Name: Konstruktion und Charakterisierung eines neuartigen Bioreaktor Stimmlippen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 11 s
Description: Erfahren Sie die Konstruktion eines Bioreaktors zur Vibrationsstimulation von mesenchymalen Stammzellen mit poly(ε-caprolacton)-Scaffolds. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Stimmbandphysiologie und Zellverhalten.

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Wir danken Dr. Jeffrey Caplan für seine Ausbildung und Erfahrungsberichte zu konfokale Bildgebung. Wir danken auch dem Keck Electron Microscopy Lab und Dr. Chaoying Ni für die SEM-Unterstützung. Diese Arbeit wird von National Institutes of Health (NIDCD, R01DC008965 und R01DC011377) finanziert. ABZ erkennt NSF Integrative Graduate Education &amp; Research Traineeship (IGERT)-Programm für die Finanzierung.

1. Bioreaktor Versammlung (Video 1) <ol><li> Machen Sie eine Aluminiumform (kreisförmige Düse + Abstandsstift) mit vorgegebenen Innen-und Außenmaße (Abbildung 1). </li><li> Mit der Form aus Schritt 1.1, fabrizieren eine Silikonmembran (Durchmesser: 42 mm, Dicke: 1,5 mm, Abbildung 1) mit einem verschanzten Hülse (Durchmesser: 12 mm, Dicke ~ 0,25 mm, von der Abstandsstift in Abbildung 1 förmig) in die mittlere mit einem handelsüblichen Silikon-Elastomer-Kit. </li><li> Machen Sie ein Paar Acrylblöcke (Abbildung 2 (4, 5)) mit einer kreisförmigen Öffnung (Durchmesser: 24 mm) in der Mitte, gravieren die Spitze (1,8 cm dick) und unten (0,9 cm dick) Blöcke mit passenden Rippen und Rillen . 10. </li><li> Sandwich die Silikonmembran zwischen den gepaarten Acrylblöcke. Sichern Sie die Montage mit vier Schrauben Ecke mit einer Micro-Drehmomentschrauber einer konstanten Kraft (35 cN · m) eingestellt. Als Ergebnis wird eine wasserdichte, 24 mm breit und 18 mm tief Vibrationskammer erzeugt wird (Fig. 2C). </li><li> Montieren Sie einen 3 &quot;erweiterten Bereich Mini-Woofer (2D, 8 Ω/20 W) unter der Vibrationskammer durch einen anderen Satz von Ecke Schrauben auf der Unterseite Acrylblock. An diesem Punkt wird eine einzelne Vibrationsmodul montiert. </li><li> Replizieren sieben zusätzliche Schwingungsmodule. Anbringen vier davon mit einem von zwei feststehenden Aluminiumstangen (40 cm x 10 cm x 2,5 cm), indem die Lautsprecher Basen in gleichmäßig beabstandeten kreisförmigen Öffnungen (Durchmesser: 7 cm, Dicke: 2 cm) in die Stäbe zu schneiden. Stabilisieren Sie jeden Lautsprecher durch Einsetzen einer Schraube durch die Seite der Aluminiumstange in jeder kreisförmigen Loch. </li><li> Individuell steuern die Lautsprecher durch einen Lautsprecher Selector. Verbinden einzelnen Lautsprecher an den Selektor durch Anbringen Drähte an die positiven und negativen Eingänge des Lautsprechers Körper dann an die entsprechenden Ausgänge des Wählers. Das Lautsprecherwähler ermöglicht das Signal von ter Funktionsgenerator, nachdem es durch einen Leistungsverstärker, um alle acht Lautsprecher auf einmal (2E) zu erreichen. </li><li> Platzieren Sie die beiden Kammeranordnungen, die Lautsprecherauswahl und die zugehörige Elektronik in einem Gehäuse zum Schutz gegen Feuchtigkeit. Haus die gesamte Baugruppe in einem kommerziellen Zellkulturbrutschrank. </li><li> Führen Sie die Hauptkabel (durch eine medizinische Qualität PVC-Schlauch), die den Leistungsverstärker und Lautsprecherwähler durch die Filteranordnung auf der Rückseite des Inkubators. </li></ol> 2. Gerüst Herstellung und Charakterisierung <ol><li> Auflösen PCL-Pellets in Chloroform bei einer Konzentration von 15 Gew.%. Laden Sie die Lösung in eine 10 ml Spritze mit einer 21 G Nadel stumpfen Enden gekappt. </li><li> Sperren Sie die Spritze auf einem programmierbaren Spritzenpumpe und stellen Sie die Durchflussmenge bei 1 ml / Std. </li><li> Platzieren der Aluminiumfolie bedeckten Kollektor gegenüber der Nadel horizontal, mit einer Nadelspitze-zu-Kollektor-Strecke von ca. 18 cm. </li><li> Klemmen Sie die positive alliAlligator-Clip in der Mitte der Nadel und dem Boden Krokodilklemme an die Aluminiumkollektor, dann die Spannung auf der Hochspannungsversorgung mit 15 kV. ACHTUNG: Hochspannung, halten Sie Abstand von der Nadel. </li><li> Nacheinander auf dem Spritzenpumpe und Stromversorgung drehen; schnell reinigen / entfernen Sie die Restpolymerlösung rund um die Spitze der Nadel mit einem trockenen Papiertuch vor stabile Faserdüsen und Taylor-Konus 19 gebildet werden. </li><li> Die Fasern auf der Sammel Al in einer Dicke von ca. 250-300 &amp;mgr; m akkumulieren (~ 7 Stunden unter den derzeitigen Spinnbedingungen). Speichern Sie die resultierende Gerüste im Vakuumtrockenschrank für 1-2 Tage, um restliche Lösungsmittel zu entfernen. </li><li> Bild die Gerüste, mit Gold beschichtet Sputtern mit einem Raster-Elektronen-Mikroskop, um konsistente Fasermorphologie zeigen. 10. </li></ol> 3. Bioreaktor Assemblierung und Charakterisierung <ol><li> Lochen Sie ein zylindrische Scheibe (Durchmesser: 8 mm) mit vier Armen (Länge: 2mm) aus der wie gesponnenen PCL Matte (2A), indem zuerst mit einem Durchmesser von 12 mm Stanzbiopsie, um den äußeren Durchmesser der Platte geschnitten. Dann mit einem zweiten, 8 mm Stanzbiopsie zu vier 2 mm langen Kerben gleichmäßig um den Kreismesser Abstand zu punkten, wo die Arme zu schneiden sind zu machen. Nach der Wertung mit der 8 mm-Stanz, verwenden Sie ein Skalpell, um die Kanten der Arme nach außen abgeschnitten. Einfügen des Gerüsts in die Nut der Silikonmembran über den verlängerten Armen (Video 1). Glätten Sie das Gerüst eingefügt durch sanftes Drücken Sie die Oberfläche mit Flachkopf-Pinzette. </li><li> Bringen Sie ein kleines Stück von dünnen Al-Folie (8 mm x 2 mm, senkrecht Form, 2B) mit dem PCL-Gerüst Laserreflexion unterstützen. </li><li> Befestigen Sie den zusammengebauten Silikonmembran / PCL Gerüst (wie in Schritt 1.4 beschrieben) in der Vibrationskammer. 