Skalierbare High Throughput Auswahl aus Phagen-Antikörperbibliotheken angezeigt Synthetische

Das übergeordnete Ziel dieses skalierbaren Verfahrens ist es, spezifische und hochaffine Fab-Phagen-Klone aus einer Phagen-Bibliothek zu isolieren, wobei ein Hochdurchsatzansatz verwendet wird, der eine parallele Selektion gegen Hunderte von antigenen Zieldomänen ermöglicht. Dies wird erreicht, indem zunächst gereinigte antigene Domänen in Mikrotiterplatten immobilisiert werden. Die nächsten Schritte bestehen darin, Fab-Phagen-Klone freizulegen, einzufangen, freizusetzen und zu amplifizieren, die in aufeinanderfolgenden Selektionsrunden spezifisch an immobilisiertes Mikroplatten-Antigen binden.

Während dieses Prozesses wird die Wirksamkeit der Auswahl bei jedem Schritt mit gepoolten Methoden überwacht. Der letzte Schritt besteht darin, die Spezifität, Affinität und/oder Aktivität der isolierten Fab-Klone zu bewerten. Letztendlich werden spezifische Fab-Fragmente mit hoher Affinität gegen eine große Anzahl von Antigenen parallel isoliert, was die Erzeugung von Antikörpern ermöglicht, die für die Analyse ganzer Klassen strukturell oder funktionell verwandter Proteine nützlich sind.

Die Bedeutung dieser Methode liegt darin, dass sie eine Alternative bietet, die dazu beitragen kann, die Einschränkungen zu überwinden und das Tempo herkömmlicher Antikörperentwicklungstechnologien in einem akademischen oder industriellen Labor zu beschleunigen. Der große Vorteil dieser Technik gegenüber herkömmlichen Antikörperentwicklungstechniken wie dem Hybridom besteht darin, dass keine Tiere verwendet werden müssen. Es kann für praktisch jedes Protein verwendet werden, einschließlich toxischer und nicht-immunogener Proteine.

Wie wir sehen werden, lässt es sich leicht parallelisieren und liefert letztendlich in nur sechs bis acht Wochen erneuerbare rekombinante DNA, die für einen hochaffinen Antikörper kodiert, der für bestimmte Antigen-, Funktions- und Standard-Immunoassays spezifisch ist. Angesichts der Bedeutung von Antikörpern in der biomedizinischen Forschung sahen wir eine Möglichkeit, die Antigengenerierung sowie die Auswahl und Identifizierung von Antikörpern an einen Hochdurchsatzansatz anzupassen und zu skalieren und gleichzeitig den Zugang zu Laboren unterschiedlicher Größe und verfügbaren Ressourcen zu gewährleisten. Wählen Sie am Morgen des Tages der Phagenselektion eine einzelne Kolonie von T-eins-Phagen-resistenten E-Coli-Zellen aus.

Geben Sie es zu einem Milliliter von zwei yt Medien mit Tetracyclin in einer Menge von 50 Mikrogramm pro Milliliter. Lassen Sie die Kolonie unter Schütteln bei 200 U/min in einem 2,5 Zentimeter großen Orbitalschüttler inkubieren. Sobald das Wachstum der Kultur visuell sichtbar ist, übertragen Sie die Zellen auf das erforderliche Volumen des mit Tetracyclin ergänzten Mediums.

Es muss genug für 100 Mikroliter pro Selektionsvertiefung oder etwa 10 Milliliter pro 96 sein. Gut Platte erweitern Aliquots der Kultur sowohl Kohlenstoff-Penicillin als auch Canin ergänzte Medien. Diese Kulturen verhindern eine Präinfektion in den Zellen, die für die Amplifikation verwendet werden sollen.

Wenn die optische Absorption der Kultur bei 595 Nanometern 0,4 bis 0,8 erreicht. Nach fünf bis sieben Stunden sind die Zellen bereit, sich auf die Antigenplatten aufzutragen. Um für dieses Protokoll die gewünschte Abdeckung der Bibliothek sicherzustellen, bereiten Sie ausreichend replizierte Antigenplatten und unspezifische Kontrollproteinplatten vor.

Bei Verwendung der angezeigten Berechnung werden die Details im Textprotokoll bereitgestellt. Nach der Immobilisierung von Ziel- und unspezifischen Kontrollproteinen über Nacht nehmen Sie die Proteinlösung von der Platte. Fügen Sie 200 Mikroliter Blockierungspuffer hinzu und blockieren Sie eine Stunde lang unter Schütteln und waschen Sie die Platte viermal, bevor Sie die Phagenbibliothek hinzufügen, während die Zellen wachsen.

