Name: In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-06T16:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 8 s
Description: Erfahren Sie die klonale Verfolgung hämatopoetischer Stammzellen in vivo durch konfokale und Multiphotonen-Mikroskopie mit fünf Fluoreszenzproteinen. Diese Methode ermöglicht 3D-Analysen der Knochenmarkarchitektur.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Intramural Research Program des National Heart, Lung, Blood Institute der National Institutes of Health. Wir danken Boris Fehse (Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Deutschland) für die Bereitstellung der fünf LeGO-Vektorplasmide; Christian A. Combs und Neal S. Young (NHLBI, NIH) für Diskussionen, Unterstützung und Ermutigung während dieser Studie und Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) für die Unterstützung bei Schwanzveneninjektionen.

Alle Mäuse wurden untergebracht und in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health behandelt, und schrieb sich in einer NHLBI Animal Care und Use Committee genehmigten Protokoll. Weiblich B6.SJL-Ptprc (d) Pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) und C57BL / 6 Mäuse, 6-12 Wochen alt, wurden als Spender und Empfänger verwendet sind. Eine Liste der Materialien, Reagenzien und Geräte ist in Tabelle 1 zur Verfügung gestellt. 1. Lego Transduktion von Maus HSPCs und Knochenmarktransplantation Führen Sie unten in einem zertifizierten Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) Gehäuse (Gewebekultur Haube) beschriebenen Verfahren. <ol><li> Produktion von LEGO Vektoren Encoding 5 Bilder pro Sekunde <ol><li> Verwenden Sie die lentiviralen &quot;Gene Ontology&quot; (LEGO) Vektorplasmiden, die jeweils eine andere FP Codierung von einem starken konstitutiven Promotor SFFV, darunter LEGO-Cer2 (Cerulean), Lego-G2 (EGFP), Lego-V2 (Venus), Lego-T2 (tdTomato) und Lego-C2 (mCherry) freundlicherweise von Dr. Boris Fehse (Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Deutschland) zur Verfügung gestellt; nun auch von Addgene 5-7 zur Verfügung. </li><li> LEGO Vektoren, Samen 5 x 10 6 Zellen 293T in 10 cm-Schalen (12 verwenden Gerichte für jeden Vektor) 24 h vor der Transfektion in 8 ml I10 Medien (IMDM mit 10% FCS und Glutamin / Penicillin / Streptomycin) zu erzeugen. </li><li> Transfektion der Zellen mit Calciumphosphat mit leicht modifizierten CAPHOS Kit Empfehlungen: <ol><li> Für jede Platte Mix 15 ug LEGO Vektor, 12 ug pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 ug Zurück-TAT und 1 pg pMD2.G-VSV-G-Plasmide in Gegenwart von 50 ul 2,5 M CaCl 2, und Wasser bis zu ergeben ein 500 ul Gesamtvolumen. </li><li> Niederschlag DNA-Plasmide mit 500 ul 2x HeBS (HEPES-gepufferte Salzlösung) und Inkubation für 20 min bei Raumtemperatur vor der Zugabe zu jeder Platte von 293T-Zellen. </li><li> Zellen inkubieren6 h bei 37 ° C 5% CO 2 Inkubator; entfernen Medien und fügen Sie frisches Kulturmedien 6 Stunden nach der Transfektion. </li></ol></li><li> Sammeln Kulturüberständen enthalten lentivirale Partikel von jeder Platte, täglich, für 3 Tage. Jeder Tag nach Überstand Sammlung frisch I10 Medien zu jeder Platte. <ol><li> Filtriert durch 0,22 um Poren, Pool und konzentrieren Stände durch Ultrazentrifugation auf einem SW28 Rotor für 2 h bei 71.900 xg und 4 ° C. </li><li> Resuspendieren der Überstände in 1 ml StemSpan Medien. Aliquotiert lentiviralen Bestände in 200 ul und bei -80 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Titration von Lentivirale Partikel Bestimmen Sie den Titer von LEGO Vektorpartikel in gesammelten Überstände über die Quantifizierung der Wandlereinheiten / ml mit NIH3T3-Zellen. Titer erlauben die Berechnung des Volumens eines jeden Vektors Stand benötigt, um in der gewünschten relativen Multiplizität der Infektion (MOI) führen zu VersuchszielZellen. <ol><li> Platte 5 x 10 4 NIH3T3 Zellen pro Vertiefung (Platte mit 12 Vertiefungen) in 2 ml Medium I10 einen Tag vor der Titration. </li><li> Bereiten 5-fach serielle Verdünnungen der Überstände in Vektor-I10 Medien mit Protaminsulfat ergänzt (4 mg / ml 1,000x). </li><li> Entfernen Sie die Medien aus den Zellen und ersetzen mit 500 ul Überstand Verdünnungen, die das Äquivalent von 2, 0,8, 0,32 und 0,128 ul konzentrierter Virus. </li><li> Bestimmen Sie die Nummer (No), die pro und zum Zeitpunkt der Transduktion Zellen, zählen ein Steuer gut. </li><li> 6 Stunden nach der Transduktion mit 2 ml I10 Medien und Inkubation für 3 Tage bei 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Ernte der Zellen aus jeder Vertiefung unter Verwendung von Trypsin-EDTA und bestimmt den Prozentsatz der fluoreszierenden Zellen (% FP) mittels Durchflusszytometrie. </li><li> Berechnung der Titer wie folgt, Mitteln der für jede Vertiefung (Verdünnung) erhaltenen Titer, was zu einem FP von 1% und 50%: Titer (Vektorpartikel / ml) = Neinx% FP / Volumen von Vektorüberstand (ml). Der Mittelwert der für jede Verdünnung erreicht, wenn der FP-% liegt zwischen 1 und 50% Titer. </li></ol></li><li> Mauszell Collection, Reinigung, Transduktion und Transplantation (in 1A schematisch dargestellt angepasst von Malide et al. 4). <ol><li> Opfern Spendermäusen von einem zugelassenen Verfahren. Ernte Knochenmark von vorderen und hinteren Gliedmaßen: sezieren humeri, Oberschenkelknochen und Schienbeine, alle Muskeln, Bänder und überschüssiges Gewebe