1,5 ml Wasser in der Kammer, um die PCL-Gerüst vor Vibrationen Hydrat. </li><li> Mit dem Funktionsgenerator, einzuführen Vibrations ZeichenALS (z. B. 200 Hz-Sinuswellen mit einer Spitze-zu-Spitze-Spannung Vpp von 0,1 V) an die sandwichartig Acrylkammer. Mit einem Voltmeter die Spannung exakt messen an jedem Lautsprechereingang. Hinweis: die Vpp Auslesen aus dem Funktionsgenerator von der eventuellen Spannungs an den Lautsprecher geliefert abweichen. </li><li> Montieren Sie den Ein-Punkt-LDV und sichern die Laserlichtsensorkopf auf eine Schwenk-Neige-Kopf Stativ. Angle den Sensorkopf, so dass sie senkrecht auf der Tischplatte zeigt. Schließen Sie das LDV Sensorkopf mit dem Datenerfassungsmodul über Koaxialkabel dann das Modul an den Laptop über USB. </li><li> Fokussierung des Laserstrahls senkrecht an verschiedenen vorbestimmten Stellen auf der Silikon-Membran (Fig. 2B und Fig. 3). </li><li> Mit der Software zur Datenerfassung, notieren Sie die Mitte Membranverschiebung. Klicken Sie auf &quot;Übernahme-Einstellungen&quot; aus dem Menü &quot;Optionen&quot;; ändern Sie dann den Messmodus auf &quot;FFT221;. Als nächstes klicken Sie auf die &quot;Dauermessung&quot; in der Hauptsymbolleiste klicken Sie dann auf die Spitze, die bei der gewählten Frequenz (6D) bildet, um eine Verschiebung zu erfassen. </li><li> Zur Erstellung der normalen Halbmembranverschiebung (w 0) als Funktion der relativen Position gegenüber dem Substrat. Erstellen Sie ein 3D-Farbtabelle der Oberfläche Vibrations Profil mit Origin 8.5 Datenanalyse-Software. </li></ol> 4. Vibrationszellkultur <ol><li> Sub-Kultur menschlichen Knochenmark abgeleiteten MSCs in T150 Zellkulturflaschen mit einer Anfangsaussaatdichte von 4000-5000 Zellen / cm 2 in MSC Wartung Medien. </li><li> Nach 7-8 Tagen Zellkultur (um ~ 85% Konfluenz), trypsinize die Zellen mit einer Zellspalt Reagens wie Accutase zählen mit einer Zählkammer, Zentrifuge (440 × g für 5 min) und Resuspension der Zellpellets in Frisch MSC Erhaltungsmedium bei einer Konzentration von 4,5 x 10 6 Zellen / ml. </li><li> Tauchen Sie den PCL scaffold in 70% Ethanol O / N. Nachdem das Lösungsmittel verdampft ist, setzen beide Seiten des Gerüsts mit UV-Licht (254 nm) für 5-8 min keimtötende. </li><li> Einweichen des PCL-Gerüst in einem 20 ug / ml Fibronektin-Lösung bei 37 ° C für 1 Stunde. Legen Sie die Fibronektin-beschichtete Gerüst in die Silikonmembran. Montieren Sie den Bioreaktor wie in Schritt 1 beschrieben. </li><li> Verteilen 40 ul der Zellsuspension gleichmäßig auf die gesicherte PCL Gerüst. Lassen Sie die Zellen für 1 bis 1,5 Stunden, bevor Sie weitere 1,5 ml frisches Medium mit der Vibrationskammer zu befestigen. </li><li> Kultur der MSC-beladenen PCL Gerüst statisch für 3 Tage und aktualisieren Sie die Medien nach Abschluss der statischen Kultur. </li><li> Impose ausgewählten Vibrations Regime auf die Zellkonstrukte. Anmerkung: Als Beispiel werden die Zellen in einen 1-Stunden-on-1-h-aus (OF) Schwingung bei 200 Hz mit einem w von 0 ~ 40 &amp;mgr; m für 12 Stunden pro Tag für bis zu 7 Tage unterzogen. Konstrukte, um Schwingungsanregungen unterzogen werden, wie Vib Proben und diesen kul bezeichnetrot statisch in identischen Schwingungs Kammern dienen als statische Kontrollen (Stat). </li></ol> 5. Biologische Bewertung <ol><li> Sammeln Sie 200 ul Zellkulturmedien aus jeder Kammer jeden zweiten Tag (Tag 1, 3, 5 und 7) und bündeln die Portionen aus der gleichen Probe zusammen (jeweils 800 ul). </li><li> Quantifizierung der zellulären Produktion von Matrix-Metalloproteinase-1 (MMP1) und HA mit einem MMP1 ELISA-Entwicklung-Kit und eine Hyaluronsäure kompetitiven ELISA-Kit, jeweils folgende Verfahren der Hersteller. Unterdessen untersuchen die Produktion von löslichem Elastin-Vorläufer nach dem zuvor berichtet ELISA-Verfahren. 8 </li><li> Nach Abschluss der letzten Schwingungszyklus am Tag 7, schnell zu entfernen, die zellulären Konstrukte aus den Schwingungs Kammern mit scharfen Pinzette und spülen Sie sie kurz mit kaltem Phosphat-gepufferte Salzlösung (PBS, 4 ° C). </li><li> Für die Live / Dead-Färbung, brüten die Konstrukte mit Propidiumiodid (1:2000 in PBS) undSyto-13 (1:1000 in PBS) gleichzeitig für 5 min bei RT. Bild die gefärbten Konstrukte mit einem Multiphotonen-konfokalen Mikroskop. </li><li> Getrennt Snap-Einfrieren der PBS-gespült Zellkonstrukte auf Trockeneis und extrahieren Sie die gesamte zelluläre RNA nach einer zuvor berichtet Protokoll für die Gen-Analyse. 9 </li><li> Überprüfen Sie, ob die Quantität und Qualität der extrahierten RNA mit Hilfe eines UV-Vis-Spektrophotometer. RNA-Proben mit A260/A280 und A260/A230 Verhältnisse von 1,8 bis 2,2 sind für die anschließende qPCR-Analyse verwendet. </li><li> Reverse Transkription der RNA (500 ng / Probe) in cDNA mit einem kommerziell erhältlichen Kit der reversen Transkription. </li><li> Führen Sie die PCR-Reaktion auf einer Echtzeit-Sequenz-Detektionssystem mit einem handelsüblichen PCR Master Mix nach der vorher beschrieben Verfahren. 8 </li><li> Analysieren Sie die qPCR Ergebnisse mit kommerziellen qPCR Datenanalyse-Software. Um die Zuverlässigkeit der Datenanalyse zu gewährleisten, werden mehrere Referenzgene (YWHAZ, TBP, PPIA) als int verwendetern Kontrollen und die Varianz der spezifischen Primer Effizienz berücksichtigt wird. 8 </li></ol>

