Name: Hydrogel-Nanopartikel Ernte von Plasma oder Urin zum Nachweis geringer Menge Proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-07T20:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Erfahren Sie, wie Hydrogel-Nanopartikel niedrig konzentrierte Biomarker aus Plasma oder Urin anreichern und erhalten. Diese Methode verbessert die Nachweisempfindlichkeit für diagnostische Proteinanalysen erheblich.

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Michael Henry, Dublin City University, freundlich mit der Datenerhebung und Analyse in Abbildung 5 dargestellt unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von (1) George Mason University, (2) die italienische IstitutoSuperiore di Sanita &#39;, die im Rahmen des Italien / USA Kooperationsvereinbarung zwischen dem US Department of Health and Human Services, George Mason University, und dem italienischen Gesundheitsministerium, (3) NIH, IMAT Programm Zuschüsse 1R21CA137706-01 und 1R33CA173359-01 LAL, und (4) Ceres Nanowissenschaften, Inc .

Humanplasma und Urin wurde von gesunden freiwilligen Spendern gesammelt, mit schriftlicher Einwilligung, nach der George Mason University Institutional Review Board genehmigt Protokolle. Spender wurden zu gleichen Teilen Männer und Frauen kaukasischen im Alter zwischen 25 und 42 Proben wurden einzeln analysiert zwischen verteilten und wurden nicht vereinigt. 1. Nanopartikel Verarbeitung von Serum-oder Plasma-Proben Potential niedrigen reichlich Biomarker im Plasma erfasst, in Lösung, mit Hydrogel-Nanopartikel. Die Teilchen dem Plasma inkubiert, durch Zentrifugation abgetrennt, gewaschen wird und die gefangenen Proteine ​​eluiert werden. Die eluierten Proteine ​​werden unter Stickstoffstrom für Downstream-Massenspektrometrie-Sequenzierung und Identifizierung getrocknet. <ol><li> 500 ul verdünnte Serum 1: 2 mit 50 mM Tris-HCl, pH 7 (500 ul Serum + 500 ul Tris-HCl) in einem Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Fügen Sie 500 ul von Poly (NIPAm / AAC) Kern NanOpArtikel. Inkubieren für 15 min bei RT. </li><li> Drehen die Probe bei 16.100 × g, 25 ° C für 10 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. </li><li> Gib 500 ul Natriumthiocyanat (25 mM) zu dem Pellet. Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. </li><li> Drehen die Probe bei 16.100 × g, 25 ° C für 10 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. </li><li> Fügen Sie 500 ul MilliQ Wasser auf die Nanopartikel-Pellets. Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. </li><li> Drehen die Probe bei 16.100 × g, 25 ° C für 10 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. </li><li> Bereiten Sie frischen Elutionspuffer: In 700 ul Acetonitril bis 300 ul Ammoniumhydroxid in ein sauberes Röhrchen. Achtung: Ammoniumhydroxid ist ätzend. Verwenden Sie bei entsprechender Belüftung. Hinweis: Der Elutionspuffer muss prep seinaRoten unmittelbar vor der Verwendung. Bewahren Sie die Elutionspuffer. </li><li> Werden 300 ul Elutionspuffer an das Nanopartikel Pellets. Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. Inkubieren für 15 min bei RT. </li><li> Drehen die Probe bei 16.100 × g, 25 ° C für 10 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor. Entfernen und speichern Sie das Eluat in einem sauberen, beschriftet Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,9 bis 1,10. Kombinieren Sie die beiden Eluate in einem Reaktionsgefäß. </li><li> Trocknen Sie die Eluate unter Stickstoffstrom in einem Stickstoffverdampfer Verteiler an 42,1 ° C, mit einem Luftstrom bis 8 (2F) eingestellt. </li><li> Das getrocknete Eluat bei RT O / N Lagerung oder bei -20 ° C für die