von Knochen, über das Ende der einzelnen Knochen so nah wie möglich an der gemeinsamen geschnitten gründlich zu entfernen, und spülen Sie das Knochenmark aus der Knochen mit einem 27-0 G Nadel auf einer Spritze mit I10 Medien. </li><li> Pellet die Gesamtknochenmarkzellen für 10 min bei 500 × g, 4 ° C und Lyse roter Blutkörperchen zweimal mit 50 ml ACK-Puffer. Die Zellen in 10 ml Medium I10. </li><li> Reinige Linie negativ (Lin) Vorläuferzellen mit dem MACS Linie Verarmungs Kit gemäß einem modifizierten Satz Protocol: <ol><li> Verwenden Sie 30 ul Anti-Biotin-Mikrokugeln statt 10 ul / 10 7 Zellen; Führen Sie die Waschschritten mit I2 Medien (IMDM mit 2% FCS) anstelle von Puffer. </li><li> Legen Sie ein Waschschritt zwischen der Inkubation mit Biotin-Antikörper-Cocktail und der Inkubation mit Anti-Biotin-Mikrokugeln; und die Säule ins Gleichgewicht mit I10 anstelle von Puffer. </li></ol></li><li> Kultur Lin-Zellen für 48 h bei einer Ausgangsdichte von 5 x 10 5 Zellen / ml in StemSpan Medium mit 10 ng / ml Maus-IL-3, 100 ng / ml Maus-IL-11, 100 ng / ml humanem Flt-3 ergänzt Liganden, und 50 ng / ml Maus-Stammzellfaktor. </li><li> Übertragungs 1 bis 4 × 10 5 Zellen auf 12-Well-Platten mit RetroNectin beschichtet und Transduktion mit LEGO Überstände, die jeweils bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 6-7 bis 50% der Expressionseffizienz für jedes FP zu erzielen, in Gegenwart StemSpan Medien und Zytokine oben beschrieben und 4 g / ml Protaminsulfat. </li><li> Transduzieren Zellenmit jedem LEGO Vektor einzeln, wie in Schritt 1.3.5 beschrieben und mischen Zellen nach Transduktion (genannt Mix) oder Co-Zellen transduzieren mit allen 5 LEGO Vektor Stände gleichzeitig (als Co). Zellen zu entfernen, 24 Stunden später, einmal mit StemSpan Medien waschen ohne Zytokine und resuspendieren sie in StemSpan Medien ohne Zytokine für die Transplantation, oder übertragen Sie sie auf frisches Medium mit Zytokinen und Kultur für zusätzliche 96 h vor der konfokalen Mikroskopie und Durchflusszytometrie. <ol><li> Führen Knochenmarktransplantation durch Infusion transduziert Lin HSPCs via Schwanzveneninjektion mit 11 Gy Einzeldosis bestrahlt Empfänger (6-18 Stunden vor der Transplantation) Empfänger, in einem Volumen von 100 ul bei einer Zelldosis pro Maus entspricht 1 -4 x 10 5 Lin Zellen, die ursprünglich für die Transduktion plattiert. In jedem Experiment verpflanzen eine ganze Kohorte von Tieren, die mit der gleichen Population von transduzierten Spender BM-Zellen. </li><li> Für in-vitro-Charakterisierung der transduzierten HSPCs, Kultur werden die Zellen für weitere 4-5 Tage in StemSpan ergänzt mit Zytokinen und durch Durchflusszytometrie analysiert für Transduktionseffizienz und durch Mikroskopie für Farbvielfalt. <ol><li> Opfern einzelnen Mäusen und Abrufen von Geweben und Organen für die Bildgebung, zu verschiedenen Zeitpunkten bis zu 120 Tage nach der Transplantation. <ol><li> Spray mit Ethanol das Fell der Maus und die Haut einzuschneiden auf der Bauchseite zu vermeiden Haare Verbreitung. </li><li> Sezieren und Verbrauch nach Standardverfahren der Milz, poplitealen Lymphknoten, Lunge, Herz, Haut, Fettgewebe, Skelettmuskel, Niere, Leber, sowie der Kopf, den Zugang zu Schädeldecke. </li><li> Alternativ können Sie Schädeldecke oder ein Knochenfenster für die Live-Darstellung mehrfach im Laufe der Zeit 2,8,9 oder Bild oberflächlichen Organe gesetzt, wie die Haut und Lymphknoten im lebenden Tier. </li></ol></li><li> Zeigen einzelnen Organe in 35 mm-Nummer 0 Deckglas Kulturschalen in 50-10056; l PBS zur Abbildung sie intakt, ohne Schneiden, Fixierung oder Weiterverarbeitung wie in Schritt 2.5 beschrieben. </li><li> Für die volumetrische Bildgebung, halten die Organe in kaltem PBS bis zur Verwendung. Für Zeitraffer-Imaging gehen sofort auf die Abbildung Organe in DMEM, 10% FBS mit 20 mM HEPES bei 37 ° C </li></ol></li></ol></li></ol></li></ol> 2. Konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie und Bildanalyse <ol><li> Führen Mikroskopie mit einem Leica SP5 fünf Kanäle konfokale und Multiphotonen-System mit mehreren Leitungen Argon, Diode 561 nm, 594 nm HeNe und He-Ne-Laser mit 633 nm sichtbar ausgestattet. Verwenden Sie in 2-Photonen-Modus, einem gepulsten Femtosekunden-Ti: Saphir (Ti-Sa)-Laser, abstimmbaren zur Anregung von 680 bis 1.080 nm mit Dispersionskorrektur. Verwendung in Experimenten mit rotverschoben fps (tdTomato und mCherry-), einen optischen parametrischen Oszillator (OPO), um die Laserausgangswellenlängenbereich soweit 1,030-1,300 nm nacheinander oder gleichzeitig mit t erstrecken,er Ti-Sa-Lasers. </li><li> Bild verschiedenen Geweben mit einem HCX-IRAPO 25X-L / 0,95 NA Wassertauchziel (WD = 2,5 mm), ein HC-PLAPO-CS 20x / 0,70 NA Trockenobjektiv (WD = 0,6 mm) oder HC-PL-40X IRAPO /1.1 NA Wasserimmersionsobjektiv (WD = 0,6 mm). </li><li> Erhalten konfokalen Fluoreszenzspektren Sammeln Lambda Stacks (xyλ) des emittierten Lichts in 5 nm-Bandbreiten des sichtbaren Spektrums von KM-Zellen mit einem einzigen FP LEGO Vektor transduziert sowie der Kontrolle, nicht-transplantierten BM. <ol><li> Prozessbilder mit dem Leica LAS AF-Software v2.4.1 Referenzspektren aller 5 RP sowie der Autofluoreszenz (2A) zu erstellen. Verwendung der einzelnen FP-Spektren und den Unterschied in der Fluoreszenzhelligkeit (ausgedrückt als% der EGFP) von Cerulean (79%), Venus (156%), tdTomato (283%) und mCherry (47%) gesetzt 5 sequentielle Bildgebung Kanäle wie folgt: Cerulean (458/468 bis 482 nm), EGFP (488/496 bis 514 nm), Venus (514/523 bis 558 nm), tdTomato (561/579 bis 597 nm) und mCherry (594/618 bis 670 nm) ( <strong&gt; 2B). </li><li> Validieren genaue RP-Trennung, wie Zellen, die mit jedem einzelnen FP transduziert nur in dem entsprechenden Kanal von dem Rest (2C) sichtbar und vorhanden sind. Darüber hinaus schafft diese definierte Multi-Channel-Ansatz eine einzigartige 5-Kanäle &quot;Colorprint&quot;, die spätere Farbanalyse und klonalen Tracking ermöglicht und hat den Vorteil der Reduzierung Akquisitionszeiten im Vergleich zu spektralen Bildgebung. </li></ol></li><li> Getrennte Fluoreszenzemission, in der 2-Photonen-Modus, durch hocheffiziente individuelle dichroitische Spiegel und sammeln mit vier Kanälen nichtdescannten Detektor (NDD) wie folgt: ein dichroitischer Spiegel 568 nm, gefolgt von einem dichroitischen Spiegel bei 465 nm, gefolgt von 452/45 nm ein Emissionsfilter für SHG oder Autofluoreszenz und Cerulean, einem 525/40 nm Emissionsfilter für EGFP oder Venus, und einem 648 nm dichroitischen Spiegel und 620/60 nm Emissionsfilter für tdTomato oder mCherry. <ol><li> Strukturinformationen zu offenbaren durch Zwei-Photonen-Mikroskopie intrinsic Kontrastbildgebung von Gewebeautofluoreszenz von Elastin, NADH, (aufgeregt bei 780 nm) (wie oben beschrieben) und der zweiten Harmonischen erzeugte Signal (SHG) aus Knochen und fibrillärem Kollagen (aufgeregt bei 920 nm oder 860 nm in einem rückgestreuten gesammelt Richtung) 10,11. </li></ol></li><li> Für 3D-Volumendarstellung, sammeln Reihe von xyz Bilder (typischerweise 1 x 1 x 4 um 3 Voxel-Größe) entlang der z-Achse bei 5 um Intervallen über einen Bereich von Tiefen (150-300 um) der gesamten Knochenmark und anderen Geweben, über große Regionen mit der Kachel-Funktion der Software automatisch generiert abgesteppten Bände umfasst eine ganze Brustbein Fossa, ca. 2,5 x 1,2 mm 2 (xy) und 300 um (z) (den 2D-2E) und Movie-1. <ol><li> Bild Schädel direkt durch den Schädel Mark ohne Schneiden 2, 8. </li><li> § Brustbein entlang der Sagittalebene (Halbierung) und dannquer an der Verbindung zwischen 2 Brustbein Fosse und Bild durch die Schnittfläche 3,4,12 (Übersicht in Abbildung 1B aus Takaku angepasst et al 3). </li></ol></li><li> 4D für Zeitraffer-Bildgebung, legen Sie frisch ausgeschnittenen Kniekehle Lymphknoten, Milz, Lunge oder Schädelknochenproben uncut auf 35 mm Deckglas Nummer 0 Kulturschalen, in 50-100 ul DMEM, 10% FBS mit 20 mM HEPES bei 37 ° C und mit 2-Photonen-Ti-Sa-Anregung (860 nm) in Kombination mit konfokaler Anregung (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) und Leica Resonanzscanner (8000 Hz / sec), wobei Z-Stapel (~ 80 um) in 20 Sekunden-Intervallen für bis zu 1 Stunde. <ol><li> Für den gleichzeitigen Drei-Farben-2P Bildgebung Ti-Sa bei 860 nm abgestimmt gleichzeitig mit dem OPO-Laser (1.130 nm auf für tdTomato abgestimmt, oder 1.140 nm mCherry) (Film 2). </li></ol></li><li> Rekonstruktion und Analyse von 3D-und 4D-Volumes Zeitabläufe <ol><li> Verwenden Imaris x64 SoftwVersion 7.6 sind, oder alternative Software-Pakete, die gefliest-Stapel von RAW-Bildern in Volumen-gemacht (3D) zu transformieren Daten von fluoreszierenden Zellen im Knochenmark und verschiedenen Geweben und sie als 3D-Rotation Filme zu exportieren, wie zuvor beschrieben, 3,4 (Movie 1) Schritt-für-Schritt-Beispiel: <ol><li> In Imaris, Bild öffnen Sie die Z-Stapel; Wählen Sie &quot;übertreffen&quot;, um das 3D-Volumen-Visualisierung angezeigt werden. </li><li> Verwenden Sie &quot;navigieren&quot;, um die Lautstärke um 360 ° zu drehen. </li><li> Wählen Sie &quot;Animation&quot;, um eine Animation zu erstellen; Schlüsselbilder verwenden, um ausgewählte Ansichten, Zoom, Rotation des Volumens hinzuzufügen; Vorschau des Films, bearbeiten, wie notwendig und speichern Sie die Datei in einem gewünschten Filmformat (zB: avi, mov). </li></ol></li><li> Zur quantitativen Bewertung der 3D-Zell und Klon Frequenz, Positionen, Größen und Verteilung, Weiterverarbeitung der Z-Stapel mit den Imaris XT Module, die MATLAB-Anwendungen Führen Abstand meas integrierensungen (mit einem Abstand Transformationsalgorithmus) und Cluster-Analyse, wie zuvor beschrieben, 3,4. Verwandeln die Sequenzen von Bildstapeln im Laufe der Zeit in die Serien gerendert vierdimensionalen (4D)-Filme mit Imaris x64-Software, und verwenden Sie vor Ort und Oberflächenanalytik für halbautomatische Verfolgung von Zellbewegung in drei Dimensionen mit autoregressiven Bewegungsalgorithmen. </li><li> Führen multispektrale Analyse von Zellen wie folgt: Entpacken Sie die Multi-Color-markierten Flecken, indem alle 5 Kanäle durch den Kanal Arithmetik der Imaris XT in einen neuen Kanal; bestimmen, für alle Spots (Zellen) die mittlere Intensität Fluoreszenz in jeder der 5 Kanäle Komponente. Exportieren Sie die Werte in Excel-Software, um die Anzeige der Grafiken einzigartigen &quot;Colorprint&quot;, dh die relative% jeder FP in einzelnen Zelle (2E Grafik) zu zeichnen. Korrigieren Sie die Daten für die Gewebe Drift eingestellt, und berechnen Zellgeschwindigkeit und Verschiebung über die Zeit, Streckenlängen, Pfade und Wege; Exportwerte in Excel software um Graphen zu zeichnen. Montieren Verbund Figuren mit Adobe Photoshop CSS-5-Software. </li></ol></li></ol>