<ol><li>Titze, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical-Stress+in+Phonation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Mechanical-Stress in Phonation.</a> J. Voice. 8, 99-105 (1994).</li>
<li>Titze, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Relation+Between+Subglottal+Pressure+and+Fundamental-Frequency+in+Phonation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Acoust.+Soc.+Am%22%5BJournal%5D)">On the Relation Between Subglottal Pressure and Fundamental-Frequency in Phonation.</a> J. Acoust. Soc. Am. 85, 901-906 (1989).</li>
<li>Gray, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+the+vocal+folds%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol.+Clin.+N.+Am%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of the vocal folds.</a> Otolaryngol. Clin. N. Am. 33, 679-698 (2000).</li>
<li>Thibeault, S. L., Gray, S. D., Bless, D. M., Chan, R. W., Ford, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+and+rheologic+characterization+of+vocal+fold+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Histologic and rheologic characterization of vocal fold scarring.</a> J. Voice. 16, 96-104 (2002).</li>
<li>Hansen, J. K., Thibeault, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+understanding+and+review+of+the+literature%3A+Vocal+fold+scarring%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Current understanding and review of the literature: Vocal fold scarring.</a> J. Voice. 20, 110-120 (2006).</li>
<li>Pittenger, M. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilineage+potential+of+adult+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells.</a> Science. 284, 143-147 (1999).</li>
<li>Hanson, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Mesenchymal+Stem+Cells+From+Human+Vocal+Fold+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Laryngoscope%22%5BJournal%5D)">Characterization of Mesenchymal Stem Cells From Human Vocal Fold Fibroblasts.</a> Laryngoscope. 120, 546-551 (2010).</li>
<li>Tong, Z., Duncan, R. L., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+the+behaviors+of+mesenchymal+stem+cells+via+the+combination+of+high-frequency+vibratory+stimulations+and+fibrous+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Modulating the behaviors of mesenchymal stem cells via the combination of high-frequency vibratory stimulations and fibrous scaffolds.</a> Tissue Eng. Part A. 19, 1862-1878 (2013).</li>
<li>Tong, Z., Sant, S., Khademhosseini, A., Jia, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+the+Fibroblastic+Differentiation+of+Mesenchymal+Stem+Cells+Via+the+Combination+of+Fibrous+Scaffolds+and+Connective+Tissue+Growth+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Controlling the Fibroblastic Differentiation of Mesenchymal Stem Cells Via the Combination of Fibrous Scaffolds and Connective Tissue Growth Factor.</a> Tissue Eng. Part A. 17, 2773-2785 (2011).</li>
<li>Jones, D. L., Wagers, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+place+like+home%3A+anatomy+and+function+of+the+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">No place like home: anatomy and function of the stem cell niche.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 9, DOI. 11-21 (1038).</li>
<li>Wang, J. H., Thampatty, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanobiology+of+Adult+and+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+Rev.+of+Cell+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanobiology of Adult and Stem Cells.</a> Int. Rev. of Cell Mol. Biol. 271, 301-346 (2008).</li>
<li>Doroski, D. M., Levenston, M. E., Temenoff, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+tensile+culture+promotes+fibroblastic+differentiation+of+marrow+stromal+cells+encapsulated+in+poly+%28ethylene+glycol%29-based+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Cyclic tensile culture promotes fibroblastic differentiation of marrow stromal cells encapsulated in poly (ethylene glycol)-based hydrogels.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 3457-3466 (2010).</li>
<li>Kim, B. S., Nikolovski, J., Bonadio, J., Mooney, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+mechanical+strain+regulates+the+development+of+engineered+smooth+muscle+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cyclic mechanical strain regulates the development of engineered smooth muscle tissue.</a> Nat. Biotechnol. 17, 979-983 (1999).</li>
<li>Webb, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+strain+increases+fibroblast+proliferation%2C+matrix+accumulation%2C+and+elastic+modulus+of+fibroblast-seeded+polyurethane+constructs%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Cyclic strain increases fibroblast proliferation, matrix accumulation, and elastic modulus of fibroblast-seeded polyurethane constructs.</a> J. Biomech. 39, 1136-1144 (2006).</li>
