High Yield Reinigung von

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, reine Plasmodium falciparum-Maites in hoher Ausbeute zu erzeugen, um deren Opsonierung durch humane Antikörper zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst der Schizontenruptur mit E 64 gehemmt wird, um membranumhüllte Maites-Strukturen zu erzeugen. Im zweiten Schritt werden die freien Maites gewonnen und anschließend mit AUM-Bromid zur Quantifizierung gefärbt. Im letzten Schritt werden die Maites mit verschiedenen humanen Plasma-Proben und THP-1-humanen monozytären Zellen inkubiert.

Schließlich kann die Opsonisierung der Maites durch verschiedene humane Plasma­proben mittels Durchfluss­zytometrie differenziert werden. Der Vorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Assays zur funktionellen Immunität gegen Malaria-Meite liegt darin, dass intakte Mes verwendet werden und die Phagozytose­antworten robust und quantifizierbar sind. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Malaria-Immunologie zu beantworten, beispielsweise welche Bedeutung oxidierende Antikörper und die Phagozytose für die Immunität gegen Malaria bei geimpften oder natürlich exponierten Individuen haben.

Die Visualisierung dieser Technik ist entscheidend, da der Zeitpunkt der Zugabe von E 64 von wesentlicher Bedeutung ist, um die Bildung von Mezo sicherzustellen. Da die Herstellung und Zählung von Mezo technisch anspruchsvoll ist, bewerten Sie nach der magnetischen Trennung von späten Stadien von P. falciparum-Trophozoiten die Parasitenreifung, indem Sie einen dünnen Parasitenabstrich 10 Sekunden lang in 100 % Methanol fixieren und anschließend drei Minuten lang in Giza einfärben. Untersuchen Sie den gefärbten Objektträger unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Parasiten die roten Blutkörperchen nahezu vollständig ausfüllen und sich im frühen Zen-Stadium befinden.

Wenn die Parasiten noch nicht das geeignete Reifestadium erreicht haben, inkubieren Sie sie weiter, bis sie ausreichend entwickelt sind. Sobald sie ausreichend reif sind, behandeln Sie die isolierten Schon mit 10 Mikromolar E 64 und inkubieren Sie sie weitere sechs bis 10 Stunden. Nach der Inkubation mit E 64 bereiten Sie einen Ausstrich der behandelten Parasiten vor.

Festigen Sie den Objektträger in 100 % Methanol und färben Sie ihn mit Giza, um zu bestätigen, dass mindestens 50 % der Parasiten eine Membran gebildet haben. Sedimentieren Sie die verbleibenden, mit E 64 behandelten Maites-Pellets acht Minuten lang bei 1900 Gs bei Raumtemperatur. Anschließend waschen Sie die Parasiten in 50 Milliliter bei Raumtemperatur.

Spülen Sie das Waschmedium, um verbleibendes humanes Serum zu entfernen. Nach dem Verwerfen des Überstandes resuspendieren Sie das Parasitenpellet in zwei Millilitern Waschmedium und filtrieren die Zellsuspension anschließend durch einen 1,2-Mikrometer-Spritzenfilter, wobei Sie die Maites und Hemonkristalle in einem 10-Milliliter-Röhrchen auffangen. Als Nächstes befestigen Sie eine kleine magnetische Säule an einem Magneten und equilibrieren sie mit 500 Mikrolitern THP-eins-Medium.

Führen Sie das Filtrat dreimal über die magnetische Säule und sammeln Sie die Maites jedes Mal im Durchlauf. Spülen Sie die Säule anschließend mit zwei Millilitern THP-eins-Medium bei Raumtemperatur, um eventuell verbliebene Maites zu gewinnen.

Die Entfernung des Hämins ist ein entscheidender Schritt zur Reinigung der Maites. Wenn die Maites nicht vom Hämin getrennt werden, bilden sich Maite-Hämin-Cluster, was zu einer ungenauen Zählung der Maites mittels Durchflusszytometrie führt. THP-1-Zellen können Hämin phagozytieren, weshalb die Maite-Hämin-Cluster ebenfalls abgebaut werden können.

Daher wird das opsonisierende Potenzial des getesteten Plasmas überschätzt, wenn das Hemin nicht entfernt wird. Färben Sie die gesammelten Maites mit 10 Mikrogramm pro Milliliter Ahy-Bromid bei Raumtemperatur, lichtgeschützt. Nach 30 Minuten zentrifugieren Sie die Maites, entsorgen Sie den Überstand in einen geeigneten Abfallbehälter und waschen Sie das Maite-Pellet mit vier Millilitern THP-einem-Medien-Pellet-Maites.

Resuspendieren Sie die Zellen anschließend in 15 Milliliter TP1-Medium, das vor Licht geschützt ist. Um die MAIT-Zellen per Durchflusszytometrie zu quantifizieren, zählen Sie die MAIT-Zellen bei Verdünnungen von eins zu 100, eins zu 50 und eins zu 25.

Zunächst pipettieren Sie 940, 930 bzw. 910 Mikroliter PBS mit BSA in drei verschiedene FACS-Röhrchen und geben jeweils 10, 20 und 40 Mikroliter gereinigte Maites zu jedem Röhrchen hinzu. Anschließend wirbeln Sie die bei Raumtemperatur gelagerten Zählperlen 30 Sekunden im Vortex-Mischer und geben danach 50 Mikroliter der Perlenlösung in jedes FACS-Röhrchen mit den verdünnten Maites. Führen Sie die drei verdünnten Maite-Proben auf einem Durchflusszytometer mit 488 Nanometer Laser aus, wobei Sie ein striktes Gate für die Maites basierend auf der Doppelmarkierung mit Atheriumbromid und GFP festlegen, die Perlen in einem separaten Kanal erfassen und so lange Ereignisse aufzeichnen, bis 2000 Perlen gesammelt wurden.

