Name: Skalierbare High Throughput Auswahl aus Phagen-Antikörperbibliotheken angezeigt Synthetische (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: Erfahren Sie eine skalierbare Hochdurchsatzmethode zur Isolierung hochaffiner Antikörperfragmente aus Phagen-Display-Bibliotheken. Diese Technik ermöglicht die parallele Selektion gegen hunderte Antigene für die Antikörperentwicklung.

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Wir möchten die NIH Gemeinsamen Fonds anerkennen - Protein Einfangreagenzien Programm für die Finanzierung der Entwicklung des rekombinanten Antikörpers Netzwerk Antikörperselektion und Charakterisierung Pipeline und der kanadischen Stiftung für Innovation zur Finanzierung Kauf des Roboterauswahl Plattform.

<ol><li>Winter, G., Milstein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Man-made+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Man-made antibodies.</a> Nature. 349, 293-299 (1991).</li>
<li>Miersch, S., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+antibodies%3A+concepts%2C+potential+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Synthetic antibodies: concepts, potential and practical considerations.</a> Methods. 57, 486-498 (2012).</li>
<li>Schofield, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+phage+display+to+high+throughput+antibody+generation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Application of phage display to high throughput antibody generation and characterization.</a> Genome Biol. 8, R254(2007).</li>
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<li>Colwill, K., Graslund, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+roadmap+to+generate+renewable+protein+binders+to+the+human+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A roadmap to generate renewable protein binders to the human proteome.</a> Nat. Methods. 8, 551-558 (2011).</li>
<li>Mersmann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+proteome+scale+antibody+selections+using+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Towards proteome scale antibody selections using phage display.</a> Nat. Biotechnol. 27, 118-128 (2010).</li>
<li>Pershad, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+a+panel+of+highly+specific+antibodies+to+20+human+SH2+domains+by+phage+display%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Eng.+Des.+Sel%22%5BJournal%5D)">Generating a panel of highly specific antibodies to 20 human SH2 domains by phage display.</a> Protein Eng. Des. Sel. 23, 279-288 (2010).</li>
<li>Turunen, L., Takkinen, K., Soderlund, H., Pulli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+panning+and+screening+procedure+on+microplates+for+antibody+generation+from+phage+display+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol.+Screen%22%5BJournal%5D)">Automated panning and screening procedure on microplates for antibody generation from phage display libraries.</a> J Biomol. Screen. 14, 282-293 (2009).</li>
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<li>Fellouse, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+generation+of+synthetic+antibodies+from+highly+functional+minimalist+phage-displayed+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">High-throughput generation of synthetic antibodies from highly functional minimalist phage-displayed libraries.</a> J. Mol. Biol. 373, 924-940 (2007).</li>
<li>Paduch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+conformation-specific+synthetic+antibodies+to+trap+proteins+in+selected+functional+states%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Generating conformation-specific synthetic antibodies to trap proteins in selected functional states.</a> Methods. 60, 3-14 (2013).</li>
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<li>Huang, H., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studying+binding+specificities+of+peptide+recognition+modules+by+high-throughput+phage+display+selections%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Studying binding specificities of peptide recognition modules by high-throughput phage display selections.</a> Methods Mol. Biol. 781, 87-97 (2011).</li>
<li>McLaughlin, M. E., Sidhu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+and+analysis+of+peptide-recognition+domain+specificities+by+phage+display+and+deep+Sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Engineering and analysis of peptide-recognition domain specificities by phage display and deep Sequencing.</a> Methods Enzymol. 523, 327-349 (2013).</li>
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<li>den Engelsman, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+the+assessment+of+protein+aggregates+in+pharmaceutical+biotech+product+development%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Strategies for the assessment of protein aggregates in pharmaceutical biotech product development.</a> Pharm. Res. 28, 920-933 (2011).</li>
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<li>Mahon, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+interrogation+of+a+minimalist+synthetic+CDR-H3+library+and+its+ability+to+generate+antibodies+with+therapeutic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Comprehensive interrogation of a minimalist synthetic CDR-H3 library and its ability to generate antibodies with therapeutic potential.</a> J. Mol. Biol. 425, 1712-1730 (2013).</li>
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<li>Bradbury, A. R., Sidhu, S., Dubel, S., McCafferty, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+natural+antibodies%3A+the+power+of+in+vitro+display+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Beyond natural antibodies: the power of in vitro display technologies.</a> Nat. Biotechnol. 29, 245-254 (2011).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Bei der Durchführung von in vitro-Antikörper-Selektionen, die zwei primäre Determinanten Auswahl Erfolg sind 1) die Isolierung von gut gefalteten Antigenziele zur Auswahl auf und 2) die Verfügbarkeit einer hohen Funktionsvielfalt Antikörperbibliothek. In vielen Fällen kann die Verfügbarkeit ausreichender Mengen von gut gefalteten Protein voller Länge nicht limitierend sein. Ein Ansatz zur Überwindung dieser Einschränkung ist, Domains von Bioinformatik-Analyse 22 identifiziert und zur Insertion synthe...