Langzeitspeicherung, vor Massenspektrometrie, Western Blot oder ELISA-Tests (optional). </li></ol> 2. Nanopartikel Verarbeitung von Urinproben Normaler Urin enthält weniger als 30 mg / dl Protein undweniger als 1 + Blut. Doch viele Krankheiten / Bedingungen können die normalen Niveaus der Urin-Protein und Blut verändern. Um bei der Bestimmung der optimalen Volumen von Nanopartikeln auf die Urinprobe hinzu zu erleichtern, wird eine Urinanalyse vor Nanopartikel Ernte durchgeführt wird. Urin Biomarker in extrem niedrigen Konzentrationen, was erfordern kann, die Optimierung des Verhältnisses von Nanopartikeln Urinvolumen vorhanden ist. Dieses Verfahren beschreibt, Nanopartikel-Ernte von Urinproben für nachfolgende Western-Blot-Analyse. <ol><li> Sammeln Urinproben in einem sauberen, trockenen Plastikbecher. Ein 22 ml Minimalvolumen ist erforderlich. Shop Urinproben bei -80 ° C bis bereit zu analysieren. </li><li> Auftauen den gefrorenen Urin bei RT oder bei 4 ° CO / N. Kurz mischen auf einem Vortex-Mixer. Gießen von mindestens 22 ml Urin in einem 50 ml Polypropylen-Röhrchen mit konischem Boden. </li><li> Drehen Sie das Urin in einer Zentrifuge mit Ausschwingrotor bei 3.700 g für 15 min. Man dekantiert die Urin, ohne das Pellet zu stören, in eine saubere 50 ml konischen Boden polypropylene Röhre. Entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Urinanalyse durchgeführt mit Hilfe eines Multi-Analyt &quot;Urinstäbchen&quot; Reagensstreifen. Hinweis: Die Teststreifen zu speichern in einem dicht geschlossenen Behälter vor direkter Sonneneinstrahlung und Feuchtigkeit 17, 18. <ol><li> Legen Sie den Reagensstreifen, face-up, auf einem sauberen, trockenen Papiertuch. </li><li> Verwenden Sie einen Einweg-Pipetten zu 1 ml Urin in Schritt 2.3 vorbereitet anzusaugen. </li><li> Stellen Sie einen Timer für 2 min aber starten Sie nicht. Schnell verzichtet werden 1 - 2 Tropfen Urin auf jedem Testkissen des Reagenzstreifens. Der Timer sofort zu starten. Hinweis: Das Reagenz Streifen direkt in der Urinbehälter Tauchen Sie. Die Farbstoff / chemischen Indikatoren im Reagenz Streifen kann möglicherweise aus dem Reagensstreifen auslaugen in den Urinbehälter. </li><li> Zu dem Zeitpunkt, zu dem Reagenzstreifen Behälter angegeben, erfassen die qualitativen Ergebnisse der verschiedenen Analyten auf dem Reagenzstreifen durch Vergleich der Farbe der einzelnen Reagenzstreifen zur entsprechenden farbcodierten indicatoren auf der Reagenzienbehälter. Typische normale Urin Ergebnisse sind: (normal oder negativ) für Blut, Eiweiß, Leukozyten, Nitrit, Glucose, Keton, Bilirubin, Urobilinogen und; Urin-pH (5,5-7,0); spezifisches Gewicht (1,001 bis 1,020). Hinweis: Hohe Proteinspiegel in einer Urinprobe mit dem Protein von Interesse für die Bindungsstellen auf den Nanopartikeln zu konkurrieren. Um Protein Ernte mit Nanopartikeln zu maximieren, kann der Nanopartikel Volumen / Volumen-Verhältnis Urin zu beiden Grenz Konkurrenz von Hochfluss-Proteine ​​reguliert werden, oder optimiert werden, um Proteine, die in sehr geringen Konzentrationen vorhanden ernten werden. Wenn der Urin-Protein-Wert ist 1 + oder höher, fügen 2x Volumen von Nanopartikeln in Schritt 2.5 unten. Wenn der Analyt von Interesse ein sehr geringer häufigste Protein, kann es notwendig sein, das Volumen der Nanopartikel bis zu 2 ml (Figur 3) zu erhöhen. </li></ol></li><li> 20 ml des geklärten Urin aus Schritt 2.3 in ein sauberes 50-ml-Polypropylen-Röhrchen mit konischem Boden. Unterlassen Siestören jeglichen Schmutz / Pellet, das in dem Boden des Urinröhre sein kann. Geben Sie 200 ul von Nanopartikeln auf die 20 ml Urinprobe. Kurz mischen auf einem Vortex-Mixer. Hinweis: Wenn der Urin-Protein-Wert ist 1 + oder höher, fügen Sie 400 ul von Nanopartikeln auf 20 ml Urin. </li><li> Inkubieren der Urin / Nanopartikelmischung für 30 min bei RT ohne Schaukel / Mischen. </li><li> Drehen Sie das Urin / Nanopartikel-Suspension in einer Zentrifuge mit Ausschwingrotor ausgestattet bei 3.700 g für 10 min. Hinweis: Wenn ein Pellet ist nicht sichtbar Nach der Zentrifugation spinnen die Proben für eine zusätzliche 2 - 7 min. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie 500 ul MilliQ Wasser auf die Nanopartikel-Pellets. </li><li> Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. Übertragen Sie die Nanopartikel-Lösung für ein sauberes 1,5 ml Reaktionsgefäß. </li><li> Dreh die Nanopartikel in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor bei 16.100 × g für 10 min. Hinweis: Wenn ein Pellet nicht sichtbar ist folgenden Zentrifugation, drehen Sie die Proben für eine zusätzliche 2 - 7 min. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.8 und 2.11 (zweimal) mit 200 ul 18 MilliQ-Wasser, um die Nanopartikel zu waschen. </li><li> Bereiten Sie frischen Elutionspuffer: In 970 ul Acetonitril bis 30 ul Ammoniumhydroxid in ein sauberes Röhrchen. Achtung: Ammoniumhydroxid ist ätzend. Verwenden Sie bei entsprechender Belüftung. Hinweis: Der Elutionspuffer muss unmittelbar vor der Anwendung hergestellt werden. Bewahren Sie die Elutionspuffer. </li><li> Mit 20 ul Elutionspuffer an das Nanopartikel Pellets. Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. Inkubieren für 15 min bei RT. </li><li> Dreh die Nanopartikel-Proben bei 16.100 g für 10 min. Entfernen und den Überstand in ein sauberes 1,5 ml Reaktionsgefäß. Stören Sie nicht die Nanopartikel-Pellets. Entsorgen Sie die Pellets in der Biohazard Papierkorb. </li><li> Legen Sie die Proben in einem Rack in einem Laborabzug. Öffnen Sie die Kappen und incUbate bei RT für 30 min. Alternativ legen Sie die Proben unter Stickstoffstrom bei 40 ° C bis trocken (1 - 2 h). </li><li> Werden 15 ul Tris-Glycin-SDS-Probenpuffer (2 x) zu den Proben. Hitze bei 100 ° C in einer trockenen Wärmeblock für 5 min mit den Kappen offenen oder bis das Volumen in dem Rohr bleibt, ist nicht mehr als 20 ul. Hinweis: Verwenden Sie kein kochendes Wasserbad. Die Feuchtigkeit aus dem Wasserbad wird die Verdampfung des Puffers zu verhindern. </li><li> Legen Sie den Deckel auf den Rohren. Die Rohre aus dem Wärmeblock entfernen. Die Probe kann bei -80 ° C gelagert oder sofort für Downstream Western-Blot-Analyse verwendet werden. </li></ol>

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</ol>

Benjamin Espina ist ein Mitarbeiter von Ceres Nanosciences, Inc., das die in diesem Artikel verwendeten Reagenzien herstellt. Lance Liotta, Alessandra Luchini und Virginia Espina halten Patente (US-Patent 7,935,518 und/oder 8,497,137) auf die in diesem Artikel verwendete Nanopartikeltechnologie. Als Universitätsangestellte haben sie Anspruch auf Lizenzgebühren aus diesen Patenten gemäß den Richtlinien der Universität. Lance Liotta und Alessandra Luchini sind Anteilseigner von Ceres Nanosciences und gehören dem wissenschaftlichen Beirat an.

Klinische Relevanz Eine Serum oder Plasmaprobe wird angenommen, niedrig-abundanten zirkulierenden Proteinen und Peptiden, die eine reiche Quelle von Informationen über den Zustand des Organismus als Ganzes bereitstellen können, enthalten. Trotz der Versprechen der Serum Proteomik, gibt es drei grundlegende und schwerwiegende physiologische Barrieren Vereitelung Entdeckung von Biomarkern und die Übersetzung in die klinische Nutzen 10, 11, 16, 25. <p class="jove...

