Name: Biochemischen Assays zur Analyse von Aktivitäten von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzyme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Lernen Sie biochemische Assays zur Analyse von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzymen mittels EMSA und Dünnschichtchromatographie. Diese Methoden ermöglichen die Messung von Nukleosomen-Sliding und ATPase-Aktivität.

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Die Arbeit im Labor der Autoren wird durch einen Zuschuss des National Institute of General Medical Sciences (GM41628) und durch einen Zuschuss an das Stowers Institute for Medical Research vom Helen Nelson Medical Research Fund bei der Greater Kansas City Community Foundation unterstützt.

1. ATP-abhängigen Nucleosome Remodeling Assays Zur Messung ATP-abhängige Nukleosom-Remodeling-Aktivitäten, immun INO80 oder INO80 Subkomplexe mit ATP und einem mononucleosomal Substrat, welches eine einzelne Nukleosomen an einem Ende eines 216-bp-, 32 P-markierten DNA-Fragment enthält, angeordnet inkubiert. Die Reaktionsprodukte werden dann einer Elektrophorese in nativen Polyacrylamid-Gelen unterzogen. <ol><li> Die 32 P-markierten, &quot;601&quot;-DNA-Fragment zu erzeugen, zu verstärken, aus pGEM-3Z-601 4 a 216 bp DNA-Fragment, enthaltend eine endständige 601 Nukleosomen Positionierungssequenz unter Verwendung der Oligonukleotide 5&#39;-und 5&#39;-ACAGGATGTATATATCTGACACGTGCCTGG AATACTCAAGCTTGGATGCCTGCAG als Vorwärts und Rückwärtsprimer. <ol><li> Einrichten einer 100 ul PCR-Reaktion, wie in Tabelle 1 beschrieben. </li><li> Die PCR-Reaktionen durchzuführen in einem Thermocycler mit folgendem Programm: 1 min bei 96 ° C, followed von 45 sec bei 94 ° C, 30 sec bei 57 ° C, 60 sec bei 72 ° C für 30 Zyklen; endend mit 7 min bei 72 ° C aufweist. </li><li> Nach der PCR-Reaktion abgeschlossen ist, entfernen Sie die eingebauten Nukleotiden, indem die Reaktionsprodukte durch Nuclease-Free-Spin-Säulen zweimal. </li><li> Versuch 5 ul des gereinigten PCR-Produkts in einem 1,2% Agarose-Gel, um zu bestätigen, dass die PCR-Reaktion erzeugt das gewünschte ~ 216 bp-DNA-Fragment. </li><li> Verdünnen 5 ul des gereinigten PCR-Produkt 20-fach, und messen Sie die DNA-Konzentration mit einem UV-Spektrophotometer. Der Durchschnittsertrag ist ~ 40 ng / ul. </li><li> Messung der Radioaktivität von 1 ul des gereinigten PCR-Produkts in einem Szintillationszähler. Schätzen Sie die Markierungseffizienz durch die Berechnung der cpm / ng. Eine erfolgreiche Markierungsreaktion wird erwartet, ~ 15.000 cpm / ng von 601 DNA-Fragment erhalten. </li></ol></li><li> HeLa-Zellen übertragen Nukleosomen auf der markierten DNA-601 über eine serielle Verdünnungsmethode 5. <ol><li> Mix 2 pmol32 P-markierten 601-DNA-Fragment mit 6 ug von Hela Nukleosomen (hergestellt wie beschrieben 5) in 50 ul eines Puffers, enthaltend 1,0 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF und 1 mM DTT und Inkubation bei 30 ° C für 30 min. </li><li> Sequentiell verdünnt das Gemisch auf 0,8 M, 0,6 M und 0,4 M NaCl durch Verdünnen mit 12,5 ul, 20,8 ul, und 41,6 ul jeweils 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA, 0,1 mM PMSF, und 1 mM DTT, mit einer 30-minütigen Inkubation bei 30 ° C nach jeder Verdünnung. </li><li> Weiteren Verdünnung der Mischung auf 0,2 M und 0,1 M NaCl durch Zugabe von 125 ul und 250 ul des gleichen Puffers, enthaltend 0,1% Nonidet P-40, 20% Glycerin und 200 ug / ml BSA, mit einem 30-minütigen Inkubation bei 30 ° C zwischen den beiden letzten Verdünnungen. Speichern die mononucleosome Substrat bei 4 ° C für bis zu 3 Monate. </li></ol></li><li> Führen ATP-abhängige Nukleosom Schiebe Reaktionen in einem Gesamtvolumen von 10 ul. Das REAction Komponenten sind in Tabelle 2 aufgeführt. Da die optimale NaCl-Konzentration für INO80 Nukleosom Remodeling-Aktivität ~ 50 mM NaCl (unveröffentlichte Ergebnisse), passen die Gesamtkonzentration von NaCl in jedem Reaktions bis 50 mM, unter Berücksichtigung der Menge von NaCl in geschlossenen Zubereitungen von Nukleosomen und Enzym. <ol><li> Vor Beginn der Tests, um die Einrichtung, Guss nativen Polyacrylamid-Gele (18 x 16 cm). Um eine einzelne Gel mit 5% Acrylamid vorzubereiten (Acrylamid: Bisacrylamid 37,5: 1), 0,5 x TBE (45 mM Tris Borat, 1 mM EDTA), 0,01% Ammoniumpersulfat (APS) und 0,001% N, N, N&#39;, N&#39;-Tetramethylethylendiamin (TEMED), mischen Sie die in Tabelle 3 aufgeführten Zutaten. Lassen Sie das Gel für mindestens 2 Stunden bei Raumtemperatur polymerisieren. </li><li> In der Zwischenzeit für jede Reaktion durchgeführt werden, verbinden sich in ein vorgekühltes 1,5 ml siliconisierten Mikrozentrifugenröhrchen ~ 20 nM INO80 oder INO80 Unterkomplex (hergestellt wie beschrieben 3) mit einer Menge von EB100 Puffer ( <strOng&gt; Tabelle 4) ausreichend ist, um ein Volumen von 4,75 ul zu ergeben. Sofort wieder einfrieren alle verbleibenden INO80 haltigen Fraktionen in Pulver Trockeneis oder flüssigem Stickstoff. </li><li> Einrichten einer Master-Cocktail mit dem Rest der Bestandteile, Skalieren um einen Faktor von &quot;X&quot; (X = Gesamtzahl der Reaktionen +3). Die Menge jedes Bestandteils für eine 10 ul-Reaktion benötigt wird, aufgelistet in Tabelle 5; das Rezept sollte entsprechend der Anzahl von Reaktionen durchgeführt werden skaliert werden. Gut mischen, indem Sie den Schlauch oder durch Auf-und Abpipettieren mit einer Pipetman und drehen Sie das Rohr für ein paar Sekunden in einer Tischmikrozentrifuge. </li><li> Verzichten 5,25 ul des Master-Cocktail zu jedem der Reaktionsgefäße in Schritt 1.3.2. Gut mischen durch Pipettieren von oben und unten. Starten Sie die Reaktionen, die durch ein auf 30 ° C Wärmeblock oder Wasserbad Übertragung Reaktionsröhrchen und Inkubation für 2 Stunden. </li><li> Unterdessen bereiten die &quot;Beseitigung Mix&quot; Cocktail enthält Konkurrenz-DNAund Nukleosomen, Skalieren um einen Faktor von X (X = Gesamtzahl der Reaktionen + 4). Die Menge jeder Zutat