Mit dem Beginn der Post-Genom-Zeitalter, ist die Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Bindungsreagenzien zur Charakterisierung und zu modulieren Proteine ​​wichtig, neue Forschung und therapeutische Wege eröffnen. Antikörper weiterhin entscheidend für die akademische und industrielle Forscher als Grundlagenforschung und Diagnose- und potenziellen Therapeutika zu sein. Es überrascht nicht, hat es eine beeindruckende Wachstum der Vertrags Antikörper-Entwicklung von Unternehmen, von denen die meisten verlassen sich auf herkömmliche Hybridom-Technologien, um kundenspezifische Antikörper zu erzeugen. Dennoch In-vitro-Selektion unter Verwendung von Phagen präsentierten Antikörperbibliotheken ist immer eine leistungsstarke Alternative Technologie, die einzigartige Vorteile und Erfolg in dem herkömmlichen Technologien kann Einschränkungen 1, 2 gegenüber anbieten können. Angesichts der erheblichen Nachfrage nach qualitativ hochwertigen Antikörpern als Forschungswerkzeuge, zwei zentralen Herausforderungen für die Erzeugung erneuerbarer Antikörper 1) Auswahl Durchsatz und 2) Antigen availability. Einige Gruppen haben nun in vitro Selektionsleitungen auf der Durchsatz erhöht und die Rate der Antikörperidentifizierung gerichtet beschrieben. Diese Beschreibungen detailliert eine Vielzahl von lebensfähigen Ansätzen, die entweder auf voller Länge der Auswahl gehören zielt 3,4 oder strukturell verwandte Domänen 5,6,7, entweder mit Wulst-basierten 6,8 oder plattenbasierte 3,4 Antigen Immobilisierung Systeme. Darüber hinaus hat die zunehmende Verbreitung der Gensynthese Technologien 9 systematische Antigen Generation, insbesondere aus isolierten Domänen, einigermaßen kostengünstig und können die Schwierigkeiten bei der Beschaffung ausreichender Mengen an gereinigtem, in voller Länge Antigen möglicherweise lindern. Durch die Verwendung der beiden Techniken in Tandem, wurde eine in sich geschlossene und skalierbare Antigenerzeugung und Antikörperselektion Pipeline erarbeitet, die die parallele Isolierung von Antikörpern für große Mengen an exprimiertem Antigen Domänen ermöglichen und erleichtern die Entwicklung von Reagenzien für cha würderacterizing ganze Klassen strukturell oder funktionell verwandten Proteinen. Zu diesem Ziel, eine integrierte Rohrleitung, die Paare in silico Identifizierung exprimierbaren Antigendomänen, Gensynthese, Hochdurchsatz-bakterielle Expression von Antigenen und skalierbare Phagen präsentierten Antikörper Selektionen wurde entwickelt. Diese Pipeline benötigt nur grundlegende Infrastruktur für die meisten Life-Science-Labors (einschließlich Antikörperbibliotheken, die durch Lizenz oder Materialübertragungsvereinbarung immer zur Verfügung stehen), sondern eignet sich auch für den Einsatz im industriellen Maßstab Automatisierung. Unter Verwendung dieses Protokolls ist es möglich, Hunderte von affinitätsmarkierten Antigen-Domänen zu erzeugen, und routinemäßig an viele dieser Antigene zu isolieren, hochspezifische Antikörperfragmente. Phagen-Display-Technologie hat gezeigt, die Kompatibilität mit einer Vielzahl von rekombinanten Affinitätsreagens Formate einschließlich Fab, scFv, Fv und autonomen Domänen und eine gezeigtenwachsende Zahl von kleinen &quot;alternativen Frameworks&quot; (entworfen Ankyrin Repeat Proteine ​​(DARPins), Fibronektin (Fn), Lipocalin Domains und 10). Diskussion In diesem Beispiel wird die Isolierung von Fab-Antikörperfragmente beschränkt, obwohl angenommen wird, können diese Verfahren auf andere Arten von Bibliotheken angepasst werden. Mit Hilfe dieser Technologie Fabs mit niedrigen nanomolaren Affinität zu kleinen, markierten Proteindomänen mit Transkriptionsfaktor-Domänen, SH2-Domänen, RNA-bindende Proteine ​​und andere haben erfolgreich ausgewählt, von denen viele zu binden Protein voller Länge und sind funktional in Immunoassays, wie Immunfluoreszenz , Immunpräzipitation und Immunhistochemie. Wichtig ist, dass rekombinantes Bindungs ​​Klone vollständig erneuerbaren und kann von Ausdruck neu generiert werden konstruiert durch bakterielle Produktionsangebot erhöhte Konsistenz, Reproduzierbarkeit und Wirtschaftlichkeit, so dass die Kosten der strengen Klon Überprüfung rechtfertigen. In diesem Protocol und dazugehörige Video, werden grundlegende Methoden zur Antikörperselektion von Phagen präsentierten Bibliothek unter Verwendung von immobilisiertem Antigen Domänen demonstriert. Dieses besondere Verfahren verwendet mit GST markierten Proteindomänen durch passive Adsorption in Mikrotiterplatten immobilisiert, obwohl auch andere Tags 11,12,13 und Selektionsformate 13,14,2 wurden ebenfalls erfolgreich verwendet. Kritische Überlegungen für die Einrichtung und Durchführung von Selektionen mit paralleler Überwachung der Auswahlparameter zu identifizieren und zu isolieren speziell angereicherten klonalen Antikörpern für die Validierung gerichtet sind detailliert.

