Name: In-vitro-Zellkulturmodell für Toxic Inhalative Chemical Testing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-05-08T15:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 44 s
Description: Erfahren Sie die Exposition von Zellkulturen mit Chlorgas zur Untersuchung toxischer Effekte auf Herzmuskel- und Atemwegsepithelzellen. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Apoptose und Membranintegrität in vitro.

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Diese Forschung wird von der CounterACT Programm, National Institutes of Health (NIH), das Büro des Direktors, und dem National Institute of Environmental Health Sciences (NIEHS) Grant Number U54 ES015678 (CWW) unterstützt. SA wird auch von Kinderkrankenhaus Colorado / Colorado School of Mines Collaboration Pilot-Award # G0100394 und Kinderklinik Colorado Forschung Institue Pilot-Award # G0100471 unterstützt.

1. Rat Cardiomyocyte Kulturen <ol><li> Alle Experimente wurden unter Protokolle, die von der institutionellen Pflege der Tiere und die Verwendung Ausschuss genehmigt IACUC durchgeführt. </li><li> Erhalten Rattenherzmuskelzellen aus den Herzen (Ventrikel) der männlichen Ratten (240-260 g) unter Verwendung zuvor 4 beschriebenen Verfahren. Kurz gesagt, Tiere anästhesiert unter Verwendung einer intraperitonealen Injektion von Pentobarbital (100 mg / kg; bestätigen Anästhesie durch Zehenklemmverfahren) und dann Herzen in 10,0 ml, 1 mM Ca 2 + enthält, Krebs-Ringer-Puffer, pH 7,4, zu entfernen. </li><li> Spülen Sie die Herzen 5-6x, um Blut zu entfernen und dann wechseln Sie zu einem Ca 2 +-freien Krebs-Ringer-Puffer mit 0,02% und 0,06% Protease Kollagenase A (5,0 ml / Herz). Die Herzen in dieser Lösung für 10-15 min bei 37 ° C unter gelegentlichem Schütteln. </li><li> Nach 10-15 min, waschen die enzymatische Lösung mit Ca 2 +-freien Krebs-Ringer-Puffer für weitere 5 min. Lassen Sie die Zellen aus dem Gewebe schlaff unsten eine 25-ml-Pipette durch Pipettieren der Suspension nach oben und unten mehrmals. </li><li> Trennen Sie die Zellen von Gewebe durch Filtrieren durch eine 70 um Nylon-Mesh und es ihnen ermöglichen, in Krebs-Ringer-Puffer mit 0,1 mM Ca 2 + zu begleichen. Aussetzung des Zellpellets in 1,0 ml Krebs-Ringer-Puffer, enthaltend 0,2 mM Ca 2 +. </li><li> Vorsichtig Schicht über 5,0 ml 60 ug / ml Rinderserumalbumin, BSA, in 15 ml Zentrifugenröhrchen, zu Kardiomyozyten aus nonmyocytes trennen und es ihnen ermöglichen, für 30 Minuten absetzen. Die Herzmuskelzellen sind schwerer und bewegen sich auf den Boden des Röhrchens. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand Zellen und Medien. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal, um weiter zu reinigen, die Zellen. </li><li> Schrittweise Übergang durch Waschen (in den Schritten unter Verwendung von 0,25 mM, 0,5 mM, 0,75 mM und 1,0 mM Ca 2 +-haltigen Puffer) die ventrikulären Myocyten / Kardiomyozyten bis 1,0 mM Ca 2 +-haltigen Puffer und ACCT Medium, bestehend aus Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium resuspendiert , DMEM containing 2 mg / ml BSA, 2 mM L-Carnitin, 5 mM Kreatin, 5 mM Taurin, 100 IU / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin. </li><li> Platte der Kardiomyozyten in ACCT Medium in einer Dichte von 100 bis 150 Zellen / mm 2 auf 100 mm oder 35 mm Laminin beschichteten Kunststoffkulturschalen oder 40 x 22 mm Deckgläschen mit Laminin (1 ug / cm 2) schwemmt. Nach 1 Stunde, waschen das Geschirr mit 2,0 ml ACCT zu Zellen, die nicht gebunden sind, zu entfernen. In 10,0 ml frisches Medium und Inkubation der Zellen. </li></ol> 2. Differenzierte Air-Liquid-Interface (ALI) Kultur der Menschen Airway Epithelial Cells Basal <ol><li> Procure menschlichen Geweben tracheobronchiale von National Disease Research Interchange unter Institutional Review Board genehmigt Protokolle. Zellernte und durchzuführen, Kultur mit einem veröffentlichten Verfahren 5,6. Dieses Verfahren verwendet Zellkulturen, wie sie sind ein präzises Modell für den menschlichen Einatmung von TIC jedoch, wenn nötig kann man isolieren und zu wachsen ALI mozu verwenden und / oder Ratte Epithelzellen der Atemwege 7,8. </li><li> Kurz gesagt, stellen kleine Stücke (~ ¼ Inch) des Gewebes nach dem Entfernen aller Bindegewebe und Lymphknoten. Mehrmals in Ringer-Laktat-Lösung waschen Gewebe. Hinzufügen Gewebe zu einer 50 ml konischen Röhrchen und fügen Protease-Lösung (1% Protease/0.01% DNase in Minimalmedium, MEM, Gewebe Fluidverhältnis (1:10)). </li><li> Rock the Gewebe bei 4 ° C über Nacht. Enden die Dissoziation des Gewebes durch Zugabe von 10% fötalem Rinderserum. Kratzen die Epitheloberfläche mit einem chirurgischen Skalpell und Sammeln der Zellen durch Zentrifugation (2.000 Upm für 10 min). </li><li> Platten Zellen bei Passage auf einem kollagenbeschichteten snapwells in speziellen ALI Medium hergestellt, wie ausführlich von Fulcher et al 9 beschrieben. Kultur für 5 Tage vor dem Wechsel zum Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) durch Entfernen apikalen Medium. </li><li> Füttern Sie die Zellen mit ALI Medien jeden zweiten Tag und damit die Zellen für weitere 2-3 Wochen (zu unterscheidenbevor Expositionen beobachten