Name: Biochemischen Assays zur Analyse von Aktivitäten von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzyme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Lernen Sie biochemische Assays zur Analyse von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzymen mittels EMSA und Dünnschichtchromatographie. Diese Methoden ermöglichen die Messung von Nukleosomen-Sliding und ATPase-Aktivität.

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Die Arbeit im Labor der Autoren wird durch einen Zuschuss des National Institute of General Medical Sciences (GM41628) und durch einen Zuschuss an das Stowers Institute for Medical Research vom Helen Nelson Medical Research Fund bei der Greater Kansas City Community Foundation unterstützt.

1. ATP-abhängigen Nucleosome Remodeling Assays Zur Messung ATP-abhängige Nukleosom-Remodeling-Aktivitäten, immun INO80 oder INO80 Subkomplexe mit ATP und einem mononucleosomal Substrat, welches eine einzelne Nukleosomen an einem Ende eines 216-bp-, 32 P-markierten DNA-Fragment enthält, angeordnet inkubiert. Die Reaktionsprodukte werden dann einer Elektrophorese in nativen Polyacrylamid-Gelen unterzogen. <ol><li> Die 32 P-markierten, &quot;601&quot;-DNA-Fragment zu erzeugen, zu verstärken, aus pGEM-3Z-601 4 a 216 bp DNA-Fragment, enthaltend eine endständige 601 Nukleosomen Positionierungssequenz unter Verwendung der Oligonukleotide 5&#39;-und 5&#39;-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG als Vorwärts und Rückwärtsprimer. <ol><li> Einrichten einer 100 ul PCR-Reaktion, wie in Tabelle 1 beschrieben. </li><li> Die PCR-Reaktionen durchzuführen in einem Thermocycler mit folgendem Programm: 1 min bei 96 ° C, followed von 45 sec bei 94 ° C, 30 sec bei 57 ° C, 60 sec bei 72 ° C für 30 Zyklen; endend mit 7 min bei 72 ° C aufweist. </li><li> Nach der PCR-Reaktion abgeschlossen ist, entfernen Sie die eingebauten Nukleotiden, indem die Reaktionsprodukte durch Nuclease-Free-Spin-Säulen zweimal. </li><li> Versuch 5 ul des gereinigten PCR-Produkts in einem 1,2% Agarose-Gel, um zu bestätigen, dass die PCR-Reaktion erzeugt das gewünschte ~ 216 bp-DNA-Fragment. </li><li> Verdünnen 5 ul des gereinigten PCR-Produkt 20-fach, und messen Sie die DNA-Konzentration mit einem UV-Spektrophotometer. Der Durchschnittsertrag ist ~ 40 ng / ul. </li><li> Messung der Radioaktivität von 1 ul des gereinigten PCR-Produkts in einem Szintillationszähler. Schätzen Sie die Markierungseffizienz durch die Berechnung der cpm / ng. Eine erfolgreiche Markierungsreaktion wird erwartet, ~ 15.000 cpm / ng von 601 DNA-Fragment erhalten. </li></ol></li><li> HeLa-Zellen übertragen Nukleosomen auf der markierten DNA-601 über eine serielle Verdünnungsmethode 5. <ol><li> Mix 2 pmol32 P-markierten 601-DNA-Fragment mit 6 ug von Hela Nukleosomen (hergestellt wie beschrieben 5) in 50 ul eines Puffers, enthaltend 1,0 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF und 1 mM DTT und Inkubation bei 30 ° C für 30 min. </li><li> Sequentiell verdünnt das Gemisch auf 0,8 M, 0,6 M und 0,4 M NaCl durch Verdünnen mit 12,5 ul, 20,8 ul, und 41,6 ul jeweils 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, und 1 mM DTT, mit einer 30-minütigen Inkubation bei 30 ° C nach jeder Verdünnung. </li><li> Weiteren Verdünnung der Mischung auf 0,2 M und 0,1 M NaCl durch Zugabe von 125 ul und 250 ul des gleichen Puffers, enthaltend 0,1% Nonidet P-40, 20% Glycerin und 200 ug / ml BSA, mit einem 30-minütigen Inkubation bei 30 ° C zwischen den beiden letzten Verdünnungen. Speichern die mononucleosome Substrat bei 4 ° C für bis zu 3 Monate. </li></ol></li><li> Führen ATP-abhängige Nukleosom Schiebe Reaktionen in einem Gesamtvolumen von 10 ul. Das REAction Komponenten sind in Tabelle 2 aufgeführt. Da die optimale NaCl-Konzentration für INO80 Nukleosom Remodeling-Aktivität ~ 50 mM NaCl (unveröffentlichte Ergebnisse), passen die Gesamtkonzentration von NaCl in jedem Reaktions bis 50 mM, unter Berücksichtigung der Menge von NaCl in geschlossenen Zubereitungen von Nukleosomen und Enzym. <ol><li> Vor Beginn der Tests, um die Einrichtung, Guss nativen Polyacrylamid-Gele (18 x 16 cm). Um eine einzelne Gel mit 5% Acrylamid vorzubereiten (Acrylamid: Bisacrylamid 37,5: 1), 0,5 x TBE (45 mM Tris Borat, 1 mM EDTA), 0,01% Ammoniumpersulfat (APS) und 0,001% N, N, N&#39;, N&#39;-Tetramethylethylendiamin (TEMED), mischen Sie die in