Trotz der Beendigung der Sequenzierung des menschlichen Genoms, hat bedeutende Fortschritte bei der Identifizierung von Biomarkern nicht prädiktiv frühen Stadium der Erkrankung durchgeführt wurden oder dass mit therapeutischen Ergebnis, Prognose oder 1 korrelieren. Ein Grund für diesen Mangel an Fortschritt ist, dass viele potenziell signifikante Biomarker in einer Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze der konventionellen Massenspektrometrie und andere Biomarker Discovery-Plattformen existieren. Massenspektrometrie (MS) und Multiple Reaction Monitoring (MRM) eine Erfassungsempfindlichkeit in der Regel mehr als 50 ng / ml, während die Mehrheit der Analyten von Immunoassays in klinischen Labors fallen in den Bereich gemessen zwischen 50 pg / ml und 10 ng / ml . Dies bedeutet, dass viele Biomarker, insbesondere im frühen Stadium einer Krankheit nicht durch konventionelle MS MRM und 2 erkannt werden. Neben der Anwesenheit von Hochfluss-Proteine, wie Albumin und Immunglobulin in komplexen biologischen Flüssigkeiten Maske oft Milliarden fache excess Nieder Fülle, geringes Gewicht Proteine ​​und Peptide Molekular 3, 4. Aus diesem Grund mehrere Probenvorbereitungsschritte sind erforderlich, vor der Massenspektrometrie-Sequenzierung und Identifizierung. Eine solche vorbereitenden Schritt setzt die Erschöpfung der Hochfluss-Proteine ​​mit handelsüblichen Erschöpfung Spalten 5-8. Leider ist dieser Schritt führt zur Verringerung der Ausbeute von Biomarker-Kandidaten, weil sie oft nicht-kovalent mit Trägerproteinen, die entfernt werden verbunden. Eine weitere Herausforderung wird durch die Stabilität der Biomarker-Kandidaten Ex-vivo dargestellt, sobald die Proben werden gesammelt. Proteine ​​unterliegen einem Abbau durch endogene oder exogene Proteasen 9. Hydrogel-Nanopartikel können diese kritischen Herausforderungen durch Verstärkung des mutmaßlichen Biomarker-Konzentration auf ein Niveau im Bereich des Assays zu überwinden, während der Schutz für das Protein vor dem Abbau 10-13. Es ist wichtig zu beachten, thbei LMW-Proteinen im Blut sind ein Gemisch von kleinen intakte Proteine ​​als auch Fragmente von großen Proteinen. Gewebe-abgeleitete Proteine ​​größer als 60 kDa sind zu groß, um den Blutstrom durch das Gefäß Basalmembran passiv geben, aber sie können im Blut als Peptide oder Proteinfragmente 14 dargestellt werden. Unser Ziel ist es, neue Umlauf Biomarker, die Kandidaten für die Früherkennung von Krankheiten, zur Stratifizierung von Patienten für die Therapie und Überwachung des Ansprechens auf die Therapie sein kann, zu messen. Unsere Nanopartikel sind geschaffen, um selektiv auszuschließen hoher Häufigkeit Immunglobuline und Albumin, wobei gleichzeitig die Erfassung kleiner Proteine ​​und Peptide und konzentriert sie bis zu 100-fach in Abhängigkeit von dem Ausgangsvolumen. Unsere Gruppe identifiziert eine Reihe von kleinen organischen Farbstoffe, die als hohe Affinität molekularen Köder erfolgreich agieren kann für Proteine ​​und Peptide. Protein-Farbstoff-Bindungs ​​wird angenommen, dass durch eine Kombination von hydrophoben und elektrostatischen Wechselwirkungs. Die aromatischen Ringe auf dem Farbstoff zu verschachteln mit Proteinen über hydrophobe Taschen auf der Proteinoberfläche 11. Die Köder, abhängig von ihrer Chemie, zeigen eine besondere Affinität für ausgewählte Klassen von Analyten. Die Köder konkurrieren mit den