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<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+MYH9-related+disease+mutations+in+nonmuscle+myosin+II-A%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A.</a> Blood. 119, 238-250 (2012).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Wir beschreiben hier die Details eines leistungsfähigen Methodik vor kurzem für klonalen Zellverfolgung entwickelt und kombiniert die große Vielfalt, die durch kombinatorische Markierung mit 5FP-kodierenden LEGO Vektoren und Bildgebung mit Tandem-konfokale und 2-Photonen-Mikroskopie, um volumetrische und dynamische Bildgebung in lebenden Geweben zu erreichen erzeugt. Dies erweitert den Einsatz von FP-basierte Farbmarkierung durch Aufnahme konfokalen Spektral-Identität in 5 &quot;deutliche&quot; 8-Bit-Kanäle. Damit das r...

A correction was made to <a href="/video/51669">In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy</a>. At the time of publication, there was a typo in the discussion, which displayed an incorrect depth.
This was corrected in the discussion from:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 30 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.
to:
This approach combines the benefits of single-cell resolved high resolution imaging together with optical sectioning via confocal microscopy. Very large x - y (mm2) regions of the intact dense tissue volume can be examined by generating tiled-images. These high resolution images from optical sections can be used to computationally reconstruct (automatically and &#8220;on-the-fly&#8221;) complete 3D volumes of great complexity to depths of ~ 300 &#956;m, comprising ~ 20-30 layers of cells, vascular, bone and collagen structures. 3D reconstructions can be used for morphometric non-invasive quantitative analyses of biologic interest. One important caveat to point out is that large volume/high resolution imaging is time-consuming, for instance 1 hr per ~1 mm3 of tissue (one fossae of the sternum), therefore we recommend imaging no more than 1 mouse per experiment per day when bone marrow as well as different tissues need to be examined in detail.

