Nicht-chromatographischen Reinigung von rekombinantem Elastin-ähnliche Polypeptide und deren Fusionen mit Peptiden und Proteinen aus Escherichia coli

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, rekombinante Elastin-ähnliche Polypeptide aus E-coli durch inversen Übergangszyklus zu reinigen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Lysat aus E-Coli-Zellen gesammelt wird, die rekombinantes Elastin wie Polypeptid exprimiert haben, und unlösliche Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt werden. Der zweite Schritt besteht darin, lösliche Verunreinigungen zu entfernen, indem der Elastin-ähnliche Polypeptidübergang unter Zugabe von Salz oder Hitze induziert wird.

Dann sammelt man die Elastin-ähnliche Polypeptidschicht durch Zentrifugation und verwirft den Überstand. Dieser Schritt wird als Hot Spin bezeichnet. Als nächstes wird die resuspendierte Elastin-ähnliche Polypeptidlösung zentrifugiert, um die unlöslichen Verunreinigungen zu entfernen.

Das lösliche Elastin-ähnliche Polypeptid im Überstand wird zurückgehalten und das Pellet wird verworfen. Dieser Schritt wird als kalter Spin bezeichnet, wobei die Zyklen von heißen und kalten Spins wiederholt werden, bis eine zufriedenstellende Reinheit des Elastin-ähnlichen Polypeptids erreicht ist. Letztendlich ergibt der inverse Übergangszyklus reine Elastin-ähnliche Polypeptidprodukte, die für den Einsatz in einer Vielzahl von biomedizinischen Anwendungen charakterisiert werden können.

Elastin-ähnliche Polypeptide, die mit dieser Technik gereinigt werden, haben eine Reihe nützlicher Anwendungen, darunter Biosensorik, Tissue Engineering und Arzneimittelverabreichung, bei denen die Übergangstemperatur und die Biopolymerarchitektur des Elastin-ähnlichen Polypeptids speziell für jede Anwendung abgestimmt werden können. Zu Beginn exprimieren Sie das gewünschte ELP-kodierende Plasmid in E-coli unter Verwendung der Bedingungen, die im begleitenden Textprotokoll beschrieben sind. Nachdem Sie eine Ein-Liter-Kultur in einem Inkubator 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius geschüttelt haben, übertragen Sie die Kultur in eine Ein-Liter-Zentrifugenflasche und zentrifugieren Sie die Flasche dann bei 2000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.

Entsorgen Sie anschließend den Überstand und die Wiederbelebung. Suspendieren Sie das Pellet in PBS-Wasser oder einem anderen gewünschten Puffer bis zu einem Gesamtvolumen von 45 Millilitern. Dann übertrug man die Zellsuspension in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen.

Legen Sie die Zellsuspension auf Eis und beschallen Sie sie nach dem Abkühlen insgesamt neun Minuten lang in Zyklen von 10 Sekunden an und 20 Sekunden aus. Mit einer Ausgangsleistung von 85 Watt. Lassen Sie die Probe nach der ersten Beschallungsrunde etwa 10 Minuten lang auf Eis abkühlen und wiederholen Sie dann den neunminütigen Beschallungszyklus.

Übertragen Sie das Lysat in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden. Fügen Sie dann zwei Milliliter Polyethylen mit 10 % Gewicht pro Volumen für jeden Liter Kultur hinzu und schütteln Sie das Röhrchen zum Mischen. Als nächstes zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 16.000 GS für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Füllen Sie dann den Überstand in ein sauberes 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen mit rundem Boden und entsorgen Sie das Pellet.

Geben Sie kristallines Natriumchlorid in die Probe, um den ELP-Übergang zu induzieren. Sobald sich das Salz aufgelöst hat, wird die Lösung trüb, was auf die Phasentrennung des ELP von der Lösung hinweist. Pelletieren Sie dann das ELP, indem Sie die Probe 10 Minuten lang bei 16.000 GS zentrifugieren.

