Name: Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-09T21:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Lernen Sie die Bewertung der antimykotischen Aktivität isolierter Alveolarmakrophagen mittels konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Phagozytose von Aspergillus-Sporen in vivo.

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Diese Arbeit wurde von der National Institute of Allergy and Infectious Disease Zuschuss R01AI079253 (BHS) unterstützt und von der National Cancer Institute Cancer Center Support Grants CA016056 nach Roswell Park Cancer Institute.

Alle Verfahren an Tieren in dieser Studie durchgeführt wurden, von der Animal Care und Verwenden Ausschuss am Roswell Park Cancer Institute genehmigt und mit allen Landes-, Bundes eingehalten werden, und National Institutes of Health Vorschriften. 1. In-vivo-Makrophagen-Labeling Hinweis: PHK26 ein lipophiler Farbstoff, der von phagozytierenden Zellen sowohl in Umlauf und in den Geweben, wenn sie intravenös (iv) verabreicht genommen wird. PKH26 wurde für in vivo-Markierung verwendet, um die Menge der nach der Ernte Manipulation der Makrophagen zu minimieren. PKH-26 hat den Vorteil, stabil zu der sich in alveolären Makrophagen während längerer Zeit. Warten Sie 10 Tage nach der Verabreichung ermöglicht Clearance von allen markierten Zellen aus dem Verkehr so dass nur Alveolarmakrophagen stabil beschriftet mit PKH26 8, 9. PKH26 ist ein roter Fluoreszenzfarbstoff, der Anregung (551 nm) und Emission (567 nm) hat Eigenschaften kompatibelmit Rhodamin oder Phycoerythrin Detektionssysteme. Jede Markierungsverfahren kann Artefakt vorstellen, einschließlich Verlust der Lebensfähigkeit. Da wir den gleichen Ansatz für die Kennzeichnung von Makrophagen in verschiedenen Maus-Genotypen (zB WT vs NADPH-Oxidase-Mangel), die Auswirkungen dieser Artefakte wäre Uniform. <ol><li> Verdünnen Stammlösung von PKH26 (1 x 10 -3 M in Ethanol) 1:5 in Verdünnungsmittel C durch den Hersteller zur Verfügung gestellt. </li><li> Last 100 ul verdünnt PKH26 in einem 1/2 ml Insulin-Spritze (29 G x 1/2 &quot;) für jede Maus. </li><li> Verabreichen Mäusen durch iv-Injektion (entweder Schwanzvene oder retro-Orbital) mindestens 10 Tage vor der Ernte. </li></ol> 2. Ernten Alveolarmakrophagen durch bronchoalveoläre Lavage (BAL) Die Anzahl der Mäuse, für ein Experiment können variieren. Eine typische Ausbeute aus einer nicht-stimulierten Maus ist im Bereich von 3-5 x 10 5 Alveolarmakrophagen, aber diese Zahl kann stark variieren based von Faktoren wie Größe des Maus Erfahrung der Person, die die Spülung und die Anzahl der Instillation von Spülflüssigkeit und das Volumen von Lungen entnommen. In diesem Protokoll Lungenspülung mit einem geschlossenen Brusthöhle, die zusammen mit 1 ml Spülungen wiederholt hilft, die Zellausbeute zu erhöhen geführt. <ol><li> Euthanize Maus durch Verabreichung einer tödlichen Dosis des Narkose Avertin (12,5 mg) intraperitoneal (ip) unter aseptischen Bedingungen, um die Lösung steril zu halten. </li><li> Spray Maus gründlich mit 70% igem Ethanol. </li><li> Entfernen der Haut aus dem kranialen Ende tierischen Aussetzen des Thorax (Fig. 1A). <ol><li> Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Haut direkt unterhalb des Zwerchfells. </li><li> Legen Sie den Finger in den Ausschnitt und ziehen die Haut von der Schädel Ende des Tieres (Abb. 1A). </li><li> Drücken Sie leicht auf den Kopf, Erweiterung der Bauchseite des Halses (Abb. 1A). </li></ol></li><li> Schneiden Sie ein kleines Loch in den Brustkorbin die rechte Seite des Brustkorbs, die Lungen entleeren und erlauben auch die Visualisierung der Lungen während der folgenden Schritte. </li><li> Suchen Sie die Luftröhre, und sorgfältig sezieren entfernt umgebende Gewebe. <ol><li> Entfernen Sie die Speicheldrüsen, Muskeln und M. sternohyoideus Kehlkopf, etc. mit einer gebogenen