<table><tbody><tr><td>MATERIALIEN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>New Brunswick Innova44 stapelbarer Inkubator-Schüttler</td><td>Eppendorf</td><td>M1282-0004</td><td></td></tr><tr><td>Liquidator 96-Kanal manuelles Tisch-Pipettiersystem</td><td>Anachem Ltd</td><td>LIQ-96-200</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten-Schüttler</td><td>VWR</td><td>12620-926</td><td></td></tr><tr><td>ThermoScientific Sorvall ST-40 Tischzentrifuge</td><td>Thermo Produkt</td><td></td><td></td>75004525</tr><tr><td>ELx405 Select Deep Well Mikrotiterplatten-Waschmaschine</td><td>Biotek</td><td>ELX405USD</td><td></td></tr><tr><td>Kundenspezifischer automatisierter Phagenauswahlroboter mit hohem Durchsatz</td><td>S& P Robotics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konisches Falcon-Röhrchen aus Kunststoff: 50 ml</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>Konisches Falcon-Röhrchen aus Kunststoff: 15 ml</td><td>VWR</td><td>89039-668</td><td></td></tr><tr><td>Axygen 1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>MCT-175-L-C</td><td></td></tr><tr><td>96-Well/384-Well-Maxisorp-Platte</td><td>Sigma</td><td>M9410-1CS</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-Well-Deep-Well-Block</td> <td>mit V-BodenCorning</td><td>3960</td><td></td></tr><tr><td>Axygen Mini-Tube 96-Well, sterile Mikroplatte, Blue Box</td><td>, Corning</td><td>AXY-MTS-06-C-R-S Atmungsaktive</td><td></td></tr><tr><td>Klebeplatte, Dichtungsfolie</td>, <td>VWR</td><td>60941-084</td><td></td></tr>, <tr><td>REAGENZIEN</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Name</td><td>, Unternehmen</td><td>, Katalognummer</td><td></td></tr><tr><td>, Polyethylenglykol,</td><td>Bioshop</td><td>PEG800.1</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Bioshop</td><td>YEX401.1</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Trypton</td><td>Bioshop</td><td>TRP402.1</td><td></td></tr><tr><td>N-Z Amin</td><td>Sigma</td><td>C7290</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Sigma</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Laktose</td><td>Bioshop</td><td>LAC234</td><td></td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Bioshop</td><td>GLY001.500</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin&nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>CAR544.10</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Bioshop</td><td>KAN201.25</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin&nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>TET701.25</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Bioshop</td><td>TWN510.500</td><td></td></tr><tr><td>monobasisches Kaliumphophat</td><td>Bioshop</td><td>PPM302.1</td><td></td></tr><tr><td>zweibasisches Natriumphosphat</td><td>Anachämie</td><td>84486-440</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Bioshop</td><td>SOD001.10</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Bioshop</td><td>POC308.1</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Bioshop</td><td>CCL302.500</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat</td><td>EMD</td><td>MX0070-1</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid</td><td>Bioshop</td><td>MAG510.500</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Amresco</td><td>0621-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Na2SO4</td><td></td><td>Bioshop SOS513.500</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Bioshop</td><td>AGR001.500</td><td></td></tr><tr><td>SybrSafe DNA-Gel-Färbung</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Phosphorsäure</td><td>Acros Organics</td><td>201140010</td><td></td></tr><tr><td>Lysozym</td><td>Bioshop</td><td>LYS702.25</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase</td><td>Novagen</td><td>71205</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td>Bioshop</td><td>TRX506.500</td></tr><tr><td>Protease-Inhibitor-Cocktail Tabletten</td><td>Roche</td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA-Harz&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>1.000x Helferphagen (M13K07) Stamm (1013 Phagen pro ml)</td><td>NEB</td><td>N0315S</td><td></td></tr><tr><td>HRP konjugierter M13-spezifischer Antikörper (anti-M13-HRP).</td><td>GE Healthcare</td><td>27-9241-01</td><td></td></tr><tr><td>TMB-Substrat: Mischen Sie gleiche Volumina TMB und H2O2 Peroxidase-Substrat</td><td>KPL</td><td>50-76-00</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Biobasic</td><td>DD0056</td><td></td></tr><tr><td>Taq-Polymerase</td><td>Genscript</td><td>E00007</td><td></td></tr><tr><td>Exonuklease</td><td>GE Gesundheitswesen&nbsp;</td><td>EZ0073X-EZ</td><td></td></tr><tr><td>Alkalische Phosphatase für Garnelen</td><td>GE Healthcare</td><td>E70092Z-EZ</td><td></td></tr></tbody></table>