benötigt, um 1,5 ul Entfernen Mischung für einen einzigen Reaktion vorzubereiten ist in Tabelle 6; das Rezept sollte abhängig von der Anzahl von Assays durchgeführt werden skaliert werden. </li><li> Beenden Reaktionen durch Zugabe von 1,5 ul der Mischung zu entfernen. Gut mischen, Spin-down, und Inkubation bei 30 ° C für weitere 30 min. </li><li> Inzwischen Vorlauf die native Polyacrylamid-Gel in einer vertikalen Elektrophorese-Einheit bei 100 V für 30 min bei 4 ° C mit 0,5 x TBE als Laufpuffer mit einem magnetischen Rührstab in der unteren Kammer zu konstanten Pufferkreislauf aufrecht zu erhalten. </li><li> , Um die Probe zu laden, fügen 2,5 ul Ladefarbstoff enthält 3x TBE, 30% Glycerin, 0,25% Bromphenolblau, 0,25% Xylencyanol FF. Gut mischen, kurz drehen die Proben, und laden Sie auf das Gel mit Lade Tipps. </li><li> Die Elektrophorese bei 200 V für 4,5 h bei 4 ° C mit Puffer Zirkulation.</li><li> Um das Signal zu erfassen, zu übertragen, um das Gel zu einem Stapel aus zwei Blättern Filterpapier. Wickeln Sie das Filterpapier mit dem Gel auf mit klaren Plastikverpackung, und dann setzen Sie es zu einem Speicherleuchtschirm bei 4 ° C für die gewünschte Zeit. </li><li> Scannen Sie den Bildschirm mit einem Isotop Imaging-Scanner-System und mit einer geeigneten Software die Daten analysieren. </li></ol></li></ol> 2. Mononucleosome Bindungstests Um die Bindungsaffinität eines gegebenen INO80 komplex Mononukleosomen Assay, führen einem elektrophoretischen Mobility Shift Assay (EMSA) unter Verwendung der in Schritt 1.2 generiert mononucleosomal Substrat. <ol><li> Bis die Reaktion eingestellt Mischungen für Bindungsassays für Nukleosomen Umbau Assays beschrieben, aber lassen Sie die ATP und Entfernen Mix aus den Reaktionen; Inkubieren bei 30 ° C für 30 min. </li><li> Fügen 2,5 ul Beladungsfarbstoff zu jeder Reaktionsmischung und gelten für eine native Polyacrylamidgel, enthaltend 3,5% Acrylamid (Acrylamid: Bis 37,5: 1), 1% Glycerin, 0,5 × TBE, 0,01% APS und 0,001% TEMED. </li><li> Mit 0.5x TBE als Laufpuffer, führen Sie das Gel bei 200 V für 2,5 h bei 4 ° C mit Pufferkreislauf und setzen auf ein Speicherleuchtschirm. </li></ol> 3. DNA und Nukleosomen-abhängige ATPase-Assays Führen ATPase-Assays in 5 ul Reaktionsmischungen, enthaltend 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 60 mM NaCl, 6,6 mM MgCl 2, 0,8 mM EDTA, 0,015% Nonidet P-40, 2,5% Glycerin, 0,1 mg / ml BSA, 1 mM DTT, 0,1 mM PMSF, 2 mM ATP, 2 uCi [α- 32 P] ATP (3000 Ci / mmol). Für jedes komplexe INO80 oder die Menge des Komplexes zu prüfen INO80 bis drei Parallelreaktionen, eine mit EB100 Puffer, um DNA-oder Nukleosomen-unabhängige ATPase, ein Set bestehend messen geschlossen zirkuläre Plasmid-DNA (5000 bp, ~ 30 nM) zu messen, werden DNA- abhängige ATPase und eine mit Hela Oligonukleosomen (~ 185 nm), um Nukleosomen-abhängige ATPase messen. Richten Sie alle Reaktionen auf Eis. <ol&gt; <li> Für jede Reaktion kombinieren 10-50 nm der immun INO80 oder INO80 Subkomplexe mit einer Menge von EB100 Puffer ausreichend ist, um ein Volumen von 2,2 ul in vorgekühlte 1,5 ml geschmiert Mikrozentrifugenröhrchen geben. Sofort wieder einfrieren keine INO80 haltigen Fraktionen in Pulver Trockeneis oder flüssigem Stickstoff. </li><li> Richten Sie ein Master-Cocktail. Die Menge jedes Bestandteils für eine Reaktion benötigt, ist in Tabelle 7 aufgeführt. Maßstab das Rezept durch Skalieren um einen Faktor von 3 (X + 2) + 1, wobei X = Anzahl der INO80 Zubereitungen getestet werden. </li><li> Zur Vorbereitung &#39;Unter Cocktails &quot;, die Puffer nur, DNA oder Nukleosomen, verzichten 2,5 (X + 2) ul des Master-Cocktail in drei getrennten Röhren. Fügen 0,3 (X + 2) ul entweder EB100, geschlossene zirkuläre Plasmid-DNA (1,5 ug / ul) oder Hela Oligonukleosomen (1,5 ug / ul) und gut mischen. </li><li> Verzichten 2,8 ul der entsprechenden Sub-Cocktail auf die enzymhaltige Reaktionsgefäße bis in str gesetztEP 3.1. Sanft auf und ab pipettieren zu mischen; Einführung zu vermeiden Blasen. </li><li> Reaktionen beginnen, übertragen Sie die Reaktionsgefäße auf 30 ° C Wärmeblock. </li><li> Nach 5, 15, 30, und 60 min Inkubation, vor Ort 0,5 ul jeder Reaktionsgemisch auf ein Polyethylenimin Cellulose Dünnschicht-Chromatographie (DC) Platte (20 x 10 cm) in einer geraden Linie, die mindestens 1,5 cm von der Unterkante . Reaktionsgefäße sofort an die 30 ° C Wärmeblock so mehrere Zeitpunkte können aus einem einzigen Rohr genommen werden zurückkehren. Nach dem Spotten, trocknen die DC-Platten mit einem Föhn. </li><li> Übertragen Sie die DC-Platten auf einer Glaskammer, die genug 0,375 M Kaliumphosphat (pH 3,5), damit die unteren 0,5 cm von der DC-Platte in die Lösung eingetaucht werden. </li><li> Decken Sie die Kammer und zu entwickeln, bis die vor der Flüssigphase an die Spitze der DC-Platten erreicht. Sofort trocknen die Platten gründlich mit einem Föhn. </li><li> Setzen die getrockneten DC-Platten zu einem Storage Phosphor Screen bei RT.Scannen Sie den Bildschirm mit einem Isotop Imaging-Scanner-System und bestimmen die Menge an radioaktivem ATP und ADP-Substrat Produkt. </li><li> Um die Menge des ATP hydrolysiert berechnen, multiplizieren Sie die ATP% durch die Menge des vorhandenen ATP in der Startreaktionsmischung hydrolysiert nach der folgenden Formel: pmol ATP hydrolysiert = 10 pmol ATP in Ausgangsreaktions x [ADP / (ATP + ADP)] </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Um sicherzustellen, dass Nukleosomen Umbau-und ATPase-Aktivitäten, die wir in Tests zu beobachten, hängt von der katalytischen Aktivität des INO80 Komplexe und nicht auf kontaminierende Umbau-und / oder ATPase-Enzyme, die wir routinemßig Assay Nukleosom Umbau-und ATPase-Aktivität der katalytisch inaktiven Versionen INO80 Komplexe, gereinigt parallel mit Wildtyp-INO80 mit dem gleichen Verfahren. Eine negative Kontrollreaktion fehlt ATP sollte auch bei der Untersuchung von Nukleosomen Umbau Aktivität, um das Vorhandensein...

