Transgenen Nager Assay zur Quantifizierung von männlichen Keimzellmutantenhäufigkeit

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Häufigkeit induzierter Mutationen in einem Reportergen zu messen, das aus den Keimzellen männlicher transgener Mäuse nach Exposition gegenüber einem chemischen oder physikalischen Mutagen gewonnen wurde. Dies wird erreicht, indem männliche Mäuse zunächst einem vermuteten Keimzellmutagen ausgesetzt werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Keimzellen zu sammeln, nachdem sie die gewünschten Stadien der Spermatogenese durchlaufen haben.

Anschließend wird die DNA, die das mutationsberichtende Transgen enthält, aus den Keimzellen gewonnen. Der letzte Schritt besteht darin, die gewonnenen Reportergene in Lambda-Phagen-Partikel zu verpacken. Letztendlich wird ein in-vitro-Positivselektionsassay verwendet, um den Anteil der aus den Keimzellen gewonnenen Reportergene zu bestimmen, die mutiert wurden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie dem spezifischen Lokus-Test oder dem Domino-Little-Test, besteht darin, dass Mutationen direkt in Keimzellen gemessen werden, anstatt mutierte Nachkommen auszuwerten. Eine große Anzahl von Keimzellen kann von einem einzelnen Männchen untersucht werden, wodurch die Empfindlichkeit des Tests gegenüber herkömmlichen Methoden verbessert wird, während gleichzeitig der Bedarf an Versuchstieren, Ressourcen und Zeit erheblich reduziert wird. Diese Methode kann zentrale Fragestellungen auf dem Gebiet der genetischen Toxikologie und der Mutagenese angehen, beispielsweise die Identifizierung von Substanzen, die für Keimzellen mutagen wirken, sowie die Aufklärung ihrer Wirkmechanismen.

Obwohl wir die Methode für das Muta-Mausmodell beschreiben, kann sie leicht auf andere transgene Nagetiersysteme übertragen werden, die bakteriophage Mutationsreportervektoren tragen. Außerdem hat die Methode, obwohl sie den Prozess für männliche Keimzellen beschreibt, eine allgemeine Anwendbarkeit auf somatische Gewebe und ist darüber hinaus durch eine international harmonisierte Testrichtlinie abgedeckt, die vom OECD veröffentlicht wurde. Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten mit der zeitlichen Abfolge des in-vitro-Teils des Assays haben, da mehrere der Schritte lange Wartezeiten beinhalten.

Die Schritte müssen sorgfältig geplant und koordiniert werden, um diese Methode rechtzeitig abzuschließen. Die Durchführung der Prozedur wird John Gingrich und Linda Soper, Biologin in meinem Labor, vor Beginn des Experiments übernehmen. Drei kritische experimentelle Variablen sollten ausgewählt werden: der Verabreichungszeitpunkt, der Probennahmezeitpunkt und die gesammelte Keimzellenpopulation.

Diese Variablen können angepasst werden, um die Auswirkungen der Exposition in verschiedenen Keimzelltypen und zu unterschiedlichen Phasen der Spermatogenese zu untersuchen. Beginnen Sie dieses Verfahren, indem Sie acht bis zwölf Wochen alte transgene männliche Mäuse zufällig auf eine Kontrollgruppe und Behandlungsgruppen mit mindestens fünf Tieren pro Gruppe verteilen. Behandeln Sie anschließend die Mäuse mit einer Testverbindung und einer entsprechenden Kontrolle über einen geeigneten Expositionsansatz für die gewählte Applikationsdauer.

Als Nächstes wählen Sie den geeigneten Zeitpunkt der Probenahme entsprechend dem gewünschten Typ spermatischer metagener Zellen. Nach Ablauf des Probenahmezeitpunkts euthanasieren Sie die Mäuse durch Halswirbelverrenkung unter Isofluran-Anästhesie. Um die Hoden zu entnehmen, führen Sie einen Schnitt im Bauchbereich durch und lokalisieren das epididymale Fettgewebe.

Ziehen Sie vorsichtig das Fettgewebe, um die Hoden und den Nebenhoden aus dem Skrotum zu ziehen. Entfernen Sie dann den Cota epididymus. Gefrieren Sie den Cota epididymus in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie ihn bei minus 80 Grad Celsius für die spätere Verwendung.

Wenn die Cota-Spermien verarbeitet werden sollen, tauen Sie den Cota-Epididymis auf Eis auf und überführen anschließend den aufgetauten Cota in eine Petrischale. Danach zerkleinern Sie den Coda-Epididymis mithilfe eines Skalpells oder einer Rasierklinge gründlich und pipettieren 700 Mikroliter DPBS bei Raumtemperatur in die Petrischale. Verwenden Sie dann eine Pipettenspitze mit großem Durchmesser (1000 Mikroliter), um die Spermien durch etwa zehnmaliges Auf- und Abpipettieren der Suspension oder bis die DPBS trüb von Spermien wird, freizusetzen. Filtern Sie die Spermien-Suspension durch einen Edelstahlsiebfilter in ein frisches 1,5-Milliliter-Röhrchen und zentrifugieren Sie das Röhrchen anschließend bei 11.000 × g für drei Minuten.