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Erratum: In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Die Produktion von Blutzellen, genannt Hämatopoese durch eine kleine Population von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen (HSPCs) gehalten. Diese Zellen befinden sich im Knochenmark (BM) in einer komplexen Mikroumgebungs Nische, bestehend aus Osteoblasten, Stromazellen, Fettgewebe und Gefäßstrukturen, die alle in der Steuerung der Selbsterneuerung und Differenzierung 1,2 gebracht. Als intakte BM traditionell unzugänglich direkte Beobachtungen wurde, bleibt die Wechselwirkungen zwischen HSPC und ihre Mikroumgebung in vivo weitgehend charakterisiertes. Bisher haben wir eine Methodik, um die 3D-Architektur von intakten BM mit Hilfe der konfokalen Fluoreszenzmikroskopie und Reflexion 3 zu visualisieren. Wir gekennzeichnet Ausbau der EGFP-markierte HSPCs in der BM, aber die Verwendung von nur einer einzigen FP ausgeschlossen Analyse der Regeneration bei einer klonalen Ebene. Erst vor kurzem haben wir den Vorteil des lentiviralen Gene Ontology (Lego)-Vektoren, die konstitutiv fluorescent Proteine ​​(RP), um effizient zu markieren Zellen 4,5. Co-Transduktion HSPC mit 3 oder 5-Vektoren erzeugt eine vielfältige Palette von kombinatorischen Farben, so dass Tracking von mehreren Einzel HSPC Klonen. Markiert HSPC mit neuen Imaging-Technologie erlaubt, einzelne HSPC Homing und Transplantation in der BM von bestrahlten Mäusen Spuren kombiniert. Lego-Vektoren wurden verwendet, um HSPC mit 3 oder 5 verschiedene Rahmenprogramme (von Cerulean, eGFP, Venus, tdTomato und mCherry) markieren und folgen ihrer Transplantation im Laufe der Zeit in der BM durch konfokale und 2-Photonen-Mikroskopie, so dass klare Visualisierung von Knochen und anderem Matrixstrukturen und das Verhältnis von HSPC Klone Komponenten ihrer Mikroumgebung. HSPC wurden als die Linie negative Zellen aus C57BL / 6 Mäusen BM, der mit Lego-Vektoren transduziert gereinigt und durch Schwanzveneninjektion in Myelo-abgetragen kongenen Mäuse reinfundiert. Durch die Überwachung der große Mengen des Brustbeins BM Gewebe visualisiert wir endostalen Transplantation früh auftretendenBM Regeneration. Zellcluster mit verschiedenen Farbspektren erschien zunächst in der Nähe der Knochen und voran zentral über die Zeit. Interessant ist, dass nach mehr als 3 Wochen das Knochenmark bestand aus makroskopischen klonalen Clustern, was darauf hindeutet Ausbreitung der Blutbildung aus einzelnen HSPCs abgeleitet zusammenhängend im Knochenmark, sondern als umfassende Verbreitung HSPCs über die Blutbahn. Es war weniger Farbvielfalt am späten Zeitpunkten, was auf Schwierigkeiten bei der Wandlerlangfristige Bestandsauffüllung Zellen mit mehreren Vektoren. Zusätzlich gebildet HSPCs Cluster in der Milz, ein Organ auch die Hämatopoese bei Mäusen verantwortlich ist. HPSC abgeleiteten einzelnen Zellen konnten in Thymus als auch gelöst werden, Lymphknoten, Milz, Leber, Lunge, Herz, Haut, Skelettmuskel, Fettgewebe und Niere. Die 3D-Bilder können qualitativ und quantitativ bewertet werden, um die Verteilung der Zellen mit minimalen Störungen der Gewebe zu schätzen. Schließlich zeigen wird die Machbarkeit der Live-dynamische Untersuchungen in 4D durch die Kombination von Resonanz Scannen Multi und konfokaler Zeitraffer-Bildgebung. Diese Methodik ermöglicht nicht-invasive hohe Auflösung, mehrdimensionale Zell-Schicksal Rückverfolgung von spektral markierten Zellen Populationen in ihrer intakten 3D-Architektur und bietet ein leistungsfähiges Werkzeug in der Erforschung der Geweberegeneration und Pathologie.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Produktion von Viren</td></tr><tr><td>LeGO-Cer2</td><td>Addgen</td><td>27338</td><td>Expression von Cerulean</td></tr><tr><td>LeGO-G2</td><td>Addgen</td><td>25917</td><td>Expression von eGFP</td></tr><tr><td>LeGO-V2</td><td>Addgen</td><td>27340</td><td>Expression von Venus</td></tr><tr><td>LeGO-T2</td><td>Addgen</td><td>27342</td><td>Expression von tdTomate</td></tr><tr><td>LeGO-C2</td><td>Addgene</td><td>27339</td><td>Expression von mCherry</td></tr><tr><td>Calciumm Phosphate Transfection Kit</td><td>Sigma</td><td>CAPHOS-1KT</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturschale</td><td>BD Falcon</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco, Life Technology</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum Hitzeinaktiviertes</td><td>Sigma</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Pen Strep Glutamin</td><td>Gibco, Leben Technologie</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>SW28 Ultrazentrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>L60</td><td></td></tr><tr><td>Millex Spritzengetriebene Filtereinheit (0,22 & Mikro; m)</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SS</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Sammlung, Reinigung, Transduktion und Transplantation von Mauszellen</td></tr><tr><td>ACK Lysingpuffer</td><td>Quality Biologicals Inc.</td><td>118-156-101</td><td></td></tr><tr><td>Lineage Cell Depletion Kit (Maus)</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-090-858</td><td></td></tr><tr><td>LS Säulen + Röhrchen</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-041-306</td><td></td></tr><tr><td>Vorabscheidungsfilter (30 & Mikro; m)</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM-serumfreies Medium für die Kultivierung und Expansion von hämatopoetischen Zellen (500 ml)</td><td>StemCell Technologies Inc&nbsp;</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>Murine IL-11 CF</td><td>R & D Systems Inc</td><td>418-ML-025/CF</td><td>100 & Mikro; g/ml entspricht dem 1.000-fachen</td></tr><tr><td>rekombinanten murinen SCF</td><td>RDI Division von Fitzgerald Industries Intl&nbsp;</td><td>RDI-2503</td><td>100 & Mikro; g/ml ist 2.000x</td></tr><tr><td>rekombinantes murines IL-3</td><td>R & D Systems Inc</td><td>403-ML-050</td><td>20 & Mikro; g/ml ist 2.000x</td></tr><tr><td>FLT-3 Ligand</td><td>Miltenyi Biotec Inc. USA</td><td>130-096-480</td><td>100 &micro; g/ml entspricht 1.000 x</td></tr><tr><td>12-Well-Platten, Costar</td><td>Corning Inc.</td><td>3527</td><td></td></tr><tr><td>Retronectin</td><td>Takara Bio Inc</td><td>T100A/B</td><td>Resuspend bei 50 &; Mikro; g/ml</td></tr><tr><td>Protaminsulfat</td><td>Sigma</td><td>P-4020</td><td>4 & Mikro; g/ml ist 1.000x</td></tr><tr><td colspan="4">Konfokal- und Zwei-Photonen-Mikroskopie</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes</td><td>Cellgro, Mediatech Inc.</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Kulturschale mit Glasboden P35G-0-20-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Kulturschale mit Glasboden P35G-0-14-C</td><td>MatTek Corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek Deckglas mit Kammer #1 Deckglas aus Borosilikat; 4-Well-Thermo</td><td>Scientific</td><td>155383</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser 22 mm Nr. 2</td><td>Thomas Scientific</td><td>6662-Q55</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP5 AOBS Konfokal- und Multiphotonenmikroskop mit fünf Kanälen</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Vision II -TiSaph Laserbereich 680-1.080 nm</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Compact OPO Laserbereich 1.030-1.350 nm</td><td>Coherent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HCX-IRAPO-L 25X/0,95 NA Wassertauchobjektiv (WD=2,5 mm)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HC-PLAPO-CS 20X/0,70 NA Trockenobjektiv (WD=0,6 mm)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HC-PL-IRAPO 40X/1,1 NA Wasserimmersionsobjektiv (WD=0,6 mm)</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Imaris Software Version 7.6</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo klonale verfolgung von hämatopoetischen stamm-und vorläuferzellen durch fünf fluoreszierende proteine ​​mit hilfe der konfokalen und multiphotonen mikroskopie markierte

In vivo Clonal Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells Marked by Five Fluorescent Proteins using Confocal and Multiphoton Microscopy

Wir entwickelt und validiert eine Fluoreszenzmarkierung Methode zur Verfolgung von klonalen hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen (HSPCs) mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung in vivo Blutbildung zu studieren mit der Maus-Knochenmark-Transplantation experimentellen Modell. Genetische kombinatorische Markierung mit lentiviralen Vektoren fluoreszierende Proteine ​​(RP) kodiert, aktiviert das Zellschicksal Mapping durch moderne Mikroskopie. Vektoren fünf verschiedenen Rahmenprogrammen codiert Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato und mCherry wurden verwendet, um gleichzeitig zu transduzieren HSPCs, Schaffung einer vielfältigen Farbpalette markierten Zellen. Imaging mittels konfokaler / Zwei-Photonen-Mikroskopie Hybrid ermöglicht die gleichzeitige hochauflösende Beurteilung der eindeutig gekennzeichneten Zellen und deren Nachkommen in Verbindung mit strukturellen Komponenten der Gewebe. Volumenanalysen über große Flächen zeigen, dass spektral kodierten HSPC-abgeleiteten Zellen nicht-invasiv in verschiedenen intakten Geweben, einschließlich Knochenmark nachgewiesen werden (BM) Für ausgedehnte Zeiträume nach der Transplantation. Live-Studien die Kombination von Video-Multirate und konfokaler Zeitraffer-Bildgebung in 4D zeigen die Möglichkeit der dynamischen zellulären und klonalen Tracking in quantitativer Weise.

