bindet, und dann entlang jeder orthogonalen Streckungsachse um 25 % gedehnt. Hier dargestellt, wurden zwischen den einzelnen Phasen des Dehnungszyklus Kontrastbilder und Epi-Fluoreszenzbilder des ungeformten und deformierten Kerns aufgenommen. Die Längen der Haupt- und Nebenkernachse entlang des ungeformten Zustands und wenn der Kern sequentiell entlang seiner Haupt- und Nebenachse gedehnt wurde, wurden mit Hilfe eines Bild-J-Plugins bestimmt und zur Berechnung der relativen Längenänderung verwendet.

Entlang jeder Achse in diesem Balkendiagramm wird die X- oder Hauptachse blau und die Y- oder Nebenachse rot dargestellt. Die Verformungsfähigkeit des Zellkerns weist eine mechanische Anisotropie auf, da er eine signifikant höhere Verformungsfähigkeit entlang seiner Nebenachse aufweist, im Vergleich zu seiner Hauptachse wurde die Rolle des Aktin- und Mikrotubuli-Zytoskeletts bei der Regulierung der Kernverformungsfähigkeit durch Depolymerisation der Aktinfilamente bzw. Mikrotubuli unter Verwendung von Cyto D bzw. Neol Depolymerisation untersucht. Es wurde festgestellt, dass die Aktinfilamente bzw. die Mikrotubuli einen Verlust der anisotropen Deformbarkeit des Zellkerns induzieren.

Diese Ergebnisse stützen die Befunde, dass Zytoskelettkomponenten Kräfte vom Substrat auf den Zellkern übertragen und auch für die Erhaltung des natürlichen mechanischen Verhaltens des Zellkerns unerlässlich sind. Während der Deformation wurde die biaxiale Dehnungsplattform auch verwendet, um den Effekt einer chronischen Überexpression des Hitzeschockproteins 27 oder HP 27 auf die Gefäßsteifigkeit HSP über die Expression zu beurteilen. In einem Atherosklerose-anfälligen Mausmodell verändert ein homozygotes POE-Negativ die histologische Zusammensetzung von Atherosklerose-Läsionen, indem es die glatten Muskelzellen und den Kollagengehalt der Intimus erhöht.

Um den Einfluss dieses histologischen Umbaus auf die mechanischen Eigenschaften des Gefäßes zu bestimmen, wurde die Dehnungsplattform zur Messung der Aortensteifigkeit verwendet. Dieses Diagramm zeigt eine typische Spannungs-Dehnungskurve, die durch die Dehnung eines Aortengefäßes erhalten wird, während die Steifigkeit bei 30 % der Dehnung berechnet wird. Die Steifigkeit ist die Steigung der Tangente, die durch die rote Linie zur Kurve angezeigt wird.

Es zeigte sich, dass die Steifigkeit der Aortensegmente von HSP 27 gegenüber exprimierenden Mäusen im Vergleich zum Kontrollmausmodell signifikant um 41% erhöht war. Zusammenfassend zeigte die mechanische Beurteilung in Kombination mit der Gefäß- und Plaquehistologie, dass die Überexpression von HSP 27 durch eine erhöhte Gefäßsteifigkeit und einen erhöhten Gehalt an glatten Kollagenzellen gekennzeichnet ist. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass HSP 27 möglicherweise die Stabilität atherosklerotischer Läsionen erhöhen und somit das Risiko einer Plaqueruptur nach seiner Entwicklung verringern könnte.

Diese Technik stellt einen neuen Weg für Forscher auf dem Gebiet des Bioengineerings dar, um die Zellreaktion auf komplexe und inotrope mechanische Verformungen für Anwendungen in der mechanischen Biologie zu erforschen, aber auch um die biologische Gewebemechanik bei Krankheiten zu überwachen.