skalierbare high throughput auswahl aus phagen-antikörperbibliotheken angezeigt synthetische

Scalable High Throughput Selection From  Phage-displayed Synthetic Antibody Libraries

Die Nachfrage nach Antikörpern, die den Bedürfnissen von Grundlagen- und klinischer Forschung Anwendungen zu erfüllen ist hoch und wird sich dramatisch in der Zukunft zu erhöhen. Es ist jedoch offensichtlich, dass herkömmliche monoklonale Techniken nicht allein bis zu dieser Aufgabe. Dies hat zu der Entwicklung von alternativen Verfahren führte zu der Forderung nach hoher Qualität und erneuerbarer Affinitätsreagenzien an alle zugänglichen Elemente des Proteoms befriedigen. Zu diesem Zweck sind Hochdurchsatzverfahren zur Durchführung von Auswahlen aus Phagendisplay-Bibliotheken synthetischer Antikörper für Anwendungen mit unterschiedlichen Antigenen entwickelt worden und zur schnellen Durchsatz und erfolgreich optimiert. Hierin wird ein Protokoll im Detail, die mit Video-Demonstration zeigt die parallel Auswahl Fab-Phagenklone aus hohe Diversität Bibliotheken gegen Hunderte von Ziele entweder mit einem manuellen 96-Kanal Liquid Handler oder automatisierten Robotersystem beschrieben. Unter Verwendung dieses Protokolls kann ein einzelner Benutzer Hunderte von Antigenen zu erzeugen,Wählen Antikörper, um sie parallel und zu validieren Antikörperbindung in 6-8 Wochen. Hervorgehoben sind: i) eine tragfähige Antigen-Format, ii) Vorauswahl Antigen Charakterisierung, iii) wichtige Schritte, die die Auswahl von spezifischen und hohen Affinität Klone beeinflussen und iv) Formen der Überwachung Auswahl Wirksamkeit und frühzeitig Antikörperklon Charakterisierung. Mit dieser Vorgehensweise haben wir synthetische Antikörperfragmenten (Fabs), viele Zielklassen einschließlich Single-Pass-Membranrezeptoren, sekretierte Proteinhormone und Multi-Domain intrazellulären Proteinen erhalten. Diese Fragmente werden leicht an Volllängen-Antikörpern umgesetzt und validiert worden sind, um eine hohe Affinität und Spezifität aufweisen. Ferner wurden sie nachgewiesen funktionellen in einer Vielzahl von Standard-Immunoassays, einschließlich Western-Blotting, ELISA, zelluläre Immunfluoreszenz, Immunpräzipitation und ähnliche Assays sein. Diese Methodik wird Antikörper Entdeckung zu beschleunigen und letztlich bringen uns näher an die Verwirklichung des Ziels of Erzeugung erneuerbarer, hochwertige Antikörper gegen das Proteom.

