Protonen-Transfer und Protein-Zustände Dynamics in Lichtempfindliche Proteine, die durch zeitaufgelöste Step-Scan Fourier-Transformations-Infrarot-Spektroskopie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Dynamik der Protonierung und der Bestätigung von Änderungen zweier lichtempfindlicher Membranproteine mit Hilfe der zeitaufgelösten STEP-Scan-FTIR-Spektroskopie-Oskopie zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein hydratisierter Proteinfilm gebildet wird, dessen Infrarotabsorption entweder in einer abgeschwächten Totalreflexionskonfiguration für Bakterien-Opsin oder in einer Transmissionskonfiguration für Kanal Rodin zwei untersucht wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Probe mit einem Nanosekunden-Laserblitz geeigneter Wellenlänge anzuregen, um eine photozyklische Reaktion im Protein zu initiieren, die zeitaufgelöste Änderungen in der Intensität des Infrarotlichts, das mit der Probe interagiert, erfasst.

Als nächstes wird der obige Vorgang an diskreten Positionen des beweglichen Spiegels eines Interferometers wiederholt, das die optische Wegdifferenz zwischen zwei geteilten Strahlen kontrolliert, bis ein vollständiges zeitaufgelöstes Interferogramm aufgezeichnet wird. Der letzte Schritt besteht darin, das zeitaufgelöste Interferogramm unter Verwendung der Fourier-Transformation und des Lambert-Beer-Gesetzes in ein zeitaufgelöstes IR-Differenzabsorptionsspektren umzuwandeln. Letztendlich wird die zeitliche Entwicklung von Bans, insbesondere im MI-Bereich und in den CO-Doppelbindungs-Carboxylregionen, untersucht, um die Dynamik von Bestätigungs- und Protonierungsänderungen im Protein zu erhalten.

Der Hauptvorteil der Technik gegenüber den meisten bestehenden experimentellen Methoden besteht darin, dass sie vorübergehende Protonierungsänderungen in Proteinen auflöst. Darüber hinaus geschieht dies auf der Mikro- und Millisekunden-Zeitskala, dem relevantesten Zeitbereich für die Untersuchung der Proteinfunktionalität. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen in der molekularen Biophysik und den Proteinwissenschaften zu beantworten, z. B. welche Rückstände das Protonat bildet und wann dies während des Funktionsmechanismus eines Proteins der Fall ist oder wann größere Veränderungen in Proteinen stattfinden.

Die Demonstration des Verfahrens wird von Victor Ria, einem wissenschaftlichen Mitarbeiter aus meinem Labor, durchgeführt. Erster Mount, die abgeschwächte Totalreflexion oder ein TR-Zubehör in den Probenraum des FTIR-Spektrometers. Messen Sie ein breites Energiespektrum bei vier inversen Zentimetern. Die Auflösung der sauberen Oberfläche des internen Reflexionselements durch konventionelle Rapid-Scan-FTIR-Spektroskopie bedeckt die Oberfläche des A TR mit 20 Mikrolitern des Puffers mit hoher Ionenstärke, der später zur Rehydrierung der Probe verwendet wird.

Messen Sie dann die IR-Absorption des Puffers. Entfernen Sie anschließend den Puffer und spülen Sie die Oberfläche mit Wasser ab, ohne sie zu berühren. Entfernen Sie die Restflüssigkeit durch einen intensiven Luftstrom, verteilen Sie etwa drei Mikroliter einer Proteinlösung von sechs Milligramm pro Milliliter des Bakteriums Rodin in einer violetten Membran auf der Oberfläche.

Trocknen Sie die Proteinsuspension unter einem sanften Strom trockener Luft, bis ein Film entsteht. Messen Sie dann das Absorptionsspektrum des Trockenfilms. Fügen Sie anschließend vorsichtig 20 bis 40 Mikroliter des Puffers mit hoher Ionenstärke hinzu, um den Trockenfilm zu rehydrieren.

Decken Sie den A TR-Halter mit einem Deckel ab, um Wasserverdunstung zu verhindern, Messung und Absorptionsspektrum. Schätzen Sie den Prozentsatz der Probe, die nach der Rehydrierung des Films in der Nähe der Oberfläche verbleibt, indem das Absorptionsspektrum des Puffers subtrahiert wird. An dieser Stelle werden 10 Mikroliter Kanal-Opsin zwei in Dezid gelöstes Molekül in einem Puffer mit niedriger Ionenstärke in der Mitte eines Bariumfluoridfensters mit einem Durchmesser von 20 Millimetern zugegeben.

Verteilen Sie die Lösung mit Hilfe der Mikropipettenspitze auf einen Durchmesser von sechs bis acht Millimetern mit einem sanften Strom aus trockener Luft, warmem, homogenem Film, dessen Durchmesser in etwa der Größe des IR-Strahls an der größten Öffnung entspricht. Verwenden Sie als Nächstes einen flachen Silikon-O-Ring mit einer Dicke von einem Millimeter. Hydratisieren Sie den Film, indem Sie drei bis fünf Mikroliter einer Mischung aus Glycerin und Wasser hinzufügen, die in drei bis fünf Tropfen um den Trockenfilm verteilt ist, und schließen Sie ihn mit einem zweiten Fenster fest.

Setzen Sie die Bariumfluorid-Sandwichfenster in eine Halterung ein. Platzieren Sie dann den Halter in das Probenfach. Messen Sie ein Absorptionsspektrum.