SNF2 Familie Chromatin-Remodeling Komplexe umfassen eine zentrale SNF2-ATPase-Untereinheit wie 1,2. Einige SNF2 artigen ATPasen Funktion als einzelne Untereinheit Enzyme, andere Funktion als die katalytische Untereinheit von größeren Multi-Untereinheiten-Komplexen. Aufklärung der molekularen Mechanismen, durch die jede der Untereinheiten von Chromatin-Remodeling-Komplexe beitragen, ihre Tätigkeit erfordert die Fähigkeit, biochemische Assays, die die Umbauprozess auszuführen sezieren. ATP-abhängige Nukleosom-Remodeling vom menschlichen INO80 Komplex und andere Chromatin-Remodeling-Enzyme können nach einem mehrstufigen Prozess, der mit der Bindung des Enzyms an Nukleosomen Umbau beginnt in Betracht gezogen werden, gefolgt von der Aktivierung der DNA-und / oder Nukleosom-abhängige ATPase, Translokation des Enzyms auf Umbau nukleosomalen DNA und eventuelle Neupositionierung der Nukleosomen 1,2. Das Verständnis der molekularen Details der ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Prozess requires Dissektion der Umbau Reaktion in seine einzelnen Schritte des Wortes der Beiträge der einzelnen Untereinheiten des Chromatin-Remodeling-Komplexes, um jeden Schritt der Reaktion. Solche Analysen erfordern die Fähigkeit zur Analyse Nukleosomen Umbau-und andere Aktivitäten mit definierten molekularen Substrate in vitro. In einem früheren JOVE Protokoll beschrieben wir Verfahren verwendet werden, um INO80 Chromatin-Remodeling-Komplexe und Subkomplexe mit definierten Untereinheit 3 Kompositionen zu erzeugen. Hier präsentieren wir drei biochemischen Assays, die quantitative Analyse der Nukleosomen-Bindung, DNA und Nukleosomen-ATPase aktiviert, und Nukleosomen Umbau Aktivitäten mit solchen Komplexen assoziiert zu ermöglichen.