zahlreiche Schläge Cilien und Schleim Sekretion). Waschen Sie die apikale Oberfläche mit warmem PBS zusammen mit Medienwechsel. </li></ol> 3. Chlor Belichtungs <ol><li> Enthält die Chlor-Belichtungssystem (CES) in einem qualifizierten chemischen Abzugshaube mit einer Betriebsgeschwindigkeit von 100 Gesicht fpm, die die notwendige Auffang Exposition von Personal im Falle des zufälligen Chlor Lecks zu verhindern bietet. </li><li> Betreiben Sie das System unter leichten Überdruck (0,5 Zoll Wasser). Trockene Luft bei 15 L / min und einem angemessenen Niveau von Chlor zugeführt wird, um die gewünschte endgültige Chlorkonzentration zu erreichen zugeführt. Die Kammern haben einen Verschlussdeckel mit 4 Mini-BCU Schleusen und einem niedrigen Härtegrad Silikondichtung, um den Druck Dichtung zu schaffen. </li><li> Geben Sie sich die Cl 2-Gemisch durch einen Massendurchflussregler. Die CES verwendet eine Druckgasflasche, die 1,0% Cl 2 in trockenem Stickstoff. </li><li> Regulieren Sie den Luftstrom mit Hilfe der Verdünnungkundenspezifische Systemsteuerung und ähnlich regeln die Cl 2-Konzentration in den Expositionskammern geliefert. Ein geringes Volumen Probenahmepumpe zieht die Abgase aus den Kammern in eine Chlor-Analysator zu Konzentrationen, die dann auf einem Datenlogger an den Analysator angeschlossen aufgezeichnet werden, zu überwachen. </li><li> Messen Sie die Durchflussmengen in den Kammern vor der Belichtung mit einem Durchflussmesser gleich und Abgasraten zu gewährleisten. </li><li> Bereiten Sie die Zellkulturen für die Exposition durch Entfernen der überstehenden Medien und Zugabe von frischem Medium (basolateralen Medien in ALI-Kulturen). Alle Vorbehandlungen mit Agenten konnte zu diesem Zeitpunkt durchgeführt werden. </li><li> Expose die ALI Kulturen der Epithelzellen der Atemwege zu Cl 2-Gas (50, 100 oder 300 ppm für 30 Minuten) in den beiden verschlossenen Polysulfon biocontainment Kammern. Die Herzmuskelzellen (untergetaucht oder konfluenten Kulturen auf Membranen) auf 50 oder 100 ppm Cl 2 für 15 Minuten ausgesetzt. </li><li> Nach der Belichtung bündig die Kammern mit Luft, bis das Cl 2 Stand unter 1 ppm und sicher geöffnet werden, um Zellen (innerhalb von 5 min) zu entfernen. </li></ol> 4. Transepitheliale Elektrischer Widerstand (TER) Mess <ol><li> Messen Sie die TER der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche, ALI, Kulturen mit einem epithelialen voltohmmeter mit einem Paar von Silberchlorid &quot;Stäbchen&quot;-Elektroden. </li><li> Äquilibrieren Sie die Essstäbchen Elektrode in der ALI Medien 15 min vor dem Gebrauch. </li><li> In warmen Medien zur apikalen (1,0 ml) und basolateralen (2,0 ml) und messen Sie die Oberfläche mit den Ess-Stäbchen TER Elektroden der voltohmmeter. </li><li> Tauchen Sie den kürzeren Arm der Elektrode in apikalen Medien und den längeren Arm in den basolateralen Medien. Klicken Sie auf die &quot;Maßnahme&quot;-Taste auf der voltohmmeter, den elektrischen Widerstand zu beurteilen. </li><li> Die voltohmmeter hat die Möglichkeit, Ohm oder k Ohm messen. Subtrahieren den Widerstand über einem zellfreien Kulturträger aus dem Widerstand über jede Zelle gemessen Schicht trans zu ergebenepithelialen Widerstand (TER). </li></ol> 5. Caspase Mess <ol><li> Add frischen ALI Medien (2,0 ml) zur basolateralen Oberfläche nach der Belichtung und Inkubation der Zelle bei Raumtemperatur. Sammeln Stand Medien bei 4 und 24 Stunden. </li><li> Messen Sie Caspase 3/7 Aktivität in den Medienüberständen mit Hilfe eines kommerziellen Caspase 3/7 Assay-Kit. </li></ol> 6. Western Blot und Immunzytochemie <ol><li> Führen Western Blots mit Zelllysaten wie zuvor beschrieben 10. Hängen Sie das Proteinlysat (20 ug) in 5x Probenpuffer reduziert und kochen für 5 min. Betreff des Proteinlysat SDS-PAGE (4-15%) und die Übertragung der getrennten Proteine ​​auf eine Nitrocellulosemembran durch elektrophoretische Blot. </li><li> Blockieren nicht-spezifischer Bindung durch Inkubation der Membran mit 5% Milch in Waschpuffer (PBS + 0,1% Detergens) und die Sonde die Membranen mit primärem Antikörper gegen Actin SERCA2 oder sarcomeric bei 1:1000 Verdünnung, über Nacht bei 4 ° C. Weiter, waschen und Inkubation mit den jeweiligen Membranen Peroxidase-konjugierten Sekundärantikörper zu entwickeln und für den Nachweis nach wie vor mit handelsüblichen 10-Peroxidase-Nachweis-Kit beschrieben. </li><li> Für Immunzytochemie Behandlung lebenden Zellen auf Einlagen oder Deckgläschen in 6-Well-Platten für 20 min nach dem Spülen mit PBS mit 0,4% gewachsen Triton-X-100 in 10 mM Natriumcitrat-Puffer. </li><li> Block unspezifische Bindung durch Behandlung der Zellen mit 5% Eselserum für 20 min inkubiert und dann die Zellen mit nicht-spezifischen IgG oder einzelne primäre Antikörper spezifisch sarcomeric Actin oder Ki-67. </li><li> Waschen der Zellen mit PBS und Inkubation mit Fluoreszenz-konjugierte sekundäre Antikörper an den primären Antikörper und einem Nuklearfarbstoff (1 &amp;mgr; g / ml DAPI) zu erfassen. </li><li> Mit PBS waschen und montieren Deckgläser mit handelsüblichen Montage Medien. </li><li> Visualisieren Sie die Färbung mit einem Fluoreszenzmikroskop. </li></ol>