Um die Anzahl der Maites bei jeder Verdünnung zu quantifizieren, mitteln Sie die drei Messungen der Maite-Konzentration. Anschließend resuspendieren Sie die Maites in einer Konzentration von 8 × 10⁶ Maites pro Milliliter in THP-1-Medium, um ein endgültiges Verhältnis von vier Maites pro THP-1-Zelle sicherzustellen, um die Phagozytose der Maites zu messen. Zentrifugieren Sie zunächst ausreichend THP-1-Zellen für den Assay und resuspendieren Sie sie in einer Dichte von 6,7 × 10⁵ Zellen pro Milliliter in THP-1-Medium.

Als Nächstes 150 Mikroliter THP-1-Zellen pro Vertiefung in dreifacher Ausführung für jede zu testende Bedingung in eine mit FCS blockierte 96-Loch-U-Boden-Platte geben, um eine endgültige Konzentration von 105 Zellen pro Vertiefung zu erreichen. Die Platte bis zum Zeitpunkt der Zugabe der MAIT-Zellen in den Inkubator stellen. Anschließend 150 Mikroliter der isolierten MAIT-Zellen in einer Konzentration von 8 × 106 pro Milliliter pro Vertiefung in eine separate, mit FCS blockierte 96-Loch-U-Boden-Platte geben, wobei eine Vertiefung pro zu testender Bedingung verwendet wird.

Geben Sie 10 µL der vorbereiteten verdünnten Plasma­proben in jedes Loch der Maites und mischen Sie gründlich, um eine homogene Lösung zu gewährleisten. Anschließend geben Sie 50 µL der Maite-Plasma-Lösung in jedes Loch der THP-eins-Platte, wobei jede Plasma­probe im Dreifachansatz getestet wird. Mischen Sie die Proben gut und inkubieren Sie die Kulturen danach in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5 % Kohlendioxid, wobei die Platten abgedeckt sind.

Nach 40 Minuten die Proben in einer vorgekühlten Zentrifuge abzentrifugieren, um die Phagozytose anzuhalten. Anschließend die Zellen zweimal mit eiskaltem Fax-Puffer waschen und nach dem zweiten Waschschritt die Zellen in 90 Mikrolitern Fax-Fixativ fixieren und auf Eis stellen.

Geschützt vor Licht bis zur Aufnahme. Das Reifestadium der Parasiten vor der E-64-Behandlung ist entscheidend für die Erzeugung membranumschlossener Merozoiten. Die Parasiten sollten groß sein, die rote Blutkörperchen fast vollständig ausfüllen und eine gepunktete Färbung der Pigmente zeigen.

Wenn E 64 in diesem Stadium hinzugefügt wird, entstehen nach einer Inkubation von sechs bis zehn Stunden membranumhüllte Maites. Wenn E 64 früher zu Trophozoiten-Stadium-Parasiten hinzugegeben wird, entstehen keine membranumhüllten Maites. Wenn E 64 später hinzugefügt wird, bleibt die Schon-Schon-Ruptur ungehemmt.

Ein hohes Maß an Parasitensynchronität ist erforderlich. Andernfalls werden nach der E-64-Behandlung alle drei beschriebenen Ergebnisse im Phagozytoseversuch beobachtet. Die Messung der Phagozytose mittels Aum-Bromid-Fluoreszenz ermöglicht eine bessere Auflösung der Parasitenphagozytose im Vergleich zur alleinigen GFP-Fluoreszenz. Eine Erhöhung des Verhältnisses von MAIT-Zellen zu THP-1-Zellen führt zu einer stärkeren Adhärenz der MAIT-Zellen an die THP-1-Zellen.

Bei fehlenden maite-spezifischen Antikörpern führt eine Erhöhung des Verhältnisses von MEITE- zu THP-1-Zellen ebenfalls zu einem Anstieg der Phagozytose zwischen null und 78 %. Eine Opsonisierung der Maites wurde unter Verwendung von Plasma-Proben aus Papua-Neuguinea bei einem Verhältnis von vier zu eins von MAITE- zu THP-1-Zellen beobachtet. Diese Daten zeigen Beispiele für die vier Quartile der PHA-sauren Reaktionen von vier repräsentativen Individuen aus Papua-Neuguinea. Opsonisierende Antikörper, die mit diesem Assay gemessen wurden, erwiesen sich als assoziiert mit klinischer Immunität gegen Malaria, während dieses Verfahren durchgeführt wurde.

Die wichtigsten Punkte, die für eine erfolgreiche PE-Zytose beachtet werden müssen, sind hochgradig synchronisierte Parasiten, um vollständig ausgereifte und intakte Maites zu erhalten, sowie die sachgemäße Pflege von THP-1-Zellkulturen. Die in diesem Verfahren beschriebene Methode zur Reinigung von Maites kann an jede Anwendung angepasst werden, die hochwertige Malaria-Maites erfordert, wie beispielsweise Marisonen-, Invasion-, Assay-, Proteomik- oder Serologieuntersuchungen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie die E-64-Methode zur Reinigung von Maites verwendet wird und wie opsonisierende Antikörper durch die Messung der Phagozytose mittels THP-1-Zellen untersucht werden können.