Den Überstand vorsichtig aus dem Röhrchen dekanteren, ohne das Pellet zu stören. Anschließend ein Milliliter kalte, 1 x Saline Sodium Citrate hinzufügen und das Röhrchen solange vortexen, bis das Pellet vollständig resuspendiert ist. Danach 15 Mikroliter 10 % SDS zum Röhrchen geben und das Röhrchen 30 Sekunden lang kräftig schütteln, um die Nicht-Spermien-Zellen zu lysieren.

Anschließend die Röhrchen bei 11.000 × g für zwei Minuten zentrifugieren. Nach der Zentrifugation vorsichtig den Überstand aus dem Röhrchen abgießen und 940 Mikroliter kalte 0,2× Saline-Sodium-Citrat-Lösung hinzufügen sowie das Röhrchen erneut verwirbeln, bis der Pellet resuspendiert ist. 120 Mikroliter A-Beta-Mercaptoethanol, 100 Mikroliter 10 % SDS, 20 Mikroliter 0,5 molare EDTA-Lösung (pH 8) und 20 Mikroliter 60 Milligramm pro Milliliter hinzufügen.

Proteinase K zu dem resuspendierten Sperma hinzufügen. Die Lösung gründlich mischen und das Röhrchen anschließend über Nacht bei 37 Grad Celsius auf einen Rotator stellen, um die Verdauung durchzuführen. Nach der über Nacht durchgeführten Verdauung die DNA aus dem Sperma mittels der im Textprotokoll beschriebenen Schritte für eine Phenol-Chloroform-Extraktion isolieren.

Lösen Sie das DNA-Präzipitat in 40 bis 100 Mikrolitern Tris-EDTA-Puffer pH 8 auf und lagern Sie es bei vier Grad Celsius. Lassen Sie mehrere Tage verstreichen, damit sich die DNA vollständig auflöst, bevor Sie am nächsten Tag mit dem folgenden Schritt fortfahren. Vor der Durchführung des LAX-Z-Mutationsassays bereiten Sie eine ausreichende Menge unteren Agar für die Anzahl der zu verarbeitenden Proben vor und autoklavieren Sie diese.

Dann aseptisch die Agar in 90-Millimeter-Petri-Schalen geben und im 50-Milliliter-Röhrchen erstarren lassen. 10 Milliliter LB-Brühe, 100 Mikroliter 20 %iger Maltoselösung, 25 Mikroliter Ampicillin (20 Milligramm pro Milliliter) und 20 Mikroliter Kanamycin (5 Milligramm pro Milliliter) hinzufügen. Anschließend das Röhrchen mit lacZ⁻ galE⁻ E. coli besiedeln und über Nacht bei 37 Grad Celsius bei 240 U/min schütteln. Am ersten Tag des Assays die Zellen durch Herstellung einer 1:100-Verdünnung der Übernachtkultur in frischer LB-Brühe ohne Antibiotika unterkultivieren.

Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 240 U/min für etwa drei Stunden oder bis der OD 600 den Wert eins erreicht. Sobald der OD 600 eins beträgt, teilen Sie die Zellsuspension gleichmäßig auf 50-Milliliter-Röhrchen auf und zentrifugieren Sie bei 1.300 ×g bei 15 Grad Celsius für 10 Minuten. Anschließend entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen in der halben ursprünglichen Menge LB-Medium, das 10 Millimolar Magnesiumsulfat enthält.

Stellen Sie die Zellen beiseite, während die anderen Reagenzien vorbereitet werden. Verpacken Sie die DNA in Lambda-Phagen-Partikel, indem Sie zunächst 4 µL der DNA, die aus dem Coda-Sperma mit einer Pipette mit großer Öffnung gewonnen wurde, in ein 1,5-mL-Röhrchen pipettieren.

Tauen Sie die erste Röhre eines Phagen-Verpackungsextrakt-Kits bei Raumtemperatur auf und pipettieren Sie anschließend 4,8 Mikroliter des Verpackungsextrakts in die Röhre mit der DNA. Danach mischen Sie die Lösung vorsichtig mit der Pipettenspitze und inkubieren die Röhre 1,5 Stunden lang in einem Wasserbad bei 30 Grad Celsius. Tauen Sie danach die zweite Röhre mit Verpackungsextrakt auf und pipettieren Sie erneut 4,8 Mikroliter in die Röhre mit der DNA.

Rühren Sie die Lösung vorsichtig mit der Pipettenspitze um und inkubieren Sie das Gefäß anschließend 1,5 Stunden in einem Wasserbad bei 30 Grad Celsius. Resuspendieren Sie die verpackten Phagenteilchen in 500 Mikroliter Salz-Magnesium-Puffer und stellen Sie die Röhrchen 30 Minuten lang auf einen Rotator mit 20 U/min. Nach der Rotation werden die Proben kurz verwirbelt und dann 30 Sekunden bei 11.000 × g zentrifugiert, um die Proben am Boden des Röhrchens zu sammeln.