<li>Kim, Y. J., Sah, R. L. Y., Grodzinsky, A. J., Plaas, A. H. K., Sandy, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+Regulation+of+Cartilage+Biosynthetic+Behavior+-+Physical+Stimuli.%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Mechanical Regulation of Cartilage Biosynthetic Behavior - Physical Stimuli.</a> Arch. Biochem. Biophys. 311, 1-12 (1994).</li>
<li>Titze, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+bioreactor+for+engineering+vocal+fold+tissues+under+combined+tensile+and+vibrational+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses.</a> J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).</li>
<li>Kutty, J. K., Webb, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibration+stimulates+vocal+mucosa-like+matrix+expression+by+hydrogel-encapsulated+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Vibration stimulates vocal mucosa-like matrix expression by hydrogel-encapsulated fibroblasts.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. 4, 62-72 (2010).</li>
<li>Farran, A. J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+Characterization+of+a+Dynamic+Vibrational+Culture+System%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Tissue+Eng.+Regen.+Med%22%5BJournal%5D)">Design and Characterization of a Dynamic Vibrational Culture System.</a> J. Tissue Eng. Regen. Med. , (2011).</li>
<li>Reneker, D. H., Yarin, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+jets+and+polymer+nanofibers%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer%22%5BJournal%5D)">Electrospinning jets and polymer nanofibers.</a> Polymer. 49, 2387-2425 (2008).</li>
<li>Wang, Y., Theobald, P., Tyrer, J., Lepper, P. The application of scanning vibrometer in mapping ultrasound fields. J. Phys.: Conf. Ser. 1, 167-173 (2004).</li>
<li>Brown, W. S., Morris, R. J., Hollien, H., Howell, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Speaking+Fundamental-Frequency+Characteristics+as+a+Function+of+Age+and+Professional%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Speaking Fundamental-Frequency Characteristics as a Function of Age and Professional.</a> J. Voice. 5, 310-315 (1991).</li>
<li>Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+mechanotransduction%3A+putting+all+the+pieces+together+again%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+J%22%5BJournal%5D)">Cellular mechanotransduction: putting all the pieces together again.</a> Faseb J. 20, 811-827 (2006).</li>
<li>Titze, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+validation+of+a+bioreactor+for+engineering+vocal+fold+tissues+under+combined+tensile+and+vibrational+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomech%22%5BJournal%5D)">Design and validation of a bioreactor for engineering vocal fold tissues under combined tensile and vibrational stresses.</a> J. Biomech. 37, 1521-1529 (2004).</li>
<li>Moore, J., Thibeault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+Into+the+Role+of+Elastin+in+Vocal+Fold+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Insights Into the Role of Elastin in Vocal Fold Health and Disease.</a> J. Voice. 26, 269-275 (2012).</li>
<li>Thibeault, S. L., Bless, D. M., Gray, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interstitial+protein+alterations+in+rabbit+vocal+fold+with+scar%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Interstitial protein alterations in rabbit vocal fold with scar.</a> J. Voice. 17, 377-383 (2003).</li>
<li>Branski, R. C., Verdolini, K., Sandulache, V., Rosen, C. A., Hebda, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vocal+fold+wound+healing%3A+A+review+for+clinicians%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Voice%22%5BJournal%5D)">Vocal fold wound healing: A review for clinicians.</a> J. Voice. 20, 432-442 (2006).</li>
<li>Clark, I. A., Swingler, T. E., Sampieri, C. L., Edwards, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+matrix+metalloproteinases+and+their+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+B%22%5BJournal%5D)">The regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors.</a> Int. J. Biochem. Cell B. 40, 1362-1378 (2008).</li>
<li>Silver, F. H., Horvath, I., Foran, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viscoelasticity+of+the+vessel+wall%3A+The+role+of+collagen+and+elastic+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Viscoelasticity of the vessel wall: The role of collagen and elastic fibers.</a> Crit. Rev. Biomed. Eng. 29, 279-301 (2001).</li>
<li>Kutty, J. K., Webb, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Engineering+Therapies+for+the+Vocal+Fold+Lamina+Propria%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+B%3A+Rev%22%5BJournal%5D)">Tissue Engineering Therapies for the Vocal Fold Lamina Propria.</a> Tissue Eng. Part B: Rev. 15, 249-262 (2009).</li>
</ol>

Keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Erfolgreiche Engineering von funktionellen Stimmlippengewebe in vitro erfordert die Erholung von einem Stimmlippenartigen Mikroumgebung, um die Verhaltensweisen der multipotenten Zellen vermitteln. Es ist allgemein anerkannt, dass Gewebe-oder Organstrukturen spiegeln die Funktionen, die sie benötigt, um durchzuführen. Für 22 Stimmlippengewebe werden die hochfrequenten Schwingungen, die bei der Lautbildung auftreten vorgeschlagen wichtig für die Gewebereifung zu sein. In unserer Studie sind PCL Gerüst...

Der menschliche Stimmlippen, einer epithelialen Schicht, die Lamina propria (LP) und der M. vocalis, ist eine spezialisierte Weichgewebe die den Luftstrom aus der Lunge in akustische Wellen für die Klangerzeugung umwandelt. 1 Stimmlippen schwingen regelmäßig während der normalen Stimmbildung, bei Grundfrequenzen im Bereich aufweisen Stämme von bis zu 30% 100-300 Hz. 2 Erwachsene Stimmlippen LP ist eine Gradienten-Struktur einer oberflächlichen (SLP) zusammengesetzt ist, ein Zwischenprodukt (ILP) und eine Tiefe (DLP)-Schicht. Weitere Klassifikationsgruppen das Epithel und die SLP als Schleimhaut-Schicht und verbindet die ILP-und DLP in die Stimmbandes. 3 Die SLP Schicht enthält in erster Linie eine amorphe Matrix mit spärlich verteilt kollagenen Fasern, während das Band mit reifen Kollagen und Elastin-Fasern angereichert um eine ausreichende Festigkeit verfügen. 4. Die Struktur und Mechanik des Neugeborenen Stimmlippen deutlich von ihrer reifen Kollegen. Obwohl Mechanismuss Regelstimmlippen Entwicklung und Reifung sind noch nicht vollständig verstanden, experimentelle Beweise für die Definition von Rollen der Vokalisation abgeleitete mechanische Belastung hingewiesen. Mehrere medizinische Bedingungen, einschließlich Sprachmissbrauch, Infektionen, chemische Reizstoffe und chirurgische Verfahren, können die Stimmlippe beschädigen. Stimmlippe Störungen betreffen schätzungsweise 3-9% der US-Bevölkerung. Aktuelle Behandlungsmethoden für Erkrankungen der Stimmlippen sind begrenzt, 5 und eine Stammzellen-basierten Tissue-Engineering-Ansatz hat sich als vielversprechende Strategie zur Wiederherstellung der Stimmlippenfunktion entstanden. Mesenchymalen Stammzellen (MSC) sind eine geeignete Alternative zu den primären Stimmlippen Stimmlippen Fibroblasten für Tissue Engineering. 6-9 Stammzell Schicksal Spezifikation und anschließender Gewebeentwicklung werden durch die spezifische Nische sie wohnen, von denen der mechanische Zustand vermittelt ein entscheidender Faktor. 10. Mechanische Kräfte sind wesentliche Regulatoren der Morphogenese einnd Homöostase, vor allem für Gewebe, die routinemäßig von der Last. ausgesetzt sind 11 Aus einer Perspektive Tissue Engineering hat es sich gezeigt, dass die Exposition gegenüber physiologisch relevanten mechanischen Reize fördert die Stammzelldifferenzierung und gewebespezifischen Matrixumbau. 12-15 Gewebekulturbioreaktoren sind entworfen, um die gewünschte physiologische Umgebung für Zell-oder Gewebewachstum in vitro zu simulieren. Für Stimmlippen Tissue Engineering, ist es besonders wichtig, die mechanische Umgebung der phonating Stimmlippen neu zu erstellen. Eine ideale Stimmlippen Bioreaktor sollte Vibrations effektiv zu liefern Hinweise zur Kultivierung von Zellen, so dass eine leichte Kontrolle über die Frequenz, Amplitude und Dauer der Erschütterungen. Titze und Mitarbeiter entwickelten eine Stimmlippen Bioreaktor (T1 Bioreaktor) 16, die statische Strecke mit hoher Frequenz (20-200 Hz) Schwingungen, die zelluläre Produktion von Matrixproteinen stimulieren kombiniert. Das Arbeg dieser Bioreaktor, Webb und Kollegen 17 suchten die Auswirkungen der 10-Tage, 100-Hz-Schwingungen auf den dermalen Fibroblasten in einer Hyaluronsäure (HA)-basierte Hydrogel kultiviert. Konstrukte Vibrationen ausgesetzt zeigten eine erhöhte Expression von HA-Synthase-2 (HAS2), Decorin, Fibromodulin und Matrix-Metalloproteinase-1 (MMP1), bezogen auf die statische Kontrollen. Die stimulierende Wirkung wurde festgestellt, zeitabhängig sein. Vor kurzem, unsere Gruppe 18 stellte ein Stimmlippen Bioreaktor (J1 Bioreaktor) mit einem Leistungsverstärker, einen Funktionsgenerator, einen geschlossenen Lautsprecher und eine Umfangs verankert Silikonmembran, die die schwingende Luft auf die beigefügten Zellen überträgt. Neonatale Vorhautfibroblasten in der J1-Bioreaktor kultiviert wurden 1 h Vibration bei 60, 110 oder 300 Hz unterzogen wird, mit einer Dehnung in der Ebene von bis zu 0,05%. Die qPCR Ergebnisse zeigten, dass die Expression einiger Gene ECM mäßig in Abhängigkeit von der unterschiedlichen Schwingungsfrequenzen verändertund Amplituden. Diese Bioreaktor entwickelt, während faszinierend, haben mehrere Einschränkungen. Zum Beispiel erfordert die T1-System eine große Anzahl von Verbindungsstangen und für mechanische Kopplung, die Begrenzung der Maximalfrequenzen erreichbar. Darüber hinaus können Zellen, um unerwünschte mechanische Bewegung und Flüssigkeits Störung, die die Datenauswertung erschweren unterworfen werden. Die J1-Bioreaktor, auf der anderen Seite, zeigt relativ geringe Wirkungsgrad der Energieumwandlung und ist nicht benutzerfreundlich. Darüber hinaus löst Vibrationen häufig die Zellbeladenen Konstrukte aus der zugrunde liegenden Silikonmembran. Der J2 Stimmlippen Bioreaktor hier berichtet, basierend auf dem gleichen Prinzip wie die J1-Version entworfen, wird die Konsistenz und Reproduzierbarkeit optimiert. Die Stimmbildung ähnlicher Vibrationen sind aerodynamisch in individuell angepassten Vibrationskammern, in denen MSC besiedelten Faser Poly (ε-Caprolacton) (PCL) Gerüste sind effektiver erzeugtEly gesichert. Laservibrometrie (LDV) ermöglicht dem Benutzer, den Vibrationsprofils der Membran / Gerüstanordnung zu überprüfen. In unserer Demonstration werden MSCs 200-Hz-Sinusschwingungen mit einer 1-Stunden-on-1-h-aus (OF) Muster für insgesamt 12 Stunden täglich für 7 Tage ausgesetzt. Zelluläre Antworten auf die verhängte Vibrations Hinweise werden systematisch untersucht. Insgesamt bietet die J2 Stimmlippen die benutzerfreundlichen Funktionen, so dass dynamische Zellkulturstudien, in einem hohen Durchsatz und reproduzierbar durchgeführt werden.