Trägerproteinen, wie Albumin, die für die Proteine ​​oder Peptide. Die niedermolekularen Proteine ​​/ Peptide werden im Partikel gefangen. Hochmolekulare Proteine ​​wie Albumin und Immunglobulin Eindringen von Teilchen durch die Sieb-Fähigkeit aufgrund der restriktiven Poren des Hydrogels 11 (Figur 1) verhindert. Hydrogel-Nanopartikel werden durch Fällung Polymerisation durch Ammoniumpersulfat 11 eingeleitet synthetisiert. N-Isopropylacrylamid (NIPAm) sind Comonomere Acrylsäure (AAc) und Allylamin (AA) und Vernetzer N, N&#39;-Methylenbisacrylamid (BIS) bei 70 ° C für 6 Stunden in verdünnter Lösung 1 reagieren1, 13. Die hohe Proteinbindungsaffinität von Poly (N-isopropylacrylamid-co-Acrylsäure) (Poly (NIPAm-co-AAc) nanoparticlesis durch kovalente Einbau aminogruppenhaltige Farbstoffe (dh., Sulfonatedanthraquinonetriazine Farbstoffe) in die Nanopartikel durch erreicht eine Amidierungsreaktion in wässrigen oder organischen Lösungsmitteln in Abhängigkeit von den hydrophilen / hydrophoben Eigenschaften der Farbstoffe durchgeführt 11, 13. nucleophile Substitution der Amingruppen in dem Nanopartikel mit dem Chloratom eines anthraquinonetriazine Farbstoff wird verwendet, um farbstoffhaltige Poly (NIPAm erstellen -CO-allylamin) (AA) Nanopartikel 11, 12. Ein zweistufiges Polymerisationsverfahren wird verwendet, um Hydrogel-Nanopartikel eine äußere Hülle aus Vinylsulfonsäure (VSA) 11, 13 enthält, zu schaffen. Hydrogel-Nanopartikel können auf verschiedenen biologischen Flüssigkeiten, wie Vollblut, Plasma, Serum, Zerebrospinalflüssigkeit, Schweiß und Urin verwendet werden. In einem Schritt, in Lösung, die nanoparticles führen Sie eine schnelle (innerhalb von Minuten) Beschlagnahme und Konzentration der niedermolekularen Analyten 10, 11, 13, 15-18. Proteine ​​werden anschließend von den Nanopartikeln eluiert und detektiert unter Verwendung von Western-Blotting 19-21, Massenspektrometrie 10, 11, 13, 15, 18, ​​22, 23, Immunoassays / ELISA 10, 11, 15, 18, ​​oder Umkehrphasen-Protein-Microarray 16, 24 Assays. Nanopartikel mit chemischen Köder funktionalisiert, und präsentiert eine Kern oder Kern-Schale-Architektur, erfassen und konzentrieren Proteine ​​auf der Grundlage der Köder / Schale physikalisch-chemischen Eigenschaften. Verschiedene Farbstoffe in die Nanopartikel eingebracht werden daher erfassen unterschiedliche Untergruppen von Proteinen mit unterschiedlicher Effizienz bezogen auf die Farbstoffaffinität, pH-Wert der Lösung und die Anwesenheit / Abwesenheit von konkurrierenden hochkonzentrierten Proteine ​​13. Darüber hinaus wird die Menge der Nanopartikel in Bezug auf das Volumen der Lösung, die Proteinausbeute aus den Nanopartikeln beeinflussen. Diese Aspekte derHydrogel-Nanopartikel Ernte werden mit drei verschiedenen Nanopartikel Köder zum Ernten von Proteinen aus Plasma-Proben, die große Mengen an Protein enthalten, nachgewiesen und von Urinproben, die in der Regel große Mengen an Protein enthalten. In diesem Protokoll Ernte und konzentriert Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF) aus Plasmaproben unter Verwendung von Poly (NIPAm-co-AAC), Poly (NIPAm / Farbstoff) und Kern-Schale-Nanopartikel zeigen wir (Poly (NIPAm-co-VSA)) . Poly (NIPAm / Farbstoff) Nanopartikel gezeigt, Mycobacterium-Spezies-Antigen, das für die menschliche Urinproben hinzugefügt wurde, zu konzentrieren, um Mycobacterium tuberculosis infizierte Personen zu imitieren.