Pinzette. </li><li> Vorsichtig mit einem gebogenen Pinzette heben und schneiden mit einer Schere die für den Luftröhre (Adventitia) enthüllt die zugrunde liegenden beringt Knorpelstruktur dünne Gewebe. </li></ol></li><li> Legen Katheter in die Luftröhre. <ol><li> Mit einer gebogenen Pinzette, legen Sie einen Faden hinter (dorsal) der Luftröhre und ziehen einen 10 cm Länge durch die Öffnung. </li><li> Ab über dem Ring (die Verdickung der Knorpelring) vorsichtig führen einen 22-G-Katheter der Luftröhre nach unten zu stoppen, wo die Luftröhre verschwindet hinter dem Brustbein. </li><li> Fest binden Naht um Luftröhre und Katheter für eine eng anliegende Passform. Entfernen Sie die Nadel aus dem Katheter. </li></ol></li><li> Montieren 4-Wege-Hahn. <ol><li> Fülleneine 6-ml-Spritze mit DPBS, 1% FBS und heften sich an 4-Wege-Hahn, wie in 1B angegeben. </li><li> Bringen Sie eine leere 6-ml-Spritze an der angegebenen Position auf der 4-Wege-Hahn (Abbildung 1B). </li><li> Bringen offenen Port auf dem 4-Wege-Hahn zum Katheter (Abbildung 1B). Achten Sie darauf, Katheter aus der Luftröhre nicht zu lösen. </li></ol></li><li> Sammeln Spülflüssigkeit aus der Lunge. Hinweis: Die Ermittler können sich für geringere Volumina an Waschflüssigkeit verwenden, um die Möglichkeit einer Schädigung des Gewebes zu minimieren. Es ist wichtig, dass der gleiche Ansatz konsistent in allen Mausgruppen angewendet werden. <ol><li> Drehen Sie den Griff auf dem Hahn, so dass die leere Spritze geschlossen und langsam injizieren ~ 1 ml DPBS, 1% FBS Lungen aufzublasen. Beachten Lungen Inflation durch das Loch geschnitten in Schritt 2.4. </li><li> Achten Sie darauf, um die Lungen overinflate. </li><li> Drehen Sie den Griff auf dem Hahn, so dass die volle Spritze geschlossen ist, und ziehen Sie vorsichtig die Grippe<html> id aus der Lunge. </li><li> Beachten Sie die Lunge durch das Loch geschnitten in Schritt 1.4 entlüften. Der Katheter kann brauchen, um etwas vor oder zurück bewegt werden, um einen guten Zug zu bekommen. Besondere Vorsichtsmaßnahme, um den Katheter in die Luftröhre zu halten. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.8.1-2.8.4 5-6x bis alle DPBS, 1% FBS wurde injiziert und aus den Lungen entnommen. Hinweis: Erholung der Lungenflüssigkeit nicht 100% der injizierten Flüssigkeit. </li></ol></li><li> Leere Spritze mit Spülflüssigkeit in einem 50 ml konischen Röhrchen. Halten Zellen bei Raumtemperatur. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur und Überstand abgießen. Dies kann beispiels Zytokinanalyse falls gespeichert werden. </li><li> Die Zellen in 5.1 ml RPMI 1640 mit 10% FBS und zählen auf eine Zählkammer. In der nicht stimulierten Maus&gt; 95% der Zellen durch BAL geerntet werden erwartet, Makrophagen, die zytologisch bestätigt werden kann. </li></ol> 3. Kultivierung und Ernte Pilz &quot;&gt; Die in diesem Protokoll verwendet Aspergillus fumigatus drückt GFP in allen Phasen des Lebenszyklus:. Sporen, Keimlinge und Hyphen Diese Pilzstamm wurde von Dr. Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Kanada bereitgestellt. <ol><li> Platte Konidien von Aspergillus fumigatus, die GFP-Stamm auf Sabouraud-Hirn-Herz-Infusion (BHI)-Agar-Schrägkulturen mit Chloramphenicol (0,05 g / l) und Gentamycin (0,5 g / L). </li><li> Im Dunkeln lose für 7 bis 10 Tage bei Raumtemperatur verschlossen. </li><li> Ernte Konidien durch Waschen Schräg mit 10 ml 0,01% Tween 20 in DPBS. Leicht kratzen den Pilz mit der Stripette zu lockern. Spülen Sie mehrmals die Schräge, um die Ausbeute zu erhöhen. </li><li> Geben Konidiensuspension durch ein 100 &amp;mgr; m-Zellsieb in ein 50-ml-Erlen. </li><li> Pellet Konidien durch Zentrifugation bei 400 × g für 10 min. </li><li> Resuspendieren Konidien in 50 ml DPBS und zählen mit einer Zählkammer. </li><li> Zweimal waschen mit DPBS verdünnt und auf die gewünschte Konzentrationtration. </li></ol> 