Vergewissern Sie sich, dass die maximale Absorption in der Amid-Eins-Region im Bereich von 0,6 bis 1,0 für die A-TR-Konfiguration liegt. Verwenden Sie eine optische Faser, die auf dem A TR-Deckel platziert ist, um den Laser mit der Probe zu koppeln. Stellen Sie die Energiedichte des Lasers an der Probe auf zwei bis drei Millijoule pro Quadratzentimeter pro Puls ein.

Verwenden Sie mit einem Leistungsmesser oder den Transmissionsexperimenten Spiegel, um den Laser zur Probe zu bringen, und bei Bedarf Linsen, um den Laserstrahl entweder zu sammeln oder auf einen Durchmesser leicht über der Probenfilmgröße abzulenken. Synchronisieren Sie den Laserpuls mit der Datenaufzeichnung über den Q-Schalter. Synchronisieren Sie den TTL-Impuls der Elektronik des Neodym-Dope-Atrium-Aluminium-Granat-Lasers, um den Analog-Digital-Wandler des Spektrometers auszulösen.

Stellen Sie die Anregungsrate des Lasers so ein, dass die Zeit aufgelöst wird. Stufenscan-Messungen im inversen Zentimeter-Spektralbereich von 1800 bis 850 Zentimetern. Platzieren Sie einen optischen Tiefpassfilter in dem Strahlengang, der oberhalb von 1.950 inversen Zentimetern undurchsichtig ist und eine gute Transmission von weniger als 1800 inversen Zentimetern aufweist.

Wechseln Sie dann den Detektor vom AC- in den DC-gekoppelten Modus. Bringen Sie an dieser Stelle den Gleichstrompegel des INTERFEROGRAMMS auf Null, indem Sie eine Stromvorspannung an den Detektor anlegen. Stellen Sie die elektronische Verstärkung neu ein, um den Dynamikbereich des Analog-Digital-Wandlers besser zu nutzen.

Starten Sie anschließend das Stufenscan-Menü des FTIR-Spektrometers. Legen Sie die spektrale Zielbandbreite für die Step-Scan-Messung auf ein Achtel der Wellenzahl des Helium-Neon-Lasers fest. Stellen Sie die spektrale und Phasenauflösung auf acht inverse Zentimeter bzw. 64 inverse Zentimeter ein.

Wählen Sie eine Appe-Funktion aus. Stellen Sie dann den INTERFEROGRAMM-Erfassungsmodus auf einseitig vorwärts ein. Stellen Sie die Abtastrate des Analog-Digital-Wandlers auf die höchste im Spektrometer verfügbare Rate ein.

Legen Sie den Auslöser für das Experiment auf extern fest. Legen Sie dann die Anzahl der aufzuzeichnenden linear verteilten Datenpunkte fest, einschließlich 100 Pret-Triggerpunkten. Stellen Sie als nächstes die Anzahl der Co-Editionen oder die Anzahl der Mittelwerte der Photoreaktion pro Spiegelposition ein und starten Sie das Experiment.

Wiederholen Sie schließlich das Experiment 10 Mal für Bakterien, Redsin und 35 Mal auf drei verschiedenen Probenfilmen für den Kanal Redsin zwei, um ungefähr 200 Co-Zugaben pro Spiegelposition zu haben. Charakteristische Verbote von Peptidbindungs-Amit-Vibrationen sind im Bakterien-Redsin-Trockenschaumabsorptionsspektrum unterscheidbar. Bei der Verwendung von Puffern mit geringer Ionenstärke dehnt sich der Film übermäßig aus und reduziert die Menge an Protein, die vom evaneszenten Feld untersucht wird. Die genaue Abhängigkeit zwischen der Filmquellung und der Ionenstärke des Puffers hängt unter anderem von der Art der Lipide ab.

Die Schwellung des Films nach der Hydratation erfordert Zeit, um eine Stabilisierung für Bakterien der Dosis zu erreichen. In der violetten Membran ist der Prozess monoexponentiell mit einer Zeitkonstante von 12 Minuten. Ein 3D-Diagramm aus einem typischen zeitaufgelösten Stufenscan, FDIR-Experiment an Bakterien.

Redsin ist hier zu sehen. Spektren können zu bestimmten Zeitpunkten extrahiert werden. Zum Beispiel, wenn man davon ausgeht, dass Zwischenzustände im Photozyklus des Bakteriums ihre höchste Population erreichen.

Im Bakterienstäbchen Dossin ändert sich die Zykluszeit der Absorptionsspuren bei 1.762 inversen Zentimetern. Berichte über die Protonierungsdeprotonierungsdynamik von Aspartat 85 und bei 1.741 inversen Zentimetern über Änderungen der Wasserstoffbrückenbindung und die Deprotonierungsrepronationsdynamik von Asparaginsäure.96. Die Zeitkurven liegen bei 1.670 und 1.555 inversen Zentimetern.

Bericht über Änderungen der Schwingungen von MI eins und zwei, die beide empfindlich auf die Bestätigung des Peptidrückgrats reagieren. Nach dieser Methode können andere Techniken wie die ortsgerichtete Neurogenese oder die retinale Enzymspektroskopie durchgeführt werden, um bestimmten Resten im Protein nach seiner Entwicklung eine Schwingungsbande zuzuordnen. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der molekularen Biophysik den Weg, um den Funktionsmechanismus vieler verschiedener lichtgetriebener Proteine zu erforschen.