High Yield Reinigung von Plasmodium falciparum Merozoiten Zur Verwendung in opsonierende Antikörper-Assays

Mess Antikörper Funktion ist der Schlüssel zum Verständnis Immunität gegen Plasmodium falciparum Malaria. Diese Methode beschreibt die Reinigung von lebensfähigen Merozoiten und Messung der Opsonisierung-abhängigen Phagozytose mittels Durchflusszytometrie.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, reine Plasmodium falciparum-Maiten in hoher Ausbeute zu erzeugen, um ihre Opsonisierung durch humane Antikörper zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst der S-Schon-Bruch mit E 64 gehemmt wird, um membranumschlossene Maitestrukturen zu erzeugen. Im zweiten Schritt werden die freien Mädchen geerntet und dann mit AUM-Bromid zur Quantifizierung gefärbt. Im letzten Schritt werden die Mädchen mit verschiedenen menschlichen Plasmaproben und THP eins menschlichen monozytären Zellen inkubiert.

Letztendlich kann die Opsonisierung der Mädchen durch die verschiedenen humanen Plasmaproben durchflusszytometrisch unterschieden werden. Der Vorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Assays der funktionellen Immunität gegen Malaria-Meite besteht darin, dass intakte mes verwendet werden und die Phagozytose-Reaktionen robust und quantifizierbar sind. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Malariaimmunologie zu beantworten, wie z. B. welche Bedeutung oxidierende Antikörper und Phagozytose für die Immunität gegen Malaria bei Impfstoffen oder natürlich exponierten Personen haben.

Die Visualisierung dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung, da das Timing von E 64 entscheidend ist, um die Bildung von Mezo sicherzustellen. Und da die Mezo-Aufbereitung und -Zählung technisch anspruchsvoll ist, beurteilen Trophozoiten nach der magnetischen Trennung von P falciparum im Spätstadium die Parasitenreifung, indem sie einen dünnen Abstrich von Parasiten 10 Sekunden lang in 100%igem Methanol fixieren und drei Minuten lang in Gizeh färben. Untersuchen Sie den Objektträger unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Parasiten die roten Blutkörperchen fast ausfüllen und sich im frühen Zen-Stadium zu befinden scheinen.

Wenn die Parasiten noch nicht das entsprechende Reifestadium erreicht haben, inkubieren Sie sie weiter, bis sie sich entsprechend entwickelt haben. Sobald die isolierte Schön entsprechend reif ist, behandeln Sie sie mit 10 mikromolaren E 64 und inkubieren Sie sie für weitere sechs bis 10 Stunden. Nach der Inkubation mit E 64 ist ein Abstrich der behandelten Parasiten anzufertigen.

Fixieren Sie den Objektträger in 100 % Methanol und färben Sie ihn mit Gizeh, um zu bestätigen, dass mindestens 50 % der Parasiten eine Membran gebildet haben. Geschlossene Maites pelletieren das restliche E 64, das acht Minuten lang bei 1900 G bei Raumtemperatur behandelt wurde. Waschen Sie dann die Parasiten bei 50 Millilitern Raumtemperatur.

Waschen Sie das Medium, um restliches menschliches Serum zu entfernen. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, resuspendieren Sie das Parasitenpellet in zwei Millilitern Waschmedium und filtrieren Sie dann die Zellsuspension durch einen 1,2-Mikrometer-Spritzenfilter, wobei Sie die Maites und Hämonkristalle in einem 10-Milliliter-Röhrchen sammeln. Befestigen Sie als Nächstes eine kleine Magnetsäule an einem Magneten und äquilibrieren Sie sie mit 500 Mikrolitern THP one Medium.

Führen Sie das Filtrat dreimal über die magnetische Säule und fangen Sie jedes Mal die Maites im Durchfluss auf. Spülen Sie die Säule anschließend mit zwei Millilitern Raumtemperatur aus. THP one media, um alle verbleibenden Maites zu sammeln.

Die Entfernung des Hämins ist ein kritischer Schritt für die Reinigung der Mädchen. Wenn die Maites nicht vom Hemin getrennt werden, bilden sich Maite-Hämin-Cluster, was zu einer ungenauen Zählung der Maite durch die Durchflusszytometrie führt. THP one cells con phagocytose hem hem, so dass die meite Hämin-Cluster auch ceto sein können.

Wenn also das Hämin nicht entfernt wird, wird auch das opsonisierende Potenzial des zu testenden Plasmas überschätzt. Färben Sie die gesammelten Maiten in 10 Mikrogramm pro Milliliter ahybromid bei Raumtemperatur lichtgeschützt. Schleudern Sie nach 30 Minuten die Maites herunter, entsorgen Sie den Überstand in einen geeigneten Abfallbehälter und waschen Sie das Maite-Pellet in vier Millilitern THP one media Pellets.

Anschließend werden die Zellen in 15 Millilitern TP one Medium lichtgeschützt aufgehängt. Quantifizierung der Mütter mittels Durchflusszytometrie. Zählen Sie die Verdünnungen bei eins zu 100, eins zu 50 und eins zu 25.