4. Pilz Herausforderung und konfokale Mikroskopie Um die Rolle von Makrophagen-NADPH-Oxidase der Wirtsabwehr zu untersuchen, wurde die Fähigkeit der isolierten alveolaren Makrophagen von Mäusen, die drei Genotypen, um das Wachstum von Aspergillus-Sporen phagozytiert Steuerung ausgewertet. Die in dieser Studie verwendeten Genotypen umfassen; 1) Wildtyp-Mäusen, 2) NCF1 * / * Mn-Mäuse mit einem natürlich vorkommenden NCF1 Mutation (NCF1 kodiert für p47 phox, eine erforderliche Komponente des Phagozyten NADPH-Oxidase) verlassen sie NADPH-Oxidase-Mangel, und 3) NCF1 * / * Mn + transgenen Mäusen (MN bezeichnet das Transgen beherbergen NCF1 Wildtyp unter der Kontrolle des humanen CD68-Promotor) wo NADPH-Oxidase-Aktivität wurde in der Monozyten / Makrophagen-Population 10, 11 wieder hergestellt ist. Konfokalen Mikroskopie ist für diesen Test geeignet sind aufgrund des Vorhandensund das Wachstum von nicht-phagozytierten Konidien auf den Folien. Das konfokale Mikroskop wird zur Visualisierung der einzelnen Ebenen in der Z-Achse zu ermöglichen, und ermöglichen die Differenzierung zwischen Pilz wächst um als innerhalb Makrophagen. Alle konfokale Bilder werden mit einem 63X Ölimmersion erworben. Z-Stapel sind mit einem elektronischen Zoom-Faktor von 2,5 erworben. Die Dicke einer Z-Stapel wird mit DAPI und Hellfeld-Bilder, um die Ober-und Unterseite des Feldes zu finden bestimmt. Z-Stapel reichte von 14 bis 24 um mit einzelnen Scheiben ~ 1 um dick. Zur Quantifizierung der Makrophagen, wurden einzelne Scans von 1X elektronische Zoom auf 10 Felder pro Genotyp durchgeführt. Intakten Makrophagen wurden basierend auf PKH26 und DAPI-Färbung der Membran und Kern bzw. identifiziert. Konidien wurden auf der Grundlage FITC-Expression und Hellfeldbild identifiziert. <ol><li> Bereiten Sie sterile Deckgläser und Teller <ol><li> Unter einem biologischen Sicherheitsschrank, genießen 22 x 22 mm Deckgläschen in 70% Ethanol für 5-10 min. </li><li> Spülen Deckgläser in sterilem PBS. </li><li> Mit einer sterilen Pinzette vorsichtig legen Sie eine einzelne Deckglas im Boden jeder Vertiefung einer sterilen einzeln verpackt 6-Well-Platte. </li></ol></li><li> Samen ~ 1 x 10 6 geerntet PKH26 markiert alveolären Makrophagen in 300 ul RPMI 1640 10% FBS auf jedes Deckglas. Die genaue Zahl kann je nach Erntemenge variieren. </li><li> Makrophagen zu ermöglichen, durch Inkubation bei 37 ° C mit 5% CO 2 über Nacht anhaften. </li><li> Am folgenden Morgen, fügen ~ 1 x 10 7 GFP-exprimierenden A. fumigatus Konidien in 100 &amp;mgr; l vorgewärmtes (37 º C) RPMI 1640, 10% FBS suspendiert. </li><li> Das Rückplatte auf 37 ° C-Inkubator mit 5% CO 2. </li><li> Zellen sollten für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C fixiert werden Bei 3, 7 und 14 Stunden fix Zellen durch Zugabe eines gleichen Volumens von 2% Formaldehyd in jede Vertiefung (Endkonzentration 1% Formaldehyd). Platz Platten für diefrühen Zeitpunkten bei 4 ° C über Nacht. Für die endgültige Zeitpunkt (14 h), fix Zellen bei Raumtemperatur für 2 Stunden. </li><li> Nach der Fixierung vorsichtig mit einer Pinzette entfernen, Deckgläser und spülen in DPBS. </li><li> Überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, indem der Rand des Deckglases auf einem gefalteten Kimwipe. </li><li> Bewerben 6 ul Fluoreszenz Eindeckmedium mit DAPI auf einen Glasobjektträger. </li><li> Legen Sie eine Kante des Deckglases auf dem Objektträger und sanft fallen mit der Zellseite nach unten in die Montage Medium. Montagemedium verteilt und bilden eine gleichmäßige Schicht unter der Deckglas. Es gibt keine Notwendigkeit, sich auf dem Deckglas gedrückt wird. </li><li> Siegel Kanten des Deckglases mit klarem Nagellack und an der Luft trocknen. </li><li> Shop vorbereitet Träger in einen Objektkasten (lichtgeschützt) bei Raumtemperatur, bis Sie sie durch konfokale Mikroskopie analysieren. </li></ol>

