Name: A Novel Stretching-Plattform für Anwendungen in der Zell-und Gewebe Mechanobiologie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-03T14:15:00.000+00:00
Duration: 16 min 46 s
Description: Erfahren Sie, wie eine neuartige anisotrope Dehnungsplattform zur Untersuchung von Einzelzellreaktionen auf mechanische Deformation und zur Quantifizierung mechanischer Gewebe-eigenschaften eingesetzt wird.

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DT wurde von einem Postdoc-Stipendium von le Fonds de Recherche du Québec-Nature et Technologies (FQRNT) und eine MITACS Elevate Strategische Fellowship unterstützt. CMC wurde von einem Postdoc-Stipendium von le Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) und Ernest und Margaret Ford Kardiologie dotierten Forschungsstipendium an der University of Ottawa Heart Institute unterstützt. EOB wurde durch Betriebskostenzuschüsse MOP80204 von der kanadischen Institut für Gesundheitsforschung (CIHR) und T6335 aus der Herz-und Schlaganfall-Stiftung von Ontario unterstützt. Die CIHR und Medtronic kollektiv EOB mit einem Peer-Review-Research Chair (URC # 57093). AEP wird durch die Natural Sciences and Engineering Research Council (NSERC) Entdeckung Grant, NSERC Discovery Accelerator Supplement finanziert und dankt der Unterstützung des Canada Research Chairs (CRC)-Programm und einer früh Researcher Award aus der Provinz Ontario.