<table><tbody><tr><td>Silikonelastomer-Kit</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td>Härten Sie die Membran bei 100 &#176 aus; C für 2 Std</td></tr>. <tr><td>PCL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744-500G</td><td>Mn ~80 kDa, lösen O/N</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7559-5VL</td><td></td></tr><tr><td>MSCs aus menschlichem Knochenmark</td><td>Lonza</td><td>PT-2501</td><td>Empfangen mit Passage 2</td></tr><tr><td>MSC-Erhaltungsmedium</td><td>Lonza</td><td>PT-3001</td><td>10% FBS in Basalmedien ergänzt mit L-Glutamin, Gentamicin und Amphotericin</td></tr><tr><td>Reagenz für die Accutase-Zelldissoziation</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E7023-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F2006-1MG</td><td></td></tr><tr><td>MMP1 DuoSet ELISA-Kit</td><td>R& D systems</td><td>DY901</td><td></td></tr><tr><td>HA ELISA-Kit</td><td>Echelon Biosciences</td><td>&nbsp; K-1200&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-136</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Syto-13&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>S7575</td><td></td></tr><tr><td>QuantiTect Reverse Transkriptionskit&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>205311</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Mastermix</td><td>Life Technologies</td><td>4309155</td><td></td></tr><tr><td>Ersatzlautsprecher</td><td>DAYTON audio (via Parts Express)</td><td>DS90-8</td><td>Papiermembran, Vollbereich (80-13.000 Hz), 85 dB</td></tr><tr><td>Ergo Micro Drehmomentschraubendreher</td><td>Mountz</td><td># 020377</td><td>Drehmomentbereich: 20-120 cN&#183; m</td></tr><tr><td>Stereo-Lautsprecher-Wahlschalter</td><td>RadioShack</td><td>40-244</td><td>Maximale Belastbarkeit 50 W</td></tr><tr><td>Funktionsgenerator</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>33220A</td><td>Frequenzbereich 1 & Mikro; Hz-20 MHz</td></tr><tr><td>Endstufe&nbsp;</td><td>PYLE audio</td><td>PylePro PT2400</td><td>Frequenzgang: 10 Hz-50 kHz, zwei Lautsprecher -Kanäle</td></tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator&nbsp;</td><td>Thermo Fisher&nbsp;</td><td>Steri-Cult 3307</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>New Era Pump Systems</td><td>NE-300</td><td></td></tr><tr><td>Hochspannungsnetzteil</td><td>Spellman</td><td>CZE 1000R</td><td>Ausgangsspannung: 0-30 kV</td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop&nbsp;</td><td>JEOL-USA</td><td>JSM-7400F</td><td></td></tr><tr><td>Schreibtisch-Gold-Sputter-Beschichter</td><td>Denton Vacuum</td><td>DSK00V-0013</td><td></td></tr><tr><td>Doppler-Laser-Vibrometer&nbsp;</td><td>Polytec</td><td>PDV-100</td><td>Berührungslose Geschwindigkeitsmessung (0-22 kHz)</td></tr><tr><td>PCR-Sequenz-Detektionssystem&nbsp;</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI7300</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Multiphotonenmikroskop</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss 510Meta NLO</td><td></td></tr><tr><td>UV-VIS Spektralphotometer&nbsp;</td><td>NanoDrop Products über Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>VibSoft Datenerfassungssoftware</td><td>Polytec</td><td></td><td>Erfassungsbandbreite bis zu 40 MHz</td></tr><tr><td>Origin 8.5 Datenanalysesoftware&nbsp;</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qbasePlus qPCR-Software zur Datenanalyse&nbsp;</td><td>Biogazelle</td><td>V2.3</td><td></td></tr><tr><td>Aluminiumlegierung</td><td>McMaster-Carr</td><td>Alloy 6061</td><td></td></tr><tr><td>Acrylblöcke</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polycarbonat Anti-Feuchtigkeits-Kammer</td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td>Schlagfest&nbsp; Schrauben aus Polycarbonat</td></tr><tr><td></td><td>McMaster-Carr</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Elektronisches Kabel/Draht</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PVC-Schläuche in medizinischer Qualität</td><td>US Plastic Corp.</td><td>Tygon S-50-HL</td><td>Klare, biokompatible</td></tr><tr><td>10 ml Spritze&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>21 G Nadel mit stumpfem Ende</td><td>Kleinteile</td><td>NE-213PL-25</td><td>1-1/2" Länge</td></tr><tr><td>Krokodilklemmen-Adapter&nbsp;</td><td>RadioShack</td><td>270-354</td><td>Vollisolierter</td></tr><tr><td>8 mm Biopsie-Stanzer</td><td><a href="http://www.sklarcorp.com/ProductListUS.aspx? Abteilungs-ID=10& CategoryID=96">Sklar&nbsp; Chirurgische Instrumente</a></td><td>96-1152</td><td>Steriler, einmaliger 12-mm-Biopsiestempel</td></tr><tr><td></td><td>Acuderm (über Fisher Scientific)</td><td>NC9998681</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturflaschen</td><td>Corning</td><td></td><td>Zellkultur, behandelt mit Zellkulturen</td></tr></tbody></table>

konstruktion und charakterisierung eines neuartigen bioreaktor stimmlippen

Construction and Characterization of a Novel Vocal Fold Bioreactor

In-vitro-Engineering von mechanisch aktiven Geweben erfordert die Präsentation physiologisch relevanter mechanischer Bedingungen für kultivierte Zellen. Um die dynamische Umgebung von Stimmlippen zu emulieren, wird ein neuartiger Stimmlippenbioreaktor konstruiert und charakterisiert, der in der Lage ist, Vibrationsstimulationen bei grundlegenden Phonationsfrequenzen zu erzeugen. Das Gerät besteht aus einem Funktionsgenerator, einer Endstufe, einem Lautsprecherwähler und parallelen Vibrationskammern. Individuelle Vibrationskammern werden erzeugt, indem eine speziell angefertigte Silikonmembran zwischen ein Paar Acrylblöcke eingebettet wird. Die Silikonmembran dient nicht nur als Boden der Kammer, sondern bietet auch einen Mechanismus zur Sicherung des mit Zellen beladenen Gerüsts. Schwingungssignale, die von einem Lautsprecher erzeugt werden, der unter dem unteren Acrylblock montiert ist, werden durch die oszillierende Luft aerodynamisch auf die Membran übertragen. Acht identische Vibrationsmodule, die auf zwei stationären Metallstangen befestigt sind, sind in einer Anti-Feuchtigkeits-Kammer untergebracht und ermöglichen den Langzeitbetrieb in einem Zellkultur-Inkubator. Die Schwingungseigenschaften des Stimmlippenbioreaktors werden zerstörungsfrei mit einem Laser-Doppler-Vibrometer (LDV) analysiert. Die Nützlichkeit des dynamischen Kulturgeräts wird durch die Kultivierung zellulärer Konstrukte in Gegenwart von sinusförmigen Schwingungen von 200 Hz mit einer mittleren Membranverschiebung von 40 μm demonstriert. Mesenchymale Stammzellen, die im Bioreaktor kultiviert werden, reagieren auf die Vibrationssignale, indem sie die Synthese und den Abbau von stimmlippenrelevanten, extrazellulären Matrixkomponenten verändern. Das hier vorgestellte neuartige Bioreaktorsystem bietet eine hervorragende in vitro Plattform für die Untersuchung der vibrationsinduzierten Mechanotransduktion und für das Engineering von funktionellem Stimmlippengewebe.

Die PCL-Scaffolds durch Elektrospinning hergestellt enthalten mikrometergroßen Poren und Zwischen zufällig verstrickt Fasern mit einem durchschnittlichen Durchmesser von 4,7 um (Abbildung 4A). Bei einer höheren Vergrößerung, nanoskalige Rillen und Poren auf einzelnen Fasern (4B) sichtbar. Die Beschichtung der Gerüste mit Fibronektin verbessert Hydrophilie und erleichtert die anfängliche Zelladhäsion / Verteilung auf der PCL-Gerüst (unveröffentlichte Beobachtung). <p class="jove_cont...

Ein neuartiger Stimmlippenbioreaktor, der in der Lage ist, physiologisch relevante, vibrierende Stimulation an kultivierte Zellen abzugeben, wird konstruiert und charakterisiert. In Kombination mit einem faserigen Poly(ε-Caprolacton)-Gerüst schafft dieses dynamische Kulturgerät eine stimmlippenmimetische Umgebung, die das Verhalten mesenchymaler Stammzellen moduliert.

Konstruktion und Charakterisierung eines neuartigen Bioreaktor Stimmlippen

In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Wirkung einer vibrotaktischen Stimulation auf mesenchymale Stammzellen mithilfe eines Bioreaktors zu untersuchen, der zur Nachbildung der Phonation konzipiert ist. Dies wird erreicht, indem Poly-epsilon-Caprolacton-Gerüste hergestellt werden, die als dreidimensionales Substrat für Zellkulturen dienen, die dem Stimmligament ähneln. In einem zweiten Schritt werden die Gerüste in Silikonmembranen integriert, die die Übertragung der Oszillation auf die Zellkonstrukte ermöglichen.Anschließend wird die Laser-Doppler-Vibrometrie verwendet, um die Schwingungseigenschaften jeder Membran-Scaffold-Kombination zu bestimmen. Letztendlich können EISA- und quantitative R-T-P-C-R-Analysen durchgeführt werden, um die zellulären Reaktionen auf Proteinebene und translationaler Ebene zu bewerten. Diese Methode kann zentrale Fragen im Bereich der Laryngologie beantworten, beispielsweise wie die Stimmlippe reift und welche Folgen eine falsche Stimmbeanspruchung hat.Die Implikationen dieser Technik reichen bis zur Behandlung von Stimmbandstörungen, da mit dieser Methode ein hohes Maß an zellulärer Kontrolle bei der Herstellung des Gerüsts möglich ist: Lösen Sie zunächst PCL-Pellets in Chloroform mit einer Konzentration von 15 Gewichtsprozent. Geben Sie anschließend die erhaltene Lösung in eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einer stumpfen 21-Gauge-Nadel verschlossen ist. Befestigen Sie die Spritze an einer programmierbaren Spritzenpumpe und stellen Sie die Flussrate auf einen Milliliter pro Stunde ein.Danach einen mit Aluminiumfolie bedeckten Kollektor horizontal gegenüber der Nadel platzieren, wobei der Abstand von der Nadelspitze zum Kollektor etwa 18 Zentimeter betragen sollte. Anschließend eine positive Krokodilklemme in der Mitte der Nadel befestigen und die Klemme mit dem Kollektor verbinden. Die Spannung der Hochspannungsquelle auf 15 Kilovolt einstellen und dabei darauf achten, sich von der Nadel fernzuhalten.Schalten Sie dann die Spritzenpumpe und die Stromversorgung ein. Entfernen Sie mit einem trockenen Papiertuch schnell die restliche Polymerslösung, die sich am Nadeltipp befindet, bevor sich der stabile Faserstrahl und der Taylor-Konus ausbilden, und lassen Sie die Fasern etwa sieben Stunden lang mit einer Dicke von 250 bis 300 Mikrometern auf dem Aluminiumkollektor ansammeln. Bewahren Sie das Ergebnis anschließend ein bis zwei Tage in einem Vakuumexsikkator auf, um restliche Lösungsmittel zu entfernen. Die PCL-Gerüste enthalten mikrometergroße interstitielle Poren und zufällig verflochtene Fasern mit einem durchschnittlichen Durchmesser von etwa 4,7 Mikrometern.Bei höherer Vergr&ouml;&szlig;erung sind nanoskalige Rillen und Poren auf den einzelnen Fasern sichtbar, aus denen der Bioreaktor zusammengesetzt wird. Beginnen Sie damit, mit einer 12 Millimeter durchmessenden Biopsiepunch die Au&szlig;endurchmesser eines acht Millimeter durchmessenden Kreisscheibens aus einem k&uuml;rzlich gesponnenen PCL-Mat zu schneiden. Verwenden Sie dann eine zweite acht Millimeter durchmessende Biopsiepunch, um die Stellen einzuritzen, an denen die Arme ausgeschnitten werden sollen.Nach der Einschnittpunktion verwenden Sie eine Skalpellklinge, um die Ränder der Arme nach außen zu schneiden, und führen Sie das Gerüst über die verlängerten Arme in die Nut der Silikonmembran ein. Glätten Sie das eingesetzte Gerüst, indem Sie vorsichtig mit einer flachen Pinzette auf die Oberfläche drücken, und befestigen Sie anschließend ein 8 mm mal 2 mm großes Stück dünner Aluminiumfolie am PCL-Gerüst. Um die Laserreflexion zu verbessern, befestigen Sie das zusammengesetzte Silikonmembran-PCL-Gerüst in der Vibrationskammer.Dann platzieren Sie die Silikonmembran zwischen zwei Acrylblöcken. Sichern Sie die Anordnung mit vier Eckschrauben mithilfe eines Mikrodrehmomentschlüssels, der auf eine konstante Kraft von 35 Zentinewtonmetern eingestellt ist, wodurch eine wasserdichte Vibrationskammer mit einer Breite von 24 Millimetern und einer Tiefe von 18 Millimetern entsteht. Danach wird ein erweiterter Mini-Tieftöner mit drei Fußkontakten unterhalb der Vibrationskammer über eine weitere Reihe von Eckschrauben am unteren Acrylblock befestigt, wodurch die Montage eines einzelnen Vibrationsmoduls abgeschlossen ist.Nachdem sieben zusätzliche Vibrationsmodule repliziert wurden, befestigen Sie vier der Module an einem von zwei feststehenden Aluminiumstäben, indem Sie die Lautsprecherbasen in gleichmäßig verteilte runde Löcher einsetzen. Schneiden Sie in die Stäbe ein und stabilisieren Sie jeden Lautsprecher, indem Sie eine Schraube von der Seite des Aluminiumstabs in jedes runde Loch einbringen. Anschließend verbinden Sie die einzelnen Lautsprecher mit dem Umschalter, indem Sie Drähte an die positiven und negativen Anschlüsse am Lautsprechergehäuse sowie an die entsprechenden Ausgänge am Umschalter