Name: Massively Parallel Reporter Assays in kultivierte Säugerzellen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-17T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 3 s
Description: Erfahren Sie, wie Massively Parallel Reporter Assays in kultivierten Säugerzellen tausende DNA-Sequenzen parallel auf genregulatorische Aktivität untersuchen. Diese Methode nutzt Reporter-Bibliotheken und Deep Sequencing für Hochdurchsatzanalysen.

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Diese Arbeit wurde von der National Human Genome Research Institute der National Institutes of Health unter Preis Anzahl R01HG006785 unterstützt.

1. Sequenz Design und Synthese <ol><li> Beginnen MPRA mit dem Design und der Synthese von Sequenzen, die Marktaktivität untersucht werden. Für die Kompatibilität mit dem pMPRA Vektor-Serie, entwerfen jede Sequenz benutzen die folgende Vorlage: 5&#39;-ACTGGCCGCTTCACTG- var -GGTACCTCTAGA- Tag -AGATCGGAAGAGCGTCG-3 &#39;, wo var bezeichnet die Sequenz zu untersuchenden und Tag bedeutet ein oder mehrere Tags identifizieren. </li><li> Die beiden variablen Regionen (var und Tag) werden durch ein Paar von KpnI (GGTACC) und XbaI (TCTAGA) Restriktionsstellen getrennt, um gerichtete Ligation eines Reportergens Fragment zwischen ihnen zu erleichtern. Zusätzlich werden zwei verschiedene SfiI (GGCCNNNNNGGCC) Seiten durch PCR zugesetzt werden, um gerichtete Ligation in die pMPRA Rückgrat zulassen. Die variablen Regionen dürfen nicht zusätzliche Kopien eines dieser Restriktionsstellen enthalten. Falls erforderlich, eine oder mehrere dieser Restriktionsenzyme ersetzt werden kann, Solange die Ersatz 1) ermöglichen effizientes Schneiden in der Nähe der Enden der DNA-Moleküle, und 2) nicht an anderer Stelle in der Vektorsequenz geschnitten. Siehe Diskussion für weitere Informationen. </li><li> Rufen Sie die in Tabelle 1 von einem kommerziellen Anbieter aufgelistet erforderlich Primer. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="381"><tbody><tr><td> MPRA_SfiI_F </td><td> GCTAAGGGCCTAACTGGCCGCTTCACTG </td></tr><tr><td> MPRA_SfiI_R </td><td> GTTTAAGGCCTCCGTGGCCGACGCTCTTC </td></tr><tr><td> TAGseq_P1 </td><td> AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACT CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT </td></tr><tr><td> TAGseq_P2 </td><td> CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT [index] GT GACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCGAGG </td></tr></tbody></table> Tabelle 1. Primer-Sequenzen. [Index] bezeichnet eine 6 bis 8 nt Index Sequenz für Multiplex-Sequenzierung verwendet. Erhalten mindestens 8 TagSeq-P2 Primer mit unterschiedlichen Indizes. Alleder Primer sollten durch HPLC oder PAGE gereinigt werden. <ol start="4"><li> Oligonukleotid-Bibliotheken können aus einer kommerziellen Lieferanten oder Kerneinrichtung erhalten werden, oder durch Verwendung eines programmierbaren Microarray-basierte Oligonucleotidsynthesizer wie vom Hersteller beschrieben erzeugt. Resuspendieren der OLS-Produkte in 100 ul TE 0,1 Puffer. </li><li> Führen Sie die Oligonukleotid-Bibliotheken auf einem 10% TBE-Harnstoff-Denaturierung Polyacrylamid-Gel. Legen Sie ca. 1 pmol pro Bahn und Fleck mit ssDNA empfindlichen Fluoreszenzfarbstoff, um ihre Qualität (2A) zu beurteilen. </li><li> Wenn eine diskrete Bande, die den Volllängen-Oligonukleotide können visualisiert werden (Abbildung 2A, Bahnen 1 und 2), die Verbrauchs den entsprechenden Acrylamid-Gel Slice und eluieren Oligonukleotide in 100 ul TE 0,1 über Nacht bei Raumtemperatur unter Schütteln. Andernfalls fahren Sie mit der RAW OLS Aufhängung. </li><li> Verstärken und fügen SfiI Schwänze mit dem Oligonukleotid-Bibliothek mit Hilfe Emulsions-PCR 9 </<html> sup&gt;. </li><li> Bis 50 ul PCR-Reaktionsgemischen, wie in Tabelle 2 beschrieben. Dann verbinden sich mit 300 ul Öl und Tensid-Mischung aus der Emulsion und Micellula DNA Purification Kit und Vortex für 5 min bei 4 ° C ist. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="368"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> 1x Volume (ul) </td></tr><tr><td> Herculase II Fusion DNA Polymerase </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> 5x Herculase II Reaktionspuffer </td><td> 10 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mM jeweils) </td><td> 1,25 </td></tr><tr><td> BSA (20 mg / ml) </td><td> 1,25 </td></tr><tr><td> Primer MPRA_SfiI_F (25 uM) </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> Primer MPRA_SfiI_R (25 uM) </td><td> 0,25 </td></tr><tr><td> OLS-Vorlage (1-10 attomol) </td><td> variiert </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 50 </td></tr></tbody></table>ve_content &quot;&gt; Tabelle 2. Emulsion PCR-Reaktionsmischung (Wasserphase). <ol start="9"><li> Verwenden Sie die Konzentration, die die maximale Ausbeute der Amplifikation Produkte gibt ohne das Auftreten von Artefakten (siehe Abschnitt 1.12). </li><li> Abgeben der resultierenden Emulsion in PCR-Röhrchen und führen 20 Zyklen PCR (2 min bei 95 ° C, 20 x [20 sec 95 ° C, 20 sec bei 55 ° C, 30 sec bei 72 ° C], 3 min bei 95 ° C). </li><li> Pool und brechen jede 350 ul Emulsion-PCR-Reaktion durch Zugabe von 1 ml Isobutanol und kurz vortexen und dann reinigen die Verstärkung Produkt mit einem DNA-Aufreinigung Spalte. </li><li> Führen Sie einen aliquoten auf einem 2% bzw. 4% Agarose-Gel, um artefaktfreie Verstärkung (2B) zu überprüfen. </li></ol><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig2highres.jpg" /> Figur 