1. Mechanische Verformung von Einzelzellen <ol><li> Die Herstellung einer PDMS Substrat mit Embedded Leuchtstoffperlen Vor der Herstellung des Substrats werden fluoreszierenden Mikrosphären in einer Wasserlösung in Isopropanol suspendiert zu Wulst Mischen in PDMS aufgrund der hydrophoben Natur zu verbessern. <ol><li> Pipette 500 ul von fluoreszierenden Mikrokugeln in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Zentrifugieren bei 16.200 × g für 10 min. </li><li> Überstand verwerfen und fügen Sie 500 ul Isopropanol folgte mit 5 min von Vortex. Setzen Sie die Fläschchen beiseite über Nacht im Dunkeln, damit keine großen Partikel-Aggregate zu sedimentieren. </li><li> Am nächsten Morgen, entfernen Sie vorsichtig den Überstand in ein sauberes Mikro Fläschchen. Dieser Bead-Lösung kann verwendet werden, um mehr als 5 Substrate herzustellen. HINWEIS: Die Bead-Lösung wird sich weiterhin für die nächsten 3 Tage zu sedimentieren. Seien Sie vorsichtig, um zu vermeiden, Resuspendieren des Pellets. </li><li> Pour 0,5 g des Härters bereitgestelltmit dem PDMS-Kit in einem 1,5-ml-Mikro Fläschchen mit einem wissenschaftlichen Gleichgewicht. Durch die aufeinanderfolgenden Schritten, fügen Sie insgesamt 90 ul-Perlen (in sechs 15 ul Ergänzungen), Vortexen für 1 Minute zwischen jeder Zugabe. Beiseite stellen. </li><li> Gewicht von 10 g PDMS und Mischen für mindestens 12 min mit 0,5 g des Härters mit fluoreszierenden Kügelchen ergänzt. </li><li> Fabrizieren eine SU-8 2050 Kreuzform mit Standard-Photolithographietechniken folgenden Anweisungen des Herstellers. Die verwendete Form weist eine Höhe von 320 um und einer Fläche von 13,4 cm 2 (Fig. 3). Die Form kann 428 ul oder 440 mg PDMS enthalten. </li><li> Pour 400 mg des PDMS mit Perlen in der kreuzförmigen Form mit Hilfe einer Transferpipette und Heilung für 2 Stunden bei 80 ° C. Nach dem Aushärten Abziehen des Substrats von der Form (Fig. 5A). Das Substrat kann in einer Petrischale bei Raumtemperatur für 2 Wochen ohne eine signifikante Änderung in seiner mechanischen Eigenschaften gehalten werden. </li&gt; <li> Gießen Tröpfchen PDMS (Härter: PDMS mit einem Verhältnis von 1,20) in einer Petrischale mit einer endgültigen Größe von etwa 4 mm im Durchmesser und härten sie auf den Kopf für 2 h bei 80 ° C (Fig. 5B). Diese Verankerungs Merkmale können in einer Petrischale für Wochen aufbewahrt. HINWEIS: Halten Sie die Schüssel auf den Kopf, um die Tropfen aus Abflachung während der Aushärtung zu verhindern. </li><li> Air-Plasma-Behandlung (30 sec bei 30 W) das Substrat und 8 Verankerung Funktionen. Binden die Eigenschaften an jedem Ende des Substrats in einem Abstand von 4 mm von der quadratischen Gedankenstrich auf dem Substrat (Fig. 5C) vorhanden. </li></ol></li><li> Montage Membrane auf den Schellen <ol><li> Wickeln Sie jedes Ende des Substrats um die gerillten zylindrischen Teil der Klemmen und befestigen Sie sie mit den zwei Befestigungsschrauben von oben (2B und 5D-E). </li><li> Schrauben Sie die 4 Klammern auf dem Klemmhalter und gießen PDMS (Verhältnis 1:20) mit einem Einweg-transfer Pipette an der Schnittstelle zwischen dem Substrat und der genuteten zylindrischen Teil der Klammern. Verbreiten Sie die nicht ausgehärteten PDMS rund um den genuteten zylindrischen Teil mit einem 1,5 mm-Sechskantschlüssel. </li><li> Gießen PDMS (1:20) in die Nuten, bis sie vollständig durch Kapillarwirkung gefüllt und die Anordnung zu härten bei 80 ° C für 2 h (Fig. 5F). </li></ol></li><li> Impfen Zellen auf der Membran <ol><li> Air-Plasma-Behandlung (30 sec bei 30 W) die ganze Versammlung zu sterilisieren und zu funktionalisieren, die das Substrat für die Kollagenbeschichtung ermöglichen. </li><li> Funktionalisieren den Bereich des Substrats, wo Zellen mit 1 ml 0,02 M Essigsäure mit 16 ug / ml Rattenschwanzkollagen bei Raumtemperatur 1 h ergänzt ausgesät werden. Die gewünschte endgültige Kollagendichte ist 5 ug / cm 2. </li><li> Mit Phosphatpuffer spülen Substrat 3x und lassen Sie es trocken bei Raumtemperatur für mindestens 10 min. </li><li> 40 &amp;mgr; l Kulturmedium mit 10% fötalem Rinder seru ergänztm und 1% Penicillin-Streptomycin enthält 2.000 Zellen in dem zentralen Abschnitt des Substrats, um eine Fläche von 1 cm 2 bedecken (Zelldichte: 20 Zellen / mm 2). Zelldichte nach Versuchsanforderungen verändert werden. </li><li> Setzen Sie die gesamte Anordnung in einem Standardzellkulturbrutschrank bei dem das Substrat nach oben mit dem Tropfen Kulturmedium, Zellen darauf. HINWEIS: Die Montage muss das Substrat nach oben für mindestens 3 Stunden, damit Zellen zu fest an sie gehalten werden. Um die Verdampfung zu verhindern, wird 30 ul warmes Kulturmedium in den Tropfen auf dem Substrat alle 45 min während 3 h zugegeben. </li><li> Nach 3 Stunden, drehen die ganze Versammlung in eine Petrischale mit frischem Kulturmedium gefüllt, um das Substrat untertauchen und Inkubation über Nacht, sodass die Zellen zu vermehren. </li><li> Am nächsten Tag vorzubereiten HEPES-gepufferter Salzlösung (HBSS, 20 mM Hepes, 120 mM NaCl, 5,3 mM KCl, 0,8 mM MgSO 4, 1,8 mM CaCl 2, 11,1 mM dextrose). Den pH-Wert auf 7,4. HINWEIS: Die HBSS-Lösung muss täglich frisch hergestellt und bei 37 º C während des Experiments gehalten. Diese physiologische Lösung wird verwendet, um die Zellen auf dem Objekttisch durch Nachahmung der normalen Gewebe / Blut-Umgebung aufrechtzuerhalten. </li><li> Montieren Sie das Set-up auf invertierten Phasenkontrast-oder Fluoreszenzmikroskop Montieren Sie die Klemme-Substrat-Baugruppe auf der BAXS Plattform und Motoren. Füllen Sie die Petrischale in der Petrischale Heizung mit HEPES-Puffer (2D). </li></ol></li></ol> 2. Steifigkeit Messung der Kleinkaliber Schiffe <ol><li> Vorbereitung <ol><li> Krebs physiologischer Lösung: Eine Lösung von 118,1 mM NaCl, 11,1 mM D-Glucose, 25 mM NaHCO 3, 4,7 mM KCl, 1,2 mM MgSO 4, 1,2 mM KH 2 PO 4 und 2,5 mM CaCl 2. Den pH-Wert auf 7,4 und mit Sauerstoff der Lösung mit Carbogen medizinisches Gas (95% O 2/5% CO 2) für 30 min. HINWEIS: Der Krebs-Löauf muss täglich frisch hergestellt und bei 37 º C während des Experiments gehalten. Diese physiologische Lösung wird verwendet, um die lebendig Gewebe durch Nachahmung der normalen Gewebe / Blut-Umgebung aufrechtzuerhalten. </li><li> Sammeln Instrumentierung für die Zerlegung und mechanische Beurteilung der Aorten-Behälter: chirurgische Schere, Pinzette gebogen, Mikro-Scheren, chirurgische Binokular, 50 ml Polypropylenzentrifugenröhrchen, 10 ml und serologischen Pipetten. Das chirurgische Verfahren und Experiment keine sterilen Bedingungen. Montieren Sie die Klemmen des BAXS Plattform zusammen mit der Wägezelle vorher. </li></ol></li><li> Tissue Isolierung und Dissection Alle Experimente mit Labortieren haben, die von der Animal Care und Verwenden Ausschuss der Nutzer Institution, die mit der Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren der der Nutzer entspricht &quot;Land genehmigt werden. <ol><li> Führen Maus Euthanasie mit der Inhalation von 99% CO 2 (7 psi)in einer Plexiglaskammer (6A). </li><li> Offene Maus Bauch und schneiden Sie die Brustaorta, die Maus zu bluten. </li><li> Entfernen Sie die Blende, den Brustkorb und die Lungenlappen (6B). HINWEIS: Um die Gefahr einer Beschädigung des Gewebes zu minimieren, halten das Herz, die Aorta befestigt und vermeiden direktes Berühren des Schiffes, aber mit dem Herzen manipulieren. </li><li> Entfernen des Herzens, der Aortenwurzel und der Aorta durch leichtes Schneiden zwischen dem Behälter und der Wirbelsäule. HINWEIS: Führen Sie keine Dehnung im Behälter während der Exzision herbeiführen, um die innere Struktur des Gewebes intakt (6C) zu halten. </li><li> Sofort tauchen und halten das Herz und die Aorta in Krebs-Lösung. </li><li> Schneiden und sorgfältig waschen die Aorta in Krebs-Lösung, um alle Blutgerinnsel zu entfernen. Entfernen Bindegewebe mit Mikro-Schere, Pinzette und chirurgische Binokular (6D-E). HINWEIS: Bewahren Sie alle Schiffslänge und verwenden Sie die aortic Wurzel, das Schiff Ausrichtung zu bestimmen. </li></ol></li><li> Schiff Dimension Ermittlung und Montage Um die Steifigkeit des Behälters zu bestimmen, werden die entladenen Behälterabmessungen erforderlich und kann mit einem kalibrierten Mikroskop bestimmt werden. <ol><li> Schneiden Sie ein Aorten-Ring von etwa 2 mm in der Länge und präzise die Länge messen mit einem kalibrierten Mikroskop-Einstellung (6F-G). Setzen Sie dieses Segment beiseite in Krebs-Lösung. </li><li> Geschnitten andere Aortaring so klein wie möglich zwischen den einzelnen Segmenten 2 mm (6F). Diesen kleinen Segment auf einem Mikroskopglasobjektträger mit dem Lumen nach oben und messen die Wandstärke mit einem kalibrierten Mikroskopeinstellung (6H). </li><li> Füllen Sie die Petrischale auf der BAXS Plattform mit Krebs-Lösung und der Aorta 2 mm Ringsegment auf der Ziehstifte (in 4C eingelassen) einfügen. </li></ol></li></ol> ge = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig5highres.jpg" width="500" /> Abbildung 5. PDMS-Substrat Fertigung und Montage. A) Nach dem Aushärten wird das Substrat vorsichtig von den SU-8 2050 Form geschält und beiseite stellen in einer Petrischale. B) Verankerung Funktionen von PDMS und helfen, das Substrat, auf die Sicherung Schellen. C) Substrat mit Verankerungs Funktionen bereit für die Montage. D) Das Substrat wird auf den 4 Klemmen, die dann auf dem Klemmhalter montiert sind (siehe Kasten) montiert. E) Detailaufnahme der auf den 4 Klemmen montiert Substrat. F ) Verfahren des Gießens PDMS in der Nut unterhalb des Substrats. Der Pfeil zeigt die PDMS langsam füllt die Nut durch Kapillarwirkung. 454fig6highres.jpg &quot;width =&quot; 500 &quot;/&gt; Abbildung 6. Vorbereitung und Isolierung der thorakalen Aorta. A) Vorbereitung chirurgischer Instrumente und die eingeschläfert Maus. B) Durch eine Längsbauchschnitt, der Brustkorb-und Lungen Lobs entfernt werden. C) Die Aorta ist sorgfältig mit dem Herzen zu manipulieren entfernt das Gewebe. D) Das Herz und die Aorta in Krebs physiologischen Lösung setzen. Die Aorta wird durch Entfernen aller Bindegewebe gereinigt. E) Detaillierte Abbildung zeigt das Herz und die Aorta. F) Aorta-Segment für Steifigkeit Beurteilung zusammen mit kleinen Segmenten zur Dickenmessung verwendet. GH) Die genaue Länge (G) und Dicke (H) von jeweils Gefäßsegmente werden mit einem inversen Mikroskop und ein Analyseprogramm ausgewertet.