Whole-Mount-3D-konfokale / 2-Photonen-Mikroskopie Rekonstruktionen der sternalen Knochenmark Zeitverlauf zeigte die Transplantation und die Expansion von transplantierten Co-5 Bilder pro Sekunde in einem Muster mit bemerkenswerten Eigenschaften: Klone erschienen klar abgegrenzt, homogen mit breiten Palette von Farben und Fortschritt zunächst markiert über die Zeit, um vorzugsweise Zellen enthalten meist eine Farbe. Konfokalen Mikroskopie-Setup und repräsentative Beispiele der bildgebenden 5 Bilder pro Sekunde markierte ...

Kombinatorische 5 fluoreszierenden Proteinen markiert von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen in vivo ermöglicht klonalen Tracking über die konfokale und Zwei-Photonen-Mikroskopie, die einen Einblick in die Knochenmark blutbild Architektur während der Regeneration. Dieses Verfahren ermöglicht nicht-invasive Abbildung von Schicksal spektral kodierten HSPCs abgeleiteten Zellen in intaktem Gewebe für ausgedehnte Zeiträume nach der Transplantation.

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

We developed and validated a fluorescent marking methodology for clonal tracking of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) with high spatial and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, fluoreszenzmarkierte hämatopoetische Klone in lebendem Gewebe einschließlich des Knochenmarks mithilfe einer neuartigen Strategie der konfokalen und Zweiphotonen-Mikroskopie zu verfolgen. Dazu werden murine hämatopoetische Vorläufer- und Stammzellen isoliert und gemeinsam mit Lentiviren der Gen-Ontologie oder Lego-Vektoren, die fünf fluoreszierende Proteine kodieren – Ian, EGFP, Venus, TD-Tomato und mCherry –, transduziert. Die transduzierten Zellen werden anschließend in myeloablatierte Empfängermäuse transplantiert, und nach Zeiträumen von bis zu 120 Tagen werden Knochenmark und Organe von den Empfängermäusen entnommen, woraufhin eine kombinierte konfokale und Zweiphotonen-Mikroskopie durchgeführt wird.Die resultierenden Bilder werden in 3D rekonstruiert, um die Lokalisation fluoreszenzmarkierter transplantierten Klone und Zellen über die Zeit zu verfolgen. Dies erleichtert die Untersuchung der klonalen Evolution während der Hämatopoese sowie das Schicksal von Knochenmark-abstammenden Zellen in anderen Organen. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber der physischen Schnitttechnik von Geweben liegt darin, dass sie die Vorteile der hochauflösenden Bildgebung mit der optischen Schichtung mittels konfokaler Mikroskopie und der Visualisierung struktureller Komponenten mittels zweifacher Auflichtmikroskopie kombiniert.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Hämatologie beantworten, beispielsweise die räumliche und zeitliche klonale Analyse der Hämatopoese während der Knochenmarkregeneration ab dem frühen Engraftment mit geografischer Beibehaltung expandierender Klone über die Zeit hinweg. Es können sehr große Volumina intakten, dichten Gewebes untersucht werden. Zum Beispiel wurden etwa 3000 Bilder rechnergestützt rekonstruiert, um farbmarkierte Klone in einem sternalem Fettgewebe sichtbar zu machen. Obwohl diese Methode Einblicke in die klonale Architektur bei normaler und gestörter Hämatopoese ermöglichen kann, ist sie auch auf die Untersuchung der Organregeneration, immunologischer Reaktionen oder Tumor-Metastasierungsmuster anwendbar.Bei diesem Verfahren enthalten lentivirale Gen-Ontologie- oder Lego-Vektoren die Gene für fünf fluoreszierende Proteine: Ian EGFP, Venus, TD-Tomato und M-Cherry. Jedes fluoreszierende Protein wird von einem starken, konstitutiven Promotor des Spleen- focus-bildenden Virus (SFFV) exprimiert. Nach der Herstellung der Lego-Vektoren, die die fluoreszierenden Proteine kodieren, der Titration der viralen Partikel und der Entnahme des Knochenmarks aus den vorderen und hinteren Gliedmaßen von geopferten Spendern, erfolgt die Isolierung aus Humern, Femuren und Tibien.Entfernen Sie mit einem Skalpell gründlich alle Muskelbänder und überschüssiges Gewebe von den Knochen. Schneiden Sie anschließend an jedem Knochenende so nah wie möglich an das Gelenk heran. Spülen Sie mit einer 27-Gauge-Nadel an einer Spritze, die I 10 Medium enthält, das Knochenmark aus und sammeln Sie es in einem 50-Milliliter-Konisch-Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie bei 500 ×g und vier Grad Celsius, um die Zellen zu pelletieren.Nach dem Verwerfen des Überstandes, um die roten Zellen zu lysieren, 50 Milliliter eines CK-Puffers hinzufügen, erneut zentrifugieren und dann den Überstand verwerfen. Diesen Schritt nach dem Verwerfen des zweiten Überstandes wiederholen. Die Zellen in 10 Milliliter I 10 Medium resuspendieren. Anschließend einen Max-Lineage-Depletion-Kit verwenden, um liniegnegative Vorläuferzellen gemäß dem im beigefügten Dokument beschriebenen modifizierten Kit-Protokoll zu reinigen.Sobald die linienegativen Zellen gereinigt wurden, pipettieren Sie sie in einen T-75-Flasche mit einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen pro Milliliter in StemSpan-Medium, ergänzt mit murinem IL-3, murinem IL-11, humanem FL-3-Ligand und murinem Stem Cell Factor, und inkubieren Sie bei 37 °C und 5 % CO₂ für 48 Stunden. Nach zwei Tagen lösen Sie die Zellen mit einem Zellabstreifer auf und überführen Sie 1–4 × 10⁵ Zellen pro Vertiefung in eine 12-Loch-Platte. Geben Sie Vektoren mit einem MOI von 6–7 jeweils in StemSpan-Medium mit Zytokinen und 4 µg/mL Protaminsulfat zu den Zellen.Um das Gesamtvolumen in jedem Well auf einen Milliliter aufzufüllen, bereiten Sie sicherheitshalber eine einzelne Farbkontrolle für jedes fluoreszierende Protein vor. Nach 24 Stunden lösen Sie die Zellen mit einem Abstreifer auf und überführen Sie sie in ein fünf Milliliter fassendes Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie anschließend und resuspendieren Sie die Zellen in Stammzell-Medium ohne Zytokine; zentrifugieren Sie erneut und resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikroliter Stammzell-Medium ohne Zytokine pro Injektion oder für die konfokale Mikroskopie oder Durchflusszytometrie.