anschließen.Mit dem Lautsprecherwahlschalter kann das Signal des Funktionsgenerators, nachdem es durch einen Leistungsverstärker gegangen ist, gleichzeitig alle acht Lautsprecher erreichen. Anschließend werden die beiden Kammeranordnungen, der Lautsprecherwahlschalter und die zugehörige Elektronik in ein feuchtigkeitsgeschütztes Gehäuse eingebracht, das die gesamte Baugruppe in einem handelsüblichen Zellkulturinkubator unterbringt. Die Hauptkabel werden durch ein Stück medizinisches PVC-Rohr geführt und der Leistungsverstärker sowie der Lautsprecherwahlschalter über die Filteranordnung an der Rückseite des Inkubators verbunden. Um den Bioreaktor zunächst zu charakterisieren, geben Sie 1,5 Milliliter Wasser in die Vibrationskammer, um das PCL-Gerüst vor der Vibration zu hydratisieren. Anschließend führen Sie mithilfe des Funktionsgenerators Vibrationssignale in die eingeschlossene Acrylkammer ein. Verwenden Sie dazu genau einen Voltmeter.Messen Sie die Spannung an jedem Lautsprechereingang und bauen Sie dann das Einzelpunkt-Laser-Doppler-Vibrometer zusammen. Befestigen Sie den faseroptischen Lasersensor. Bringen Sie das Sensorgehäuse auf einem Schwenk-Neige-Kopf am Stativ an und richten Sie es so aus, dass es senkrecht zur Tischoberfläche zeigt.Verbinden Sie dann den Sensor-Kopf über ein Koaxialkabel mit dem Datenerfassungsmodul und das Modul über den USB-Anschluss mit einem Laptop. Richten Sie den Laserstrahl senkrecht auf verschiedene vorbestimmte Punkte der Silikonmembran aus und klicken Sie anschließend im Datenakquisitionssystem im Optionsmenü auf „Erfassungseinstellungen“. Ändern Sie danach den Messmodus in FFT und klicken Sie anschließend im Hauptwerkzeugkasten auf das Werkzeug für die kontinuierliche Messung.Klicken Sie auf den Peak, der sich bei der gewählten Frequenz bildet, um die Verschiebung aufzuzeichnen und die normale mittlere Membranverschiebung als Funktion der relativen Position über das Substrat darzustellen. Um eine schwingende Zellkultur einzurichten, subkultivieren Sie zunächst humanen Knochenmark-stammzellbasierten mesenchymalen Zellen in T-150-Zellkulturgefäßen mit einer anfänglichen Aussaatdichte von vier bis fünf mal 10³ Zellen pro Quadratzentimeter in Erhaltungsmedium für sieben bis acht Tage. Am Tag vor dem Experiment inkubieren Sie ein PCL-Gerüst über Nacht in 70 % Ethanol.Am nächsten Morgen lösen Sie die Zellen mit Accutane ab, zentrifugieren anschließend die Zellen und resuspendieren das Pellet in frischem Erhaltungsmedium bei einer Konzentration von 4,5 × 10⁶ Zellen pro Milliliter. Nachdem der Ethanol verdampft ist, bestrahlen Sie beide Seiten des Scaffolds fünf bis acht Minuten lang mit keimabtötendem UV-Licht. Danach inkubieren Sie den PCL-Scaffold eine Stunde lang in einer Fibronectin-Lösung mit 20 µg/mL bei 37 °C.Der Bioreaktor, wie gerade gezeigt, und verteilen Sie dann 40 Mikroliter der Zellsuspension gleichmäßig auf dem befestigten Scaffold. Lassen Sie die Zellen eine bis 1,5 Stunden anhaften und fügen Sie anschließend weitere 1,5 Milliliter frisches Medium in die Vibrationskammer hinzu. Nachdem der mit mesenchymalen Stammzellen beladene PCL-Scaffold drei Tage lang statisch kultiviert wurde, erneuern Sie das Medium und leiten Sie dann die ausgewählten Vibrationsregime an die zellulären Konstrukte weiter.Die Vibrationsfrequenzen wurden so gewählt, dass sie den grundlegenden menschlichen Sprachfrequenzen entsprechen, und es besteht eine lineare Beziehung zwischen der normalen Verschiebung und der Spitzen­spitzen­spannung im Bereich von null bis 0,125 Volt für alle getesteten Frequenzen. Bei einer gegebenen Spitzen­spitzen­spannung nimmt die normale Verschiebung ab, wenn die Frequenz von 100 auf 300 Hertz ansteigt. Zelluläre Reaktionen auf vibratoire Stimuli wurden auf mRNA-Ebene hinsichtlich der Expression wesentlicher Proteine der Stimmlippen untersucht. Extrazelluläre Matrixproteine wie Elastin, Hyaluronan-Synthase 1, Kollagen Typ III Alpha 1 und Matrix-Metalloprote­inase 1 zeigen, dass eine zyklische Vibration mit einer Stunde an und einer Stunde aus zu einer 2,3-fachen Erhöhung der Elastin-Expression im Vergleich zu statischen Kontrollen führt.Am siebten Tag erhöhen die Vibrationsstimulationen auch mäßig die Kollagenexpression. Bemerkenswert ist, dass die Expression der wichtigsten Enzyme für die Remodellierung der extrazellulären Matrix, Hyaluronsäure-Synthase 1 und Matrix-Metalloproteinase 1, durch die Vibrationsreize von Tag drei bis Tag sieben signifikant gesteigert wird. Dynamisch kultivierte Zellen produzieren nach sieben Tagen Vibration 4,2 ± 0,1 µg/mg trockenes Gerüstgewicht lösliches Elastin, wie mittels ELISA nachgewiesen wurde.Während die statischen Kontrollen nur 2,7 ± 0,2 Mikrogramm pro Milligramm Elastin akkumulieren. Im Durchschnitt führen siebentägige Vibrationen mit einer Stunde an und einer Stunde aus zu 2,2- bzw. 4,7-fachen Zunahmen im Vergleich zu den entsprechenden statischen Kontrollen bei der Sekretion von Hyaluronsäure bzw. MMP-1. Obwohl unser System zur Untersuchung der VOCO-Form-Physiologie konzipiert ist, kann es auch auf viele andere Systeme angewendet werden.Zum Beispiel Ohren- und menschliche Hautgewebe. Vielen Dank fürs Zuschauen. Viel Erfolg bei Ihren Experimenten.

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Research

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