<ol><li>Mohan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+accidental+exposure+to+chlorine+gas%3A+clinical+presentation%2C+pulmonary+functions+and+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Indian+J+Chest+Dis+Allied+Sci%22%5BJournal%5D)">Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes.</a> Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).</li>
<li>Kose, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocardial+infarction%2C+acute+ischemic+stroke%2C+and+hyperglycemia+triggered+by+acute+chlorine+gas+inhalation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Emerg+Med%22%5BJournal%5D)">Myocardial infarction, acute ischemic stroke, and hyperglycemia triggered by acute chlorine gas inhalation.</a> Am J Emerg Med. 27, 1021-1024 (2009).</li>
<li>Das, R., Blanc, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorine+gas+exposure+and+the+lung%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Ind+Health%22%5BJournal%5D)">Chlorine gas exposure and the lung: a review.</a> Toxicol Ind Health. 9, 439-455 (1993).</li>
<li>Claycomb, W. C., Palazzo, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+the+terminally+differentiated+adult+cardiac+muscle+cell%3A+a+light+and+scanning+electron+microscope+study%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Culture of the terminally differentiated adult cardiac muscle cell: a light and scanning electron microscope study.</a> Dev Biol. 80, 466-482 (1980).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+suppresses+sarcoplasmic%2Fendoplasmic+reticulum+Ca2%2B-ATPase+expression+in+cystic+fibrosis+airways%3A+role+in+oxidant-mediated+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 suppresses sarcoplasmic/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase expression in cystic fibrosis airways: role in oxidant-mediated cell death.</a> Am J Respir Crit Care Med. 179, 816-826 (2009).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+factor+signals+airway+epithelial+basal+cell+survival+via+coagulation+and+protease-activated+receptor+isoforms+1+and+2%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Cell+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tissue factor signals airway epithelial basal cell survival via coagulation and protease-activated receptor isoforms 1 and 2.</a> Am J Respir Cell Mol Biol. 48, 94-104 (2013).</li>
<li>Lam, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mouse+respiratory+epithelial+cells+and+exposure+to+experimental+cigarette+smoke+at+air+liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of mouse respiratory epithelial cells and exposure to experimental cigarette smoke at air liquid interface.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Hosokawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+tracheal+basal+cells+to+ciliated+cells+and+tissue+reconstruction+on+the+synthesized+basement+membrane+substratum+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Connect+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of tracheal basal cells to ciliated cells and tissue reconstruction on the synthesized basement membrane substratum in vitro.</a> Connect Tissue Res. 48, 9-18 (2007).</li>
<li>Fulcher, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Well-differentiated+human+airway+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Well-differentiated human airway epithelial cell cultures.</a> Methods Mol Med. , 107-183 (2005).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SERCA2+regulates+non-CF+and+CF+airway+epithelial+cell+response+to+ozone%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SERCA2 regulates non-CF and CF airway epithelial cell response to ozone.</a> PloS One. 6, e10(2011).</li>
<li>Martin, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorine-induced+injury+to+the+airways+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Chlorine-induced injury to the airways in mice.</a> Am J Respir Crit Care Med. 168, 568-574 (2003).</li>
<li>Evans, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chlorine%3A+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Lung%22%5BJournal%5D)">Chlorine: state of the art.</a> Lung. 183, 151-167 (2005).</li>
<li>Vliet, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+reactive+nitrogen+species+during+peroxidase-catalyzed+oxidation+of+nitrite.+A+potential+additional+mechanism+of+nitric+oxide-dependent+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Formation of reactive nitrogen species during peroxidase-catalyzed oxidation of nitrite. A potential additional mechanism of nitric oxide-dependent toxicity.</a> J Biol Chem. 272, 7617-7625 (1997).</li>
<li>Ahmad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+epithelial+cells+release+ATP+during+ozone+exposure%3A+signaling+for+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Lung epithelial cells release ATP during ozone exposure: signaling for cell survival.</a> Free Radic Biol Med. 39, 213-226 (2005).</li>
<li>Allen, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+system+for+exposure+of+cultured+cells+and+other+materials+to+ozone%5BTitle%5D)+AND+%22Inhal+Toxicol%22%5BJournal%5D)">An automated system for exposure of cultured cells and other materials to ozone.</a> Inhal Toxicol. 15, 1039-1052 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die häufigste Form der akuten toxischen Expositionen tritt auf, wenn man eine giftige Chemikalie in die Lunge atmet. Diese Chemikalien können auch schnell in den Blutkreislauf aufgenommen werden und andere Organe wie Herz und Gehirn beeinflussen. Giftigkeit beim Einatmen von verschiedenen Agenten mit Hilfe von Tiermodellen untersucht und darüber berichtet, aber die Mechanismen sind weniger gut verstanden. Dies ist eine große Hürde bei der Entwicklung wirksamer Therapien. Das Fehlen von in-vitro-Belichtungssysteme</e...