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

Die hier vorgestellten BAXS Plattform ermöglicht zahlreiche Experimente in der Studie von Mechanobiologie aus Untersuchungen von Einzelzellen zu ganzen Geweben. Außerdem ist die Plattform hoch flexibel und konfigurierbar, so dass für zahlreiche mechanische Stimulationsexperimente und multiaxiale Zugversuch. Die Plattform ermöglicht auch die Aufrechterhaltung von Zellen und Geweben unter physiologischen Bedingungen und ermöglicht die gleichzeitige Mikroskopie während des Streckens Experimenten. Die beiden in den vorherig...

Die mechanische Mikro spielt eine wichtige Rolle in vielen Zellfunktionen wie Proliferation, Migration und Differenzierung, die eine tiefgreifende Wirkung auf die Entwicklung und die Homöostase von Geweben und auch Krankheiten 1-6 haben. Im Laufe der Jahre eine Vielzahl von experimentellen Werkzeuge werden verwendet, um mechanisch zu stimulieren Zellen oder Geweben zu messen und mechanischen Eigenschaften von biologischem Gewebe mit dem Ziel der Erhöhung der unser Verständnis der Grund Mechanobiologie und Untersuchung der Entstehung und Progression von Krankheiten 6-17. Allerdings muss man oft auf verschiedenen experimentellen Vorrichtungen, um die Ziele einer bestimmten Untersuchung zu erreichen. Dieser Artikel stellt eine Einzel-, Multi-Funktions-, biaxiale Streckung (BAXS)-Plattform, die für die Studien, die die Rolle zu untersuchen, dass die mechanischen Eigenschaften und mechanische Kräfte spielen in der Biologie an der sub-zellulären, ganze Gewebelängenskalen erlaubt. Die BAXS Plattform ermöglicht nicht nur für die quantification der mechanischen Eigenschaften von Geweben isoliert, sondern erleichtert auch die Fähigkeit, einfache, komplexe und dynamische Spannungsfeldern auf lebende Zellen, um ihre Reaktion auf Strecken, die in vivo auftritt verstehen anzuwenden. Die Plattform BAXS behält auch die Fähigkeit lebender Zellen Mikroskopie bei der mechanischen Prüfung und Störungen auf Zellen und Gewebe durchzuführen. Die BAXS Plattform ist ein custom-built Vorrichtung, die verwendet werden können, um die Wirkung der Substratdeformation auf zellulärer Ebene zu untersuchen und durchzuführen, Zugversuche an biologischen Geweben (Abb. 1A). Eine Aluminium Heizvorrichtung wurde hergestellt, um eine Standard-10-cm-Petrischale aufzunehmen und irgendwelche physiologischen Lösungen aufrechterhalten bei 37 ° C mit einem Temperaturregler und Kapton Heizer (Fig. 1B). Diese BAXS Plattform auf einem invertierten Phasenkontrast und / oder Fluoreszenzmikroskop integriert werden und ermöglicht die gleichzeitige Bildgebung (Fig. 1C).Kurz gesagt, die BAXS Plattform besteht aus vier linearen Schwingspulenmotoren, von denen die beweglichen Teile auf Miniatur-Linearbewegung-Kugellager gleitet entlang von zwei senkrechten Achsen (Fig. 1D) ausgerichtet montiert ist. Ein Linearstellstufe zu jeder der vier Motoren angebracht, um die vertikale Bewegung des Spannsystems, mit (1E) werden können. Die Position jedes Motors wird durch einen optischen Codierer mit einer Auflösung von 500 nm (Fig. 1F) überwacht. Alle vier Motoren sind unabhängig voneinander mit einer Bewegungssteuerung, die optische Encoder-Feedback, Bewegungsbefehle (1G) ausführen gesteuert. Ein LabVIEW-Schnittstelle bietet die volle Kontrolle über die Verschiebungsgröße, Geschwindigkeit und Beschleunigung jedes Motors, um vollständig anpassbar, statische und dynamische Verformung der Zellen oder Gewebeproben zu generieren. Die Einrichtung zur Verformung in Zellen zu induzieren Technik wird erreicht, indem einfach allowing Zellen fest an einem flexiblen und transparenten Substrat zu haften und dann Strecken dieses Substrat mit den vier Motoren der BAXS Plattform. Die Plattform ermöglicht die Montage BAXS jeder maßgeschneiderten Satz von Klammern, um das Substrat auf den Schwingspulenmotoren befestigen. Zu diesem Zweck haben wir eine Reihe von Klemmen, um die ein flexibles und transparentes Substrat, Polydimethylsiloxan (PDMS) hergestellt ist, kann angebracht werden (Fig. 2A-C und Fig. 3). Da die Klemmen werden physiologischen Lösungen ausgesetzt werden, wurden alle Teile aus rostfreiem Stahl gefertigt, um für die Sterilisation zu ermöglichen. Diese Klemmen sind sorgfältig entworfen, um das Substrat so nahe wie möglich an dem Mikroskopobjektiv zu bringen, um die Bildqualität zu verbessern und gleichzeitig eine Minimierung der Belastung des Substrats während des Streckens (Fig. 2D). Das gleiche BAXS Plattform kann auch verwendet werden, um die Steifheit der kleinen Gewebeproben zu quantifizieren, unter Verwendung eines geeigneten Satzes von Klemmen mit ADAPted Träger für die Gewebeproben und einer Lastzelle, um Kräfte zu überwachen. Verschiedene Ansätze werden können, um ein Gewebe zu den BAXS Plattform Motoren montieren; in diesem Fall werden die Edelstahl-Insekten minutiens Stifte durch die Öffnung des Gefäßgewebe um Zugversuche (Fig. 4A-B) führen zu haken. Alternativ für dicke Gewebe ohne eine natürliche Öffnung, Gewebekanten können entweder in der Position mit den Klemmen an den Schwingspulenmotoren angebracht oder mit kleinen Glasobjektträger mit biologischen Kleber verklebt und an die Motoren mit den Klemmen befestigt gehalten werden. Um Zug-Tests durchführen, ein Miniatur-Wägezelle ist erforderlich und kann leicht auf die Plattform BAXS Motoren eingebaut und verwendet, um die während einer Streckzyklus (4C) auf das Gewebe wirkenden Kraft zu messen. Da die BAXS Plattform von vier Motoren besteht, die Einführung einer zweiten Lastzelle erlaubt es, Zugprüfmaschine entlang zweier orthogonaler Richtungen durchzuführen. Diese Fähigkeit ermöglicht es, quantify die mechanische Steifigkeit eines einzelnen Gewebe entlang zwei senkrechten Richtungen im gleichen Experiment. Wichtig ist, dass in allen Konfigurationen, die Zellen oder Gewebeproben von Interesse sind immer in einem temperaturkontrollierten Bad, das für den Benutzer zugänglich ist, gehalten. Diese Fähigkeit ermöglicht die Einführung von pharmakologischen Mitteln während der Proben Strecken, um die zeitliche Antwort der Probe zu untersuchen. Zusätzlich, da die optische Achse des umgekehrten Mikroskop unbehindert bleibt, sind immer noch alle Formen der Mikroskopie für den Benutzer verfügbar. Schließlich wird, wie alle vier Motoren der BAXS Plattform unabhängig ist es möglich, in hohem Maße konfigurierbar Spannungsfeldern auf die Probe von Interesse anzuwenden. In vivo Zellen und Gewebe ausgesetzt sind komplex und anisotrope Streckung, angemessener nachgeahmt in dieser Plattform gegen sein kann zu herkömmlichen einachsigen Dehnung Plattform 7,13,15,18,19. Darüber hinaus sind die physikalischen Eigenschaftender Dehnungsfeld kann dynamisch während eines Experiments geändert werden. Diese Fähigkeiten ermöglichen es dem Benutzer, den Zell-und Gewebeebene als Reaktion auf eine große Anzahl von komplexen, anisotropen, zeitlich und räumlich variierenden Spannungsfelder zu prüfen. Dieser Artikel beschreibt die Vorteile und Grenzen der BAXS Plattform sowie sein Design, Funktionsprinzipien und die experimentellen Details für einzelne Zelle und ganze Gewebe Experimenten. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig1highres.jpg" width="500" /> Abbildung 1. Übersicht der BAXS-Plattform. A) Top Blick auf die BAXS Plattform, welche die vier Schwingspulenmotoren. B) Detailaufnahme der Petrischale Heizung Die Plattform kann auf einem inversen Mikroskop live-montiert werden verwendet, um Zellen und Gewebe bei 37 ° C C zu halten) Cell Imaging Experimente während der Dehnung.D) Detailaufnahme des Schwingspulenmotor; der bewegliche Teil der Plattform. E) Detaillierte Abbildung des linearen Positionierungsstufe ermöglicht vertikale Verschiebung der Spannsystemen. F) Detailaufnahme des optischen Encoder, der Echtzeit-Position des Motors bietet der Bewegungssteuerung. G) Detailaufnahme der Motion-Controller, der die vier optischen Encoder-Eingänge und Stromausgänge zu den vier Schwingspulenmotoren. <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig2highres.jpg" width="500" /> 2. Spannsystem für Zellstreckexperimente. AB) Bilder, welche die Details der zur Herstellung der PDMS-Substrat zu den Schwingspulenmotoren für die Dehnung. C) Das Substrat wird um den zylindrischen Teil der Klemme mit seiner Verankerung featur gewickelt befestigen Schellenes sitzt in der Nut an der Spitze. Dann wird das Substrat mit den Stellschrauben, die das Substrat schieben / Verankerung Features in die obere Nut D) Illustration der BAXS Plattform mit die Klammern halten das Substrat an Ort und Stelle gesichert.. Der Einschub zeigt eine Detailansicht des Substrats mit Zellen daran befestigt sitzt direkt über einem Deckglas und dem Mikroskopobjektiv. <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig3highres.jpg" width="500" /> 3. Stückmaterialien der Membran und ihre Spannsystem. Zeichnungen, die die Abmessungen der Hauptteile integriert werden, um die biaxiale Streckung Plattform Zellexperimente durchzuführen. <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51454/51454fig4highres.jpg" width="500" /> 4. Exreichlich von einem Spannsystem für Steifigkeit Beurteilung der Kleinkalibergefäße. AB) Detailbilder des Spannsystems verwendet, um eine Verformung in einem 1 mm Durchmesser Maus Aorta zu induzieren. Edelstahl-Pins wurden sorgfältig in offene Dreiecke geformt, dass das Schiff auf beide Pins gleiten. C) Illustration der BAXS Plattform mit die Klammern halten das Schiff und eine Lastzelle zwischen der feststehenden Motor und der linken Klammer befestigt. Der Einschub zeigt eine detaillierte Draufsicht des auf den Stiften montiert Gefäß.

<table><tbody><tr><td>PDMS</td><td>Ellsworth Adhesives</td><td>184 SIL ELAST KIT 0,5 kg</td><td>Das in diesem Protokoll verwendete Verhältnis von Base zu Vernetzer beträgt 20:1. Mischen Sie eine laminare Haube ein, um zu verhindern, dass Staub Ihre Haut verunreinigt.</td></tr><tr><td>FluoSpheres fluoreszierende Mikrosphären</td><td>Invitrogen</td><td>F8810</td><td>Vor Licht schützen.</td></tr><tr><td>Lineare Schwingspule</td><td>Moticont</td><td>LVCM-051-051-01</td><td>Die motro wird in zwei Teilen (Magnet und Spule) geliefert. Er muss auf einem Kugellagersystem montiert werden, um funktionsfähig zu sein.</td></tr><tr><td>Kugelgelagerter</td><td>Schlitten Edmund Optics</td><td>NT37-360</td><td>Miniatur- und kleine Linearführungen mit Kugellager</td></tr><tr><td>Linearer Positioniertisch</td><td>Edmund Optics</td><td>38-960</td><td>Zentrierantrieb 1,25" quadratische lineare Verschiebungstische</td></tr><tr><td>Optischer Encoder</td><td>GSI microE systems</td><td>Mercury II 1600S -</td><td>Reflektierender Inkrementalgeber</td> mit 0,5 μm Auflösung.</tr><tr><td>Motion Controller</td><td>Galil</td><td>DMC-2143(DIN)-DC48 mit AMP-20440</td><td>4-Achsen-Controller mit einem 4-Achsen-Verstärker</td></tr><tr><td>Wägezelle</td><td>Honeywell</td><td>31 niedrige</td><td>Miniatur-Wägezelle mit einem Bereich von 0-150 g</td></tr><tr><td>Insektenminutiens Pins (0,20 mm)</td><td>Pin Service Austerlitz Insektenstifte</td><td></td><td>Edelstahlstifte, die in einer offenen Dreiecksform gebogen sind</td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>Micro Chem</td><td>SU-8 2050</td><td>Permanenter Epoxid-Negativ-Fotolack. Von Hitze und Licht fernhalten</td></tr><tr><td>Luft-Plasma-Behandlungssystem</td><td>Glowresearch</td><td></td><td>Autoglow Sauerstoff-Plasma-System</td></tr><tr><td>Rattenschwanz-Kollagen</td><td>Invitrogen</td><td>A10483-01</td><td>Kollagen I, Rattenschwanz 5 mg/ml</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>R37605</td><td>DNA-spezifischer Fluoreszenzfarbstoff. Im Kühlschrank aufbewahren.</td></tr><tr><td>Kapton (Polyimidfolie) isolierte flexible Heizelemente</td><td>omega.ca</td><td>KHLV-0504/(10)-P</td><td>28 V flexible Heizkörper; kann mit einem 24 V</td></tr><tr><td>1/16 DIN Autotune Temperatur- und Prozessregler</td><td>geliefert werden omega.ca</td><td>CN63200-R1-LV</td><td>Temperaturregler; Versorgung mit 24 V.</td></tr><tr><td>DMEM-Kulturmedium</td><td>Hyclone</td><td>SH3024301</td><td>Dulbecco' s modifizierte 30 Eagle Medium. Halten Sie bei 4 &#176; C</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Hyklon</td><td></td><td>SV30010</td><td>Halten Sie den Bestand eingefroren. Die Lösung bei 4 &#176;C weiterarbeiten.</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Hyklon</td><td>SH3039603C</td><td>Tiefgefroren aufbewahren.</td></tr><tr><td>Trypsin 0,05%</td><td>Hyklon</td><td>SH30236,02</td><td>Tiefgefroren aufbewahren. Verdau von Zellanheftungsproteinen für die Subkultivierung</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Wisent Inc</td><td>330-050-EL</td><td>HEPES-gepufferte Salzlösung&nbsp;</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td>HEPES-gepufferte Salzlösung / Krebs physiologische Lösung</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>HEPES-gepufferte Salzlösung / Krebs physiologische Lösung</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>M65-500</td><td>HEPES-gepufferte Salzlösung / Krebs physiologische Lösung</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Fisher Scientific</td><td>C614-500</td><td>HEPES-gepufferte Salzlösung / Krebs physiologische Lösung</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP220-1</td><td>HEPES-gepufferte Salzlösung / Krebs physiologische Lösung</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP328-1</td><td>Krebs physiologische Lösung</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>Krebs physiologische Lösung</td></tr><tr><td>Carbogen 95% O2/5% CO2</td><td>Lindle</td><td>DIN:02154749</td><td>Krebs physiologische Lösung Oxygenierung</td></tr><tr><td>Nocodazol</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td>Mikrotubuli Depolymerisationsmittel</td></tr><tr><td>Cytochalasin-D</td><td>Sigma</td><td>C8273</td><td>Aktinfilamente Depolymerisationsmittel</td></tr><tr><td>Anti-&alpha;- SMA-FITC</td><td>Sigma</td><td>F3777</td><td>Zur Färbung und Quantifizierung des Gehalts an glatten Muskelzellen</td></tr><tr><td>Picrosirius-Rotfärbung</td><td>Fluka</td><td>43665</td><td>Zur Färbung und Quantifizierung des Kollagengehalts</td></tr></tbody></table>

a novel stretching-plattform für anwendungen in der zell-und gewebe mechanobiologie

A Novel Stretching Platform for Applications in Cell and Tissue Mechanobiology

Werkzeuge, die die Anwendung von mechanischen Kräften, um Zellen und Gewebe oder die Quantifizierung zu ermöglichen kann die mechanischen Eigenschaften von biologischem Gewebe haben sich zum Verständnis der Grund Mechanobiologie beigetragen. Diese Techniken wurden intensiv genutzt, um zu zeigen, wie die Entstehung und Progression von verschiedenen Krankheiten sind stark von mechanischen Signale beeinflusst. Dieser Artikel stellt eine multifunktionale biaxiale Streckung (BAXS)-Plattform, die entweder mechanisch stimulieren können einzelne Zellen oder zu quantifizieren, die mechanische Steifigkeit des Gewebes. Die BAXS Plattform besteht aus vier Schwingspulenmotoren, die unabhängig voneinander gesteuert werden können. Einzelne Zellen können auf einem flexiblen Substrat, das an die Motoren so dass man die Zellen, um komplexe, dynamische und räumlich variierenden Dehnungsfeldern aus befestigt werden kann, kultiviert werden. Umgekehrt wird durch den Einbau eines Kraftlastzelle, kann man auch eine Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften des Primärgeweben, wie sie Deformationszyklen ausgesetzt sind.In beiden Fällen muss eine richtige Satz von Klemmen entwickelt und montiert, um den Motoren BAXS Plattform, um fest zu halten das flexible Substrat oder das Gewebe von Interesse sein. Die BAXS Plattform auf einem inversen Mikroskop, um die gleichzeitige Durchlicht und / oder Fluoreszenzabbildung durchzuführen, um die strukturelle oder biochemische Reaktion der Probe während des Streckens Experimente untersuchen montiert werden. Dieser Artikel enthält experimentelle Details der Gestaltung und Nutzung des BAXS Plattform und präsentiert die Ergebnisse für einzelne Zelle und ganze Gewebestudien. Die BAXS Plattform wurde verwendet, um die Verformung der Kerne in Einzel Maus Myoblasten Zellen in Reaktion zu messen, um Stamm-Substrat und die Steifigkeit der isolierten Maus-Aorten messen. Die BAXS Plattform ist ein vielseitiges Werkzeug, mit verschiedenen optischen Mikroskopie, um neue Erkenntnisse zu den mechanobiological subzellulärer, Zell-und Gewebespiegel bieten ganze kombiniert werden können.

Handy Stretching Die BAXS Plattform verwendet, um die mechanische Antwort des Kerns in einzelne Maus-Myoblasten-Zellen (C2C12) auf ein Substrat eine Verformung von 25% exponiert wurden. Myoblasten-Zellen werden in Muskelgewebe gefunden und werden ständig mechanischen Dehnung und Kompression in vivo ausgesetzt wird. Die Form und die mechanischen Eigenschaften des Zellkerns haben gezeigt, eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression und Transkriptionsaktiv...

Wir stellen in diesem Artikel ein neues Streck Plattform, die verwendet werden können, um einzelne Zellantworten auf komplexe anisotropen biaxiale mechanische Verformung zu untersuchen und zu quantifizieren, die mechanischen Eigenschaften von biologischen Geweben.