Das hier beschriebene Protokoll verwendet worden, um Antikörperfragmente zu einer Vielzahl von sowohl strukturell und funktionell verwandten Antigen-Domänen, von kombi Phagen präsentierten Fab-Bibliotheken, die parallel zu isolieren. Probleme, die Antigen Verfügbarkeit bezogen in silico Identifizierung exprimierbaren Antigen-Domänen, die geeignet sind für die Antikörper-Selektion 23 umgangen werden können, in vielen Fällen durch. Durch Kopplung an Antikörper-Antigen-Expression Auswahl im gleichen Labor <stron...

Es wird ein Verfahren mit visuellen Begleitung für die Durchführung von skalierbaren, Hochdurchsatz-Auswahl aus Phagendisplaykombi synthetische Antikörperbibliotheken gegen Hunderte von Antigenen gleichzeitig beschrieben. Mit dieser parallelen Ansatz haben wir Antikörperfragmente, die eine hohe Affinität und Spezifität für verschiedene Antigene, die in Funktionsstandard Immunoassays weisen isoliert.

Skalierbare High Throughput Auswahl aus Phagen-Antikörperbibliotheken angezeigt Synthetische

The demand for antibodies that fulfill the needs of both basic and clinical research applications is high and will dramatically increase in the future. ...

Das übergeordnete Ziel dieses skalierbaren Verfahrens besteht darin, spezifische und hochaffine Fab-Phagenklone aus einer phagenpräsentierten Bibliothek zu isolieren, wobei ein Hochdurchsatzansatz verwendet wird, der eine parallele Selektion gegen Hunderte von antigenen Zielbereichen ermöglicht. Dies wird erreicht, indem zunächst gereinigte antigenische Domänen in Mikrotiterplatten immobilisiert werden. Die folgenden Schritte bestehen darin, Fab-Phagenklone, die spezifisch an die in der Mikrotiterplatte immobilisierten Antigene binden, in aufeinanderfolgenden Selektionsrunden auszusetzen, zu erfassen, freizusetzen und zu amplifizieren. Während dieses Prozesses wird die Effektivität der Selektion mithilfe von gepoolten Methoden in jedem Schritt überwacht. Der letzte Schritt besteht darin, die Spezifität, Affinität und/oder Aktivität der isolierten Fab-Klone zu bewerten. Letztendlich werden spezifische, hochaffine Fab-Fragmente gegen eine große Anzahl von Antigenen parallel isoliert, wodurch die Erzeugung von Antikörpern ermöglicht wird, die für die Analyse ganzer Klassen strukturell oder funktionell verwandter Proteine nützlich sind.Die Bedeutung dieser Methode liegt darin, dass sie

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video demonstrieren wir die Phagen-Display-Technik, um vorgefertigte Phagen zu isolieren, die Proteine mit hoher Affinität zum Zielprotein exprimieren.

Verwendung des Phagen-Displays zur Auswahl von Proteinen mit hoher Affinität zu einem Zielprotein

Phagen-Display ist eine leistungsfähige Technik, Proteine ​​oder Proteineinheiten, die mit einem immobilisierten Molekül von Interesse in Wechselwirkung zu erfassen. Sobald eine Entscheidung über die Art der Phagen-cDNA-Bibliothek zu erstellen und zu Bildschirm gemacht worden ist, das hier beschriebene Protokoll ermöglicht eine effiziente Affinitätsselektion, die zu Identifizierung der Interaktionspartner.

Ein Protokoll für die Phagen-Display-und Affinity Auswahl mit rekombinantem Protein-Köder

Die beschriebenen Protokolle ermöglichen Aufbau, Charakterisierung und Auswahl (gegen das Ziel der Wahl) einer "Domainome"-Bibliothek, die aus jeder DNA-Quelle hergestellt. Dies wird erreicht durch eine Forschungs-Pipeline, die verschiedenen Technologien kombiniert: Phagen-Display, eine klappbare Reporter und Sequenzierung der nächsten Generation mit einem Web-Tool für die Datenanalyse.

