Generation und Reinigung von Menschen INO80 Chromatin Remodeling Komplexe und Subkomplexe

Das Ziel dieses Verfahrens ist die Generierung und Reinigung von Wildtyp- und Mutantenversionen der Multi-Untereinheit im oh 80 Chromatin Remodeling Complex. Dies wird erreicht, indem zunächst die Zellkerne aus Zellen isoliert werden, die Flaggenepitope exprimieren, die mit O 80-Proteinen markiert sind. Im zweiten Schritt werden Kernextrakte hergestellt, und dann werden die Wildtyp- oder mutierten Menschen in O 80 Chromatin-Remodeling-Komplexen durch Anti-Flag-Chromatographie gereinigt. Letztendlich können die Zusammensetzungen der Untereinheiten der gereinigten NO 80-Komplexe durch Western Blot oder Silberfärbung analysiert werden.

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen darüber zu beantworten, wie die Untereinheiten der MultiPro-Chromatin-Remodeling-Komplexe zu ihrer Gesamtaktivität beitragen. Diese Methode wurde speziell für die Untersuchung von Wildtyp- und Mutantenversionen des NO 80 Chromatin Remodeling-Komplexes entwickelt, kann aber auch zur Untersuchung anderer Kernkomplexe mit mehreren Untereinheiten verwendet werden. Wie der Mediator.

Der kritischste Schritt des Verfahrens ist der Schritt der nuklearen Extraktion. In der Regel stößt man auf ein Problem, weil man während der Salzextraktion dazu neigt, Salz zu schnell oder zu stark hinzuzufügen. Nach der Kultivierung Übertragen Sie die HEC 2 9 3 Zellen in Rollflaschen in ein abgestuftes konisches Röhrchen geeigneter Größe und schleudern Sie sie 10 Minuten lang bei 1000 mal G und vier Grad Celsius herunter. Nach dem Entfernen des Supinats messen Sie das Volumen des gepackten Zellpellets, suspendieren Sie das Pellet dann durch vorsichtiges Pipettieren wieder in fünf Packungen Zellvolumen von Puffer A und inkubieren Sie die Zellen genau 10 Minuten lang auf Eis.

Nachdem Sie die Zellen wieder heruntergeschleudert haben, messen Sie das Zellpellet ein zweites Mal, es sollte sich auf das Zweifache vergrößert haben. Diesmal resuspendieren Sie die Zellen in zwei Packungszellvolumina von Puffer A, dann übertragen Sie die Zellsuspension in einen entsprechend verkleinerten Gewebehomogenisator und homogenisieren Sie die Zellsuspension mit dem losen Glasstößel, bis 90% der Zellen positiv mit Trianblau-Zentrifuge gefärbt sind, die homogenisierten Zellen in einem 45-Milliliter-Hochgeschwindigkeitszentrifugenröhrchen für 20 Minuten bei 25, 000 mal G und vier Grad Celsius in einem Festwinkelrotor. Entfernen Sie dann die SUP-Natante, die die zytosolischen Proteine enthält, aus dem Kernpellet, um die Zellkerne mit Salz zu extrahieren.

Geben Sie nun 2,5 Milliliter Puffer C in das Pellet, jedoch alle drei Milliliter des anfänglich gepackten Zellvolumens. Entfernen Sie dann mit einer serologischen Pipette das Pellet von der Wand des Röhrchens und geben Sie die gesamte Mischung in einen Homogenisator geeigneter Größe. Homogenisieren Sie die Mischung mit zwei Schlägen eines losen Stößels, um die Kerne wiederzubeleben, suspendieren Sie sie und überführen Sie dann die resuspendierte nu-Kernfraktion in ein gekühltes Becherglas von einer solchen Größe, dass die Suspension das Becherglas bis zu einer Tiefe von mindestens 0,5 Zentimetern füllt.

Berechnen Sie als Nächstes das Volumen von fünf molaren Natriumchlorid, das benötigt wird, um die Lösung auf eine Endkonzentration von 0,42 molaren Natriumchlorid gemäß der folgenden Formel zu bringen. Geben Sie nun nach und nach das berechnete Volumen der Salzlösung tropfenweise hinzu, während Sie die Suspension vorsichtig mit einem Glasstab auf Eis setzen, um die Salzkonzentration der Suspension zu erhöhen, bis das gesamte Natriumchlorid zugegeben wurde und die Lösung sehr viskos wird. Übertragen Sie dann die viskose Suspension vorsichtig in 70-Milliliter-Polycarbonat-Röhrchen in einem Typ 45 TI-Rotor mit Kappenbaugruppe und verwenden Sie einen Mutator, um die versiegelten Röhrchen langsam bei vier Grad Celsius zu schaukeln. Nach 30 Minuten ultrazentrifugieren Sie die Proben in einem TI 45-Rotor für 30 Minuten bei 40.000 Mal G und vier Grad Celsius. und ziehen Sie den Kernextrakt mit den Überständen in einen einzigen Kunststoffbehälter.