<table><tbody><tr><td>Hydrogel-Nanopartikel</td><td>Ceres Nanoscience</td><td>CS003</td><td>NanoTrap ESP Partikel</td></tr><tr><td>18 M&Omega;-cm Wasser</td><td></td><td></td><td>Typ 1 Reagenzqualität Wasser</td></tr><tr><td>Tris HCl, 50 mM pH 7,0</td><td>VWR</td><td>IC816116</td><td>50 mM, pH 7</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>BDH</td><td>BDH1103-4LP</td><td>Erhältlich bei VWR</td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid NH4OH</td><td>BDH</td><td>BDH3014</td><td>Erhältlich bei VWR, untersucht bei 28-30 % NH3</td></tr><tr><td>Natriumthiocyanat 25 mM</td><td>Acros Organics</td><td>419675000</td><td>Für Serum-/Plasmaproben</td></tr><tr><td>Multi-Analyt Urin-Reagenzstreifen</td><td>Siemens</td><td>2161</td><td>Für Urinproben</td></tr><tr><td>Tris-Glycin SDS-Probenpuffer (2X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC2676</td><td>Verwendung bei RT, um die Ausfällung</td></tr> <tr><td>von SDS zu verhindernTrockenbad-Inkubator (100 oC) mit Heizblock</td><td>Barnstead</td><td>11-715-125DQ</td><td>Ersetzen Sie kein Siedewasserbad</td></tr><tr><td>Stickstoff-Verdampfer-Verteiler</td><td>Organomation Associates</td><td>Microvap118</td><td>Für Serum-/Plasmaproben</td></tr><tr><td>Zentrifuge, Ausschwingrotor</td><td>Sorvall</td><td>Legend Serie</td><td>50 ml Röhrcheninhalt, rcf 3.700 x g</td></tr><tr><td>Zentrifuge, Festwinkelrotor</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>1,7 ml Mikrozentrifugenkapazität, RCF 16.000 x g</td></tr><tr><td>50 ml konische Zentrifuge&nbsp; Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Mit Schraubverschlüssen für Urinproben</td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-755</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S04782</td><td>Sekunden/Minuten</td></tr></tbody></table>

hydrogel-nanopartikel ernte von plasma oder urin zum nachweis geringer menge proteine

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Roman Entdeckung neuer Biomarker spielt eine entscheidende Rolle bei der Bereitstellung von empfindlicher und spezifischer Nachweis von Krankheiten. Leider sind viele Niedrigfluss Biomarkern, die in biologischen Flüssigkeiten vorliegen können nicht leicht mit Massenspektrometrie oder Immunassays, weil sie in sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden sind, sind labil und werden häufig durch Hochfluss Proteine ​​wie Albumin oder Immunglobulin maskiert detektiert werden. Köder, die Poly (N-isopropylacrylamid) (NIPAm) auf Basis Nanopartikel sind in der Lage, diese physiologischen Barrieren zu überwinden. In einem Schritt sind sie in der Lage, zu erfassen, zu konzentrieren und zu bewahren Biomarkern aus Körperflüssigkeiten. Niedermolekularen Analyten geben Sie den Kern der Nanopartikel und werden von verschiedenen organischen chemischen Farbstoffen, die als hohe Affinität Protein Köder handeln gefangen genommen. Die Nanopartikel können die interessierenden Proteine ​​von mehreren Größenordnungen zu konzentrieren. Dieser Konzentrationsfaktor ausreicht, um den Proteingehalt zu erhöhen, so daß die Proteine ​​in derNachweisgrenze von Strom-Massenspektrometer, Western Blot und Immuntests. Nanopartikel können mit einer Vielzahl von biologischen Flüssigkeiten inkubiert werden und sie in der Lage, die Konzentration der Proteine ​​und Peptide Gewicht niedermolekulare stark anreichern, während ohne Albumin und andere Proteine ​​Gewichtshochmolekularen sind. Unsere Daten zeigen, dass eine 10000-fachen Verstärkung der Konzentration eines bestimmten Analyten erreicht werden kann, wodurch Massenspektrometrie und Immunoassays, zuvor nicht nachweisbar Biomarker zu detektieren.

Hydrogel Nanopartikelgröße und Gleichmäßigkeit Poly (NIPAm-AAC) Teilchen mit extrem hoher Ausbeute und Reproduzierbarkeit zwischen und innerhalb der Serie gefertigt. Die Teilchen haben eine sehr gute kolloidale Stabilität bei RT während der Zeit für die Erfassung, Speicherung, und die Elution von Proteinen (mindestens 48 Stunden) erforderlich ist und Nanopartikel Fällung wurde nicht beobachtet (Abbildung 1) 11. Die kolloidale Stabilität kann für d...

Mehrere pathologische Biomarker können mit den derzeitigen Techniken aufgrund ihrer geringen Konzentration in biologischen Flüssigkeiten, des Vorhandenseins von abbauenden Enzymen und großer Mengen an Proteinen mit hohem Molekulargewicht nicht leicht nachgewiesen werden. Chemisch funktionalisierte Hydrogel-Nanopartikel können Proteine mit geringer Abundanz ernten, konservieren und konzentrieren, was den Nachweis von bisher nicht nachweisbaren Biomarkern ermöglicht.

Hydrogel-Nanopartikel Ernte von Plasma oder Urin zum Nachweis geringer Menge Proteine

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Biomarker mit geringer Häufigkeit und niedrigem Molekulargewicht aus biologischen Flüssigkeiten in geeigneten Konzentrationen zu gewinnen, zu konzentrieren und zu konservieren. Bei Standard-Proteinassays wird dies erreicht, indem zunächst chemisch funktionalisierte Hydrogel-Nanopartikel in die biologische Flüssigkeit mit niedrigem Molekulargewicht gegeben werden. Analyten dringen in den Kern des Nanopartikels ein und werden von verschiedenen organischen chemischen Farbstoffen eingefangen, die als hochaffine Proteinköder fungieren.Der zweite Schritt besteht darin, die Partikel durch Zentrifugation aus dem Biofluid zu trennen. Die Nanopartikel konzentrieren die interessierenden Proteine um mehrere Größenordnungen. Die Nanopartikel werden dann mit Wasser gewaschen, um Fremdproteine zu entfernen.Der letzte Schritt besteht darin, die eingefangenen Proteine aus den Nanopartikeln zu eluieren. Letztendlich werden Western Blotting, Massenspektrometrie oder Aminoassays verwendet, um das Vorhandensein und/oder die Konzentration der zuvor nicht nachweisbaren geernteten Biomarker mit geringer Abundanz nachzuweisen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Nanopartikel gewaschen und die Wiederbelebung ausgesetzt werden müssen.Ohne die Pipettenspitze zu verstopfen, lassen sich die Nanopartikel nicht so leicht reanimieren wie eine Zelle, P.So Sie müssen kräftig auf und ab pipettieren, um die Nanopartikel nach der ersten Inkubation angemessen wiederzubeleben. Bei Nanopartikeln ist es wichtig, die Wände der Tube zu spülen, um eventuelle Rückstände von Nanopartikeln zu sammeln, die an der Tube haften bleiben könnten. Um die Nanopartikelverarbeitung von Serumproben durchzuführen, verdünnen Sie 500 Mikroliter Humanserum eins bis zwei mit 50 Millimolar Tris, HCL pH sieben in einem Mikrozentrifugenröhrchen.Fügen Sie 500 Mikroliter Poly- und ISOP-Propylacrylamid oder Polynipam-Co-Monomere von Acrylsäurekern-Nanopartikeln hinzu und inkubieren Sie 15 Minuten lang bei Raumtemperatur. Dann wird die Probe 10 Minuten lang bei 16, 100 G und 25 Grad Celsius geschleudert. In einer Zentrifuge, die mit einem Festwinkelrotor ausgestattet ist, das SUP-Natin entfernen und verwerfen, bevor 500 Mikroliter Natriumthiocyanat zum Pellet hinzugefügt werden, resuspendieren Sie die Nanopartikel, indem Sie mehrmals kräftig auf und ab pipettieren.Schleudern Sie die Probe wie zuvor und verwerfen Sie den Überstand, bevor Sie dem Nanopartikel-Pellet 500 Mikroliter Milli Q Wasser hinzufügen. Auch hier werden die Nanopartikel durch mehrmaliges Auf- und Abpumpen durch Wiederbelebung suspendiert. Nachdem ich die Probe erneut geschleudert hatte, hatte ich 300 Mikroliter frisches Elucian, pufferte und resuspendierte es mit der demonstrierten Technik.15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach einer letzten Drehung der Probe wird das EIT entfernt und in einem sauber beschrifteten Mikrozentrifugenröhrchen aufbewahrt. Eluieren Sie ein zweites Mal und kombinieren Sie die beiden EITs zu einer Mikrozentrifuge. Zwei.Trocknen Sie anschließend die EITs unter Stickstofffluss und einem Stickstoffverdampferverteiler bei 42,1 Grad Celsius und einem auf sechs eingestellten Luftstrom. Lagern Sie das getrocknete EIT bei Raumtemperatur für die Lagerung über Nacht oder fügen Sie minus 20 Grad Celsius für die Langzeitlagerung hinzu, bevor Massenspektrometrie, Western Blotting oder EISA-Assays durchgeführt werden, um die Nanopartikelverarbeitung von Urinproben durchzuführen. Sammeln Sie ein Mindestvolumen von 22 Millilitern und lagern Sie die Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis sie zur Analyse bereit sind.Tauen Sie den gefrorenen Urin bei Raumtemperatur oder bei vier Grad Celsius über Nacht auf. Nach dem Auftauen kurz auf einem Vortex-Mixer mischen. Gießen Sie dann mindestens 22 Milliliter Urin in ein 50-Milliliter-Röhrchen aus Polypropylen mit konischem Boden.Anschließend wird der Urin in einer Zentrifuge mit Ausschwingrotor 15 Minuten lang bei 3.700 G gedreht, ohne das Pellet zu stören. Dekantieren Sie den Urin in ein sauberes 50-Milliliter-Röhrchen aus Polypropylen mit konischem Boden und entsorgen Sie das Pellet. Führen Sie eine Urinanalyse mit einem Multianalyt-Urinmessstab-Reagenzstreifen durch.Legen Sie den Reagenzstreifen mit der bedruckten Seite nach oben auf ein sauberes, trockenes Papiertuch. Verwenden Sie eine Einwegpipette, um einen Milliliter des Urins abzusaugen. Geben Sie schnell ein bis zwei Tropfen Urin auf jedes Testpad des Reagenzstreifens.Starten Sie sofort einen Timer, der zuvor auf zwei Minuten zu der auf dem Reagenzstreifenbehälter angegebenen Zeit eingestellt wurde. Erfassen Sie die qualitativen Ergebnisse für die verschiedenen Analyten im Reagenzstreifen, indem Sie die Farbe der einzelnen Reagenzstreifens mit den entsprechenden farbcodierten Indikatoren auf dem Reagenzbehälter vergleichen. Typische normale Urinergebnisse zeichnen sich durch einen pH-Wert von 5,5 bis 7,0 und ein spezifisches Gewicht von 1,001 bis 1,020 aus.Der Urin sollte negativ für Blutprotein, Leukozyten, Nitrit, Glukose, Keton, Bilirubin und Urobilinogen sein. Übertragen Sie anschließend 20 Milliliter des geklärten Urins in ein sauberes 50-Milliliter-Röhrchen aus Polypropylen mit konischem Boden. Stören Sie keine Schmutzpellets, die sich am Boden des Urinschlauchs befinden könnten, aus dem Sie den Urin entfernen.Geben Sie 200 Mikroliter Nanopartikel zu der 20 Milliliter Urinprobe und mischen Sie sie kurz auf einem Vortex-Mischer. Inkubieren Sie dann das Urin-Nanopartikel-Gemisch 30 Minuten lang bei Raumtemperatur, ohne zu schaukeln oder zu mischen. Die Suspension der Urin-Nanopartikel wird in einer Zentrifuge, die mit einem Ausschwingrotor ausgestattet ist, 10 Minuten lang bei 3.700 mal G geschleudert.Nachdem Sie den Überstand entfernt und entsorgt haben, fügen Sie dem Nanopartikel-Pellet 500 Mikroliter Milli Q Wasser hinzu. Resuspendieren Sie die Nanopartikel, indem Sie mehrmals kräftig auf und ab pipettieren. Übertragen Sie die Nanopartikellösung in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen.Als nächstes drehen Sie die Nanopartikel in einer Zentrifuge, die mit einem festen Winkelrotor ausgestattet ist, 100 Mal G für 10 Minuten. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand, bevor Sie diese Schritte mit Wasser wiederholen. Um die Nanopartikel zu waschen, fügen Sie dem Nanopartikel-Pellet 20 Mikroliter frischen Elutionspuffer hinzu und resuspendieren Sie die Nanopartikel, indem Sie mehrmals kräftig auf und ab pipettieren.15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Schleudern Sie die Nanopartikelproben erneut, bevor Sie die Snat entfernen, ohne das Nanopartikel-Pellet zu zerstören und den Überstand in einem sauberen 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen aufzubewahren. Entsorgen Sie das Pellet im Müll für biologische Gefahren.Legen Sie die Proben in ein Gestell in einem chemischen Abzug. Öffnen Sie die Verschlüsse und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Alternativ können Sie die Proben bis zum Trocknen unter Stickstofffluss bei 40 Grad Celsius setzen.Geben Sie 15 Mikroliter Trisglycin-SDS-Probenpuffer zu den Proben. