Echtzeit-Bildgebung von Einzel Engineered RNA-Transkripte in lebenden Zellen Mit Ratiometrische Bimolekulare Beacons

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, einzelne RNA-Transkripte in lebenden Zellen in Echtzeit abzubilden. Dies wird erreicht, indem zunächst zwei Oligonukleotide hybridisiert werden, die so konzipiert wurden, dass sie eine Haarnadel-bildende Sonde bilden, die als Verhältnismetrik durch molekulares Leuchtfeuer bekannt ist. Der zweite Schritt besteht darin, das metrische Verhältnis durch molekulare Beacons durch Größenausschlusschromatographie zu reinigen.

Als nächstes wird die Verhältnismetrik durch molekulare Beacons in Zellen eingeführt, die das manipulierte RNA-Ziel über Mikroporionen exprimieren. Der letzte Schritt besteht darin, die Zellen in eine Mikrotiterplatte zu sehen, die für die Lebendzellmikroskopie geeignet ist. Letztendlich wird die Fluoreszenzmikroskopie verwendet, um die Bewegungen einzelner RNA-Transkripte zu überwachen, die als helle fluoreszierende Flecken innerhalb einzelner Zellen sichtbar gemacht werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie synthetische Sonden verwendet, die hell photostabil sind und ein hohes Signal zum Hintergrund aufweisen, was die Möglichkeit eröffnet, endogene RNA abzubilden. Beginnen Sie die Vorbereitung der Verhältnismetrik mit molekularen Beacons oder RBM BS, indem Sie die folgenden Reagenzien in einem Röhrchen mischen. 20 Mikroliter Rbm B ein 30 Mikroliter Rbm B zwei sechs Mikroliter 10 x Phosphatpuffer, und vier Mikroliter DNAs und RNAs befreien Wasser. Dies ist in der Regel ausreichend für etwa 50 Studien.

Inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine Flüssigkeitschromatographiesäule vor, um alle UN-hybridisierten RBM B-Oligonukleotide zu entfernen. Verwenden Sie 75 Superdecks in Vorbereitungsqualität in einer Acht-Milliliter-Flüssigkeitschromatographiesäule mit einem Bettvolumen von etwa vier Millilitern unter Verwendung einer Spritzenpumpe, die mit einer Durchflussrate von 0,6 Millilitern pro Minute läuft.

Waschen und äquilibrieren Sie das SUEx mit etwa 50 Millilitern eines x Phosphatpuffers, bevor die gesamte Flüssigkeit in das Bettvolumen gelangt. Stoppen Sie die Spritzenpumpe, nehmen Sie sie ab und lassen Sie die restliche Flüssigkeit durch die Schwerkraft durch die Säule fließen. Laden Sie anschließend die RBMB-Mischung auf die Chromatographiesäule.

Nachdem die RBMB-Probe vollständig in das Bett eingedrungen ist, fügen Sie langsam weitere 250 Mikroliter eines x Phosphatpuffers auf die Oberseite des Bettes hinzu, um sicherzustellen, dass die gesamte Probe vollständig in die Säule gelangt ist. Füllen Sie die Säule bis zum Rand mit einem x Phosphatpuffer. Schließen Sie den Deckel und starten Sie die Spritzenpumpe.

Die Spritze ist mit etwa 50 Millilitern eines XPBS befüllt und läuft mit einer Durchflussrate von 0,6 Millilitern pro Minute. In der Regel kann die RBMB-Probe aufgrund der Farbe des in die Sonde eingearbeiteten Farbstoffs leicht visualisiert werden. Sobald sich der RBMB dem Boden der Säule nähert, wird der Durchfluss mit zwei Tropfen pro Mikrozentrifugenröhrchen aufgefangen.

Hören Sie auf, die Probe zu sammeln. Sobald die Farbe der Probe in den Mikrozentrifugenröhrchen klar wird, kombinieren Sie die Röhrchen mit der farbigen RBMB-Probe, in der Regel fünf bis sechs Röhrchen, und laden Sie sie in eine Zentrifugalfiltervorrichtung. Zentrifugieren Sie die Probe bei 10.000 RCF für 20 Minuten oder bis zum gewünschten Volumen.