Überführen Sie sie in 12-Well-Platten mit frischem Medium mit Zytokinen und kultivieren Sie sie weitere 96 Stunden. Bereiten Sie die Knochenmarktransplantation vor, indem Sie bestrahlte Empfängermäuse in einen Käfig unter eine Wärmelampe stellen, während sich die Tiere erwärmen. Bereiten Sie Spritzen zur Injektion vor, mit jeweils ein- bis viermal 10 hoch 5 linien-negativen Zellen in 100 Mikroliter StemSpan pro Maus.Bereiten Sie eine Spritze pro Maus vor. Wenn die Schwanzvenen erweitert sind, können die Mäuse injiziert werden. Legen Sie die zu injizierende Maus in eine Mausehalterung und desinfizieren Sie den Schwanz mit einem in 70 % Ethanol getränkten Tupfer.Dieser Schritt ermöglicht zudem eine bessere Visualisierung der Schwanzvene. Injizieren Sie anschließend die Zellen in die Schwanzvene. Transplantieren Sie eine gesamte Kohorte von Tieren mit derselben Population transduzierter donorer Knochenmarkzellen zu verschiedenen Zeitpunkten bis zu 120 Tagen nach der Transplantation.Entnehmen Sie die Gewebe und Organe zur intakten Bildgebung ohne Schnitt. Legen Sie einzelne Organe in 35 Millimeter große Kulturgeschirre mit Deckglas Nummer null in 50 bis 100 Mikroliter kalter PBS für die Zeitrafferaufnahme.Platzieren Sie die Organe in DMEM mit 10 % FBS, das 20 Millimolar HEPES enth&auml;lt, bei 37 Grad Celsius und nehmen Sie sofort eine Bildaufnahme vor. Hier erfolgt die Mikroskopie mit einem invertierten Leica SP f&uuml;nf, einem f&uuml;nffarbigen konfokalen und Multiphotonensystem, das mit mehrzeiligen Argon-Diodenlasern sowie sichtbaren Lasern mit 561 Nanometer, Helium-Neon mit 594 Nanometer und Helium-Neon mit 633 Nanometer ausgestattet ist. Platzieren Sie eine der einzelnen, mit Lego transduzierten Proben auf dem Mikroskoptisch und fokussieren Sie.Sammeln Sie Lambda-Bildstapel in Bandbreitenintervallen von fünf Nanometern über das gesamte Lichtspektrum. Wählen Sie anschließend mithilfe der Software einen interessierenden Bereich im Bild aus und betrachten Sie das Histogramm des Referenzspektrums. Speichern Sie diese Daten.Wiederholen Sie diesen Vorgang anschließend für jedes fluoreszierende Protein im Experiment. Verwenden Sie danach die von einzelnen fluoreszierenden Proteinen gesammelten Spektren, um die Bandbreiten im Kanalmodus einzustellen. Klicken Sie hierzu für jeden Kanal auf den schwarzen Schieberegler und geben Sie die zu verwendende Bandbreite ein.Die gewählte Bandbreite sollte den Spitzenbereich des Anregungsspektrums jedes fluoreszierenden Proteins abdecken, wobei sichergestellt werden muss, dass keine Überlappung zwischen den fluoreszierenden Kanälen auftritt. Stellen Sie die Verstärkung und den Offset für jeden Detektor so ein, dass der Dynamikbereich des Probenausgangs auf einem nachweisbaren Niveau liegt, zwischen den fluoreszierenden Proteinen vergleichbar ist und keine Sättigung auftritt. Beispielsweise ist das M-Cherry-Protein etwa halb so hell wie EGFP, daher sollten Verstärkung und Offset so angepasst werden, dass beide eine ähnliche Dynamik aufweisen.Schließlich erfassen Sie im Kanalmodus ein Bild jeder Einzelfarben-Kontrollprobe mit allen fünf Kanälen und prüfen Sie, ob jedes fluoreszierende Protein nur im entsprechenden Kanal sichtbar ist und in den übrigen Kanälen fehlt. Sobald die Spektren aller Kanäle validiert wurden, speichern Sie die Einstellungen. Diese können in zukünftigen Experimenten, die dieselben fluoreszierenden Proteine und Gewebeproben verwenden, importiert und wiederverwendet werden.Hier wird die kombinierte konfokale und Zweiphotonen-Mikroskopie an Mark aus dem Brustbein demonstriert, das mit einem Skalpell und einer Pinzette gewonnen wird, indem das Brustbein entlang der Sagittalebene geschnitten wird. Anschließend führen Sie einen Querschnitt an der Verbindung zwischen zwei sterbralen Fossae durch. Legen Sie die Knochen mit der Schnittfläche nach unten in eine 35-Millimeter-Kulturschale mit Deckglas Nr. 0, die 50 bis 100 Mikroliter kalte PBS enthält. Die Bildgebung erfolgt durch die Schnittfläche.