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Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Unter Verwendung dieses Ansatzes für die ex vivo Analyse der Antipilz-Aktivität der Makrophagen in vivo zusammen mit Pilz Herausforderung, die wir früher gezeigt, dass NADPH-Oxidase in Makrophagen spielen eine wichtige Rolle bei der Abwehr gegen A. 4 fumigatus. Die Verwendung von isolierten Alveolarmakrophagen ermöglicht es uns, auf ihre fungizide Aktivität in der Abwesenheit von anderen Immunzellen (zB rekrutierten Neutrophile), die gegen Aspergillus verteidigen <...

Alveolarmakrophagen sind die First-Line-Fresszellen, die eingeatmete Keime begegnen. Makrophagen erkennen Aspergillus Motive durch Erreger Erkennungsrezeptoren, aufnehmen und das Wachstum von inhalierten Sporen (Konidien) zu begrenzen, und Entzündungsreaktionen auslösen. Phagozyten NADPH-Oxidase wandelt molekularen Sauerstoff in Superoxid-Anion und stromabwärts reaktiven Sauerstoffzwischenprodukte (ROI). Chronische Granulomatose (CGD) ist eine erbliche Erkrankung der NADPH-Oxidase, die durch schwere bakterielle und Pilzinfektionen und durch übermäßige Entzündungsreaktionen. Obwohl NADPH-Oxidase ist für neutrophile Granulozyten vermittelten Wirtsabwehr werden 1 - 3, die Bedeutung der NADPH-Oxidase in Makrophagen nicht gut definiert ist. Frühere Studien haben gezeigt, dass Alveolarmakrophagen aufnehmen und töten Aspergillus-Sporen, während Neutrophilen hauptsächlich gezielt die Hyphen Stufe 5. Jedoch gibt es widersprüchliche Results in Bezug auf die Rolle der NADPH-Oxidase in Makrophagen bei der Kontrolle des Wachstums von A. fumigatus Sporen 6, 7. Das Ziel dieser Methode war, die spezifische Rolle der NADPH-Oxidase in Makrophagen bei der Vermittlung der Wirtsabwehr gegen A. abzugrenzen fumigatus Sporen. Wir fanden, dass NADPH-Oxidase in Alveolarmakrophagen steuert das Wachstum von phagozytierten A. fumigatus Sporen 4. Um am nächsten modellieren die Wirtsreaktion auf inhalierte Pilze, verwendeten wir Alveolarmakrophagen von BAL geerntet von nicht-stimulierten Mäusen unmittelbar nach der Tötung. Die Verwendung von isolierten alveolaren Makrophagen konnten wir auf ihre fungizide Aktivität in der Abwesenheit von anderen Immunzellen (zB rekrutierten Neutrophile), die gegen Aspergillus verteidigen in vivo zu konzentrieren. In diesem Verfahren wurden Alveolarmakrophagen in vivo vor gefärbt, um so zu ernten, um die Menge der nach der Ernte Manipulation zu minimieren. &lt;/ P&gt; Ein weiterer Vorteil dieses Protokolls ist die Verwendung eines GFP-exprimierenden A. fumigatus-Stamm. Dieser Pilz drückt GFP aus der Konidienstadium durch die Hyphen-Bühne und hat keine Notwendigkeit für eine weitere Färbung. Um Bilder mit mehr Details zu erhalten, entschieden wir uns für die konfokale Mikroskopie, die die Rekonstruktion der dreidimensionalen Strukturen der erhaltenen Bilder ermöglicht. Dreidimensionale Rekonstruktion die Möglichkeit gibt, zwischen Hyphen herum wachsen und nicht in oder durch einen Makrophagen zu differenzieren. Konidien können auch genau unterschieden als intrazelluläre gegenüber extrazellulären sein.