Tabelle 3 aufgeführten Zutaten. Lassen Sie das Gel für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur polymerisieren. </li><li> In der Zwischenzeit für jede Reaktion durchgeführt werden, verbinden sich in ein vorgekühltes 1,5 ml siliconisierten Mikrozentrifugenröhrchen ~ 20 nM INO80 oder INO80 Unterkomplex (hergestellt wie beschrieben 3) mit einer Menge von EB100 Puffer ( <strOng&gt; Tabelle 4) ausreichend ist, um ein Volumen von 4,75 ul zu ergeben. Sofort wieder einfrieren alle verbleibenden INO80 haltigen Fraktionen in Pulver Trockeneis oder flüssigem Stickstoff. </li><li> Einrichten einer Master-Cocktail mit dem Rest der Bestandteile, Skalieren um einen Faktor von &quot;X&quot; (X = Gesamtzahl der Reaktionen +3). Die Menge jedes Bestandteils für eine 10 ul-Reaktion benötigt wird, aufgelistet in Tabelle 5; das Rezept sollte entsprechend der Anzahl von Reaktionen durchgeführt werden skaliert werden. Gut mischen, indem Sie den Schlauch oder durch Auf-und Abpipettieren mit einer Pipetman und drehen Sie das Rohr für ein paar Sekunden in einer Tischmikrozentrifuge. </li><li> Verzichten 5,25 ul des Master-Cocktail zu jedem der Reaktionsgefäße in Schritt 1.3.2. Gut mischen durch Pipettieren von oben und unten. Starten Sie die Reaktionen, die durch ein auf 30 ° C Wärmeblock oder Wasserbad Übertragung Reaktionsröhrchen und Inkubation für 2 Stunden. </li><li> Unterdessen bereiten die &quot;Beseitigung Mix&quot; Cocktail enthält Konkurrenz-DNAund Nukleosomen, Skalieren um einen Faktor von X (X = Gesamtzahl der Reaktionen + 4). Die Menge jeder Zutat benötigt, um 1,5 ul Entfernen Mischung für einen einzigen Reaktion vorzubereiten ist in Tabelle 6; das Rezept sollte abhängig von der Anzahl von Assays durchgeführt werden skaliert werden. </li><li> Beenden Reaktionen durch Zugabe von 1,5 ul der Mischung zu entfernen. Gut mischen, Spin-down, und Inkubation bei 30 ° C für weitere 30 min. </li><li> Inzwischen Vorlauf die native Polyacrylamid-Gel in einer vertikalen Elektrophorese-Einheit bei 100 V für 30 min bei 4 ° C mit 0,5 x TBE als Laufpuffer mit einem magnetischen Rührstab in der unteren Kammer zu konstanten Pufferkreislauf aufrecht zu erhalten. </li><li> , Um die Probe zu laden, fügen 2,5 ul Ladefarbstoff enthält 3x TBE, 30% Glycerin, 0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylencyanol FF. Gut mischen, kurz drehen die Proben, und laden Sie auf das Gel mit Lade Tipps. </li><li> Die Elektrophorese bei 200 V für 4,5 h bei 4 ° C mit Puffer Zirkulation.</li><li> Um das Signal zu erfassen, zu übertragen, um das Gel zu einem Stapel aus zwei Blättern Filterpapier. Wickeln Sie das Filterpapier mit dem Gel auf mit klaren Plastikverpackung, und dann setzen Sie es zu einem Speicherleuchtschirm bei 4 ° C für die gewünschte Zeit. </li><li> Scannen Sie den Bildschirm mit einem Isotop Imaging-Scanner-System und mit einer geeigneten Software die Daten analysieren. </li></ol></li></ol> 2. Mononucleosome Bindungstests Um die Bindungsaffinität eines gegebenen INO80 komplex Mononukleosomen Assay, führen einem elektrophoretischen Mobility Shift Assay (EMSA) unter Verwendung der in Schritt 1.2 generiert mononucleosomal Substrat. <ol><li> Bis die Reaktion eingestellt Mischungen für Bindungsassays für Nukleosomen Umbau Assays beschrieben, aber lassen Sie die ATP und Entfernen Mix aus den Reaktionen; Inkubieren bei 30 ° C für 30 min. </li><li> Fügen 2,5 ul Beladungsfarbstoff zu jeder Reaktionsmischung und gelten für eine native Polyacrylamidgel, enthaltend 3,5% Acrylamid (Acrylamid: Bis 37,5: 1), 1% Glycerin, 0,5 × TBE, 0,01% APS und 0,001% TEMED. </li><li> Mit 0.5x TBE als Laufpuffer, führen Sie das Gel bei 200 V für 2,5 h bei 4 ° C mit Pufferkreislauf und setzen auf ein Speicherleuchtschirm. </li></ol> 3. DNA und Nukleosomen-abhängige ATPase-Assays Führen ATPase-Assays in 5 ul Reaktionsmischungen, enthaltend 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 60 mM NaCl, 6,6 mM MgCl 2, 0,8 mM EDTA, 0,015% Nonidet P-40, 2,5% Glycerin, 0,1 mg / ml BSA, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 2 mM ATP, 2 uCi [α- 32 P] ATP (3000 Ci / mmol). Für jedes komplexe INO80 oder die Menge des Komplexes zu prüfen INO80 bis drei Parallelreaktionen, eine mit EB100 Puffer, um DNA-oder Nukleosomen-unabhängige ATPase, ein Set bestehend messen geschlossen zirkuläre Plasmid-DNA (5000 bp, ~ 30 nM) zu messen, werden