Biochemischen Assays zur Analyse von Aktivitäten von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzyme

Das Ziel des folgenden Verfahrens ist es, die verschiedenen biochemischen Aktivitäten eines TP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Komplexes zu messen. Dies wird erreicht, indem ein TP-abhängiges Gleiten eines Positionsnukleosoms von einem Ende eines DNA-Moleküls zu einer zentraleren Position auf der DNA unter Verwendung eines elektrophoretischen Mobility Shift Assays oder emsa gemessen wird. Eine ähnliche EMSA-basierte Methode kann verwendet werden, um die Bildung von Remodeling-Komplex-gebundenen Mononukleo-Zonen zu überwachen, um die Nukleosomenbindungsaktivität der Chromatin-Remodeling-Komplexe zu beurteilen.

Zusätzlich kann die Dünnschichtchromatographie verwendet werden, um die APAs-Aktivität eines TP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Komplexes zu messen. Letztendlich können diese Methoden verwendet werden, um den a TP-abhängigen Chromatin-Remodeling von humanen in O 80-Komplexen zu messen. In diesem Video zeigen wir biochemische Assays, die NO 80 Chromatin-Remodeling-Komplexe untersuchen.

Ein ähnliches Verfahren kann auch angewendet werden, um andere Chromatin-Remodeling-Komplexe zu untersuchen, um den TP-abhängigen Nukleosomen-Remodeling-Assay durchzuführen. Bereiten Sie zunächst die Nukleosomensubstrate vor, nachdem Sie eine 100-Mikroliter-PCR-Reaktion eingerichtet haben, wie in der Tabelle beschrieben. Führen Sie die PCR-Reaktionen in einem Thermocycler durch und leiten Sie die Reaktionsprodukte dann zweimal durch nukleasefreie Spin-Säulen, um alle nicht eingebauten Nukleotide zu entfernen.

Mischen Sie als nächstes zwei ole P 32-markierte 6 0 1 DNA-Fragmente mit sechs Mikrogramm hilärer Nukleosomen in 50 Mikrolitern Puffer und inkubieren Sie die Mischung 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius. Dann verdünnen Sie das Gemisch nacheinander auf 0,8 molare, 0,6 molare und 0,4 molare Natriumchlorid durch Zugabe von 12,5 Mikrolitern, 20,8 Mikrolitern bzw. 41,6 Mikrolitern Tris-HCL-Pufferlösung, ergänzt mit E-D-T-A-P-M-S-F und DTT, inkubieren Sie nach jeder Zugabe 30 Minuten lang bei 30 Grad Celsius, nach der letzten Inkubation bei 125 und dann 250 Mikrolitern des Trishydrochlorid-Puffers. Weiter ergänzt mit nicht verschuldetem P 40 Glycerin und PSA in zwei weiteren Verdünnungen von 30 Minuten bei 30 Grad Celsius auf 0,2 molar bzw. 0,1 molar Natriumchlorid.

Lagern Sie dann das Mononukleosomensubstrat bis zu drei Monate bei vier Grad Celsius, bevor Sie die Assays einrichten und native Polyacrylamid-Gele gießen. Dann werden für jede durchzuführende Reaktion etwa 20 Nanomolar in oh 80 mit der entsprechenden Menge EB 100 Puffer kombiniert, die ausreicht, um ein Volumen von 4,75 Mikrolitern in einem vorgekühlten silikonisierten zu erhalten. 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen frieren sofort alle verbleibenden NO 80 enthaltenden Fraktionen wieder ein, imp Trockeneispulver.

Geben Sie anschließend 5,25 Mikroliter des frisch zubereiteten Master-Cocktails in jedes Reaktionsröhrchen und mischen Sie es gut, indem Sie auf und ab pipettieren. Dann inkubieren Sie die Reaktionen in einem 30 Grad Celsius heißen Block. Am Ende der Inkubation 1,5 Mikroliter frisch zubereitete Entnahmemischung in jedes Röhrchen geben, um die Reaktionen zu beenden, und dann jedes Reaktionsröhrchen mischen.

Nun, schleudern Sie sie herunter und brüten Sie sie weitere 30 Minuten bei 30 Grad Celsius. In der Zwischenzeit wird das native Polyacrylamid-Gel in einer vertikalen Elektrophoreseeinheit 30 Minuten lang bei 100 Volt bei vier Grad Celsius vorgeführt, wobei 0,5 XTBE als Laufpuffer mit einem magnetischen Rührstab in der unteren Kammer verwendet werden, um eine konstante Pufferzirkulation am Ende der Inkubation mit Entmischung aufrechtzuerhalten, und 2,5 Mikroliter Ladedüse mit jeder Reaktion mischen. Und nach einem kurzen Schleudern verwenden Sie Ladetipps, um die Proben auf das Gel zu laden.

Lassen Sie das Gel 4,5 Stunden lang bei 200 Volt bei vier Grad Celsius mit Pufferzirkulation laufen. Übertragen Sie dann das Gel auf einen Stapel von zwei Blättern Filterpapier und lassen Sie die Papierfilter mit dem Gel auf die Oberseite fallen, indem Sie durchsichtige Plastikfolie verwenden, um das Signal zu erkennen. Setzen Sie das Gel für die gewünschte Zeit einem Lagerphospho-Screening bei vier Grad Celsius aus, scannen Sie dann das Sieb mit einem Isotopen-Imaging-Scannersystem und analysieren Sie die Daten mit der entsprechenden Software, um die DNA- und Nukleosomen-abhängigen APA-Assays durchzuführen.