Am Tag der Phagenselektion klären wir unspezifische oder tag-spezifisch bindende FAB-Klone aus der Bibliothek, indem wir 100 Mikroliter der Phagenbibliothek auf die negativen Selektionsplatten übertragen, um eine zusätzliche negative Selektion zu erhalten. Entfernen Sie den Tag-bindenden Phagen, indem Sie einen Überschuss an löslichem Affinitäts-Tag hinzufügen. Fügen Sie dazu jeweils eine Endkonzentration von 10 Mikromolaren löslicher GST hinzu.

Na dann die Platten ein bis zwei Stunden auf einem Shaker bei Raumtemperatur inkubieren. Um die Zielproteinplatte herzustellen, aspirieren Sie die Proteinlösung aus der Platte, fügen Sie 200 Mikroliter Blockierungspuffer hinzu und blockieren Sie eine Stunde lang durch Schütteln und viermaliges Waschen, bevor Sie die Phagenbibliothek hinzufügen. Nach der Inkubation die Phagenschlinge von den Platten sammeln.

Übertragen Sie das Phagensupinat mit einem 96-Kanal-Liquidhandler auf antigenbeschichtete Platten. Anschließend werden die Platten ein bis zwei Stunden auf einem Shaker bei Raumtemperatur inkubiert. Entfernen Sie nach der Inkubation den ungebundenen Phagen, indem Sie die Vertiefungen acht- bis 15-mal mit PT-Puffer waschen.

Dies kann manuell oder mit einer automatischen Tellerwaschanlage erfolgen. Entfernen Sie dann kurz vor dem Hinzufügen der Zellen den gesamten überschüssigen Waschpuffer, wenn die Zellen und Antigenplatten fertig sind. Eluieren Sie den Phagen, indem Sie 100 Mikroliter wachsender Zellen in jede Vertiefung geben und die Platten eine halbe Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren lassen.

Es wird nicht erwartet, dass die ersten Selektionsrunden zu einer signifikanten Anreicherung führen, aber die Quantifizierung der Ausgangs-Phagentiter kann die Illusion der minimalen Phagenkonzentrationen gewährleisten, die für eine erfolgreiche Selektion erforderlich sind. Zu diesem Zweck kann ein Aliquot von Zellen vor der Zugabe von Helferphagen entnommen werden, um die Phagenproduktion durch Vorbereiten und Plattieren von seriellen Verdünnungen der Zellen auf mit Antibiotika ergänzten Agarplatten zu verengen. Nach einer halbstündigen Inkubation werden M 13 K oh sieben Helferphagen in jede Vertiefung gegeben, um eine Konzentration von 10 Milliarden koloniebildenden Einheiten pro Milliliter zu erhalten.

Lassen Sie die Platten weitere 45 Minuten inkubieren, diesmal unter Schütteln bei 200 U/min. Übertragen Sie anschließend die Zellen in einen 96-Well-Deep-Well-Block mit einem V-Boden, der 1,2 Milliliter ergänzte zwei YT-Medien pro Well enthält. Lassen Sie die Deep-Well-Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren und am nächsten Tag bei 200 U/min schütteln.

Pelletieren Sie die Bakterien, indem Sie die Platten 15 Minuten lang bei 4.000 GS bei vier Grad Celsius drehen. Übertragen Sie dann von jeder Replikatplatte gleiche Volumina des Überstands, der den Phagen enthält, in ein Miniröhrchen. 96-Well-Mikroplatten-Bluebox, die als Eingabe für nachfolgende Selektionsrunden für den gepoolten Phagen verwendet werden soll, fügen Sie ein 10. Volumen von 10 XPBT hinzu und mischen Sie, um zu neutralisieren.

Wiederholen Sie nun den Auswahlvorgang aus der Bibliothek. Drei- bis viermalige Pre-Clearance- und Antigen-Phagen-Inkubation mit Phagen, die aus der vorherigen Selektionsrunde amplifiziert wurden. Tun Sie dies, bis eine Anreicherung der Zielbindung im Vergleich zur Bindung unspezifischer Kontrollproteine durch Eliza Micro-Well-Platten beobachtet wird, die mit zwei Mikrogramm pro Milliliter Antigen oder Kontrollprotein kodiert sind, wie zuvor in der Vorab-Clearance- und Antigen-Phagen-Inkubation in der Bibliothek beschrieben, dann blockiert und wie zuvor auf blockierte und gewaschene Antigen- und Kontrollprotein-beschichtete Platten gewaschen werden, 100 Mikroliter verdünnte Phagenplatten in die Vertiefungen geben und die Platten unter Schütteln inkubieren lassen 15 Minuten bei Raumtemperatur Nach der Inkubation die Platten achtmal mit PT-Puffer waschen.