DNA- abhängige ATPase und eine mit Hela Oligonukleosomen (~ 185 nm), um Nukleosomen-abhängige ATPase messen. Richten Sie alle Reaktionen auf Eis. <ol&gt; <li> Für jede Reaktion kombinieren 10-50 nm der immun INO80 oder INO80 Subkomplexe mit einer Menge von EB100 Puffer ausreichend ist, um ein Volumen von 2,2 ul in vorgekühlte 1,5 ml geschmiert Mikrozentrifugenröhrchen geben. Sofort wieder einfrieren keine INO80 haltigen Fraktionen in Pulver Trockeneis oder flüssigem Stickstoff. </li><li> Richten Sie ein Master-Cocktail. Die Menge jedes Bestandteils für eine Reaktion benötigt, ist in Tabelle 7 aufgeführt. Maßstab das Rezept durch Skalieren um einen Faktor von 3 (X + 2) + 1, wobei X = Anzahl der INO80 Zubereitungen getestet werden. </li><li> Zur Vorbereitung &#39;Unter Cocktails &quot;, die Puffer nur, DNA oder Nukleosomen, verzichten 2,5 (X + 2) ul des Master-Cocktail in drei getrennten Röhren. Fügen 0,3 (X + 2) ul entweder EB100, geschlossene zirkuläre Plasmid-DNA (1,5 ug / ul) oder Hela Oligonukleosomen (1,5 ug / ul) und gut mischen. </li><li> Verzichten 2,8 ul der entsprechenden Sub-Cocktail auf die enzymhaltige Reaktionsgefäße bis in str gesetztEP 3.1. Sanft auf und ab pipettieren zu mischen; Einführung zu vermeiden Blasen. </li><li> Reaktionen beginnen, übertragen Sie die Reaktionsgefäße auf 30 ° C Wärmeblock. </li><li> Nach 5, 15, 30, und 60 min Inkubation, vor Ort 0,5 ul jeder Reaktionsgemisch auf ein Polyethylenimin Cellulose Dünnschicht-Chromatographie (DC) Platte (20 x 10 cm) in einer geraden Linie, die mindestens 1,5 cm von der Unterkante . Reaktionsgefäße sofort an die 30 ° C Wärmeblock so mehrere Zeitpunkte können aus einem einzigen Rohr genommen werden zurückkehren. Nach dem Spotten, trocknen die DC-Platten mit einem Föhn. </li><li> Übertragen Sie die DC-Platten auf einer Glaskammer, die genug 0,375 M Kaliumphosphat (pH 3,5), damit die unteren 0,5 cm von der DC-Platte in die Lösung eingetaucht werden. </li><li> Decken Sie die Kammer und zu entwickeln, bis die vor der Flüssigphase an die Spitze der DC-Platten erreicht. Sofort trocknen die Platten gründlich mit einem Föhn. </li><li> Setzen die getrockneten DC-Platten zu einem Storage Phosphor Screen bei RT.Scannen Sie den Bildschirm mit einem Isotop Imaging-Scanner-System und bestimmen die Menge an radioaktivem ATP und ADP-Substrat Produkt. </li><li> Um die Menge des ATP hydrolysiert berechnen, multiplizieren Sie die ATP% durch die Menge des vorhandenen ATP in der Startreaktionsmischung hydrolysiert nach der folgenden Formel: pmol ATP hydrolysiert = 10 pmol ATP in Ausgangsreaktions x [ADP / (ATP + ADP)] </li></ol>

<ol><li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">The biology of chromatin remodeling complexes.</a> Annual Review of Biochemistry. 78, 273-304 (2009).</li>
<li>Narlikar, G. J., Sundaramoorthy, R., Owen-Hughes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+and+functions+of+ATP-dependent+chromatin-remodeling+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mechanisms and functions of ATP-dependent chromatin-remodeling enzymes.</a> Cell. 154 (3), 490-503 (2013).</li>
<li>Chen, L., Ooi, S. K., Conaway, J. W., Conaway, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+purification+of+human+INO80+chromatin+remodeling+complexes+and+subcomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Generation and purification of human INO80 chromatin remodeling complexes and subcomplexes.</a> , (2013).</li>
<li>Lowary, P. T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> J. Mol. Biol. 276 (1), (1006).</li>
<li>Owen-Hughes, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+nucleosome+disruption+by+ATP-driven+chromatin+remodeling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of nucleosome disruption by ATP-driven chromatin remodeling complexes.</a> Methods Mol. Biol. 119, 319-331 (1999).</li>
<li>Udugama, M., Sabri, A., Bartholomew, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+INO80+ATP-dependent+chromatin+remodeling+complex+is+a+nucleosome+spacing+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The INO80 ATP-dependent chromatin remodeling complex is a nucleosome spacing factor.</a> Mol. Cell Biol. 31 (4), 662-673 (2011).</li>