Bei Raumtemperatur kann das ELP-Pellet zunächst undurchsichtig erscheinen, den Überstand verwerfen und dann nach dem Abkühlen ein bis fünf Milliliter des gewünschten Puffers hinzufügen. Das ELP-Pellet kann durchscheinend und braun erscheinen. Reanimation: Suspendieren Sie das Pellet, indem Sie das Röhrchen bei vier Grad Celsius pipettieren oder drehen.

Pipettieren Sie anschließend einen Milliliter Aliquote der resuspendierten ELP-Lösung in saubere 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 16.000 GS für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Füllen Sie dann den Überstand in ein sauberes Rohr um und entsorgen Sie die Pellets.

Induzieren Sie den ELP-Übergang durch Zugabe von Natriumchlorid. Wenn das ELP eine hohe Sprungtemperatur hat, die nicht allein mit Salz induziert werden kann, inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang auf einem Heizblock bei einer Temperatur über der ELP-Übergangstemperatur. Zentrifugieren Sie die Probe dann 10 Minuten lang bei 16.000 GS bei einer Temperatur, die über der Temperatur liegt, die für den ELP-Übergangsschritt verwendet wird.

Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das ELP-Pellet in 500 bis 750 Mikrolitern des gewünschten Puffers, indem Sie das Röhrchen bei vier Grad Celsius pipettieren oder drehen, bis das Pellet wieder löslich ist. Zentrifugieren Sie die Probe anschließend 10 Minuten lang bei 16.000 GS bei vier Grad Celsius, um unlösliche Verunreinigungen zu pelletieren. Füllen Sie dann die Schlinge in ein sauberes Rohr und entsorgen Sie das Pellet. Wiederholen Sie den umgekehrten Übergangszyklus, bis keine Verunreinigungspellets mehr beobachtet werden.

Dies erfordert in der Regel zwei bis fünf Zyklen. Bereiten Sie eine Verdünnungsreihe von ELP-Lösungen in PBS oder einem anderen gewünschten Puffer vor. Verwenden Sie dann ein temperaturgesteuertes UV-v-Spektralphotometer, um die optische Dichte bei 350 Nanometern über einen Temperaturbereich zu messen, während die Probe mit einer Rate von einem Grad Celsius pro Minute erhitzt wird.

Wenn keine Zunahme der optischen Dichte zu sehen ist, kann die Sprungtemperatur die obere Temperaturgrenze überschreiten. Messen Sie als Nächstes die Abnahme der optischen Dichte über den gleichen Temperaturbereich mit einer Abkühlrate von einem Grad Celsius pro Minute. Um die Reversibilität des ELP-Übergangsdiagramms zu überprüfen, wird die optische Dichte in Abhängigkeit von der Temperatur bestimmt, dann wird die Sprungtemperatur des Homopolymers ELP bestimmt.

Durch die Identifizierung des Wendepunktes auf diesem Trübungsprofil wird die erfolgreiche Reinigung von LPs auf der SDS-Seite bestätigt, wie hier zu sehen ist. Die Anzahl der Kontaminanten ist im anfänglichen E-Coli-Lysat viel größer als in der Probe nach einer Runde des inversen Übergangszyklus. Die ELP-Sprungtemperatur wird durch die temperaturprogrammierte Trübung für ein ELP-Homopolymer charakterisiert.

Das Trübungsprofil zeigt eine einmalige starke Zunahme der optischen Dichte, die die Sprungtemperatur bei einer bestimmten Konzentration definiert. Die reversible Natur des ELP-Übergangs wird durch einen kühlenden Trübungsscan bestätigt. ELP-Dieblock-Copolymere weisen ein komplexeres Trübungsprofil auf als Homopolymer-LPs.

Anschließend können dynamische Lichtstreuungsmessungen durchgeführt werden, um das Verhalten dieser LPs zu bestätigen, das aus der Trübungsprofildatei abgeleitet wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man rekombinantes Elastin wie Polypeptide aus E. coli mit Hilfe des inversen Übergangszyklus aufreinigt. Nein, nein, nein, nein, nein.