Inhalativen Exposition gegenüber toxischen Chemikalien (TIC) / Gase wie Chlor (Cl 2) bleibt eine laufende Gesundheitsproblem in zufälligen Positionen als auch in ihren möglichen Einsatz als chemische Bedrohung Mittel. Obwohl die Lunge das primäre Ziel sind Organe wie Herz und Gehirn betroffen 1-3. In vivo-Modelle sind in der Regel für die Prüfung Toxizität von TIC verwendet, aber in vitro-Assays zur Beurteilung Toxizität sind einfacher, schneller und kostengünstiger. In vitro-Modellen auch für die umfangreiche Untersuchung von Mittel-Zell-Interaktionen, die schwer zu in vivo zu beurteilen sein kann zu ermöglichen. Wie in vitro-Belichtungssysteme sind selten und außerdem in einigen herkömmlichen Modellen, bei denen giftige Substanzen werden dem Kulturmedium der Zellen hinzugefügt taucht, die Eigenschaften der Mittel kann aufgrund von Wechselwirkungen und die Bindung an Komponenten in dem Medium ändern. In solchen Szenarien Zellkultursystemen, wie Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche (ALI) Kulturen von primären humanen Epithelzellen der Atemwege, hier vorgeschlagen, die direkt in den gasförmigen Mittel ausgesetzt werden könnte vielversprechend. Epithelzellen der Atemwege sind die ersten Verteidigungslinien gegen giftige Chemikalien eingeatmet. Der menschliche Luftwegsepithel bildet eine physikalische Barriere zwischen dem Lumen und den darunterliegenden Zellen in der Lunge und nimmt an der Reaktion der Lunge. Es produziert eine Anzahl von Cytokinen und anderen pro-und anti-inflammatorische Mittel sowie Schleim sekretiert / Atemwegsoberflächenflüssigkeit (ASL), die das Epithel. Eine der Einschränkungen bei herkömmlichen in vitro-Kultursystemen untergetaucht ist auch, dass die ASL und Schleim, die Epitheloberfläche Abdeckung entfernt oder verdünnt. Dies entspricht nicht den physiologischen Zustand der Lungen Epithelzellen, die der Luft ausgesetzt sind. Daher sollte ein ideales in vitro-System für die TIC Toxizität dieser Architektur repliziert werden. Es gibt ein großes Interesse an der Entwicklung schnelle Screening methoden, die in vivo-Toxizität vorherzusagen. Epithelzellen an der ALI gewachsen zu differenzieren und haben gut differenzierten Strukturen und Funktionen im Vergleich zu Zellen gewachsen untergetaucht und servieren ein überlegenes Modell der Atemwege. In dieser Studie beschreiben wir den Einsatz von Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche Kultur der Menschenatemwege (tracheobronchiale) Epithelzellen zum Testen eingeatmeten Giftgastoxizität und vergleichen Sie sie mit einem untergetauchten Zellkultur von Kardiomyozyten, damit das Studium ein weiteres wichtiges Ziel der Toxizität.