2: Herstellung von Oligonukleotid-Synthesebibliotheken. A) </sTrong&gt; Drei verschiedene rohe Oligonukleotid-Synthese-Bibliotheken (OLS) auf denaturierenden 10% TBE-Harnstoff-Polyacrylamid-Gelen laufen. Banden, die in voller Länge Oligonukleotide (*) visualisiert und aus Bibliotheken 1 ausgeschnitten werden und 2. Bibliothek 3 enthält Schadstoffe, die mit PAGE Reinigung stören. Wenn dies der Fall ist, fahren Sie mit PCR-Amplifikation. B) Die Produkte von offenen und Emulsions-PCR-Amplifikation der gleichen Oligonukleotid-Bibliothek ausgeführt auf einem Agarosegel. PCR-Amplifikation von komplexen Oligonukleotid-Bibliotheken erstellt häufig chimären Produkte und andere Artefakte, die als höhere und niedrigere Bands auftreten können. Emulsions-PCR können diese Artefakte zu minimieren. 2. Library Construction <ol><li> Vorbereitung eines linearisierten Plasmid-Backbone durch Verdau mit SfiI pMPRA1 Vektor bei 50 ° C für 2 Stunden, auf einem 1% igen Agarosegel aufgetrennt, die Verbrauchs das Rückgrat Band (in diesem Fall 2,5 kb) und reinigt sie mit einem Gel-Reinigung Spin-Säule. </li><li> Verdauendie Emulsions-PCR-Produkte aus Schritt 1.4 mit SfiI bei 50 ° C für 2 h und Reinigung mittels DNA-Reinigungssäulen. </li><li> Um die Promotor-Tag-Bibliothek in die linearisierte Vektor-Rückgrat ligieren, bis Reaktionen mit 100 ng des verdauten PCR-Produkt, 50 ng linearisierte Vektor-Rückgrat und T4-DNA-Ligase eingestellt. Inkubieren über Nacht bei 16 ° C und dann bei 65 ° C für 20 min, um die Ligase zu inaktivieren. </li><li> Transformation von E. coli mit dem Ligationsreaktion. Die Bibliothek Komplexität zu bewahren, wollen mindestens 10x mehr KBE erhalten, als es verschiedene Promotor-Tag-Kombinationen in der Bibliothek ausgelegt. </li><li> Wenn die Gesamtzahl von Tags ist etwa 100.000, kann die Ziel cfu typischerweise durch Ausführen 6-8 parallelen Umwandlungen pro Bibliothek erreicht werden. </li><li> Für jede Transformation, kombinieren 50 ul elektro E. coli-Zellen mit 2 ul Ligationsmischung auf Eis. Transformation durch Elektroporation, erholen die Zellen in 800 ul SOCMedium unter Schütteln bei 37 ° C für 1 h und dann kombinieren Zellen aus den parallel Transformationen. </li><li> Um die Transformationseffizienz zu bewerten, plattenReihenVerdünnungen von einem alinquot der gewonnenen Zellen auf LB-Agarplatten mit 50-100 ug / ml Carbenicillin und Inkubation über Nacht bei 37 ° C aufweist. Schätzung Gesamtkolonie wie beobachtet (cfu) x (Verdünnungsfaktor) × (V - V) / V, wobei V das Gesamtvolumen der gewonnenen Zellen und v das Volumen des Aliquots für die serielle Verdünnungen gemacht. </li><li> Gleichzeitig Verwenden der Rest der gewonnenen Zellen zur Beimpfung 200 ml LB mit 100 ug / ml Carbenicillin ergänzt. Wachsen Zellen bei 37 ° C über Nacht in einem Schüttelinkubator und dann isolieren die Plasmid-DNA nach Standardverfahren. </li><li> Digest ein Aliquot der isolierten Plasmid-Bibliothek mit SfiI bei 50 ° C für 2 h und laufen auf einem 1% Agarose-Gel auf die Anwesenheit des Inserts zu bestätigen. </li><li> Linearisierung der Plasmid-Bibliothek von cUtting zwischen den Promotorvarianten und Tags mit KpnI und XbaI. Um die Verdauung Effizienz zu maximieren, führen Serien Aufschlüsse: </li><li> Zunächst verdauen mit KpnI bei 37 ° C für 1 h und reinigen mit magnetischen Kügelchen. Zweitens Verdau mit XbaI unter Zusatz von 1 U alkalischer Shrimp-Phosphatase bei 37 ° C für 2 h, Hitze inaktiviert bei 65 ° C für 5 min und dann unter Verwendung von magnetischen Kügelchen zu reinigen. </li><li> Führen eines Aliquots auf einem 1% Agarose-Gel, um eine vollständige Linearisierung überprüfen. Wenn ungeschnittenen Plasmid sichtbar ist, sollte das linearisierte Fragment gelgereinigt werden. </li><li> Um eine MPRA Bibliothek geeignet für die Transfektion in Säugerzellen zu erzeugen, ligieren einen ORF mit KpnI / XbaI kompatible Enden in den lineaZwischen Bibliothek. </li><li> Wenn Sie einen kompatiblen luc2 ORF-Fragment aus pMPRAdonor1 vorzubereiten, zu verdauen, die dieses Plasmid mit KpnI und XbaI bei 37 ° C für 1 h und auf einem 1% Agarose-Gel laufen. Verbrauchsteuern Das ORF-Fragment (1,7 kB in diesem Fall) und zu reinigen mit einer Gelreinigung Spinsäule. </li><li> Klonen Sie die ORF-Fragment in den lineaZwischen Bibliothek wie in den Schritten 2,3-2,8 beschrieben. </li><li> Digest eines Aliquots (entsprechend 1-2 ug) des MPRA Bibliothek mit KpnI bei 37 ° C für 1 h und auf einem 1% Agarose-Gel laufen gelassen. Wenn die Bibliothek verdaut wird als Einzelband, Abschnitt 3. vorgehen, wenn zusätzliche Banden beobachtet (in der Regel um Verschleppungen von Zwischen Konstrukte entsprechend), kann die Bibliothek weiter gereinigt wie folgt: </li><li> Verdauen 3-5 ug des kontaminierten Bibliothek mit KpnI bei 37 ° C für 1 h und auf einem 0,8% Agarose-Gel bei 4 ° C über Nacht ausgeführt. </li><li> Auszuschneiden die korrekte Bandbibliothek, reinigen die DNA unter Verwendung einer Gel-Reinigung Spin-Säule und führen die Selbstligation unter Verwendung von hoch-konzentrierten T4-DNA-Ligase bei 37 ° C für 1 Stunde. Wiederholen Sie dann die Transformation und letzte Bibliothek DNA-Isolierung, wie in Schritt 2.8 beschrieben. </li></ol> 3. Transfection, Störungs und RNA-Isolierung <ol><li> Für jede unabhängige Transfektion Kultur der erforderlichen Anzahl von Zellen (wie von der MPRA Bibliothek Komplexität bestimmt, siehe Diskussion) in