Überprüfen Sie die Position der Knochen unter einem Auflichtmikroskop. Positionieren Sie die Probe auf dem Mikroskoptisch. Stellen Sie dann die Bildgebungssoftware so ein, dass sie nacheinander das Zwei-Photonen-Signal mit dem durch zweite Harmonische erzeugten Signal erfasst.Danach f&uuml;nf Farben-Konfokal-Anregung. Legen Sie die Grenzen des Zack-Erfassungsbereichs mit einer Schrittgr&ouml;&szlig;e von f&uuml;nf Mikrometern &uuml;ber 150 bis 300 Mikrometer fest. Verwenden Sie die Kachel-Funktion, um der Software anzuweisen, automatisch zusammengesetzte Volumen zu erzeugen, die die gesamte Sternum-Fossa umfassen, etwa 2,5 mal 1,2 Quadratmillimeter in der XY-Richtung.Starten Sie die Aufnahme, um nacheinander X-, Y- und Z-Bilder in allen fünf Kanälen sowie Zwei-Photonen-Mikroskopie mit durch zweite Harmonische erzeugtem Signal von Knochen und faserförmigem Kollagen für eine vierdimensionale zeitaufgelöste Bildgebung zu sammeln. Legen Sie frisch exzidierte, ungeschnittene Proben von poplitealen Lymphknoten, Milz, Lunge oder kalvarialem Knochen auf 35-Millimeter-Kulturdischen mit Deckglas Nummer null. Bedecken Sie die Proben mit 50 bis 100 Mikrolitern DMEM, das 10 % FBS und 20 Millimolar HEPES enthält, und halten Sie sie bei 37 Grad Celsius.Platzieren Sie die Probe auf dem beheizten Mikroskopobjektträger. Schalten Sie dann in der Software die Aufnahmeparameter so, dass eine Zwei-Photonen-Anregung mit Titan-Saphir-Laser bei 860 Nanometern in Kombination mit konfokaler Anregung und dem Leica-Resonanzscanner bei 8.000 Hertz pro Sekunde verwendet wird. Nehmen Sie Z-Stapel mit 80 Mikrometern Dicke in 22-er Intervallen bis zu einer Stunde lang auf, um simultane Dreifarb-Zwei-Photonen-Bildgebung durchzuführen, und weisen Sie die Software an, den Titan-Saphir-Laser bei 860 Nanometern gleichzeitig mit dem OPO-Laser bei 1.130 Nanometern für TD-Tomato oder bei 1.140 Nanometern für M-Cherry zu verwenden.Starten Sie abschließend die Aufnahme, um vier D-Bilder zu erfassen. Wie zuvor, sobald alle Bilder gesammelt wurden, führen Sie die 3D- und 4D-Rekonstruktion sowie die Analyse mit der Amer-64-Bit-Version oder einer ähnlichen Software in der Software durch. Öffnen Sie das Zack-Bild und wählen Sie „Surpass“, um den 3D-Volumenvisualisierer anzuzeigen.Danach Navigation verwenden, um das Volumen um 360 Grad zu drehen. Anschließend Animation auswählen. Mit Schlüsselbildern ausgewählte Ansichten, Zoomstufen und Drehungen des Volumens hinzufügen.Sehen Sie sich den Film vorab an und bearbeiten Sie ihn bei Bedarf. Speichern Sie die Datei abschließend in einem gewünschten Filmformat, um die klonale Entwicklung von fluoreszenzmarkierten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen nachzuverfolgen. Spendezellen, die gleichzeitig mit fünf verschiedenen Lego-Vektoren transduziert wurden, wurden in eine Empfängermaus transplantiert, und das Sternummark wurde wie in diesem Video beschrieben abgebildet und analysiert.Vier Tage nach der Transplantation waren Cluster von Zellen, die in einer Vielzahl von Farben markiert waren, in unmittelbarer Nähe zur Knochenkante sichtbar, die in Weiß dargestellt ist. Am Tag 31 hatte sich ein großer Klon mit einer einzigartigen grün-gelben Farbe so ausgedehnt, dass er die gesamte Fossa, wie in den überlagerten sowie in den Einzelkanal-Bildern veranschaulicht, vollständig besetzte. Die FPS-Inhaltsanalyse zeigte eine homogene Markierung durch zwei FPS-Varianten, EGFP und Venus.Dieses 3D-Rekonstruktionsvideo zeigt die räumliche Architektur der markierten Klone, die im Brustbein eingekapselt sind. Dieses Bild zeigt ein Beispiel für aus dem Knochenmark stammende Zellen im poplitealen Lymphknoten 120 Tage nach der Transplantation. Verstreute Zellen sind hauptsächlich gelb und rot markiert und peripher von Kollagenfasern umgeben, die in Weiß dargestellt sind, im Herzen von der epikardialen Seite aus betrachtet.Zahlreiche einzelne Zellen sind zwischen den Kardiomyozyten sichtbar, die in Weiß dargestellt werden und deren Zweiphoton-Autofluoreszenz bei 780 Nanometern visualisiert wird. Sobald die Methode beherrscht ist, kann sie innerhalb mehrerer Tage durchgeführt werden, sofern sie ordnungsgemäß angewendet wird, nachdem sie entwickelt wurde. Diese Technik ebnete den Weg für Forscher im Bereich der Organregeneration und -entwicklung sowie für die Erforschung räumlich-zeitlicher Anordnungen klonal komplexer zellulärer und struktureller Elemente mittels Mehrfarbenmarkierung sowie konfokaler und Zweiphotonen-Bildgebung.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Fluoreszenzmarkierungsmethode zur Verfolgung der klonalen Markierung hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen in lebenden Organen entwickelt.

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Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Labeling hESCs und hMSCs mit Eisenoxid-Nanopartikel für Non-Invasive in vivo-Tracking mit MR-Bildgebung

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Phänotypische Analyse und Isolierung von murinen hämatopoetischen Stammzellen und Lineage-festgelegte Vorläuferzellen

Quelle: Gómez-Villafuertes, R., et. Al., Live-Bildgebung mit anschließender Einzelzellverfolgung zur Überwachung der Zellbiologie und des Verlaufs der Abstammungslinie mehrerer neuronaler Populationen. J. Vis. Exp. (2017) Die Das Video zeigt den Prozess der Vorbereitung, Bildgebung und Verfolgung adulter neuronaler Stammzellen in Echtzeit, um zelluläres Verhalten, einschließlich Teilung und Differenzierung, zu untersuchen.

 Live-Bildgebung und Einzelzell-Tracking zur Überwachung der neuronalen Abstammung in adulten neuralen Stammzellen

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In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte (Video) | JoVE Journal

In vivo Klonale Verfolgung von hämatopoetischen Stamm-und Vorläuferzellen durch Fünf Fluoreszierende Proteine ​​mit Hilfe der konfokalen und Multiphotonen Mikroskopie Markierte

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