A Novel Stretching-Plattform für Anwendungen in der Zell-und Gewebe Mechanobiologie

Tools that allow the application of mechanical forces to cells and tissues or that can quantify the mechanical properties of biological tissues have ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Neuheit einer anisotropen Dehnungsplattform zu demonstrieren, die zur Untersuchung der Reaktion einzelner Zellen auf komplexe mechanische Verformungen und zur Quantifizierung der mechanischen Eigenschaften biologischer Gewebe verwendet werden kann. Dies wird erreicht, indem zunächst die flexible Membran hergestellt und auf einer Reihe von Klemmen befestigt wird. Der zweite Schritt besteht darin, C zwei C 12-Zellen über Nacht auf der Membran zu kultivieren und am folgenden Tag die Klemmen auf der Dehnungsplattform zu montieren.Anschließend werden in einem zweiten Experimentansatz thorakale Aortengewebe von einem Mausmodell entnommen und von sämtlichen Bindegeweben befreit. Danach wird das Aortengewebe mithilfe eines anderen Klammersystems auf der Dehnplattform befestigt. Letztendlich dient die Dehnplattform dazu, eine Deformation der Zellen entlang zweier zueinander orthogonaler Richtungen hervorzurufen, die mittels eines umgekehrten Mikroskops quantifiziert werden kann.Oder alternativ wird ein Kraftaufnehmer in die Devorrichtung integriert, um die Gewebesteifigkeit zu messen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Techniken, wie uniaxialer oder biaxialer Zelldehnung, besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, die Deformation in zwei zueinander senkrechten Richtungen auf einer transparenten Membran, an der die Zellen befestigt sind, unabhängig voneinander zu steuern, und somit Live-Cell-Imaging zu ermöglichen. Die Mikroskopie erfordert außerdem eine sorgfältige Konstruktion eines anderen Satzes von Klemmen.Mit der Integration eines viersträngigen Benutzers auf der Plattform können wir an biologischem Gewebe 10-Zell-Tests zur Quantifizierung ihrer mechanischen Eigenschaften durchführen. In diesem Video wird die biaxiale Dehnungsplattform vorgestellt, eine speziell angefertigte Vorrichtung, mit der die Auswirkungen von Substratverformungen auf zellulärer Ebene untersucht und Zugversuche an biologischem Gewebe durchgeführt werden können. Der Aufbau und die Merkmale der biaxialen Dehnungsplattform sind in der begleitenden Veröffentlichung detailliert beschrieben. Um die Wirkung mechanischer Verformung einzelner Zellen zu untersuchen, muss zunächst ein flexibles und transparentes Substrat hergestellt werden, an dem sich Zellen anheften können.Um dieses Verfahren zu beginnen, pipettieren Sie 500 Mikroliter einer fluoreszierenden Mikrokugel-Lösung in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie 10 Minuten bei 16.200 G. Entsorgen Sie das Überstand und geben Sie 500 Mikroliter Isopropanol hinzu, gefolgt von fünfminütigem Vortexen. Stellen Sie das Röhrchen über Nacht dunkel gestellt beiseite, um größeren Partikelaggregaten Zeit zum Sedimentieren zu geben. Am folgenden Morgen übertragen Sie vorsichtig das Überstand in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen. Diese Kugellösung kann zur Herstellung von mehr als fünf Substraten verwendet werden, da die Kugellösung in den nächsten drei Tagen weiter sedimentieren wird.Es ist wichtig, die Wiederaufschlämmung des Pellets zu vermeiden. Geben Sie 0,5 Gramm des mit dem PDMS-Kit bereitgestellten Härtermittels in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie 15 Mikroliter fluoreszierende Kügelchen hinzu und wirbeln Sie eine Minute lang vermischt.Wiederholen Sie dies noch fünfmal, um insgesamt 90&nbsp;Mikroliter Kügelchen hinzuzufügen. Beiseitestellen. 10&nbsp;Gramm PDMS abwiegen, 0,5&nbsp;Gramm des Härters zugeben, der mit fluoreszierenden Kügelchen angereichert ist, und mindestens 12&nbsp;Minuten lang mischen. Verwenden Sie anschließend die Transferpipette, um vier&nbsp;Milligramm des mit Kügelchen versetzten PDMS in eine kreuzförmige SUH-2050-Form zu überführen, die zuvor mittels Standard-Photolithographietechniken hergestellt wurde.Die Form hat eine Höhe von 320 Mikrometern und eine Fläche von 13,4 Quadratzentimetern und kann 428 Mikroliter oder 440 Milligramm PDMS aufnehmen. Härten Sie das PDMS zwei Stunden bei 80 Grad Celsius aus. Nach dem Aushärten wird das Substrat von der Form abgezogen; das Substrat kann zwei Wochen lang bei Raumtemperatur in einer Petrischale aufbewahrt werden, ohne signifikante Veränderungen oder Änderungen seiner mechanischen Eigenschaften zu zeigen. Geben Sie Tropfen aus PDMS in eine Petrischale mit einem endgültigen Durchmesser von etwa vier Millimetern und härten Sie sie zwei Stunden bei 80 Grad Celsius stehend nach unten aus. Die Schale muss stehend nach unten gehalten werden, um zu verhindern, dass die Tropfen während des Aushärtens ihre Form verlieren.Diese Verankerungselemente können wochenlang in einer Petrischale aufbewahrt werden. Behandeln Sie das Substrat und die acht Verankerungselemente mit Luft-Plasma, und befestigen Sie die Elemente an beiden Enden des Substrats in einem Abstand von vier Millimetern von der quadratisch geformten Vertiefung, die auf dem Substrat vorhanden ist, um die Membran an den Klemmen zu montieren. Wickeln Sie jedes Ende des Substrats um den rillenförmigen zylindrischen Teil der Klemmen und befestigen Sie es mit den beiden Schrauben von oben.Schrauben Sie die vier Klemmen auf den Klemmhalter. Gießen Sie anschließend PDMS an die Grenzfläche zwischen dem Substrat und dem gerillten Teil der Klemmen. Verteilen Sie das ungehärtete PDMS mithilfe eines 1,5-Millimeter-Inbusschlüssels um den gerillten zylindrischen Teil herum.Geben Sie PDMS in die Rillen, bis diese vollständig durch Kapillarwirkung gefüllt sind, und härten Sie die Vorrichtung bei 80 Grad Celsius zwei Stunden lang aus, bevor Sie Zellen auf der Membran ansiedeln. Luft-Plasma. Behandeln Sie die gesamte Vorrichtung, um das Substrat zu sterilisieren und funktionalisieren, sodass eine Kollagenbeschichtung möglich ist.Funktionalisieren Sie den Bereich des Substrats, auf dem Zellen ausgesät werden sollen, mit einem Milliliter 0,02 molarer Essigsäure, die mit 16 Mikrogramm pro Milliliter Rattenschwanzkollagen bei Raumtemperatur für eine Stunde ergänzt wurde. Die gewünschte endgültige Kollagendichte beträgt fünf Mikrogramm pro Quadratzentimeter. Nach einer Stunde spülen Sie das Substrat dreimal mit Phosphatpuffer und lassen es mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur trocknen. Geben Sie 40 Mikroliter Kulturmedium hinzu, das mit 10 % fetalem Rinderserum und 1 % Penicillin ergänzt wurde.Streptomycin, das 2000 Zellen im zentralen Bereich des Substrats enthält, um eine Fläche von einem Quadratzentimeter abzudecken. In diesem Beispiel beträgt die Zelldichte 20 Zellen pro Quadratzentimeter. Die Zelldichte kann jedoch je nach experimentellen Anforderungen angepasst werden.Stellen Sie die gesamte Montage in einen Standard-Zellkultur-Inkubator, wobei das Substrat nach oben zeigen muss und der Tropfen Kulturmedium mit den Zellen darauf liegt. Die Montage muss mindestens drei Stunden lang mit nach oben gerichtetem Substrat aufbewahrt werden, um eine feste Anheftung der Zellen an das Substrat zu ermöglichen und Verdunstung zu verhindern. 