<li>Jin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+chromatin+remodeling+complex+with+similarities+to+the+yeast+INO80+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A mammalian chromatin remodeling complex with similarities to the yeast INO80 complex.</a> Journal of Biological Chemistry. 280 (50), 41207-41212 (1074).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+organization+of+the+human+INO80+chromatin+remodeling+complex%3A+an+evolutionarily+conserved+core+complex+catalyzes+ATP-dependent+nucleosome+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Subunit organization of the human INO80 chromatin remodeling complex: an evolutionarily conserved core complex catalyzes ATP-dependent nucleosome remodeling.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (13), 11283-11289 (2011).</li>
<li>Hamiche, A., Sandaltzopoulos, R., Gdula, D. A., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP-dependent+histone+octamer+sliding+mediated+by+the+chromatin+remodeling+complex+NURF%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">ATP-dependent histone octamer sliding mediated by the chromatin remodeling complex NURF.</a> Cell. 97 (7), 833-842 (1999).</li>
<li>Polach, K. J., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restriction+enzymes+as+probes+of+nucleosome+stability+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Restriction enzymes as probes of nucleosome stability and dynamics.</a> Methods Enzymol. 304, 278-298 (1999).</li>
<li>Anderson, J. D., Thastrom, A., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+access+of+proteins+to+buried+nucleosomal+DNA+target+sites+occurs+via+a+mechanism+that+is+distinct+from+nucleosome+translocation%2C+Mol.Cell+Biol%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Spontaneous access of proteins to buried nucleosomal DNA target sites occurs via a mechanism that is distinct from nucleosome translocation, Mol.Cell Biol.</a> 22 (20), 7147-7157 (2002).</li>
<li>Saha, A., Wittmeyer, J., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodeling+through+directional+DNA+translocation+from+an+internal+nucleosomal+site%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodeling through directional DNA translocation from an internal nucleosomal site.</a> Nature Structural and Molecular Biology. 12 (9), 747-755 (2005).</li>
<li>Gottschalk, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28ADP-ribosyl%29ation+directs+recruitment+and+activation+of+an+ATP-dependent+chromatin+remodeler%2C+Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Poly(ADP-ribosyl)ation directs recruitment and activation of an ATP-dependent chromatin remodeler, Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.</a> 106 (33), 13770-13774 (2009).</li>
<li>Clapier, C. R., Cairns, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ISWI+involves+inhibitory+modules+antagonized+by+nucleosomal+epitopes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of ISWI involves inhibitory modules antagonized by nucleosomal epitopes.</a> Nature. 492 (7428), 280-284 (2012).</li>
<li>Brune, M., Hunter, J. L., Corrie, J. E. T., Direct Webb, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-Time+Measurement+of+Rapid+Inorganic+Phosphate+Release+Using+a+Novel+Fluorescent+Probe+and+Its+Application+to+Actomyosin+Subfragment+1+ATPase%2C+Biochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Real-Time Measurement of Rapid Inorganic Phosphate Release Using a Novel Fluorescent Probe and Its Application to Actomyosin Subfragment 1 ATPase, Biochemistry.</a> 33 (27), 8262-8271 (1994).</li>
<li>Luk, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stepwise+histone+replacement+by+SWR1+requires+dual+activation+with+histone+H2A.Z+and+canonical+nucleosome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Stepwise histone replacement by SWR1 requires dual activation with histone H2A.Z and canonical nucleosome.</a> Cell. 143 (5), 725-736 (2010).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Um sicherzustellen, dass Nukleosomen Umbau-und ATPase-Aktivitäten, die wir in Tests zu beobachten, hängt von der katalytischen Aktivität des INO80 Komplexe und nicht auf kontaminierende Umbau-und / oder ATPase-Enzyme, die wir routinemßig Assay Nukleosom Umbau-und ATPase-Aktivität der katalytisch inaktiven Versionen INO80 Komplexe, gereinigt parallel mit Wildtyp-INO80 mit dem gleichen Verfahren. Eine negative Kontrollreaktion fehlt ATP sollte auch bei der Untersuchung von Nukleosomen Umbau Aktivität, um das Vorhandensein...

SNF2 Familie Chromatin-Remodeling Komplexe umfassen eine zentrale SNF2-ATPase-Untereinheit wie 1,2. Einige SNF2 artigen ATPasen Funktion als einzelne Untereinheit Enzyme, andere Funktion als die katalytische Untereinheit von größeren Multi-Untereinheiten-Komplexen. Aufklärung der molekularen Mechanismen, durch die jede der Untereinheiten von Chromatin-Remodeling-Komplexe beitragen, ihre Tätigkeit erfordert die Fähigkeit, biochemische Assays, die die Umbauprozess auszuführen sezieren. ATP-abhängige Nukleosom-Remodeling vom menschlichen INO80 Komplex und andere Chromatin-Remodeling-Enzyme können nach einem mehrstufigen Prozess, der mit der Bindung des Enzyms an Nukleosomen Umbau beginnt in Betracht gezogen werden, gefolgt von der Aktivierung der DNA-und / oder Nukleosom-abhängige ATPase, Translokation des Enzyms auf Umbau nukleosomalen DNA und eventuelle Neupositionierung der Nukleosomen 1,2. Das Verständnis der molekularen Details der ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Prozess requires Dissektion der Umbau Reaktion in seine einzelnen Schritte des Wortes der Beiträge der einzelnen Untereinheiten des Chromatin-Remodeling-Komplexes, um jeden Schritt der Reaktion. Solche Analysen erfordern die Fähigkeit zur Analyse Nukleosomen Umbau-und andere Aktivitäten mit definierten molekularen Substrate in vitro. In einem früheren JOVE Protokoll beschrieben wir Verfahren verwendet werden, um INO80 Chromatin-Remodeling-Komplexe und Subkomplexe mit definierten Untereinheit 3 Kompositionen zu erzeugen. Hier präsentieren wir drei biochemischen Assays, die quantitative Analyse der Nukleosomen-Bindung, DNA und Nukleosomen-ATPase aktiviert, und Nukleosomen Umbau Aktivitäten mit solchen Komplexen assoziiert zu ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>Protease-Inhibitor-Cocktail</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>10x PCR-Reaktionspuffer</td><td>Roche Angewandte Wissenschaften&nbsp;</td><td></td><td></td>11435094001</tr><tr><td>Roche Taq DNA-Polymerase</td><td>Roche Angewandte Wissenschaft&nbsp;</td><td></td><td></td>11435094001</tr><tr><td>NucAway Nuklease-freie Spin-Säulen&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>Kat. # AM10070</td><td></td></tr><tr><td>hochreines ATP&nbsp;</td><td>USB/Affymetrix</td><td>77241 25 μm</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9418&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamid/Bis 37,5:1</td><td>Amresco</td><td>0254-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Beschallte Lachsspermien-DNAs&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>27-4565-01</td><td></td></tr><tr><td>10 % Ammoniumpersulfat (APS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>17874</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase&nbsp;</td><td>Novagen</td><td>Kat. Nr. 70664</td><td></td></tr><tr><td>dCTP, [&alpha;-32P]- 6.000 Ci/mmol</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU013Z250UC</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Thermocycler PTC 200</td><td>MJ Research</td><td>PTC 200</td><td></td></tr><tr><td>Hoefer vertikale Elektrophoreseeinheit</td><td>Hoefer</td><td>SE600X-15-1,5</td><td></td></tr><tr><td>geschmierte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>Speicher-Phosphor-Sieb</td><td>Molecular Dynamics</td><td>63-0034-79</td><td></td></tr><tr><td>3MM Filterpapier</td><td>Whatman&nbsp;</td><td>28458-005</td><td>VWR</td></tr><tr><td>Typhoon PhosphorImager&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant Software</td><td>GE Healthcare</td><td>ver2003.02</td><td></td></tr><tr><td>DC-Glasplatten, PEI-Cellulose F</td><td>Millipore</td><td>5725-7</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL Transfermembran 7 x 8,4</td><td>Millipore</td><td>IPFL07810</td><td></td></tr><tr><td>Allzweck-Vermessungsmessgerät mit Endfenster oder Pfannkuchensonde GM (Geiger-Müller)</td><td>Biodex</td><td>Modell 14C</td><td></td></tr></tbody></table>

biochemischen assays zur analyse von aktivitäten von atp-abhängigen chromatin-remodeling-enzyme

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Mitglieder der SNF2-Familie von ATPasen fungieren oft als Komponenten von Multi-Subunit-Chromatin-Remodeling-Komplexen, die die Nukleosomendynamik und DNA-Zugänglichkeit regulieren, indem sie den ATP-abhängigen Nukleosomenumbau katalysieren. Die biochemische Zerlegung der Beiträge einzelner Untereinheiten solcher Komplexe zur mehrstufigen ATP-abhängigen Chromatin-Umbaureaktion erfordert die Verwendung von Assays, die die Produktion von Reaktionsprodukten überwachen und die Bildung von Reaktionszwischenprodukten messen. Dieses JOVE-Protokoll beschreibt Assays, die es ermöglichen, die biochemischen Aktivitäten von Chromatin-Remodeling-Komplexen oder -Unterkomplexen zu messen, die verschiedene Kombinationen von Untereinheiten enthalten. Der Chromatin-Remodeling wird mit einem ATP-abhängigen Nukleosomen-Gleitassay gemessen, der die Bewegung eines Nukleosoms auf einem DNA-Molekül mit einer auf elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsassays (EMSA) basierenden Methode überwacht. Die Nukleosomenbindungsaktivität wird gemessen, indem die Bildung von komplexgebundenen Mononukleosomen im Umbau mit einer ähnlichen EMSA-basierten Methode überwacht wird, und die DNA- oder Nukleosomen-abhängige ATPase-Aktivität wird mittels Dünnschichtchromatographie (DC) gemessen, um die Umwandlungsrate von ATP in ADP und Phosphat in Gegenwart von DNA oder Nukleosomen zu messen. Mit diesen Assays kann man die Funktionen von Untereinheiten eines Chromatin-Remodeling-Komplexes untersuchen, indem man die Aktivitäten des gesamten Komplexes mit denen vergleicht, denen eine oder mehrere Untereinheiten fehlen. Als Beispiel wird der humane INO80-Chromatin-Remodeling-Komplex verwendet; Die hier beschriebenen Methoden können jedoch auf die Untersuchung anderer Chromatin-Remodeling-Komplexe angepasst werden.

Die Zahlen zeigen repräsentative Ergebnisse von biochemischen Tests zur INO80 Aktivitäten charakterisieren, einschließlich Nukleosomen Schiebe (Abbildung 1) und Bindung (Abbildung 2)-Assays und DNA-oder Nukleosomen-abhängige ATPase-Assays (Abbildung 3). Die in Figur 1 gezeigte Experiment vergleicht die Fähigkeit von intakten Komplexen durch INO80 FLAG-Ies2 oder FLAG-INO80E gereinigt und INO80 Subkomplexe durch entweder FLAG-...

Hier beschreiben wir biochemische Assays, die zur Charakterisierung von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzymen verwendet werden können, um 1) ATP-abhängiges Nukleosomengleiten zu katalysieren, 2) mit Nukleosomensubstraten zu interagieren und 3) ATP auf nukleosomen- oder DNA-abhängige Weise zu hydrolysieren.

Biochemischen Assays zur Analyse von Aktivitäten von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzyme

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Das Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, die verschiedenen biochemischen Aktivitäten eines TP-abhängigen chromatinumbauenden Komplexes zu messen. Dies wird erreicht, indem eine TP-abhängige Verschiebung eines positionierten Nukleosoms von einem Ende eines DNA-Moleküls in eine zentralere Position auf der DNA mittels eines elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsassays oder EMSA gemessen wird. Eine ähnliche auf EMSA basierende Methode kann verwendet werden, um die Bildung von umbaukomplexgebundenen Mononukleosomen zu überwachen, um die Nukleosombindungsaktivität der chromatinumbauenden Komplexe zu beurteilen.Zusätzlich kann die Dünnschichtchromatographie verwendet werden, um die APA-Aktivität TP-abhängiger chromatinremodelierender Komplexe zu messen. Letztendlich können diese Methoden eingesetzt werden, um die TP-abhängige Chromatinremodelierung humaner INO80-Komplexe zu untersuchen. In diesem Video werden wir biochemische Assays zur Untersuchung von INO80-Chromatinremodeling-Komplexen demonstrieren.Ähnliche Methoden können auch zur Untersuchung anderer Chromatin-Remodeling-Komplexe angewendet werden, um einen ATP-abhängigen Nukleosom-Remodeling-Assay durchzuführen. Bereiten Sie zunächst Nukleosom-Substrate vor, indem Sie eine 100 µL PCR-Reaktion wie in der Tabelle beschrieben einrichten. Führen Sie die PCR-Reaktionen in einem Thermocycler durch und leiten Sie die Reaktionsprodukte anschließend zweimal durch nukleasefreie Säulenchromatographie-Säulen, um nicht eingebaute Nukleotide zu entfernen.Mischen Sie anschließend zwei Mol des mit P-32 markierten 601-DNA-Fragments mit sechs Mikrogramm hiliären Nukleosomen in 50 Mikroliter Puffer und inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten bei 30 Grad Celsius. Verdünnen Sie die Mischung dann nacheinander auf 0,8 molare, 0,6 molare und 0,4 molare Natriumchloridlösung durch Zugabe von jeweils 12,5 Mikroliter, 20,8 Mikroliter und 41,6 Mikroliter Tris-HCl-Pufferlösung, die mit EDTA-PMSF und DTT ergänzt ist, und inkubieren Sie nach jeder Zugabe 30 Minuten bei 30 Grad Celsius, nach der letzten Inkubation zusätzlich mit 125 bzw. 250 Mikrolitern der Tris-Hydrochlorid-Pufferlösung. Führen Sie weitere zwei Verdünnungen unter Zugabe von nicht-invasivem P-40, Glycerin und PSA jeweils 30 Minuten bei 30 Grad Celsius auf 0,2 molare und 0,1 molare Natriumchloridlösung durch.Danach den mononukleosomalen Substrat bei vier Grad Celsius bis zu drei Monate lagern, bevor die Assays zur Herstellung nativer Polyacrylamidgele aufgebaut werden. Anschließend für jede durchzuführende Reaktion etwa 20 Nanomolar in OH 80 mit der entsprechenden Menge EB 100-Puffer kombinieren, ausreichend, um ein Volumen von 4,75 Mikrolitern in einer vorab gekühlten, silikonisierten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenprobe zu erreichen. Sofort alle verbleibenden NO-80-haltigen Fraktionen einfrieren, indem trockenes Pulver-Eis verwendet wird.Nächster Schritt: Geben Sie 5,25 µL der frisch zubereiteten Master-Cocktail in jedes Reaktionsröhrchen und mischen Sie gründlich durch mehrmaliges Auf- und Abpipettieren. Anschließend inkubieren Sie die Ansätze in einem Wärmeblock bei 30 °C. Am Ende der Inkubation geben Sie 1,5 µL der frisch zubereiteten Entfernungslösung zu jedem Röhrchen hinzu, um die Reaktionen zu beenden, und mischen danach jedes Reaktionsröhrchen. Zentrifugieren Sie sie gut ab und inkubieren Sie sie weitere 30 Minuten bei 30 Grad Celsius. In der Zwischenzeit führen Sie das native Polyacrylamidgel in einer vertikalen Elektrophoreseeinheit bei 100 Volt für 30 Minuten bei vier Grad Celsius vor, wobei Sie 0,5×TBE als Laufpuffer verwenden und einen magnetischen Rührstab in der unteren Kammer platzieren, um eine konstante Pufferzirkulation aufrechtzuerhalten. Am Ende der Inkubation geben Sie den Mix hinzu, mischen 2,5 Mikroliter Lade-Farbstoff mit jeder Reaktion und laden nach einer kurzen Zentrifugation die Proben mithilfe von Ladespitzen auf das Gel auf.Laufen Sie das Gel bei 200 Volt für 4,5 Stunden bei vier Grad Celsius mit Pufferzirkulation. Übertragen Sie dann das Gel auf einen Stapel aus zwei Filterpapierblättern und legen Sie die Filter mit dem Gel darauf ab, wobei Sie klare Plastikfolie verwenden, um das Signal nachzuweisen. Belichten Sie das Gel bei vier Grad Celsius für die gewünschte Zeit auf einem Speicherphosphor-Screen und scannen Sie anschließend den Screen mit einem Isotopen-Bildgebungssystem. Analysieren Sie die Daten mithilfe der geeigneten Software, um DNA- und Nukleosom-abhängige APA-Assays durchzuführen.Beginnen Sie damit, 10 bis 50 Nanomolar der immunoaffin gereinigten Subkomplexe mit einer Menge EEB 100-Puffer zu kombinieren, die ausreicht, um ein Volumen von 2,2 Mikrolitern in einem vorab gekühlten, geschmierten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pro Reaktion zu ergeben, und gefrieren Sie anschließend sofort alle NO 80-haltigen Fraktionen in pulverisiertem Trockeneis ein. Anschließend vorsichtig 2,8 Mikroliter frisch zubereitete Sub-Cocktails, die DNA-Nukleosomen oder keines von beiden enthalten, mit Auf- und Ab-Pipettieren in die enzymhaltigen Reaktionsröhrchen zu mischen und die Röhrchen in einen 30 °C warmen Wärmeprobehalter zu überführen. Danach mit einem Bleistift eine sehr schwache Linie mindestens 1,5 Zentimeter vom unteren Rand einer 20 mal 10 Polyethylenplatte entfernt einzeichnen.Ich meine eine Dünnschichtchromatographie-Platte oder TLC-Platte. Tragen Sie dann jeweils 0,5 Mikroliter der Reaktionsmischung auf die Linie bei 5, 15, 30 und 60 Minuten nach der Inkubation auf, wobei jede Probe unmittelbar danach wieder in den Heizblock zurückgebracht wird, sodass mehrere Zeitpunkte aus einem einzigen Reaktionsgefäß entnommen werden können. Nach dem Auftragen der letzten Probe trocknen Sie die Platte mit einem Föhn und überführen sie anschließend in eine Glaswanne, die ausreichend enthält.0,375 molares Kaliumphosphat, sodass die unteren 0,5 Zentimeter der Dünnschichtchromatographieplatte in die Lösung eingetaucht sind. Die Kammer verschließen und die Entwicklung so lange fortsetzen, bis die Laufmittelfront die Oberkante der Dünnschichtchromatographieplatte erreicht hat. Zu diesem Zeitpunkt sollte die Platte sofort abgetrocknet und bei Raumtemperatur einer Speicher-Phosphorfolie ausgesetzt werden. Abschließend die Folie mit einem Isotopen-Bildgebungssystem scannen, um die Menge an radioaktiv markiertem aTP-Substrat und aDP-Produkt zu bestimmen.Dieses erste Experiment zeigt, dass das Komplex durch Flag IES zwei Flag, N-O-A-T-E und Flag NO 80 delta N gereinigt wurde, wobei beide ähnliche Nukleosomen-Verschiebeaktivitäten aufweisen, was darauf hindeutet, dass das N-terminale Ende von NO 80 und/oder seine assoziierten Untereinheiten für die Nukleosomen-Remodeling-Aktivität des NO 80-Komplexes entbehrlich sind. Im Gegensatz dazu ist das durch Flag NO 80 delta n delta HSA gereinigte Komplex in diesem Assay inaktiv, was darauf hinweist, dass die Remodeling-Aktivität von der HSA-Domäne der NO 80 APAs und/oder ihren assoziierten Untereinheiten abhängt. Mithilfe einer modifizierten Version der NUKLEOSOM-Verschiebe-Assay-Prozedur kann man die Nukleosomen-Bindungsaktivität von Chromatin-Remodeling-Komplexen messen.In diesem Experiment führte die Inkubation der Nukleosomen mit zunehmenden Mengen intakter NO 80-Komplexe, die über die NO 80-E-Untereinheit gereinigt wurden, zu einem dosisabhängigen Verschwinden der Bande, die den freien Mononukleosomen entspricht, sowie zum Auftreten einer neuen verschobenen Spezies, die nahe dem oberen Rand des Gels wanderte. Im Gegensatz dazu wanderte bei Inkubation der Nukleosomen mit kleineren Komplexen, die über NO 80 delta N gereinigt und einen Teil der NO 80-Untereinheiten fehlten, die verschobene Spezies schneller, was darauf hindeutet, dass die relative Mobilität der super-verschobenen Bande durch die Größe der Komplexe im Assay bestimmt ist. In diesem letzten Experiment werden die Ergebnisse eines Assays gezeigt, der die DNA- und NUKLEOSOM-aktivierten APA-Aktivitäten zweier verschiedener NO 80-Subkomplexe vergleicht.Die langsamer wanderten Flecken entsprechen dem Ausgangsprodukt, dem mit α-32P-markierten ATP, während die schneller wanderten Spezies die Reaktionsprodukte ADP darstellen, wobei die Pfeile die Richtung der Lösungsmittelwanderung anzeigen. Bei Anwendung dieser Verfahren ist es wichtig, Assays durchzuführen, die sich in der Reaktionsdauer unterscheiden und verschiedene Enzymkonzentrationen enthalten. Dies gewährleistet, dass die Messungen in dem Bereich erfolgen, in dem die Produkt-Zeit- und Dosis-Wirkungskurven linear verlaufen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die Nukleosomenbindung und die Nukleosomenverschiebungsaktivität gereinigter Chromatin-Remodeling-Komplexe am TPA analysiert. Vergessen Sie nicht, dass der Umgang mit radioaktiven Materialien gefährlich sein kann. Man sollte Vorsichtsmaßnahmen treffen, wie das Tragen eines Laborkittels und von Augenschutz, die Überwachung auf radioaktive Kontamination sowie die ordnungsgemäße Entsorgung von radioaktivem Abfall.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Inhibitoren von Histonacetyltransferasen (HATs, auch bekannt als Lysin-Acetyltransferasen), wie CBP/p300, sind potenzielle Therapeutika zur Behandlung von Krebs. Es sind jedoch strenge Methoden zur Validierung dieser Inhibitoren erforderlich. Drei In-vitro-Methoden zur Validierung umfassen HAT-Assays mit rekombinanten Acetyltransferasen, Immunoblotting für Histonacetylierung in der Zellkultur und ChIP-qPCR.

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DNA-Vorhang, ein Hochdurchsatz-Einzelmolekül-Bildgebungsverfahren, bietet eine Plattform für die Echtzeit-Visualisierung verschiedener Protein-DNA-Interaktionen. Das vorliegende Protokoll verwendet die DNA-Vorhangtechnik, um die biologische Rolle und den molekularen Mechanismus von Abo1 zu untersuchen, einer Schizosaccharomyces pombe Bromodomänen-haltigen AAA+ ATPase.

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Biochemischen Assays zur Analyse von Aktivitäten von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzyme

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