Geben Sie zunächst 940, 930 und 910 Mikroliter PBS plus BSA in drei verschiedene Faxröhren und fügen Sie jeweils 10, 20 und 40 Mikroliter gereinigte Röhrchen zu jedem Röhrchen hinzu. Zählen Sie dann die Kügelchen bei Raumtemperatur 30 Sekunden lang und geben Sie dann 50 Mikroliter der Kügelchen in jedes Faxrohr, das die verdünnten Kügelchen enthält. Führen Sie die drei verdünnten Maite-Proben auf einem Durchflusszytometer durch, das mit einem 488-Nanometer-Laser ausgestattet ist, und stellen Sie ein stringentes Gate für die Maites ein, das auf dem Atheriumbromid und dem GFP-Dual-Fluoreszenz-Gate basiert, stellen Sie die Kügelchen in einem separaten Kanal und erfassen Sie Ereignisse, bis 2000 Kügelchen gesammelt wurden.

Um die Anzahl der Maite bei jeder Verdünnung zu quantifizieren, werden die drei Messungen der Maitekonzentration gemittelt. Dann reanimation suspendieren die Maites bei acht mal 10 zu den sechs Maites pro Milliliter in THP ein Medium, um ein endgültiges Verhältnis von vier Maites pro THP eine Zelle zu gewährleisten, um die Phagozytose der Maites zu messen. Pelletieren Sie zunächst genügend THP-1-Zellen für den Assay und reanimation suspendieren Sie sie bei 6,7 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro Milliliter in THP einem Medium.

Als nächstes bei 150 Mikrolitern THP eine Zelle pro Well in dreifacher Ausfertigung für jede zu testende Bedingung auf eine FCS blockierte 96 Well U-Bodenplatte bis hin zu einer abschließenden Konzentration von 10 bis fünften Zellen pro Well. Lege die Platte in den Inkubator, bis es Zeit ist, die Maites hinzuzufügen. Geben Sie dann 150 Mikroliter der isolierten Maites in einer Konzentration von acht mal 10 bis sechs Millilitern pro Vertiefung in eine separate FCS-blockierte 96-Well-U-Bodenplatte mit einer Vertiefung pro zu testender Bedingung.

Geben Sie 10 Mikroliter vorbereiteter verdünnter Plasmaproben in jede Vertiefung der Maites und mischen Sie gründlich, um eine homogene Lösung zu gewährleisten. Geben Sie dann 50 Mikroliter der Maite-Plasmalösung in jede Vertiefung des THP, eine Platte in dreifacher Ausfertigung für jede zu testende Plasmaprobe. Mischen Sie die Proben gut und inkubieren Sie dann die Co-Kulturen in einem befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius in 5 % Kohlendioxid.

Nach 40 Minuten werden die Proben in einer vorgekühlten Zentrifuge heruntergeschleudert, um die Phagozytose zu stoppen. Waschen Sie die Zellen dann nach dem zweiten Waschen zweimal in eiskaltem Faxpuffer. Fixieren Sie die Zellen in 90 Mikrolitern Faxfixiermittel und lassen Sie sie auf Eis.

Bis zum Erwerb vor Licht geschützt. Das Reifungsstadium der Parasiten vor der Behandlung mit E 64 ist entscheidend für die Bildung von membranumschlossenen Weibchen. Die Parasiten sollten groß sein, fast die roten Blutkörperchen ausfüllen und gesprenkelte Edelsteinflecken aufweisen.

Die Zugabe von E 64 in diesem Stadium führt nach einer Inkubation von sechs bis 10 Stunden zu membranumschlossenen Maiten. Wenn E 64 früher zu Trophozoiten im Parasitenstadium hinzugefügt wird, werden keine membranumschlossenen Weiden erzeugt. Wird E 64 später zu schon schon zugegeben, ist der Bruch ungehemmt.

Ein hohes Maß an Parasitensynchronität ist erforderlich. Andernfalls wird ein Bereich aller drei beschriebenen Endpunkte nach der E 64-Behandlung beobachtet: Die Phagozytosemessung mittels aum-Bromid-Fluoreszenz ermöglicht eine überlegene Auflösung der Parasiten-Phagozytose gegenüber der alleinigen GFP-Fluoreszenz. Eine Erhöhung des Verhältnisses von Maites zu TP one Zellen führt zu einer erhöhten Adhärenz der Maites an den THP one Zellen.

In Ermangelung von Maite-spezifischen Antikörpern führt eine Erhöhung des Verhältnisses von MEITE zu THP zu einer Zellzahl auch zu einem Anstieg der Phagozytose zwischen null und 78 %Opsonisierung der Maites wurde unter Verwendung von Plasmaproben aus Papua-Neuguinea bei einem Verhältnis von vier zu eins MAITE zu THP einer Zelle beobachtet. Diese Daten zeigen Beispiele für die vier Quartile der sauren PHA-Reaktionen von vier repräsentativen Individuen aus Papua-Neuguinea. Opsonisierende Antikörper, die mit diesem Assay gemessen wurden, haben gezeigt, dass sie mit klinischer Immunität gegen Malaria assoziiert sind, während dieses Verfahren versucht wurde.

Die wichtigsten Punkte, die für eine erfolgreiche PE-Zytose zu beachten sind, sind hochgradig synchronisierte Parasiten, um vollständig ausgereiftes und intaktes Meite zu erhalten und die HB-Eins-Zellkulturen angemessen zu erhalten. Die in diesem Verfahren beschriebene Technik zur Meite-Aufreinigung kann an jede Anwendung angepasst werden, die qualitativ hochwertige Malariamedikamente erfordert, wie z. B. Marizon, Invasion, Assays, Proteomik oder Serologie. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die E 64-Methode zur Reinigung von Müttern und zur Untersuchung opsonisierender Antikörper durch Messung der Phagozytose durch THP-1-Zellen verwenden können.