<table><tbody><tr><td>Ratten</td><td>Harlan Laboratories</td><td>Sprague-Dawley&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td></td></tr><tr><td>Chlor</td><td>AirGas, Inc</td><td>X02NI99CP163LS1</td><td></td></tr><tr><td>Caspase 3/7 Kit&nbsp;</td><td>Promega</td><td>G8091</td><td></td></tr><tr><td>Epithel-Voltohmmeter und Essstäbchenelektrode</td><td>World Precision Instruments</td><td>EVOM und STX2</td><td></td></tr><tr><td>Snapwell-Einsätze</td><td>Corning</td><td>07-200-708</td><td></td></tr><tr><td>70 Mikron Nylon-Zellsieb</td><td>Corning</td><td>#352360</td><td></td></tr><tr><td>Polysulfon-Biocontainment-Kammern&nbsp;</td><td>BCU, Allentown Cage Equipment</td><td>BCU</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Life</td><td>Technologies</td><td>12491-015</td><td></td></tr><tr><td>Sarkomerischer Aktin-Antikörper</td><td>Abcam Cambridge, MA</td><td>ab28052</td><td></td></tr><tr><td>SERCA2-Antikörper</td><td>Affinity Bioreagents, Golden, CO</td><td>MA3-9191</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 Antikörper</td><td>Dako, Carpinteria, CA</td><td>M7248</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-konjugierter Sekundärantikörper</td><td>Invitrogen, Grand Island, NY</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>Carnitin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0283</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8691</td><td></td></tr><tr><td>Kreatinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6257</td><td></td></tr><tr><td>Krebs Ringer Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4002</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>DNAase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN-25</td><td></td></tr><tr><td>Laktat-Ringer-Lösung</td><td>Abott Laboratories</td><td>7953</td><td></td></tr><tr><td>Eselserum</td><td>Fisher Scientific</td><td>017-000-001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>4-15% SDS-PAGE Gele</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1083</td><td></td></tr><tr><td>Nitrozellulose-Membran</td><td>Bio-Rad</td><td>162-0115</td><td></td></tr><tr><td>Dergent, Tween&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Peroxidase-Nachweiskit</td><td>Pierce</td><td>3402</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedien, Fluormount G</td><td>eBiosciences</td><td>00-4958-02</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcitrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71497</td><td></td></tr><tr><td>Kollagen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7521</td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8028</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>BD Biowissenschaften</td><td>354259</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>200-6140AJ</td><td></td></tr></tbody></table>