geeigneten Medium. Beispielsweise Kultur HEK293T / 17 Zellen in DMEM, ergänzt mit 10% FBS und L-Glutamin / Penicillin / Streptomycin. Kulturzellen von mindestens zwei unabhängigen Transfektionen für jede Bibliothek und experimentellen Bedingungen. </li><li> Transfektion der kultivierten Zellen mit Plasmiden MPRA. Die Transfektion Verfahren und Bedingungen müssen für jeden Zelltyp optimiert. Für jede Probe transfiziert sind, behalten ein Aliquot (50-100 ng) der Plasmid-DNA als eine abgestimmte Steuerung. </li><li> B. Transfektion von 0,5 x 10 7 HEK293T / 17-Zellen gezüchtet, um ~ 50% Konfluenz in einer 10 cm Kulturschale mit 10 ug Plasmid-DNA in 1 ml Opti-MEM I Reduzierte Serummedium unter Verwendung von 30 ul Lipofectamine LTX und 10 ul plus Reagenz. Entfernen Sie die Transfektion Mischung nach 5 Stunden und lassen Sie dasZellen für 24-48 Stunden zu erholen. </li><li> Optional führen Sie keine Störung erforderlich, um kontextabhängige oder Signal regulatorischen Sequenzen in der Bibliothek ausgelegt aktivieren. </li><li> Ernte der Zellen und Isolierung von Poly (A) + mRNA mit Standard-Oligo (dT) Cellulose-Säulen oder Kugeln mit Anweisungen des jeweiligen Herstellers. </li><li> Sicherzustellen, dass die maximale Bindungskapazität der Säulen oder Beads die Gesamtmenge an mRNA aus den geernteten Zellen erwartet überschreiten. Zum Beispiel kann die erwartete Rendite aus dem Abschnitt 3.3 ist etwa 0,5-2,5 ug mRNA. </li></ol> 4. Tag-Seq <ol><li> Verschleppung von Vektor-DNA aus den transfizierten Zelllysaten zu beseitigen, behandeln jeweils 20 ul mRNA-Probe mit 1 ul Turbo DNase (2 U) und 2,3 ul 10x Turbo DNase-Puffer bei 37 ° C für 1 h, fügen Sie 2,4 ul Turbo DNase Inaktivierung Reagenz bei RT für 5 min Mischen, Zentrifugieren bei 10.000 g für 90 sec, und dann wird die Lösung in ein frisches Röhrchen. </li><li> Überprüfen<html> Reinheit durch eine PCR, wie in Abschnitt 4.6 auf 60-100 ng jedes mRNA Probe beschrieben, und dann läuft die Produkte auf einem Agarose-Gel. Wenn bestimmte Amplikons sind sichtbar (0,25 kb bei Verwendung pMPRA1 mit luc2), Spalte reinigen die mRNA behandelt und wiederholen Sie den DNase-Behandlung. </li><li> Um Tag-Seq-Sequenzierung Bibliotheken generieren, konvertieren Reporter mRNA in cDNA und fügen Sequenzierung Adapter durch PCR. </li><li> Einrichtung mRNA / RT-Primer Mischungen, wie in Tabelle 3 beschrieben. Inkubation bei 65 ° C für 5 min auf Eis zu stellen. Parallel dazu richten Sie cDNA-Synthese-Reaktionen, wie in Tabelle 4 beschrieben. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> 1x Volume (ul) </td></tr><tr><td> mRNA Probe (400-700 ng Gesamt) </td><td> 8 </td></tr><tr><td> Oligo-0DT (50 uM) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> dNTP (10 mM jeweils) </td><td> 1 </td></tr></tbody></table>ove_content &quot;&gt; Tabelle 3. RNA / reverse Transkription Primer-Mix für die cDNA-Synthese. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> 1x Volume (ul) </td></tr><tr><td> 10x Superscript III RT Buffer </td><td> 2 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> DTT (0,1 M) </td><td> 2 </td></tr><tr><td> RNaseOut (40 U / ul) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Superscript III (200 U / ul) </td><td> 1 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4. cDNA-Synthese Reaktionsmischung. <ol start="5"><li> Sanft kombinieren mRNA / RT-Primer vermischt sich mit der cDNA-Synthese Mischungen. Inkubieren bei 50 ° C für 50 min, 85 ° C für 5 min und dann auf Eis. Schließlich Inkubation mit 2 U von Ribonuclease H bei 37 ° C für 20 min. </li><li> Bis PCR-Reaktionen wie in Tabelle 5 mit 4-6 ul beschriebencDNA Reaktionsmischung oder 50 ng Reporterplasmid als Vorlagen. Dann führen die PCR-Amplifikation (95 ° C für 2 min, 26 x [95 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 sec, 72 ° C für 30 sec], 72 ° C für 3 min). </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="428"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> 1x Volume (ul) </td></tr><tr><td> 2x PfuUltra II HotStart PCR Master Mix </td><td> 25 </td></tr><tr><td> Primer TagSeq_P1 (25 uM) </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> Primer TagSeq_P2 (25 uM) </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> Vorlage (mRNA, cDNA-Mix oder Plasmid-DNA) </td><td> variiert </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 50 </td></tr></tbody></table> Tabelle 5. Tag-Seq PCR-Reaktionsmischung. <ol start="7"><li> Führen Sie die PCR-Produkte über ein 2% Agarose-Gel, Verbrauch Bands, die den Tag-Seq Bibliothek Amplikons (0,25 kb bei VerwendungpMPRA1 mit luc2) und reinigen Sie diese mit Gel-Reinigung Spin-Säulen. </li><li> Pool, denaturieren und Sequenz, die das gereinigte Tag-Seq Amplikons direkt mit einem Illumina-Sequenzierung Instrument. </li><li> Filter mit geringer Qualität liest, indem alle, dass a) eine oder mehrere Position mit einem Phred Qualitätsfaktor von weniger als 30 innerhalb des sequenzierten Tag oder b) nicht genau einen Tag ausgelegt entsprechen. Zählen Sie die Anzahl der jeweils verbleibenden Tag in jeder Bibliothek erscheint. Normalisieren die Tag zählt, um TPM (Tags pro Million sequenziert Tags) und berechnen dann das Verhältnis der mRNA-Tag zählt über Plasmid-abgeleitete Tag zählt für jedes Paar von Sequenzierungsbibliotheken. Wenn mehrere verschiedene Tags wurden zu jedem Sequenzvariante verknüpft, nutzen ihre mittlere Verhältnisse für Downstream-Analyse. </li></ol>