30 µL warmes Kulturmedium werden dem Tropfen auf dem Substrat hinzugefügt.Alle 45 Minuten nach Ablauf von drei Stunden das gesamte Ensemble in eine mit frischem Kulturmedium gefüllte Petrischale umdrehen, um das Substrat zu überfluten, und über Nacht inkubieren, damit die Zellen am folgenden Tag proliferieren können. Die Anordnung auf einem invertierten Phasenkontrast- oder Fluoreszenzmikroskop montieren. Die Substrat-Halterung auf der biaxialen Dehnungsplattform befestigen und die Motoren die Petrischale innerhalb des Petrischalen-Heizgeräts mit einer frisch zubereiteten HEPES-pufferter Salzlösung füllen.Diese physiologische Lösung dient zur Aufrechterhaltung der Zellen auf dem Mikroskoptisch, indem sie die normale Blutumgebung des Gewebes nachahmt. Die gleiche biaxiale Dehnplattform kann auch zur Quantifizierung der Steifheit kleiner Gewebeproben verwendet werden. Im vorliegenden Demonstrationsversuch werden isolierte Maus-Aorten eingesetzt.Entfernen Sie das Zwerchfell, den Brustkorb und die Lungenlappen von der euthanasierten Maus, um das Risiko einer Gewebeschädigung zu minimieren. Lassen Sie das Herz am Aortenanschluss sitzen und vermeiden Sie es, den Gefäßstamm direkt zu berühren, sondern manipulieren Sie über das Herz.Entfernen Sie das Herz, die Aortenwurzel und die Aorta thoracica, indem Sie vorsichtig zwischen dem Gefäß und der Wirbelsäule schneiden, um die innere Struktur des Gewebes intakt zu halten. Achten Sie darauf, während des Einschnitts keine Dehnung des Gefäßes zu verursachen. Tauchen Sie das Herz und die Aorta sofort ein und bewahren Sie sie in Krebs-Lösung auf, die täglich frisch zubereitet und während der Experimente bei 37 Grad Celsius gehalten wird.Schneiden Sie die Aorta unter einem chirurgischen Operationsmikroskop ab und waschen Sie sie vorsichtig in Krebs-Lösung, um Blutgerinnsel zu entfernen. Entfernen Sie das Bindegewebe mit einer Mikroschere und Pinzette. Es ist wichtig, die gesamte Länge des Gefäßes beizubehalten und die Aortenwurzel zur Bestimmung der Gefäßorientierung zu nutzen.Die Abmessungen des entlasteten Gefäßes sind erforderlich, um die Steifigkeit des Gefäßes zu bestimmen. Schneiden Sie einen etwa zwei Millimeter langen Aortaring aus und messen Sie seine Länge präzise mithilfe einer kalibrierten Mikroskopeinstellung. Legen Sie dieses Segment beiseite in Krebs-Lösung.Schneiden Sie anschließend zwei kleine Aortaringe aus den verbleibenden Aortenabschnitten nach der Entfernung des zwei Millimeter langen Segmentes. Ein Ring stammt aus dem Aortenabschnitt vor dem zwei Millimeter langen Segment, der andere aus dem Aortenabschnitt nach diesem Segment. Legen Sie beide Aortaringe mit der Lumenseite nach oben auf eine Objektträgerplatte und messen Sie die Wanddicke mithilfe einer kalibrierten Mikroskopeinstellung.Die Dicke der Aortenwand wird mithilfe dieser beiden Ringe gemessen und gemittelt. Füllen Sie die Petrischale auf der biaxialen Dehnplattform mit Krebs-Lösung und setzen Sie das zwei Millimeter lange Aortenringsegment auf die Zugstifte. In diesem Protokoll wurde die biaxiale Dehnplattform verwendet, um die mechanische Antwort des Zellkerns in einzelnen Maus-Myoblastenzellen zu untersuchen, die einer Substratdeformation von 25 % Deformationsverformung ausgesetzt waren.Beziehungen, die sich aus der Durchführung von standardmäßigen und rein einachsigen Dehnversuchen ergeben, sind in diesen repräsentativen Ergebnissen dargestellt. Fluoreszierende Partikel werden manuell im ersten Bild des Videos ausgewählt und von einem Bild zum nächsten verfolgt, bis die maximale Dehnung in horizontaler und vertikaler Richtung erreicht ist. Ein MATLAB-Skript berechnet automatisch die Komponenten des grünen Verzerrungstensors für jedes Bild und erzeugt eine Kalibrierungskurve der Dehnung in Abhängigkeit von der Motordisplacement.In diesen Diagrammen entsprechen die blauen und roten Linien jeweils der Komponente der grünen gespannten Struktur entlang der horizontalen und vertikalen Richtung. Diese Ergebnisse veranschaulichen die Fähigkeiten der biaxialen Dehnplattform, eine Verformung des Substrats entlang zweier orthogonaler Richtungen hervorzurufen. Neben standardmäßigen uniaxialen und biaxialen Dehnungsfeldern kann die biaxiale Dehnplattform komplexe Dehnungsfelder im Substrat erzeugen.Abbildung G zeigt, dass eine Dehnung des gleichen Substrats um vier Millimeter entlang der X-Achse und eine leichte Dehnung entlang der Y-Achse um 1,5 Millimeter, hervorgehoben in Rot, ein rein einachsiges Feld erzeugt, ohne dass eine kompressive Deformation im Substrat auftritt. Abbildung H zeigt, dass eine Dehnung des Substrats entlang der X-Achse um 3,5 Millimeter eine Deformation von 25 % und eine kompressive Deformation von 7 % erzeugt, wenn die Enden des Substrats entlang der vertikalen Achse fixiert sind, hervorgehoben in Rot. Mithilfe der Möglichkeit, während der Dehnung Live-Cell-Mikroskopie-Aufnahmen durchzuführen, wurden die Zellkerne mit einem fluoreszierenden Farbstoff für lebende Zellen gefärbt, der an die DNA bindet, und anschließend um 25 % entlang jeder orthogonalen Dehnungsachse gedehnt, wie hier zwischen den Phasen jedes Dehnungszyklus veranschaulicht. Dabei wurden Kontrastbilder sowie epifluoreszierende Bilder des undeformierten und des deformierten Zellkerns aufgezeichnet. Die Längen der langen und kurzen Kernachse im undeformierten Zustand sowie bei schrittweiser Dehnung entlang der langen und kurzen Kernachse wurden mithilfe eines ImageJ-Plugins bestimmt und zur Berechnung der relativen Längenänderung verwendet.Entlang jeder Achse in diesem Balkendiagramm ist die X- oder Hauptachse in Blau dargestellt und die Y- oder Nebenachse in Rot. Die Verformbarkeit des Kerns weist eine mechanische Anisotropie auf, da sie entlang der Nebenachse signifikant höher ist im Vergleich zur Hauptachse. Die Rolle des Aktin- und Mikrotubuli-Cytoskeletts bei der Regulierung der Kernverformbarkeit wurde untersucht, indem die Aktinfilamente oder Mikrotubuli selektiv mit Cyto D bzw. Neol depolymerisiert wurden. Es zeigte sich, dass die Depolymerisierung der Aktinfilamente oder der Mikrotubuli einen Verlust der anisotropen Verformbarkeit des Kerns hervorruft.Diese Ergebnisse stützen die Erkenntnisse, dass zytoskelettale Komponenten Kräfte vom Substrat auf den Zellkern übertragen und außerdem für die Aufrechterhaltung des natürlichen mechanischen Verhaltens des Kerns unerlässlich sind. Während der Verformung wurde die biaxiale Dehnplattform ebenfalls verwendet, um den Effekt einer chronischen Überexpression des Hitzeschockproteins 27 oder HSP27 auf die Gefäßsteifigkeit zu bewerten. In einem mausmodell mit Neigung zur Atherosklerose verändert APOE homozygot negativ die histologische Zusammensetzung von Atherosklerose-Läsionen, indem es den Anteil intimaler glatter Muskelzellen und des Kollagengehalts erhöht.Um die Auswirkung dieser histologischen Umbildung auf die mechanischen Eigenschaften der Gefäße zu bestimmen, wurde die Dehnplattform verwendet, um die Steifheit der Aorta zu messen. Dieses Diagramm zeigt eine typische Spannungs-Dehnungs-Kurve, die durch das Dehnen eines Aortengefäßes erhalten wurde, wobei die Steifheit bei 30 % Dehnung berechnet wird. Die Steifheit entspricht der Steigung der Tangente, die durch die rote Linie an die Kurve angelegt ist.Es wurde festgestellt, dass die Steifigkeit von Aortensegmenten von Mäusen mit HSP-27-Überexpression im Vergleich zum Kontrollmausmodell signifikant um 41 % erhöht war. Insgesamt zeigten die mechanische Beurteilung in Kombination mit der Gefäß- und Plaque-Histologie, dass die Überexpression von HSP 27 durch eine erhöhte Gefäßsteifigkeit sowie einen erhöhten Gehalt an Kollagen und glatten Muskelzellen gekennzeichnet ist. Diese Ergebnisse legen nahe, dass HSP 27 die Stabilität atherosklerotischer Läsionen möglicherweise erhöhen und somit das Risiko eines Plaquerupturs nach der Entstehung der Läsion verringern könnte.Diese Technik eröffnet Forschern auf dem Gebiet der Bioingenieurwissenschaft neue Möglichkeiten, die Zellreaktion auf komplexe und inotrope mechanische Deformationen für Anwendungen in der mechanischen Biologie zu untersuchen, aber auch die Mechanik biologischer Gewebe bei Krankheiten zu überwachen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