in-vitro-zellkulturmodell für toxic inhalative chemical testing

In vitro Cell Culture Model for Toxic Inhaled Chemical Testing

Zellkulturen sind unverzichtbar für die Entwicklung und Studie die Wirksamkeit von therapeutischen Mitteln, vor ihrem Einsatz in Tiermodellen. Wir haben die einzigartige Fähigkeit, gut differenzierten humanen Atemwegsepithel und Herzmuskelzellen zu modellieren. Dies könnte ein wertvolles Werkzeug, um die schädlichen Wirkungen toxischer inhalierten Chemikalien wie Chlor, die normalerweise mit der Zelloberfläche interagieren, und bilden verschiedene Nebenprodukte bei der Reaktion mit Wasser, und ihren Effekten in Submerskulturen zu studieren. Unser Modell mit gut differenzierten menschlichen Atemwege epithelialen Zellkulturen bei Luft-liqiuid Schnittstelle umgeht diese Beschränkung auf und bietet die Möglichkeit, kritische Mechanismen der Toxizität von möglichen giftigen Chemikalien inhalativen beurteilen. Wir beschreiben eine verbesserte Verlust der Membranintegrität, Caspase Mitteilung und Tod auf toxische chemische inhalativen Exposition wie Chlor. In diesem Artikel schlagen wir Methoden, um Chlor Exposition in Säugetier-Herz und Atemwegsepithelzellen c modellierenEllen in Kultur und einfache Tests, um ihre Wirkung auf diese Zelltypen zu evaluieren.

Primäre stabförmigen Kardiomyozyten befestigen auf Laminin Matrizen und zu verbreiten und differenzieren sich in konfluenten Kulturen (Abbildung 1A und seinen Kasten). Diese Zellen wurden weiter auf der Grundlage des sarko Aktin und SERCA2 Ausdruck (Fig. 1B und 1C) gekennzeichnet. Kardiomyozyten sind sehr anfällig für Chlor Toxizität als 15 min Einwirkung von 100 ppm Chlor verursachte umfangreiche Zellabrundung und Tod in Submerskulturen und Störungen der konfluente Sch...