<ol><li>Kinney, J., Murugan, A., Callan, C. G., Cox, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+deep+sequencing+to+characterize+the+biophysical+mechanism+of+a+transcriptional+regulatory+sequence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Using deep sequencing to characterize the biophysical mechanism of a transcriptional regulatory sequence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 107 (20), 9158-9163 (2010).</li>
<li>Melnikov, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+dissection+and+optimization+of+inducible+enhancers+in+human+cells+using+a+massively+parallel+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 271-277 (2012).</li>
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<li>Patwardhan, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+functional+dissection+of+mammalian+enhancers+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo.</a> Nature Biotechnology. 30 (3), 265-270 (2012).</li>
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<li>Kheradpour, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+dissection+of+regulatory+motifs+in+2000+predicted+human+enhancers+using+a+massively+parallel+reporter+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Systematic dissection of regulatory motifs in 2000 predicted human enhancers using a massively parallel reporter assay.</a> Genome Research. 23 (5), 800-811 (2013).</li>
<li>White, M. A., Myers, C. A., Corbo, J. C., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+in+vivo+enhancer+assay+reveals+that+highly+local+features+determine+the+cis+-regulatory+function+of+ChIP-seq+peaks%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Massively parallel in vivo enhancer assay reveals that highly local features determine the cis -regulatory function of ChIP-seq peaks.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 110 (29), 11952-11957 (2013).</li>
<li>Mogno, I., Kwasnieski, J. C., Cohen, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+synthetic+promoter+assays+reveal+the+in+vivo+effects+of+binding+site+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Massively parallel synthetic promoter assays reveal the in vivo effects of binding site variants.</a> Genome Research. 23 (11), 1908-1915 (2013).</li>
<li>Schütze, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+streamlined+protocol+for+emulsion+polymerase+chain+reaction+and+subsequent+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A streamlined protocol for emulsion polymerase chain reaction and subsequent purification.</a> Analytical Biochemistry. 410 (1), 155-157 (2011).</li>
<li>Panne, D., Maniatis, T., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+atomic+model+of+the+interferon-beta+enhanceosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An atomic model of the interferon-beta enhanceosome.</a> Cell. 129 (6), 1111-1123 (2007).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessen konkurrieren.

MPRA ist ein flexibles und leistungsfähiges Werkzeug zur Aufschlüsselung von Sequenz-Aktivitäts-Beziehungen in genregulatorischen Elementen. Der Erfolg von MPRA-Experimenten hängt von mindestens drei Faktoren ab: 1) sorgfältiges Design der Sequenzbibliothek, 2) Minimierung von Artefakten während der Amplifikation und Klonierung und 3) hohe Transfektionseffizienz. 
Die möglichen Längen der variablen Regionen in den Reporterkonstrukten werden maßgeblich durch die verwendete Synthese- bzw. Klonierungstechnologie bestimmt. Standard-OLS ist im Allgemeinen auf etwa 200 nt begrenzt, aber dieses Protokoll ist mit Einfügungen bis zu mindestens 1.000 nt kompatibel. Beachten Sie, dass variable Regionen, die stark repetitiv sind oder starke Sekundärstrukturen enthalten, aufgrund von PCR- und Klonierungsverzerrungen unterrepräsentiert sein können. Die Länge der Markierungen, die jeden der variablen Bereiche identifizieren, sollte 10-20 nt betragen, und die Sammlung von Tags sollte idealerweise so gestaltet sein, dass es mindestens zwei Nukleotidunterschiede zwischen einem beliebigen Paar gibt. Markierungen, die die Seed-Sequenzen bekannter microRNA oder andere Faktoren enthalten, die die mRNA-Stabilität beeinflussen könnten, sollten nach Möglichkeit ebenfalls vermieden werden.
Ein Schlüsselparameter bei der Planung von MPRA-Experimenten ist die Gesamtzahl der unterschiedlichen Reporterkonstrukte, die in die Bibliothek aufgenommen werden sollen (die Designkomplexität, bezeichnet als CD). In der Praxis ist CD durch die Anzahl der kultivierten Zellen begrenzt, die transfiziert werden können. Als Faustregel gilt, dass die Gesamtzahl der transfizierten Zellen mindestens 50-100 Mal größer sein sollte als die von CD. Wenn beispielsweise 20 Millionen Zellen mit einer Transfektionseffizienz von 50 % transfiziert werden können, sollte CD nicht mehr als ~200.000 betragen. Beachten Sie, dass CD gleich der Anzahl der unterschiedlichen regulatorischen Sequenzvarianten multipliziert mit der Anzahl der unterschiedlichen Tags pro Sequenz ist. Je mehr unterschiedliche Tags mit jeder regulatorischen Sequenz verknüpft sind, desto genauer kann die Aktivität dieser Sequenz geschätzt werden (da Messungen von unterschiedlichen Tags gemittelt werden können), aber desto weniger unterschiedliche Varianten können in einem Experiment getestet werden. Die optimale Wahl hängt vom Versuchsdesign ab. In einem einfachen "Promotor-Bashing"-Experiment, bei dem ein mathematisches Modell an die aggregierten Messungen angepasst wird, ist in der Regel ein einziges Tag pro Variante ausreichend. In einem Screening auf Einzelnukleotid-Polymorphismen, die Veränderungen in den regulatorischen Aktivitäten verursachen, kann es erforderlich sein, 20 oder mehr Tags pro Allel zu verwenden, um statistisch robuste Ergebnisse zu erhalten, da der Vergleich jedes Allelpaares einen separaten Hypothesentest erfordert. 
Wenn nicht davon auszugehen ist, dass die zu untersuchenden Sequenzen Transkriptionsstartstellen enthalten, kann auch ein konstanter Promotor im selben Fragment hinzugefügt werden. Zum Beispiel umfasst pMPRAdonor2 (Addgene ID 49353) einen minimalen TATA-Box-Promotor, der nützlich ist, wenn erwartet wird, dass die stromaufwärts liegende variable Region eine signifikante Enhanceraktivität aufweist, während pMPRAdonor3 (Addgene ID 49354) einen modifizierten, starken SV40-Viruspromotor enthält, der nützlich ist, wenn erwartet wird, dass die variable Region Schalldämpferaktivität oder andere negative regulatorische Elemente enthält. 
Rohe OLS-Produkte enthalten oft einen signifikanten Anteil an verkürzten Oligonukleotiden. Diese können die genaue PCR-Amplifikation der designten Sequenzen beeinträchtigen, insbesondere wenn zwischen ihnen eine signifikante Homologie besteht. Die Verwendung der PAGE-Aufreinigung zur Entfernung verkürzter Syntheseprodukte und die Emulsions-PCR zur Minimierung von Amplifikationsartefakten sind wirksame Techniken zur Sicherstellung einer hohen Bibliotheksqualität. Wenn einer der beiden Schritte nicht praktikabel ist, ist es zwingend erforderlich, die Anzahl der PCR-Zyklen, die bei jedem Amplifikationsschritt verwendet werden, zu minimieren. Die Auswahl und Erweiterung der klonierten Bibliothek in der Flüssigkultur ist im Allgemeinen ausreichend, um die Komplexität des Designs aufrechtzuerhalten, aber wenn rekombinationsanfällige Vektoren verwendet werden sollen oder eine signifikante Repräsentationsverzerrung beobachtet wird, können die gewonnenen Zellen stattdessen direkt auf große LB-Agarplatten plattiert, als einzelne Kolonien expandiert und dann für die DNA-Isolierung abgeschabt werden. Es ist auch wichtig, die potenziellen Auswirkungen von Synthesefehlern zu berücksichtigen, die typischerweise bei einer Rate von 1:100-500 bei OLS auftreten. Es wird empfohlen, die Reporterkonstrukte vor der Transfektion in voller Länge zu sequenzieren, um solche Fehler zu identifizieren und zu korrigieren.
Es ist nicht notwendig, Reporterkonstrukte in jede Zelle in der transfizierten Kultur einzuführen, aber Transfektionseffizienzen unter ~50% können zu schlechten Signal-Rausch-Verhältnissen führen. Es ist ratsam, die Transfektionsbedingungen zu optimieren, bevor MPRA-Experimente in einem neuen Zelltyp durchgeführt werden. Bei der Arbeit mit schwer zu transfizierenden Zelltypen können MPRA-Signale durch Vorselektion transfizierter Zellen verstärkt werden. Die pMPRA-Vektorreihe umfasst Varianten, die konstitutiv einen verkürzten Zelloberflächenmarker exprimieren, der zur physikalischen Anreicherung von transfizierten Zellen vor der RNA-Isolierung verwendet werden kann (z. B. Addgene IDs 49350 und 49351).

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Erratum: Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

Massively Parallel Reporter Assays (MPRA) erlauben Multiplex-Messung der Transkriptionsregulationsaktivitäten Tausende bis Hunderttausende von DNA-Sequenzen 1-7. In ihrer allgemeinsten Ausführung wird durch Multiplexen Koppeln jeder Sequenz von Interesse ein synthetisches Reportergen, das eine Identifizierungssequenz Tag stromabwärts eines offenen Leserasters enthält erzielt (ORF Abbildung 1). Nach der Transfektion der RNA-Isolierung und Sequenzierung des Tief 3 &#39;Enden der Reportergen-Transkripten, können die relativen Aktivitäten der gekoppelten Sequenzen aus der relativen Häufigkeit der Ermittlung Variablen abgeleitet werden. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig1highres.jpg" /> Abbildung 1. Übersicht über MPRA. Eine Bibliothek von MPRA Reporterkonstrukte durch Kopplung mutmaßlichen regulatorischen Sequenzen zu synthetischen gebautReportergene, die aus einem &quot;inerten&quot; ORF bestehen (wie GFP oder Luciferase), gefolgt von einem identifizierenden Sequenz-Tag. Die Bibliothek wird in Massen in eine Population von kultivierten Zellen transfiziert und transkribiert Reporter mRNA wird anschließend zurückgewonnen. Deep sequencing wird verwendet, um die Anzahl der Vorkommen der einzelnen Tag unter den Reporter-mRNAs und den transfizierten Plasmiden zählen. Das Verhältnis der mRNA zählt über Plasmid Zahlen können verwendet werden, um die Aktivität der entsprechenden Regulationssequenz abzuleiten. Angepasst mit Erlaubnis von Melnikow, et al 2. MPRA kann zu einer breiten Vielzahl von experimentellen Designs angepasst werden, einschließlich 1) umfassende Mutagenese einzelner Gen regulatorische Elemente, 2) Überprüfung auf neue regulatorische Elemente in einem Ort von Interesse, 3) Testen der Wirkung der natürlichen genetischen Variation in einer Menge von putativen Promotoren, Enhancer oder Silencer, und 4) semi-rationale Konstruktion von synthetischen regulatorische Elemente. Libibliotheken von Sequenzvarianten können unter Verwendung einer Vielzahl von Verfahren, einschließlich Oligonukleotid-Synthese von Bibliotheken (OLS) auf programmierbaren Mikroarrays 2,3,6,7, Montage von degenerierten Oligonukleotiden 1,4, kombinatorische Ligations 8 und Fragmentierung der genomischen DNA, 5 erzeugt werden. Dieses Protokoll beschreibt die Konstruktion einer Bibliothek von Promotorvarianten mit OLS und die pMPRA1 und pMPRAdonor1 Vektoren (Addgene IDs 49349 und 49352 sind; http://www.addgene.org) transiente Transfektion dieser Bibliothek in kultivierte Säugerzellen und die anschließende Quantifizierung der Promotor-Aktivitäten von deep sequencing der ihnen zugeordneten Tags (Tag-Seq). Frühere Versionen von diesem Protokoll wurden in der Forschung in Melnikov et al. Nature Biotechnology 30, 271-277 (2012) und in Kheradpour et al. Genome Research 23, 800-811 (2013) berichtet, verwendet.

<table><tbody><tr><td>Synthese von Oligonukleotidbibliotheken</td><td>Agilent, CustomArray oder andere OLS-Anbieter</td><td>kundenspezifisch</td><td>Bei Verwendung der OLS-Konstruktionsmethode</td></tr><tr><td>pMPRA1</td><td>Addgene</td><td>49349</td><td>MPRA Plasmid Rückgrat</td></tr><tr><td>pMPRAdonor1</td><td>Addgene</td><td>49352</td><td>luc2 ORF Donor</td></tr><tr><td>Plasmid TE 0,1 Puffer (10 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, pH 8,0)</td><td>Generisch</td><td>n/a</td><td>OLS Puffer</td></tr><tr><td>Novex TBE-Harnstoff-Gele, 10%</td><td>Life Technologies</td><td>EC6875BOX PAGE-Aufreinigung</td><td>von OLS-Produkten</td></tr><tr><td>Novex TBA-Harnstoff-Probenpuffer</td><td>Life Technologies</td><td>LC6876</td><td>PAGE-Aufreinigung von OLS-Produkten</td></tr><tr><td>SYBR Gold Nukleinsäure-Gel Stain</td><td>Life Technologies</td><td>S-11494</td><td>PAGE-Aufreinigung von OLS-Produkten</td></tr><tr><td>Micellula DNA-Emulsion & Aufreinigungskit</td><td>EURx/CHIMERx</td><td>3600-01</td><td>Bibliotheksamplifikation durch Emulsions-PCR</td></tr><tr><td>Herculase II Fusion DNA-Polymerase</td><td>Agilent</td><td>600675</td><td>Polymerase für Emulsions-PCR</td></tr><tr><td>SfiI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0123S</td><td>Bibliotheksklonierung mit pMPRA-Vektoren</td></tr><tr><td>KpnI-HF</td><td>New England Biolabs</td><td>R3142S</td><td>Bibliotheksklonierung mit pMPRA-Vektoren</td></tr><tr><td>XbaI</td><td>Neu England Biolabs</td><td>R0145S Klonierung</td><td>der Bibliothek mit pMPRA-Vektoren</td></tr><tr><td>T4-DNA-Ligase (2.000.000 Einheiten/ml)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202T</td><td>Klonierung der Bibliothek mit pMPRA-Vektoren</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 Electrocomp E. coliLife</td> <td>Technologies</td><td>C4040-50</td><td>Klonierung der Bibliothek mit pMPRA-Vektoren</td></tr><tr><td>LB-Agar und flüssigen Medien mit Carbenicllin</td><td>Generisches</td><td>n/a</td><td>Wachstumsmedien für Klonierung</td></tr><tr><td>von E-Gel EX Gelen 1%</td><td>Life Technologies</td><td>G4010-01</td><td>Verifizierung und Aufreinigung von Bibliotheken</td></tr><tr><td>E-Gel EX Gele, 2%</td><td>Life Technologies</td><td>G4010-02</td><td>Verifizierung und Aufreinigung von Bibliotheken</td></tr><tr><td>MinElute Gel Extraction Kit</td><td>Qiagen</td><td>28604</td><td>Aufreinigung von Bibliotheken und Rückgraten</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Bibliothek DNA-Isolierung</td></tr><tr><td>Zellkulturmedien</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Experimentspezifische</td></tr><tr><td>Transfektionsreagenzien</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td>Experimentspezifisches</td></tr><tr><td>MicroPoly(A)Purist Kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1919</td><td>mRNA-Isolierung</td></tr><tr><td>TURBO DNA-freies Kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1907</td><td>Plasmid-DNA-Entfernung</td></tr><tr><td>SuperScript III Erststrangsynthese</td><td>Systemlebensdauer Technologien</td><td>18080-051</td><td>cDNA-Synthese</td></tr><tr><td>PfuUltra II Hotstart PCR Master</td><td>Mix Agilent</td><td>600850</td><td>Polymerase für Tag-Seq</td></tr><tr><td>PCR Primer (siehe Text)</td><td>IDT</td><td>custom</td><td>PAGE purify Tag-Seq Primer</td></tr></tbody></table>

massively parallel reporter assays in kultivierte säugerzellen

Massively Parallel Reporter Assays in Cultured Mammalian Cells

Der genetische Reporter-Assay ist ein gut etabliertes und leistungsfähiges Werkzeug, um die Beziehung zwischen DNA-Sequenzen und ihren genregulatorischen Aktivitäten zu entschlüsseln. Der potentielle Durchsatz dieses Assays wurde jedoch durch die Notwendigkeit begrenzt, die Aktivität jeder Sequenz einzeln zu klonen und zu testen, wobei die Proteinfluoreszenz oder die enzymatische Aktivität als Proxy für die regulatorische Aktivität verwendet wurde. Fortschritte in der Hochdurchsatz-DNA-Synthese und -Sequenzierungstechnologie haben es in jüngster Zeit ermöglicht, diese Einschränkungen zu überwinden, indem die Konstruktion und Abfrage großer Bibliotheken von Reporterkonstrukten gemultiplext wurde. Dieses Protokoll beschreibt die Implementierung eines Massively Parallel Reporter Assay (MPRA), der den direkten Vergleich von Hunderttausenden von mutmaßlichen regulatorischen Sequenzen in einer Einzelzellkulturschale ermöglicht.

MPRA ermöglicht hochauflösende, quantitative Zerlegung der Sequenz-Aktivitäts-Beziehungen von transkriptionalen regulatorischen Elemente. Eine erfolgreiche MPRA Experiment ergeben typischerweise hoch reproduzierbare Messungen für die Mehrzahl der Sequenzen in der Bibliothek transfiziert (3A). Wenn schlechte Reproduzierbarkeit beobachtet (3B), ist dies ein Hinweis auf eine zu niedrige Konzentration an Reporter-mRNAs in den gewonnenen RNA-Proben aufgrund entweder 1) geringe absolute Aktivität unter den Sequenzen untersucht, oder 2) geringe Transfektionseffizienz. Figur 4 zeigt ein repräsentatives &quot;Daten-Fußabdruck&quot; 1,2 durch Bestimmung erzeugt ~ 37.000 zufällige Varianten eines 145 bp-Sequenz stromaufwärts des menschlichen IFNB Gens in HEK293-Zellen, die mit oder ohne Einwirkung von Sendai-Virus. Der Promotor TATA-Box und bekannt proximalen Enhancer 10 eindeutig als informationsreichen regi identifiziert werdenons in einem Virus-abhängige Weise. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Tag-Seq Reproduzierbarkeit. Streudiagramme, die Beispiele von Tag-Seq-Daten aus zwei unabhängigen Transfektionen mit hoher Wiederholungs (A) und niedriger (B) Reproduzierbarkeit. Letztere Plot zeigt viele Ausreißer-Tags mit hoher mRNA zählt in nur einer der zwei Wiederholungen. Solche Artefakte typischerweise an, dass die Konzentrationen der Reporter-mRNAs zu niedrig für die quantitative PCR-Amplifikation entweder durch niedrige absolute Aktivitäten unter den Reporterkonstrukte oder niedrige Transfektionseffizienz. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/51719/51719fig4highres.jpg" /> Abbildung 4. Information Footprinting des menschlichen IFNB Transkriptionsstartstelle und proximalen Enhancer. </strOng&gt; Etwa 37.000 zufällige Varianten einer 145 Nukleotid (nt)-Region stromaufwärts des menschlichen Gens wurden unter Verwendung IFNB MPRA in HEK293-Zellen, die mit (A) und ohne (B) Einwirkung von Sendai-Virus untersucht. Die blauen Balken zeigen die gegenseitige Information zwischen dem Ausgang und dem Reporter Nukleotid an jeder Position. Das proximale Enhancer und TATA-Box stehen als Regionen mit hoher Informationsgehalt auf Virusinfektion.