Nach dem Waschen werden dann 100 Mikroliter Anti-M 13 HRP-Antikörper in einer Dosis von 1 bis 5.000 Litern PBT in jede Vertiefung gegeben, die eine halbe Stunde lang inkubiert wird, um die Antikörperbindung an antigengebundene Phagen zu ermöglichen. Anschließend die Platten sechsmal mit PT-Puffer waschen und noch zweimal mit reinem PBS-Substrat vorbereiten, mischen und jeweils 100 Mikroliter eins zu eins TMB-Substrat auf die Vertiefungen auftragen. Lassen Sie dies fünf bis 15 Minuten einwirken und stoppen Sie die Reaktionen, wenn es zu einer signifikanten Farbänderung kommt.

Stoppen Sie die Reaktionen, indem Sie 100 Mikroliter eines molaren Phosphorsäures hinzufügen. Lesen Sie nun die Absorption in den Vertiefungen bei 450 Nanometern ab und vergleichen Sie die Zielbindungssignale mit den Bindungssignalen der Kontrollproteine nach der Anreicherung. Einzelne Klone können isoliert und charakterisiert werden durch die Sequenzierung von Phagen, die DNA-Umwandlung von Phagen, die an freie Fab gebunden sind, und die Bewertung der direkten Bindung an das Ziel unter Verwendung von klonalem FabuLisa, wie im Textteil des Protokolls erläutert.

Für Labore, in denen ein höherer Durchsatz erforderlich ist, kann diese Methodik skaliert und automatisiert werden. Zu diesem Zweck wurde eine maßgeschneiderte Robotik entwickelt, die die Selektionskapazität erweitern kann, indem alle Aspekte des Verfahrens automatisiert werden, einschließlich Blockierung, Phagen, Bindung und Elucian und mehr. Ein Ansatz zur Gewinnung von Antigenen für die Verwendung bei der Antikörperselektion ist die Verwendung synthetischer Gentechnologien, um Konstrukte für die Expression isolierter Proteindomänen zu erhalten.

In den meisten Fällen ermöglicht dies die Hochdurchsatz-Expression und die Isolierung ausreichender Mengen an ausreichend reinem gereinigtem Antigen für die Selektion. In aufeinanderfolgenden Runden des Auswahlprozesses wurden die entgangenen Phagenkonzentrationen und die Anreicherung von Phagen, die spezifisch an das Antigen gebunden waren, entweder durch Phagentitration wie zuvor gezeigt oder mit Phagenpools überwacht. In einem ELA-Assay zeigt ein Bindungsverhältnis von mehr als zwei im Allgemeinen das Vorhandensein spezifischer Bindungsklone an.

Umgekehrt kann ein niedrigeres Verhältnis helfen, die Ursache eines Auswahlfehlers zu ermitteln. Die Charakterisierung der Klonbindung mit einem farbmetrischen Aminoassay ermöglicht den Vergleich der Bindung von Fab-Phagen oder Fab an immobilisiertes Antigen im Vergleich zur Bindung von Negativkontrollproteinen, wodurch ein Maß an Spezifität bei der Skalierung und Automatisierung der Selektion mit robotergestützten Liquid-Handling-Einheiten erreicht wird. Die Verwendung von absorbierenden Chromophoren kann dazu beitragen, zu erkennen, wenn bestimmte Kanäle in der Fluidik entweder verstopft sind oder ihre Dichtung verloren haben, was zu einer teilweisen Volumenabgabe führt, und bei der Fehlerbehebung bei der Optimierung von Waschvorgängen helfen. Die Verwendung bekannter Bindungsklone stellt sicher, dass die Zielbindung erhalten bleibt, während die Hintergrundbindung während der Wäsche entfernt wird.

Darüber hinaus stellen wirksame Dekontaminationsprotokolle sicher, dass es keine Kreuzkontaminationen aus aufeinanderfolgenden Auswahlrunden oder verschiedenen Auswahlverfahren gibt, und es wird empfohlen, dass zusätzliche Parameter zur Fehlerbehebung im Textprotokoll überprüft werden. Durch die Skalierung dieser Technik für die industrielle Anwendung hoffen wir, Forschern die Erforschung ganzer Klassen strukturell oder funktionell verwandter Proteine zu ermöglichen, indem wir die Auswahl und Identifizierung von hochaffinen erneuerbaren Antikörpern beschleunigen, mit dem ultimativen Ziel, eine maximale Proteomabdeckung zu erreichen.