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Belichtungsverfahren von Zellkulturen zu inhalierenden toxischen Chemikalien zeigen. Exposition der differenzierten Luft-Flüssigkeit-Schnittstelle (ALI) Kulturen von Epithelzellen der Luftwege bietet eine einzigartige Modell von Atemwegs Exposition gegenüber toxischen Gasen, wie Chlor. In dieser Handschrift beschreiben wir Wirkung von Chlor-Exposition auf die Luft-Flüssigkeits-Grenzkulturen von Epithelzellen und Tauchkultur der Herzmuskelzellen. In-vitro-Belichtungssysteme erlauben wichtige mechanistische Studien, um Wege, die dann genutzt werden, um neue therapeutische Mittel zu entwickeln beurteilen.

In-vitro-Zellkulturmodell für Toxic Inhalative Chemical Testing

Cell cultures are indispensable to develop and study efficacy of therapeutic agents, prior to their use in animal models. We have the unique ability to ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Wirkung einer Chlorbelastung an in vitro Zellkulturmodellen der Lunge, der Atemwege und des Herzens zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst Ratten-Kardiomyozyten oder humane Atemwegsepithelzellen kultiviert werden. Die Kulturen von Ratten-Kardiomyozyten werden Chlorgas ausgesetzt, um die Toxizität von Chlor gegenüber lebenswichtigen Organen wie dem Herzen zu bewerten, während die Exposition differenzierter Kulturen humaner Atemwegsepithelzellen gegenüber Chlor eine genauere Modellierung der Exposition des Menschen gegenüber toxischen Gasen ermöglicht.Schließlich können die Freisetzung von Caspase-3/7 und der trans-epitheliale elektrische Widerstand gemessen werden, um den apoptotischen Zelltod der Kardiomyozyten bzw. die Membranruptur und den Zelltod der humanen Atemwegsepithelzellen zu bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Methode liegt darin, dass primäre Zellkulturen aus Gewebe statt ganzer Tiere verwendet werden, wodurch eine einfache chemische In-vitro-Testmethode ermöglicht wird. Tipp vier: Durchführung von Chlor-Expositionsversuchen.Das Chlor-Expositionssystem muss vor Beginn der Exposition in einer zugelassenen chemischen Abzugshaube mit einer operativen Gesichtsgeschwindigkeit von 100 FPM untergebracht sein. Stellen Sie zunächst das System auf einen geringen Überdruck mit einem halben Zoll Wassersäule ein, und führen Sie dann trockene Luft sowie eine geeignete Menge Chlor über einen Massendurchflussregler mit 15 Litern pro Minute in das System ein; das Chlor-Expositionssystem verwendet eine Druckgasflasche, die 1 % Chlor in trockenem Stickstoff enthält. Verschließen Sie anschließend den Kammerdeckel mit den vier Verschlüssen der Mini-Biocon-Containment-Einheit und der Silikondichtung mit niedriger Dichtigkeit, um die Druckabdichtung sicherzustellen.Regeln Sie anschließend mithilfe des speziell konstruierten Durchflussfeldes die Verdünnungsluftströmung und die Chlor-Konzentration in den Expositions­kammern. Eine Probennahmepumpe mit geringem Volumenstrom saugt das Abluftgas aus den Kammern in einen Chloranalysator, um die Konzentrationen zu überwachen, die dann auf einem an den Analysator angeschlossenen Datenlogger aufgezeichnet werden. Messen Sie mit einem Durchflussmesser die Durchflussraten innerhalb der Kammern vor der Exposition, um eine gleichmäßige Zufuhr und Ablaufgeschwindigkeit sicherzustellen.Entfernen Sie nun das überstehende Medium von den gewünschten Zellen und geben Sie frisches Medium in die Zellkultur. Anschließend setzen Sie die Zellkulturen in den beiden versiegelten Poly-Handy-Biocon-Containment-Kammern dem Chlorgas bei der geeigneten PPM-Konzentration und Einwirkdauer aus.Nach der Exposition spülen Sie die Kammern etwa fünf Minuten lang mit Luft, bis der Chlorgehalt unter einen PPM fällt, um eine sichere Öffnung des Systems und Entfernung der Zellen zu gewährleisten. Um den trans-epithelialen elektrischen Widerstand der chlor-exponierten Zellkulturen zu