Der genetische Reporter-Assay ist ein gut etabliertes und leistungsfähiges Werkzeug, um die Beziehung zwischen DNA-Sequenzen und ihren genregulatorischen Aktivitäten zu entschlüsseln. Die Kopplung von regulatorischen Elementkandidaten an Reportergene, die identifizierende Sequenz-Tags tragen, ermöglicht eine massive Parallelisierung dieser Assays.

Massively Parallel Reporter Assays in kultivierte Säugerzellen

The genetic reporter assay is a well-established and powerful tool for dissecting the relationship between DNA sequences and their gene regulatory ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die genregulatorischen Aktivitäten von Tausenden von DNA-Sequenzen parallel zu testen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Reporterbibliothek konstruiert wird, in der die interessierenden DNA-Sequenzen mit Reportergenen mit einem oder mehreren identifizierenden Sequenz-Tags in ihren drei Primzahlen verknüpft sind. Der zweite Schritt des Verfahrens besteht darin, diese Reporterbibliothek in eine Zellpopulation zu transfizieren.Der letzte Schritt besteht darin, die Anzahl der Vorkommen jedes der identifizierenden Sequenz-Tags in den Reporter-mRNAs und der entsprechenden Reporterbibliothek durch Tiefensequenzierung zu zählen. Letztendlich können die Ergebnisse verwendet werden, um die Beziehung zwischen der DNA-Sequenz und den Aktivitäten genregulatorischer Elemente durch computergestützte Analyse der Sequenz-Tag-Zählung abzuleiten. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie Luciferase- oder GFP-basierten Reporter-Assays besteht darin, dass Sie Tausende von regulatorischen Sequenzen in einer einzigen Schale von kultivierten Zellen testen können.Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Genregulation zu beantworten, z. B. welche Nukleotide im Promotor oder Enhancer essentiell sind. Diese Methode kann für eine Vielzahl anderer Experimentdesigns verwendet werden, wie z.B. das Screening einer großen Bibliothek von mutmaßlichen Regulatorelementen auf Aktivität in einem bestimmten zellulären Zustand. Peter Rugo, ein leitender wissenschaftlicher Mitarbeiter aus Biotechnologielabors, wird das Verfahren zum Aufbau der Reporterbibliothek demonstrieren und die RNA-Rückgewinnung von Lee Wang, einem leitenden wissenschaftlichen Mitarbeiter aus meiner Gruppe, demonstrieren.Und Tag bezeichnet ein oder mehrere identifizierende Tags. Die Einschränkungsseiten KPN one und XBA one liegen dazwischen. Die synthetisierte Oligonukleotidbibliothek wird in 100 Mikrolitern TE 0,1-Puffer resuspendiert.Führen Sie die Oligonukleotidbibliothek auf einem 10%%igen TBE-Harnstoff-denaturierendem Polyacrylamidgel aus. Laden Sie etwa ein Ole in jede Bahn und analysieren Sie das Gel mit einem einzelsträngigen DNA-empfindlichen Fluoreszenzfleck. Wenn es ein diskretes Verbot gibt, das den Oligonukleotiden in voller Länge entspricht, schneiden Sie es aus und eluieren Sie die Oligos über Nacht bei Raumtemperatur und unter Schütteln unter Verwendung der gelgereinigten oder rohen Oligonukleotidbibliothek in 100 Mikroliter TE 0,1.Richten Sie eine Emulsions-PCR ein, um die Bibliothek zu amplifizieren, und fügen Sie SI one Tails hinzu. Richten Sie 50 Mikroliter-Reaktionen ein, wie in Tabelle zwei beschrieben. Kombinieren Sie dann das 50-Mikroliter-Reaktionsgemisch mit 300 Mikrolitern Öl und Tensidgemisch aus dem my DNA-Emulsions- und Reinigungskit für fünf Minuten bei vier Grad Celsius Wirbelmischung zu einer Emulsion.Verteilen Sie dann die Emulsion in PCR-Röhrchen oder -Platten als 50-Mikroliter-Reaktionen und führen Sie nach der PCR 20 PCR-Zyklen durch. Ziehen Sie die 350-Mikroliter-Emulsionen wieder zusammen. Fügen Sie dann einen Milliliter Isobutanol hinzu und wirbeln Sie es in die Mischung ein.Reinigen Sie das Amplifikationsprodukt kurz mit einer DNA-Aufreinigungssäule und lassen Sie ein Eloqua auf einem 2%- oder 4%Agros-Gel laufen, um seine Qualität zu beurteilen. Die Serumamplifikation einer komplexen Ölbibliothek kann zu Repräsentationsverzerrungen, RIC-Applikionen und anderen Artefakten führen. Es ist wichtig, die Anzahl der PCR-Zyklen, die für die zusätzliche Qualitätskontrolle verwendet werden, zu minimieren.Es wird empfohlen, eine vollständige Sequenzierungsbibliothek durchzuführen, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren Zur Vorbereitung des linearisierten Plasmid-Rückgrats. Erster Verdauungs-P pra ein Vektor mit SFI eins bei 50 Grad Celsius für zwei Stunden. Lassen Sie dann die verdauten Produkte auf einem 1%igen Gel laufen und sammeln Sie die DNA aus dem 2,5 KILOBASE-Rückgratband mit einer Gelreinigungs-Spin-Säule.Als nächstes verdauen Sie die Emulsions-PCR-Produkte auf die gleiche Weise und sammeln Sie die Produkte auch mit der DNA-Aufreinigungssäule. Richten Sie nun eine Ligationsreaktion mit 100 Nanogramm verdauter PCR und 50 Nanogramm linearisiertem Plasmid ein. Verwenden Sie die T-Vier-Ligase und führen Sie die Reaktion über Nacht bei 16 Grad Celsius am nächsten Tag durch.Inaktivieren Sie die Ligationsreaktion, indem Sie sie 20 Minuten lang auf 65 Grad Celsius erhitzen. Dann werden zwei Mikroliter-Aliquots der Ligationsreaktionsprodukte in 50 Mikroliter-Aliquots elektrokompetenter Equali umgewandelt. Erholen Sie die Zellen in 800 Mikrolitern SOC-Medium bei 37 Grad Celsius unter einstündigem Schütteln.Fassen Sie dann alle parallelen Umwandlungen zusammen und bewerten Sie sie, indem Sie serielle Verdünnungen mit 50 bis hundert Mikrogramm Kohlenstoff-Penicillin pro Milliliter auf LB-Agar aufbringen. Inkubieren Sie die Platten über Nacht bei 37 Grad Celsius und schätzen Sie die Gesamt-KBE am nächsten Tag. Unmittelbar nach der Transformation wird der Rest der transformierten Zellen verwendet, um 200 Milliliter LB zu impfen, die mit 100 Mikrogramm Kohlensäure pro Milliliter ergänzt sind.Züchten Sie die Zellen über Nacht bei 37 Grad Celsius und isolieren Sie die Plasma-DNA am nächsten Tag nach Standardverfahren, um das Vorhandensein von Inserts zu bestätigen. Verdauen Sie ein Aliquot der isolierten Bibliothek mit SFI one und lassen Sie die Produkte auf einem 1%aros-Gel laufen. Linearisieren Sie die Plasmidbibliothek mit seriellen Aufschlüssen mit KPN one und XBA one, verdauen Sie zuerst mit KPN one bei 37 Grad Celsius für eine Stunde und reinigen Sie die Produkte mit magnetischen Kügelchen. Zweitens verdauen Sie ein Produkt mit XBA eins plus einer Einheit alkalischer Phosphatase für Garnelen bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden später.Inaktivieren Sie die Reaktion bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten und reinigen Sie die Produkte dann mit magnetischen Kügelchen. Führen Sie ein Aliquot auf einem 1%-Gel aus, und wenn ein ungeschnittenes Plasmid sichtbar ist, reinigen Sie das linearisierte Fragment jetzt mit dem Gel, um eine NPRA-Bibliothek zu erzeugen, die für die Transfektion in Säugetierzellen geeignet ist. Bereiten Sie zunächst ein kompatibles Leserahmenfragment von P-M-P-R-A-Spender vor.Verdauen Sie dieses Plasmid mit KPN one und XBA one bei 37 Grad Celsius für eine Stunde. Lassen Sie die Produkte dann auf einem 1%AGROS Gel laufen. Exzidieren Sie das offene Leserahmenfragment, in diesem Fall bei 1,7 Kilobasen, und reinigen Sie es mit einer Gelaufreinigungs-Spin-Säule.Ligatieren Sie dann den linearisierten offenen Leserahmen in die linearisierte Zwischenbibliothek, wie für die vorherige Ligation beschrieben. Transformieren Sie die Ligationsprodukte in E-Coli-Zellen und isolieren Sie die endgültige NPRA-Plasmidbibliothek, wie zuvor beschrieben. Wenn du nicht aufpasst, übertrage sie.Die angepassten Plasmide und subplattierten Produkte können den Anteil korrekter Konstrukte im endgültigen Plasmidpool erheblich reduzieren. Stellen Sie sicher, dass Sie das richtige Band isolieren und den Hintergrund überprüfen, bevor Sie mit den nächsten Schritten fortfahren. Als Prüfverdau wird ein Eloqua von einem oder zwei Mikrogramm der NPRA-Bibliothek mit KPN eins verwendet.Führen Sie dies auf einem 1%-Gel aus und wenn es als einzelnes Band ausgeführt wird, fahren Sie fort. Andernfalls konsultieren Sie das Textprotokoll zum Umgang mit Kontaminationen bei transfiktierten kultivierten Zellen. Mit der NPRA.Die Bedingungen für Plasmide müssen für jeden Zelltyp optimiert werden. Zum Beispiel können 5 Millionen HK 2 93 T 17-Zellen, die in einer 10-Zentimeter-Kulturschale auf etwa 50 % Konfluenz gezüchtet wurden, mit 10 Mikrogramm Plasmid-DNA in einem Milliliter ofm, einem reduzierten Serummedium unter Verwendung von 30 Mikrolitern Lipo LTX und 10 Mikrolitern Plus-Reagenz transfiziert werden. Entfernen Sie in diesem Fall das Transfektionsgemisch etwa fünf Stunden und lassen Sie die Zellen ein oder zwei Tage später erholen, ernten Sie die Zellen und verwenden Sie ein Kit, um die polypositive mRNA zu isolieren.Erstellen Sie dann ein Tag, suchen Sie nach einer Sequenzierungsbibliothek und analysieren Sie die Ergebnisse. NPRA ermöglicht die hochauflösende quantitative Aufschlüsselung der Sequenz-Wirkungs-Beziehungen von transkriptionellen regulatorischen Elementen. Ein erfolgreiches NPRA-Experiment liefert in der Regel hochgradig reproduzierbare Messungen für die meisten Sequenzen in der transfizierten Bibliothek.Wenn die Reproduzierbarkeit schlecht ist, ist die Konzentration von Reporter-mRNAs in der zurückgewonnenen RNA wahrscheinlich zu niedrig. Dies kann aufgrund einer geringen absoluten Aktivität zwischen den Assay-Sequenzen oder aufgrund einer geringen Transfektionseffizienz geschehen. In diesen erfolgreichen n PRAs wurden 37.000 Varianten einer 1 45-Basenpaar-Sequenz stromaufwärts des humanen Interferon-beta-Gens mit oder ohne Exposition gegenüber dem Sendi-Virus analysiert.Der Promotor Tata-Box und der bekannte proximale Enhancer können in einer virusabhängigen Weise eindeutig als informationsreiche Regionen identifiziert werden. Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in etwa einer Woche durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach diesem Verfahren wird dies der Fall sein. Andere Methoden wie EMCE und Protein-DNA-Affinitätserfassung können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. welcher Transkriptionsfaktor an kritische Nukleotide innerhalb einer aktiven DNA-Sequenz bindet.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Reporterbibliotheken vorbereiten, um die genregulatorischen Aktivitäten von Tausenden von DNA-Sequenzen parallel zu testen.

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