<table><tbody><tr><td>Protease-Inhibitor-Cocktail</td><td>Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>10x PCR-Reaktionspuffer</td><td>Roche Angewandte Wissenschaften&nbsp;</td><td></td><td></td>11435094001</tr><tr><td>Roche Taq DNA-Polymerase</td><td>Roche Angewandte Wissenschaft&nbsp;</td><td></td><td></td>11435094001</tr><tr><td>NucAway Nuklease-freie Spin-Säulen&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>Kat. # AM10070</td><td></td></tr><tr><td>hochreines ATP&nbsp;</td><td>USB/Affymetrix</td><td>77241 25 μm</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A9418&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>40% Acrylamid/Bis 37,5:1</td><td>Amresco</td><td>0254-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Beschallte Lachsspermien-DNAs&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>27-4565-01</td><td></td></tr><tr><td>10 % Ammoniumpersulfat (APS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>17874</td><td></td></tr><tr><td>Benzonase&nbsp;</td><td>Novagen</td><td>Kat. Nr. 70664</td><td></td></tr><tr><td>dCTP, [&alpha;-32P]- 6.000 Ci/mmol</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU013Z250UC</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Thermocycler PTC 200</td><td>MJ Research</td><td>PTC 200</td><td></td></tr><tr><td>Hoefer vertikale Elektrophoreseeinheit</td><td>Hoefer</td><td>SE600X-15-1,5</td><td></td></tr><tr><td>geschmierte 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen&nbsp;</td><td>Costar</td><td>3207</td><td></td></tr><tr><td>Speicher-Phosphor-Sieb</td><td>Molecular Dynamics</td><td>63-0034-79</td><td></td></tr><tr><td>3MM Filterpapier</td><td>Whatman&nbsp;</td><td>28458-005</td><td>VWR</td></tr><tr><td>Typhoon PhosphorImager&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>8600</td><td></td></tr><tr><td>ImageQuant Software</td><td>GE Healthcare</td><td>ver2003.02</td><td></td></tr><tr><td>DC-Glasplatten, PEI-Cellulose F</td><td>Millipore</td><td>5725-7</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL Transfermembran 7 x 8,4</td><td>Millipore</td><td>IPFL07810</td><td></td></tr><tr><td>Allzweck-Vermessungsmessgerät mit Endfenster oder Pfannkuchensonde GM (Geiger-Müller)</td><td>Biodex</td><td>Modell 14C</td><td></td></tr></tbody></table>