messen, verwenden Sie ein epitheliales Ommeter mit einem Paar Silber-Chlorid-Chopstick-Elektroden. Equilibrieren Sie die Chopstick-Elektroden zunächst 15 Minuten lang im Luft-Flüssigkeits-Grenzflächen-Medium, bevor Sie sie verwenden.Anschließend ein Milliliter warmes Medium auf die apikale Oberfläche und zwei Milliliter auf die basolaterale Oberfläche der Zellkultur geben. Danach das kürzere Ende der Elektrode in das apikale Medium und das längere Ende in das basolaterale Medium eintauchen und die Mess-Taste am Voltmeter betätigen, um den elektrischen Widerstand zu bestimmen. Zur Ermittlung des trans-epithelialen elektrischen Widerstands wird anschließend der Widerstand über einen zellfreien Kultuträger vom gemessenen Widerstand über jede Zellschicht subtrahiert.Primäre, rohe, geformte Kardiomyozyten heften sich an Laminin-Matrizes an, breiten sich aus und differenzieren zu konfluenten Kulturen. In diesem repräsentativen Experiment wurden die RAC-Kardiomyozyten zusätzlich anhand ihres sarcomerischen Aktins und des circadianen Expressionsmusters charakterisiert. Rattenkardiomyozyten sind äußerst empfindlich gegenüber Chlorgiftigkeit. Eine 15-minütige Exposition gegenüber 100 ppm Chlor verursacht umfassendes Abrunden und Absterben der Zellen in untergetauchten Kulturen sowie eine Störung der konfluenten Zellschichten auf lamininbeschichteten Membranen.Die Zellen zeigen außerdem einen verstärkten apoptotischen Zelltod, wie durch die Freisetzung von Caspase drei sieben in auf Einsätzen kultivierten Kardiomyozyten angezeigt wird. In den folgenden Abbildungen ist ein repräsentatives Experiment mit chlorbelastetem, differenziertem menschlichem Atemwegsepithel dargestellt.Die Exposition des menschlichen Atemwegsepithels gegenüber Chlor führt sowohl bei niedrigen als auch bei hohen Konzentrationen zum Abblättern und Anheben der Zellmembranen. Schäden durch eine niedrige Chlor-Konzentration werden schnell rückgängig gemacht. In Zellen, die höheren Chlor-Konzentrationen ausgesetzt sind, verzögert sich jedoch die Erholungsfähigkeit nach der Gasexposition oder sie bleibt ganz aus, wie durch visuelle Inspektion oder Beurteilung der Zellproliferation mittels KI-67-Färbung beobachtet. Trans-epitheliale elektrische Widerstandsmessungen und Caspase-Aktivitätsanalysen bestätigen diese Ergebnisse weiter und liefern Hinweise auf einen Verlust der Membranintegrität sowie auf apoptotischen Zelltod nach Chlor-Exposition. Somit beschreiben diese Studien die Entwicklung eines in-vitro-Chlor-Expositionssystems, das nach seiner Etablierung zum Verlust der Membranintegrität und zum Zelltod von Atemwegsepithelzellen sowie Kardiomyozyten führt.Diese Technik ebnete den Weg für Forscher, die Mechanismen der Schädigung durch giftige Gase in komplexen Organen wie der Lunge und dem Herzen zu erforschen.

in-vitro-cell-culture-model-for-toxic-inhaled-chemical-testing

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Das Ziel dieses Protokolls ist es, menschliche organotypische 3D-Bronchial- und Nasengewebemodelle dem Mainstream-Zigarettenrauch (CS) an der Luft-Flüssig-Grenzfläche auszusetzen. Der Einfluss von CS auf das Gewebe wird dann mit Hilfe eines Cytochrom-P450-Aktivitätsassays, einer Zilienschlagmessung und eines systembiologischen Ansatzes untersucht.

Folgenabschätzung Wiederholte Exposition von organotypischen 3D bronchiale und nasale Zellkulturmodelle zu Whole Zigarettenrauch

Elektronische Zigarette (e-Cig) Benutzer steigen weltweit. Jedoch ist wenig, über die gesundheitlichen Auswirkungen induziert durch eingeatmete e-Cig Aerosole bekannt. Dieser Artikel beschreibt eine e-Cig Aerosol Generation Technik für tierische Belichtungen und anschließende toxikologische Studien geeignet. Solche Protokolle sind erforderlich, um experimentell reproduzierbar und standardisierte e-Cig Belichtung Systeme zu etablieren.

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