Beginnen Sie mit der Kombination von 10 bis 50 Nanomolar der immungereinigten Subkomplexe mit einer Menge eeb 100 Puffer, die ausreicht, um ein Volumen von 2,2 Mikrolitern in einem vorgekühlten, geschmierten 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen für jede Reaktion zu erhalten, und frieren Sie dann sofort alle NO 80 enthaltenden Fraktionen in pulverisiertem Trockeneis wieder ein. Mischen Sie dann vorsichtig 2,8 Mikroliter frisch zubereiteten Sub-Cocktails, die DNA-Nukleosomen oder keines von beidem enthalten, zu den enzymhaltigen Reaktionsröhrchen mit Auf- und Ab-Pipettieren und geben Sie die Röhrchen in einen 30 Grad Celsius heißen Block. Zeichnen Sie als Nächstes mit einem Bleistift eine sehr helle Linie mindestens 1,5 Zentimeter von der Unterkante eines 20 x 10 großen Polyethylens entfernt.

Ich meine Dünnschichtchromatographie oder DC-Platte. Platzieren Sie dann 0,5 Mikroliter jedes Reaktionsgemisches 5, 15, 30 und 60 Minuten nach der Inkubation auf der Linie und geben Sie jede Probe sofort wieder in den Heizblock zurück, so dass mehrere Zeitpunkte aus einem einzigen Röhrchen entnommen werden können. Nachdem Sie die letzte Probe aufgetragen haben, trocknen Sie die Platte mit einem Fön und geben Sie die Platte dann in eine Glaskammer, die genug enthält.

0,375 molares Kaliumphosphat, damit die unteren 0,5 Zentimeter der DC-Platte in die Lösung eingetaucht werden können. Decken Sie die Kammer ab und entwickeln Sie die Reaktion, bis die Vorderseite der flüssigen Phase die Oberseite der DC-Platte erreicht, woraufhin die Platte sofort föhngetrocknet und einem Lager-Phospho-Sieb bei Raumtemperatur ausgesetzt werden sollte. Scannen Sie abschließend den Bildschirm mit einem Isotopen-Bildgebungs-Scannersystem, um die Menge an radioaktivem Substrat auf einem TP-Substrat und einem DP-Produkt zu bestimmen.

Dieses erste Experiment zeigt, dass der Komplex durch die Flag IES zwei Flags, N-O-A-T-E und Flag NO 80 delta N gereinigt wird, ähnliche Nukleosomen-Gleitaktivitäten aufweisen, was darauf hindeutet, dass der NO 80 N-Terminus und/oder seine zugehörigen Untereinheiten für den Nukleosomenumbau durch den NO 80-Komplex entbehrlich sind. Im Gegensatz dazu ist der Komplex durch die Flagge NO 80 delta n delta HSA in diesem Assay inaktiv ist, was darauf hindeutet, dass die Umbauaktivität von der HSA-Domäne der NO 80 APAs und/oder ihrer zugehörigen Untereinheiten abhängt. Mit einer Modifikation des NUCLEOSOME sliding Assay-Verfahrens kann die Nukleosomenbindungsaktivität von Chromatin-Remodeling-Komplexen gemessen werden.

In diesem Experiment führte die Inkubation der Nukleosomen mit zunehmenden Mengen an intakten NO 80-Komplexen, die durch die NO 80 E-Untereinheit gereinigt wurden, zu einem dosisabhängigen Verschwinden der Bande, die den freien Mononukleozonen entspricht, und zum Auftreten einer neuen verschobenen Spezies, die in der Nähe der Oberseite des Gels migrierte. Im Gegensatz dazu wurden die Nukleosomen mit kleineren Komplexen inkubiert, die durch NO 80 delta N gereinigt wurden und denen eine Untergruppe von NO 80-Untereinheiten fehlte, während die verschobenen Spezies schneller migrierten, was darauf hindeutet, dass die relative Mobilität der superverschobenen Bande durch die Größe des Komplexes bestimmt wird. In diesem abschließenden Experiment werden die Ergebnisse eines Assays gezeigt, der die DNA- und NUCLEOSOM-aktivierten APAs-Aktivitäten von zwei verschiedenen NO 80-Subkomplexen vergleicht.

Die langsamer wandernden Flecken entsprechen dem als TP markierten Ausgangs-alpha 32 P, und die schneller wandernden Spezies sind die A DP-Reaktionsprodukte, wobei die Bereiche die Richtung der Lösungsmittelmigration anzeigen. Bei der Anwendung dieser Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, Assays durchzuführen, die unterschiedlich lange dauern und unterschiedliche Enzymkonzentrationen enthalten. Dadurch wird sichergestellt, dass Messungen durchgeführt werden, wenn die Zeit- und Dosis-Wirkungs-Kurven des Produkts linear sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Nukleosomenbindung und die Nukleosomengleiten von gereinigten Chromatin-Remodeling-Komplexen bei TPAs analysieren können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit radioaktiven Materialien gefährlich sein kann. Man sollte Vorsichtsmaßnahmen treffen, wie das Tragen eines Laborkittels und eines Augenschutzes, die Überwachung auf radioaktive Kontamination und die ordnungsgemäße Entsorgung von radioaktiven Abfällen.