Diese Geschwindigkeit und Zeit ergibt in der Regel ein Endvolumen von etwa 30 Mikrolitern. In diesem Protokoll wurde eine humane Fibrosarkom-Zelllinie so verändert, dass sie Q-F-P-R-N-A mit 96 Tandem-Wiederholungen der RBMB-Zielsequenz in den drei Prime-UTR exprimiert, die Kontrollzelllinie wurde so verändert, dass sie Wildtyp-Q-F-P-R-N-A einen Tag vor der Sondenabgabe von Plattenzellen in einem T-25-Kolben bei 40 bis 50 % co-Fluenzkultur exprimiert. Die Zellen mit DMEM-Medien, ergänzt mit 1 % Streptokokken und 10 % fötalem Rinderserum, inkubieren am folgenden Tag bei 37 Grad Celsius mit 5 % Kohlendioxid.

Schalten Sie das Mikropor ein und richten Sie die Mikroportrationsparameter ein, die für HT 10 80-Zellen optimiert sind. Füllen Sie das Mikroporionenröhrchen mit vier Millilitern Elektrolytpuffer und legen Sie es auf die Mikropräparationsstation. Eine Stammprobe mit gereinigtem RBMB auftauen und mehrere Mikroliter mit einem x Phosphatpuffer auf eine Endkonzentration von 12 Mikromol verdünnen.

Für jedes Mikroporion wird ein Mikroliter benötigt. Für jede Mikroporionenreaktion wird ein Milliliter Nährmedium mit FBS, jedoch ohne Antibiotika, in ein Mikrozentrifugenröhrchen pipettiert. Legen Sie es in der Nähe des Mikroporionengeräts beiseite.

Es wird später verwendet, um die Zellen unmittelbar nach der Mikropräparation zu suspendieren. Antibiotika werden nicht eingesetzt, da sie die Lebensfähigkeit der Zellen nach der Mikropräparation verringern würden. Die am Vortag plattierten HT 10 80-Zellen sollten nun zu 60 bis 80 % konfluent sein.

Entfernen Sie das Zellkulturmedium und waschen Sie die Zellen einmal mit einem Milliliter kalzium- und magnesiumfreiem DPBS, inkubieren Sie ein bis zwei Minuten lang mit einem Milliliter Trypsin. Stoppen Sie das Trypsin, indem Sie einen Milliliter DMEM-Medium hinzufügen, das mit 10 % fötalem Rinderserum ohne Antibiotika und Phenolrot ergänzt wird, und die Zellen in zwei 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Schleudern Sie die Zellen im Mikrozentrifugenröhrchen fünf Minuten lang bei 200 Mal G herunter.

Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie ihn und kombinieren Sie die Zellpellets in einem Endvolumen von einem Milliliter DPBS. Entnehmen Sie 10 Mikroliter aus der gut gemischten Zellsuspension, um die Zellen zu zählen, pipettieren Sie die Zellen mehrmals auf und ab, um sicherzustellen, dass sie gut dispergiert sind, und übertragen Sie 300.000 Zellen mit DPBS in ein neues 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Schleudern Sie fünf Minuten lang mit dem 200-fachen G herunter.

Entfernen Sie den Überstand und achten Sie darauf, das Zellpellet nicht zu stören. Resuspendieren Sie das Pellet in 11 Mikrolitern Resus-Suspension, Puffer und pipettieren Sie mehrmals auf und ab, um sicherzustellen, dass die Zellen gut verteilt sind. Achten Sie darauf, keine Luftblasen zu erzeugen.

Fügen Sie einen Mikroliter des verdünnten RBMB hinzu und mischen Sie gut, indem Sie mehrmals auf und ab pipettieren. Achten Sie auch hier darauf, keine Luftblasen zu erzeugen. Es ist wichtig, das Einbringen von Luftblasen in die RBMB-Verkaufssuspension zu vermeiden, da Luftblasen während des Mikrobetriebs einen Funken verursachen und zu einer schlechten RBMB-Abgabe und Zelltod führen.

Mit der Mikropräparationspipette 10 Mikroliter der RBMB-Zellmischung aspirieren und die Pipette in das Mikropräparationsröhrchen einführen. Drücken Sie den Startknopf, um das Kleinstunternehmen zu starten. Es sollten keine sichtbaren Luftblasen in der Spitze vorhanden sein, wenn das Sieb des Mikropors abgeschlossen ist.