biochemischen assays zur analyse von aktivitäten von atp-abhängigen chromatin-remodeling-enzyme

Biochemical Assays for Analyzing Activities of ATP-dependent Chromatin Remodeling Enzymes

Mitglieder der SNF2-Familie von ATPasen fungieren oft als Komponenten von Multi-Subunit-Chromatin-Remodeling-Komplexen, die die Nukleosomendynamik und DNA-Zugänglichkeit regulieren, indem sie den ATP-abhängigen Nukleosomenumbau katalysieren. Die biochemische Zerlegung der Beiträge einzelner Untereinheiten solcher Komplexe zur mehrstufigen ATP-abhängigen Chromatin-Umbaureaktion erfordert die Verwendung von Assays, die die Produktion von Reaktionsprodukten überwachen und die Bildung von Reaktionszwischenprodukten messen. Dieses JOVE-Protokoll beschreibt Assays, die es ermöglichen, die biochemischen Aktivitäten von Chromatin-Remodeling-Komplexen oder -Unterkomplexen zu messen, die verschiedene Kombinationen von Untereinheiten enthalten. Der Chromatin-Remodeling wird mit einem ATP-abhängigen Nukleosomen-Gleitassay gemessen, der die Bewegung eines Nukleosoms auf einem DNA-Molekül mit einer auf elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsassays (EMSA) basierenden Methode überwacht. Die Nukleosomenbindungsaktivität wird gemessen, indem die Bildung von komplexgebundenen Mononukleosomen im Umbau mit einer ähnlichen EMSA-basierten Methode überwacht wird, und die DNA- oder Nukleosomen-abhängige ATPase-Aktivität wird mittels Dünnschichtchromatographie (DC) gemessen, um die Umwandlungsrate von ATP in ADP und Phosphat in Gegenwart von DNA oder Nukleosomen zu messen. Mit diesen Assays kann man die Funktionen von Untereinheiten eines Chromatin-Remodeling-Komplexes untersuchen, indem man die Aktivitäten des gesamten Komplexes mit denen vergleicht, denen eine oder mehrere Untereinheiten fehlen. Als Beispiel wird der humane INO80-Chromatin-Remodeling-Komplex verwendet; Die hier beschriebenen Methoden können jedoch auf die Untersuchung anderer Chromatin-Remodeling-Komplexe angepasst werden.

Die Zahlen zeigen repräsentative Ergebnisse von biochemischen Tests zur INO80 Aktivitäten charakterisieren, einschließlich Nukleosomen Schiebe (Abbildung 1) und Bindung (Abbildung 2)-Assays und DNA-oder Nukleosomen-abhängige ATPase-Assays (Abbildung 3). Die in Figur 1 gezeigte Experiment vergleicht die Fähigkeit von intakten Komplexen durch INO80 FLAG-Ies2 oder FLAG-INO80E gereinigt und INO80 Subkomplexe durch entweder FLAG-...

Hier beschreiben wir biochemische Assays, die zur Charakterisierung von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzymen verwendet werden können, um 1) ATP-abhängiges Nukleosomengleiten zu katalysieren, 2) mit Nukleosomensubstraten zu interagieren und 3) ATP auf nukleosomen- oder DNA-abhängige Weise zu hydrolysieren.

Biochemischen Assays zur Analyse von Aktivitäten von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzyme

Members of the SNF2 family of ATPases often function as components of multi-subunit chromatin remodeling complexes that regulate nucleosome dynamics and ...

Das Ziel des folgenden Verfahrens besteht darin, die verschiedenen biochemischen Aktivitäten eines TP-abhängigen chromatinumbauenden Komplexes zu messen. Dies wird erreicht, indem eine TP-abhängige Verschiebung eines positionierten Nukleosoms von einem Ende eines DNA-Moleküls in eine zentralere Position auf der DNA mittels eines elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsassays oder EMSA gemessen wird. Eine ähnliche auf EMSA basierende Methode kann verwendet werden, um die Bildung von umbaukomplexgebundenen Mononukleosomen zu überwachen, um die Nukleosombindungsaktivität der chromatinumbauenden Komplexe zu beurteilen.Zusätzlich kann die Dünnschichtchromatographie verwendet werden, um die APA-Aktivität TP-abhängiger chromatinremodelierender Komplexe zu messen. Letztendlich können diese Methoden eingesetzt werden, um die TP-abhängige Chromatinremodelierung humaner INO80-Komplexe zu untersuchen. In diesem Video werden wir biochemische Assays zur Untersuchung von INO80-Chromatinremodeling-Komplexen demonstrieren.Ähnliche Methoden können auch zur Untersuchung anderer Chromatin-Remodeling-Komplexe angewendet werden, um einen ATP-abhängigen Nukleosom-Remodeling-Assay durchzuführen. Bereit

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Protokoll beschreibt, wie Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) verwendet wird, um den dynamischen Veränderungen der Chromatin-Vorlage, die Transkription von einem Signaltransduktionsweg induziert regulieren zu studieren.

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) zur Assay Dynamische Histonmodifikationen in Activated Gene Expression in menschlichen Zellen

Chromatin Interaction Analysis von Paired-End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) ist eine Methode...

Chromatin Interaction Analysis gepaart mit End-Tag-Sequenzierung (Chia-PET) zur Abbildung von Chromatin-Wechselwirkungen zu verstehen und Transkriptionsregulation

Wir beschreiben ein grundlegendes Protokoll zur Quantifizierung der in vitro ATPase-Aktivität. Dieses Protokoll kann basierend auf dem Aktivitätsgrad und den Anforderungen an eine bestimmte gereinigte ATPase optimiert werden.

Messung<em&gt; In Vitro</em&gt; ATPase Aktivität für die enzymatische Charakterisierung

Sequentielle Salzgewinnung gebunden Chromatin Proteine ist ein nützliches Werkzeug für die Bestimmung der Bindungseigenschaften von großen Proteinkomplexen. Diese Methode kann verwendet werden, um die Rolle der einzelnen Untereinheiten oder Domänen in die allgemeine Affinität von einem Proteinkomplex, bulk-Chromatin zu bewerten.

Sequentielle Salz Extraktionen für die Analyse von Bulk-Chromatin bindenden Eigenschaften von Chromatin komplexe ändern

Dieses Protokoll beschreibt die kombinatorische Verwendung von ChIP-Seq, 4sU-Seq, total RNA-Seq und Ribosom profiling für Zelllinien und Primärzellen. Nachverfolgen von Änderungen im Transkriptionsfaktor verbindlich, de Novo Transkription, RNS-Verarbeitung, Umsatz und Übersetzung im Laufe der Zeit und zeigt den gesamten Verlauf der Ereignisse in aktivierten und/oder sich rasch verändernden Zellen ermöglicht.

Echtzeit-Analyse des Transkriptionsfaktors verbindlich, Transkription, Übersetzung und Umsatz, globale Ereignisse während der zellulären Aktivierung anzuzeigen

Inhibitoren von Histonacetyltransferasen (HATs, auch bekannt als Lysin-Acetyltransferasen), wie CBP/p300, sind potenzielle Therapeutika zur Behandlung von Krebs. Es sind jedoch strenge Methoden zur Validierung dieser Inhibitoren erforderlich. Drei In-vitro-Methoden zur Validierung umfassen HAT-Assays mit rekombinanten Acetyltransferasen, Immunoblotting für Histonacetylierung in der Zellkultur und ChIP-qPCR.

Assays zur Validierung von Histon-Acetyltransferase-Inhibitoren

Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Chromatinpräparation aus tiefgefrorenem Gewebe und eignet sich für die Vernetzung der Chromatin-Immunpräzipitation (X-ChIP), gefolgt von einer quantitativen PCR-Analyse (X-ChIP-qPCR) oder einem Next-Generation-Sequencing-Ansatz (X-ChIP-seq).

Chromatinextraktion aus gefrorenem chimärem Lebergewebe für die Chromatin-Immunpräzipitationsanalyse

Die Wechselwirkung eines ATP-abhängigen Chromatin-Remodelers mit einem DNA-Liganden wird mittels CD-Spektroskopie beschrieben. Die induzierten Konformationsänderungen an einem Genpromotor, die durch die erzeugten Peaks analysiert werden, können verwendet werden, um den Mechanismus der transkriptionellen Regulation zu verstehen.

CD-Spektroskopie zur Untersuchung von DNA-Protein-Wechselwirkungen

Dieses Protokoll beschreibt eine Reihe von Methoden, die eine analytische Größenausschlusschromatographie zur Untersuchung der Histon-Chaperon-Oligomerisierung und -stabilität, den Pull-Down-Assay zur Entschlüsselung von Histon-Chaperon-Histon-Interaktionen, die AUC zur Analyse der Stöchiometrie der Proteinkomplexe und den Histon-Chaperoning-Assay zur funktionellen Charakterisierung eines mutmaßlichen Histon-Chaperons in vitro umfassen.

In vitro Charakterisierung von Histon-Chaperonen mittels analytischer, Pull-Down- und Chaperoning-Assays

DNA-Vorhang, ein Hochdurchsatz-Einzelmolekül-Bildgebungsverfahren, bietet eine Plattform für die Echtzeit-Visualisierung verschiedener Protein-DNA-Interaktionen. Das vorliegende Protokoll verwendet die DNA-Vorhangtechnik, um die biologische Rolle und den molekularen Mechanismus von Abo1 zu untersuchen, einer Schizosaccharomyces pombe Bromodomänen-haltigen AAA+ ATPase.

Entschlüsselung des molekularen Mechanismus der Histonassemblierung mittels DNA-Vorhangtechnik

Schnelle und genaue chemische Assays zum Screening auf bestimmte Inhibitoren sind ein wichtiges Instrument in der Arzneimittelentwicklung. Hier präsentieren wir einen skalierbaren Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Hemmung der HAT1-Acetylierungsaktivität.

Ein Acetyl-Click-Chemie-Assay zur Messung der Histon-Acetyltransferase-1-Acetylierung

Lernen Sie biochemische Assays zur Analyse von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzymen mittels EMSA und Dünnschichtchromatographie. Diese Methoden ermöglichen die Messung von Nukleosomen-Sliding und ATPase-Aktivität.

Biochemischen Assays zur Analyse von Aktivitäten von ATP-abhängigen Chromatin-Remodeling-Enzyme

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