Dann wird die Kernextraktlösung in normal große Aliquots aufgeteilt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei minus 80 Grad Celsius gelagert. Um Anti-Flag Aros für die Immunaufreinigung vorzubereiten, beginnen Sie mit einer 200-Mikroliter-Pipette mit dem Spitzenausschnitt, um 200 Mikroliter über eine 50%ige Anti-Flag Arous-Bead-Aufschlämmung in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen zu überführen. Die vorgewaschenen Kügelchen werden vor Stunden von vier Grad Celsius mit einer langsamen Drehung auf einem Laborrotator in ein konisches Röhrchen mit 10 Millilitern frisch aufgetautem Kernextrakt überführt und dann durch Zentrifugation von fünf Minuten bei 1000 mal G und vier Grad Celsius gesammelt.

Als nächstes waschen Sie den Perlenextrakt P in 10 Millilitern Läusen, vier 50er Puffer für fünf Minuten von vier Grad Celsius mit leichtem Schaukeln auf einem Mutator. Nachdem Sie die Perlenextraktmischung heruntergeschleudert haben, verwenden Sie sie erneut wieder. Suspendieren Sie das Pellet in 100 bis 150 Mikroliter frische Läuse vier 50 und geben Sie die Kügelchen in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.

Spülen Sie das konische 15-Milliliter-Röhrchen mit 100 bis 150 Mikrolitern Lysol 50 weiter, bis alle Kügelchen in das Mikrozentrifugenröhrchen übergegangen sind. Nach dem Schleudern in einer Mikrozentrifuge waschen Sie die Kügelchen dreimal mit einem Milliliter Lys four 50 und einmal mit einem Milliliter EB 100.Buffer. Um die gebundenen Proteine zu eluieren, fügen Sie dann 200 Mikroliter EB 100 Puffer hinzu, der das Flaggenpeptid enthält, und inkubieren Sie die Probe bei vier Grad Celsius auf einer Nuss.

Nach einer halben Stunde pelletieren Sie die Kügelchen in der Mikrozentrifuge, die Sie gewinnen, und übertragen Sie dann das SUP-Material mit dem eluierten OAC-C-Komplex in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen. Nachdem Sie das Elucian noch viermal wiederholt haben, leiten Sie das gezogene Eluat durch eine leere Spin-Säule, um alle verbleibenden Flaggen-Aero-Kügelchen aus der Proteinfraktion zu entfernen. Verwenden Sie schließlich ein zentrifugales Ultrafiltrationsgerät mit einem Cutoff von 50.000 Molekulargewichten, um die angedeutete Proteinfraktion etwa 10-fach zu konzentrieren.

Wie in dieser Abbildung dargestellt, kann die Reinheit der NO 80-Komplexe, die unter Verwendung der angegebenen Flaggen-Tag-Untereinheiten hergestellt wurden, wie gerade gezeigt, mit silbergefärbten SDS-Polyacrylamid-Gelen beurteilt werden. Alle Proteine, die in dieser Kontrollspur auftreten, sind Verunreinigungen, die unspezifisch an Flaggenflugzeuge binden. Diese Kennzeichnungen geben die Verbote an, die den getesteten NO 80-Untereinheiten entsprechen, und sie geben die Beweglichkeit der Molekulargewichtsmarker an.

Die Position des Wildtyps NO 80 ist durch das schwarze Quadrat gekennzeichnet, die Positionen der NO 80-Mutanten sind durch die offenen Kreise gekennzeichnet. Die durch die schwarze Linie getrennten Lanes stammen von separaten Gelen. Die Zusammensetzung der Komplexe kann mittels Western Blott anhand von Antikörpern gegen verschiedene NO 80-Untereinheiten bestimmt werden.

Zum Beispiel. Hier wurden die Untereinheiten des Endterminal-Domain-Moduls, des Helicase-Zentrum-zugeordneten Moduls und des SNF-Zwei-Moduls bewertet. Einmal gemeistert, kann diese Technik innerhalb eines Tages abgeschlossen werden, beginnend mit der Ernte der Zellen und endend mit der Reinigung der Komplexe.

Diese Technik wird es Forschern ermöglichen, Komplexe und Unterkomplexe mit mehreren Untereinheiten für Säugetierzellen zu reinigen, um ihre Funktionen zu untersuchen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, werden Sie ein besseres Verständnis dafür haben, wie Sie den Chromatin-Remodeling und andere Proteinkomplexe mit mehreren Untereinheiten aus menschlichen Zellen oder anderen Impulszelllinien reinigen können.