Nehmen Sie die Pipette aus der Station und stoßen Sie die 10-Mikroliter-Mischung in das zuvor vorbereitete Mikrozentrifugenröhrchen aus, das einen Milliliter Nährmedium mit FBS enthält, jedoch ohne Antibiotika, das vorsichtig gemischt wird, indem Sie das Röhrchen mehrmals von einer Seite zur anderen bewegen. Drehen Sie die Zellen fünf Minuten lang mit dem 200-fachen G. Waschen Sie die Zellen zweimal in einem Milliliter phenolrotfreiem Kulturmedium mit FBS, jedoch ohne Antibiotika, um rbm BS zu entfernen, das nicht in die Zellen abgegeben wurde.

Nach der zweiten Wäsche. Bei der Resus werden die Zellen in 400 Mikrolitern phenolrotfreiem Kulturmedium mit FBS, jedoch ohne Antibiotika, suspendiert. Plattieren Sie die mikroanteiligen Zellen in ein zuvor vorbereitetes Poly-de-Lysin-beschichtetes Deckglas mit acht Well-Kammern bei 200 Mikrolitern pro Well oder bei der gewünschten Kofluenz.

Stellen Sie das Kammer-Deckglas in einen Zellkultur-Inkubator. Die Bildgebung kann bereits 30 Minuten nach der Mikropräparation durchgeführt werden. Um diesen Vorgang zu starten, schalten Sie das obere Inkubationssystem im Lebendzellstadium ein und äquilibrieren Sie es, bis es 37 Grad Celsius, 5 % Kohlendioxid und 75 % Luftfeuchtigkeit erreicht.

Schalten Sie das Mikroskop und die Leuchtstoffröhre ein und öffnen Sie die Metamorph-Bildaufnahmesoftware. Tragen Sie Immersalöl auf das Objektiv auf. Überführen Sie das gekammerte Deckglas mit mikroporigen Zellen in das Lebendzellstadium.

Top-Inkubationssystem. Inkubieren Sie das Stage-Top-System, bis sich die Temperatur und der Kohlendioxidgehalt stabilisiert haben. Öffnen Sie die Registerkarte "Erfassen" in der Metamorph-Software.

Klicken Sie auf die Schaltfläche "Live anzeigen", um das Feld zu suchen. Passen Sie den Fokus unter weißem Licht an und klicken Sie auf die Schaltfläche "Live stoppen". Auf der Registerkarte "Erwerben".

Klicken Sie auf die Popup-Schaltfläche für die Stream-Erfassung, öffnen Sie sie und richten Sie die gewünschten Parameter für die Filmaufnahme ein. Erfassen Sie 150 Bilder mit dem Filter SCI five CF six 40 R. Speichern Sie die Bilder auf der Festplatte.

Hier sind repräsentative Bilder von HT 10 80 Zellen zu sehen, die RNA stabil exprimieren, mit 96 Tandem-Wiederholungen oder vier Tandem-Wiederholungen der RBMB-Bindungsstelle in den drei Prime-UTR. Nach der intrazellulären Verabreichung von mbs. Das Vorhandensein von 96 Tandem-Wiederholungen ermöglicht es, dass einzelne RNA-Transkripte als helle fluoreszierende Flecken erscheinen.

Im Gegensatz dazu erscheinen RNAs, die nur vier Tandem-Wiederholungen enthalten, als sehr schwache fluoreszierende Flecken und sind oft nur in Bereichen mit außergewöhnlich niedrigem Hintergrund nachweisbar. Durch die Aufnahme von Streaming-Bildern können einzelne RNA-Transkripte in Echtzeit abgebildet werden. Einzelne RNA-Transkripte können leicht im Zytoplasma und im Zellkern der Zellen gesehen werden, die brownsche oder subdiffusive Bewegungen durchlaufen.

In seltenen Fällen wird eine RNA beobachtet, die einen gerichteten Transport durchläuft, wie hier gezeigt. RNA-Transkripte, die einen gerichteten Transport durchlaufen, bewegen sich in der Regel schnell auf einem geraden Weg. In dieser Montage ist die Trajektorie des RNA-Transkripts über einem einzigen Bild der Zeitreihe zu sehen.

Die gerichteten RNA-Bewegungen stimmen mit dem Transport von RNA entlang von Mikrotubuli und Mikrofilamenten überein. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man rassische Metriken mit molekularen Leuchtfeuern vorbereitet und reinigt. Bringen Sie rassische Metriken durch molekulare Leuchtfeuer über Mikroparionen in Zellen und bilden Sie einzelne RNA-Transkripte mit dem Fluoreszenzmikroskop ab.