Interaktom-Seq: Ein Protokoll zur Domainome Bibliotheksbau, Validierung und Auswahl von Phagen-Display und Next Generation Sequencing

Dieses Protokoll beschreibt ein detailliertes Verfahren für den Bau einer synthetischen Antikörper Phagen angezeigt-Bibliothek mit maßgeschneiderten Vielfalt. Synthetischen Antikörper haben breite Anwendungen von der Grundlagenforschung zur Krankheit Diagnostik und Therapie.

Bau von synthetischen Phagen Fab Bibliothek mit maßgeschneiderten Vielfalt angezeigt

Die Schaffung chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme mit gewünschter Affinität und Spezifität für einen bestimmten kleinen Molekülligand hätte viele biologische Sensor- und Betätigungsanwendungen. Hier beschreiben wir eine effiziente, verallgemeinerbare Methode zur de novo Engineering von chemisch induzierten Dimerisierungssystemen durch die schrittweise Auswahl einer phagenangezeigten kombinatorischen Ein-Domänen-Antikörperbibliothek.

Erstellen hochspezifischer chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme durch schrittweise Phage-Auswahl einer kombinatorischen Single-Domain-Antikörperbibliothek

Diese Studie zielte darauf ab, eine Strategie zur Identifizierung von Wechselwirkungen zwischen Medikamenten und Peptid zu präsentieren. Die Strategie umfasst die Biopanierung von medikamentenerkennenden kurzinomischen Kurzpeptiden auf der Grundlage eines Mikrobilanzsensors (QCM) in Quarzkristall, gefolgt von einer Bioinformatik-Analyse zur quantitativen Bewertung der für die Arzneimittelerkennung und Anmerkung der Arzneimittelbindungsstellen auf Proteinen erhaltenen Informationen.

Biosensor-basierte Hochdurchsatz-Biopanning- und Bioinformatik-Analysestrategie zur globalen Validierung von Wechselwirkungen zwischen Arzneimittel und Proteinen

Ubiquitinierung ist eine kritische posttranslationale Proteinmodifikation, deren Dysregulation mit zahlreichen menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht wurde. Dieses Protokoll beschreibt, wie die Phagenanzeige verwendet werden kann, um neuartige Ubiquitin-Varianten zu isolieren, die die Aktivität von E3-Ligasen binden und modulieren können, die die Spezifität, Effizienz und Muster der Ubiquitinierung steuern.

Verwendung von Phagenanzeige zur Entwicklung von Ubiquitin-Variantenmodulatoren für E3-Ligasen

Dieses Protokoll beschreibt die wesentlichen Schritte für die Durchführung von Auswahlkampagnen für Hefeoberflächendisplays zur Anreicherung von Proteinvarianten, die an ein Antigen von Interesse binden.

Protein-Engineering durch Hefe-Oberflächendisplay

Wir beschreiben eine effiziente Methode, um Einzelstrang-DNA, doppelsträngige DNA-und RNA-Molekülen aus Umwelt-virale Gemeinden zu trennen. Nukleinsäuren sind fraktionierte mit Hydroxyapatit-Chromatographie mit steigenden Konzentrationen von Phosphat-haltigen Puffer. Diese Methode erlaubt die Isolierung aller viralen Nukleinsäure-Typen aus Umweltproben.

Trennung von Einzelstrang-DNA, doppelsträngige DNA und RNA aus ökologischer Viral Gemeinschaft mit Hydroxyapatit-Chromatographie

Diese Methode beschreibt die Verwendung von Infrarot-Farbstoff basierende Imaging-System für den Nachweis von H1N1 in bronchioalveolar Lavage (BAL) Flüssigkeit von infizierten Mäuse mit einer hohen Empfindlichkeit. Diese Methodik in einem 96 durchgeführt werden kann - oder 384-Well-Platte, erfordert &lt;10 ul Volumen von Testmaterial und hat das Potenzial für die gleichzeitige Screening von mehreren Erregern.

High-Throughput Nachweisverfahren für Influenza-Virus

Erfahren Sie eine skalierbare Hochdurchsatzmethode zur Isolierung hochaffiner Antikörperfragmente aus Phagen-Display-Bibliotheken. Diese Technik ermöglicht die parallele Selektion gegen hunderte Antigene für die Antikörperentwicklung.

Skalierbare High Throughput Auswahl aus Phagen-Antikörperbibliotheken angezeigt Synthetische

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