Die Phagenpartikel sind nun bereit zur Infektion. Bereiten Sie anschließend acht Milliliter Überlagar für jede Titer- und Mutantenplatte vor. Halten Sie den Überlagar bei 50 Grad Celsius, bevor Sie Magnesiumsulfat auf 10 Millimolar zugeben, und fügen Sie drei Gramm pro Liter des selektiven Wirkstoffs PGAL zur Mutantenselektion hinzu.

Nur vor der Infektion der Zellen den oberen Auger verwenden. Beschriften Sie zwei 50-Milliliter-Röhrchen pro Probe, eines als Mutante und eines als Titer. Beschriften Sie anschließend acht Auger-Platten pro Probe, vier als Mutante und vier als Titer.

Pipettieren Sie anschließend zwei Milliliter der resuspendierten Zellen in jedes 50-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 500 Mikroliter verpackte Phagenteilchen in ein 50-Milliliter-Röhrchen, das als Mutante beschriftet ist. Mischen Sie das Röhrchen vorsichtig und lassen Sie die Phagenteilchen die Zellen 30 Minuten lang bei Raumtemperatur infizieren.

Nach der 30-minütigen Inkubation die infizierten Zellen kurz vortexen und anschließend 15 Mikroliter der infizierten Zellen in das entsprechende 50-Milliliter-Titerrohr überführen. 30 Milliliter 50 Grad Celsius heißer Titer-Top-Agar zum 50-Milliliter-Titerrohr hinzufügen. Die Agar-Zell-Mischung sofort gleichmäßig auf die vier Titerplatten verteilen.

Stellen Sie sicher, dass drei Gramm pro Liter P gal dem 50 Grad Celsius warmen Mutantenselektionsauger zugesetzt wurden. Geben Sie anschließend 30 Milliliter des Mutantenselektionsaugers, der PGAL enthält, in das Mutanten-50-Milliliter-Röhrchen. Verteilen Sie dann sofort die Menge aus Auger und Zellen auf die vier Mutantenplatten.

Lassen Sie die Platten erstarren und danach die Platten umdrehen und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren. Nach der Übernacht-Inkubation zählen Sie die Anzahl der Plaques auf den Mutanten- und Titerplatten. Schätzen Sie dann die Mutantenfrequenz, indem Sie die Gesamtanzahl der gezählten Mutanten-Plaques, ermittelt aus den vier Mutantenplatten, durch die geschätzte Gesamtanzahl an Plaque-bildenden Einheiten im Gesamtvolumen der infizierten Zellen dividieren, die aus den Titerplatten bestimmt wurde.

Eine typische transgene Keimzellen-Mutationsanalyse an Nagetieren führt insbesondere in den Kontroll-Dosisgruppen auf den Mutanten-Platten zu sehr wenigen Kolonien. Andererseits werden hingegen auf den Titerplatten Hunderte von Kolonien nachgewiesen. Die Exposition männlicher Mutt-Mäuse gegenüber einer einzelnen akuten oralen Dosis von 0,25, 50 und 100 Milligramm pro Kilogramm ENU, gefolgt von einer Sammelzeit von 70 Tagen, ermöglichte die Messung der mutationalen Ereignisse in spermatogonialen Stammzellen.

Die niedrige Dosis von ENU führte zu einem 2,6-fachen Anstieg der Mutantenfrequenz gegenüber den Kontrollen, und die maximale Dosis bewirkte einen 4,4-fachen Anstieg. Bei der Planung von Experimenten, die dieses Verfahren verwenden, ist es wichtig, stets den Zeitpunkt zu berücksichtigen. Der spermatozoide Metagenesezyklus, der Zeitpunkt der Applikation, der Zeitpunkt der Probenentnahme sowie der Typ der gesammelten Zellen müssen sorgfältig ausgewählt werden, um Effekte zu beobachten, die aus dem gewünschten Typ der spermatozoiden metagenetischen Zellen stammen.

Nach Durchführung dieses Verfahrens kann eine DNA-Sequenzierung an den mutierten Plaques durchgeführt werden, um die Mutationen zu charakterisieren und Mutanten zu identifizieren, die möglicherweise aus klonalen Expansionsereignissen hervorgegangen sind. Diese Technik ebnet den Weg für Forscher im Bereich der genetischen Toxikologie, Mutagene zu identifizieren, die möglicherweise die Keimbahn targetieren. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die induzierte Mutantenfrequenz in Keimzellen oder transgenen männlichen Mäusen, die einem Mutagen ausgesetzt wurden, bestimmt werden kann.

Dieser Test hat potenzielle Anwendungen in der regulatorischen Prüfung von Keimzellen mutagenen Substanzen sowie in gezielteren mechanistischen Untersuchungen.