<table><tbody><tr><td>PKH26 Rot fluoreszierendes Zellvernetzer-Kit für die allgemeine Zellmembranmarkierung</td><td>Sigma</td><td>PKH26GL-1KT</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2 Tribromethanol</td><td>Sigma</td><td>T48402</td><td>Wird zur Herstellung von AverttinAnästhetikum</td></tr><tr><td>2-Methyl-2-butanol</td><td>Sigma</td><td>A-1685</td><td>Verwendet zur Herstellung von AvertinAnästhetikum</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039; s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (ohne Calcium und Magnesium)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma</td><td>A0171</td><td>Wird zur Herstellung von ACK-Erythrozyten-Lysepuffer</td></tr><tr><td>KHCO3</td><td>Sigma</td><td>P91444</td><td>Wird zur Herstellung von ACK-Erythrozyten-Lysepuffer</td></tr><tr><td>EDTA</td><td></td><td>Sigma E6758</td><td>Wird zur Herstellung von ACK-Erythrozyten-Lysepuffer</td></tr><tr><td>22 G x 1,00 Zoll i.v. Katheter</td><td>BD</td><td>381523</td><td>Insyte Autoguard Winged</td></tr><tr><td>Insulin Spritzen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 ml Spritzen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-Wege Absperrhahn</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-700-077</td><td></td></tr><tr><td>Nahtfaden</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml konische Zentrifugenröhrchen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mullschwämme (4 Zoll im Quadrat)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 mit L-Glutamin</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum-Hyklon</td><td></td><td>SH30396.03</td><td>hitzeinaktiviertes</td></tr><tr><td>Hema 3 Fleckenset</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-122-911</td><td></td></tr><tr><td>Cytoseal 60</td><td>Thermo Scientific</td><td>8310-4</td><td></td></tr><tr><td>Sabouraud Brain Heart Infusion Agar mit Chloramphenicol und Gentamicin Slants</td><td>BD</td><td>297252</td><td></td></tr><tr><td>Aspergillus fumigatous Stamm, der grün fluoreszierendes Protein</td><td></td><td></td> exprimiert<td>, bereitgestellt von Dr. Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Kanada</td></tr><tr><td>100 &mu; m Zellsiebe</td><td>BD Falcon</td><td>64753-00</td><td></td></tr><tr><td>Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zange</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biologische Sicherheitswerkbank Klasse II</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sorval ST40 Zentrifuge mit Ausschwingrotor</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DM1000 Lichtmikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cytospin 2 Zentrifuge</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-Inkubator</td><td></td><td></td><td>37 > C, 5%&nbsp; CO2</td></tr><tr><td>22 x 22 mm Mikro-Deckglas</td><td>VWR</td><td>48366-227</td><td>Glasdeckgläser</td></tr><tr><td>6-Well-Zellkulturplatten</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>10% neutral gepuffertes Formalin</td><td>VWR</td><td>BDH0502-1LP</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Leica TCS SP2 System mit Laserpunktscanner</td><td></td><td></td><td>Montiert auf dem DMIRE2-Fluoreszenzmikroskop</td></tr></tbody></table>

beurteilung der anti-pilz-aktivität von isolierten alveolarmakrophagen durch konfokale mikroskopie

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

Die Lunge ist eine Schnittstelle, wo Wirtszellen werden routinemäßig an Mikroben und mikrobielle Produkte ausgesetzt. Alveolarmakrophagen sind die First-Line-Fresszellen, die eingeatmeten Pilzen und anderen Mikroben zu begegnen. Makrophagen und anderen Immunzellen erkennen Aspergillus Motive durch Erreger Erkennungsrezeptoren und nachgeschalteten Entzündungsreaktionen auslösen. Die Phagozyten NADPH-Oxidase erzeugt reaktive Sauerstoff-Intermediate (ROIs) und ist entscheidend für die Immunabwehr. Obwohl NADPH-Oxidase ist für neutrophile Granulozyten vermittelten Wirtsabwehr werden 1 - 3, die Bedeutung der NADPH-Oxidase in Makrophagen nicht gut definiert ist. Das Ziel dieser Studie war es, die spezifische Rolle der NADPH-Oxidase in Makrophagen bei der Vermittlung der Immunabwehr gegen A. abzugrenzen fumigatus. Wir fanden, dass NADPH-Oxidase in Alveolarmakrophagen steuert das Wachstum von phagozytierten A. fumigatus Sporen 4. Hier beschreiben wir ein Verfahren für die Bewertung der Fähigkeit von Maus-alveolar Makrophagen (AMS), das Wachstum der Phagozytose Aspergillus-Sporen (Konidien) zu steuern. Alveoläre Makrophagen in vivo gefärbt und zehn Tage später aus Mäusen isoliert durch Lavage (BAL). Makrophagen werden auf Deckgläschen überzogen, dann mit dem grün fluoreszierenden Protein (GFP)-exprimierenden A. ausgesät fumigatus Sporen. Zu bestimmten Zeitpunkten wurden die Zellen fixiert und die Anzahl der intakten Makrophagen phagozytierten Sporen durch konfokale Mikroskopie untersucht.

<html> Sammeln Alveolarmakrophagen von BAL aus nicht-stimulierten Mäusen wird in einem&gt; 95% reine Population basierend auf Zytologie führen. Die 3 und 7 h (Abbildung 2) Zeitpunkten gehen der Hyphen-Phase des Pilzwachstum und damit für einen Vergleich der Effizienz der phagocytic Konidien unter Genotypen. Die 14 Stunden Zeitpunkt, wo Genotypen hinsichtlich der Fähigkeit, den Übergang von phagozytierten Konidien zum Gewebe-invasive Hyphen Stufe (Fig. 3) zu inhibieren, verglichen werden....

Ein Verfahren, um die Fähigkeit der isolierten Maus-Alveolarmakrophagen, um das Wachstum von phagozytierten Aspergillus-Sporen durch konfokale Mikroskopie Steuerung auszuwerten.

Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Fähigkeit von Makrophagen zum Kontrollieren des Wachstums von krypto fungalen Candida ex vivo zu vergleichen. Dies wird erreicht, indem die alveolären Makrophagen in vivo zunächst mit einem lipophilen Farbstoff PKH 26 markiert werden. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, alveoläre Makrophagen aus den infizierten Mäusen mittels Bronchoalveolärer Lavage zu gewinnen.Der dritte Schritt besteht darin, GFP-positive Pilzsporen zu kultivieren und zu sammeln. Die letzten Schritte beinhalten die Herausforderung von Makrophagen mit GFP-positiven Candida-Zellen und fixierten Zellen zu vorbestimmten Zeitpunkten. Letztendlich kann mittels konfokaler Mikroskopie bei minimaler ex vivo-Zellmanipulation die Fähigkeit alveolärer Makrophagen aufgezeigt werden, das Wachstum phagozytierter Keime zu kontrollieren.Sporen Zunächst den lipophilen Farbstoff P HK 26 mit Verdünnungsmittel C im Verhältnis 1 zu fünf verdünnen. Der Farbstoff wird von den FOC-sauren Zellen aufgenommen. 100 Mikroliter des verdünnten P HK 26 in eine 0,5-cc-Spritze geben und den Farbstoff retroorbital oder über die Schwanzvene intravenös injizieren.Schätzen Sie,

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier beschreiben wir Protokolle zum Ernten von murinen Alveolarmakrophagen, die ihren Sitz angeborenen Immunsystems Zellen in der Lunge und Prüfung ihrer Aktivierung in Reaktion auf Co-Kultur mit Polyanhydrid Nanopartikel.

Ernte Murine Alveolarmakrophagen und Auswerten zelluläre Aktivierung von Polyanhydrid Nanopartikel Induced

Quelle: Barbero, A. M., et.al. Fluoreszenztests zur Untersuchung der Wechselwirkung von Mycobacterium tuberculosis mit dem Immunrezeptor SLAMF1. J. Vis. Exp. ( (2025)Dieses Video demonstriert einen fluoreszenzbasierten Test zur Untersuchung der Wechselwirkung zwischen einem Makrophagerezeptor und Mycobacterium tuberculosis-Antigenen . Fluoreszierend markierte Antigene auf einem Deckzettel werden mit Makrophagen-Proteinextrakten inkubiert, vernetzt, mit Antikörpern markiert und durch...

Fluoreszenzbasierter Assay zur Untersuchung von Makrophagenrezeptor-Interaktionen mit bakteriellen Antigenen

Dieses Video zeigt die Bildgebung lebender Zellen zur Analyse der antimykotischen Aktivität in menschlichen Neutrophilen unter Verwendung von fluoreszierenden Aspergillus-Reporterkonidien. Zunächst werden sowohl rote als auch magentafarbene Fluoreszenz in Neutrophilen nachgewiesen, während die rote Fluoreszenz mit der Zeit abnimmt, was auf den Abbau von Konidien hinweist und die antimykotische Aktivität von Neutrophilen bestätigt.

Echtzeit-Bewertung der antimykotischen Aktivität primärer humaner Immunzellen

Live-cell Video Mikroskopie Pilzpathogenentwicklung Phagozytose

Hier zeigen wir, wie Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen in der Kultur verwendet werden. Diese Technik kann als Alternative zu CFU Aufzählung verwendet werden.

Verwendung Bildzytometrie zur Quantifizierung von pathogenen Pilzen in Verbindung mit Wirtszellen

Hier beschreiben wir ein Protokoll Anti - Pilz - Aktivität von primären humanen Immunzellen in Echtzeit zu bewerten unter Verwendung von fluoreszierendem Aspergillus Reportern Konidien in Verbindung mit Live-Zell - Videomikroskopie und Durchflusszytometrie. Erzeugten Daten geben einen Einblick in die Wirts zell- Aspergillus Wechselwirkungen wie fungizide Aktivität, Phagozytose, Zellmigration und Hemmung des Pilzwachstums.

Live-Imaging von Anti-Pilz-Aktivität von Human Primary Neutrophilen und Monozyten in Reaktion auf<em&gt; A. fumigatus</em

Diese Mitteilung beschreibt Methoden zur Isolierung und Kultur der alveolären Makrophagen aus Menschen und murinen Modellen zu Versuchszwecken.

Isolation und In-vitro- Kultur von murinen und menschlichen alveoläre Makrophagen

Wir beschreiben eine Methode zur Verarbeitung von bronchoalveolarer Spülflüssigkeit und abgestimmtem peripherem Blut von chronisch HIV-infizierten Personen auf antiretrovirale Therapie zur Beurteilung von lungenen HIV-Reservoirs. Diese Methoden führen zum Erwerb von hochreinen CD4-T-Zellen und Alveolar-Makrophagen, die anschließend zur Immunphenotypisierung und HIV-DNA/RNA-Quantifizierungen durch ultraempfindliche Polymerase-Kettenreaktion eingesetzt werden können.

Verarbeitung von Bronchoalveolar Lavage Fluid und Matched Blood für Alveolar Macrophage und CD4+ T-Zell Immunophenotypisierung und HIV Reservoir Assessment

Dieses Protokoll bietet eine schnelle und zuverlässige Methode zur quantitativen Messung der Phagozytose der Aspergillus fumigatus conidia durch menschliche primäre Phagozyten mittels Durchflusszytometrie und zur Unterscheidung der Phagozytose der Conidia von der bloßen Adhäsion zu Leukozyten.

Messung der Phagozytose von Aspergillus fumigatus Conidia durch menschliche Leukozyten mit Flow Cytometrie

Wir beschreiben die Methode zur quantitativen Analyse der Verteilung von Aspergillus fumigatus conidia (3 μm groß) in den Atemwegen von Mäusen. Die Methode kann auch für die Analyse von Mikropartikeln und Nanopartikelagglomeratverteilung in den Atemwegen in verschiedenen pathologischen Zustandsmodellen verwendet werden.

Konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie-basierte quantitative Analyse der Aspergillus fumigatus Conidia-Verteilung in der optisch geklärten Mauslunge

Die Technik der Phagozytose von Pilzkonidien durch Makrophagen wird häufig für Studien verwendet, die die Modulation der Immunantwort gegen Pilze untersuchen. Der Zweck dieses Manuskripts ist es, eine Methode zur Bewertung der Phagozytose- und Clearance-Fähigkeiten von mononuklearen Makrophagen aus humanem peripherem Blut vorzustellen, die mit Trichoderma stromaticum conidia stimuliert wurden.

Viabilitätstest von Trichoderma stromaticum-Konidien in mononuklear gewonnenen Makrophagen des menschlichen peripheren Blutes

Lernen Sie die Bewertung der antimykotischen Aktivität isolierter Alveolarmakrophagen mittels konfokaler Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Phagozytose von Aspergillus-Sporen in vivo.

Beurteilung der Anti-Pilz-Aktivität von isolierten Alveolarmakrophagen durch konfokale Mikroskopie

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