In diesem Protokoll, zeigen wir die Herstellung eines Mikroaktor Reihe von vertikal versetzt zum Thema, die die Technologie basiert, und wie diese Basistechnologie können modifiziert werden, um High-Throughput-mechanisch dynamischen Zellkultur in beiden zweidimensionalen und dreidimensionalen Kultur durchzuführen Paradigmen.

Mikrofabrizierten Plattformen für Mechanisch Dynamische Cell Culture

Ein neuartiges Bildgebungsprotokoll wurde entwickelt, das einen speziellen motorbetriebenen mechanischen Aktuator verwendet, um die Messung von Echtzeitreaktionen auf mechanische Dehnung in lebenden Zellen zu ermöglichen. Das für die Mechanobiologie relevante System kann Dehnungen von bis zu 20 % aufbringen und ermöglicht gleichzeitig eine Bildgebung nahezu in Echtzeit mit konfokaler oder Rasterkraftmikroskopie.

Live Cell Imaging bei Mechanical Stretch

Die Zelldifferenzierung wird durch eine Vielzahl von Mikroumgebungsfaktoren reguliert, einschließlich der beiden Matrixzusammensetzung und Substratmaterialeigenschaften. Wir beschreiben hier eine Technik unter Verwendung von Zellmicroarrays in Verbindung mit Traktionskraftmikroskopie sowohl Zelldifferenzierung und biomechanischen Zell-Substrat-Wechselwirkungen als Funktion der Mikroumgebungskontext zu bewerten.

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Hier stellen wir ein mechanikbasiertes Protokoll vor, um den Spaltknoten-Anschluss 43 zu stören und die daraus resultierenden Auswirkungen auf die endotheliale Biomechanik durch Beobachtung von Traktionen und interzellulären Spannungen zu messen.

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Die vorgestellte Methode beinhaltet das einachsige Dehnen von 3D-Weichhydrogelen, die in Silikonkautschuk eingebettet sind, während eine konfokale Live-Mikroskopie ermöglicht wird. Die Charakterisierung der externen und internen Hydrogelstämme sowie die Faserausrichtung werden demonstriert. Das entwickelte Gerät und Protokoll kann die Reaktion von Zellen auf verschiedene Belastungsregime beurteilen.

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Hier stellen wir ein neuartiges Gerät vor, das isotrope und uniaxiale Dehnungswellenformen auf Zellen anwendet und gleichzeitig Kultur auf Substraten mit abstimmbarer Steifigkeit und anpassbaren Proteinmatrizen unterstützt. Diese einfache, wirtschaftliche Plattform ermöglicht es Forschern, zu untersuchen, wie mechanische Hinweise die zelluläre Funktion sowohl in grundlegenden Studien als auch in krankheitsrelevanten Kontexten regulieren.

Eine neuartige Plattform für in vitro zelluläre Dehnung und Bildgebung

Selbstorganisierte Monoschichten (SAMs) aus langkettigen Alkan Thiolen auf Gold gebildet ist gut definierten Substraten für die Bildung von Protein-Muster-und Zell-Entbindung. Mikrokontaktdruck von Hexadecanthiol mit einem Polydimethylsiloxan (PDMS)-Stempel durch Verfüllung mit folgten einem Glykol-terminierte Alkanthiol Monomer erzeugt ein Muster, bei dem Protein und Zellen adsorbieren nur den Stempel Hexadecanthiol Region.

Erstellen Zweidimensionale Patterned Substrate für Protein-und Zell-Confinement

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A Novel Stretching-Plattform für Anwendungen in der Zell-und Gewebe Mechanobiologie

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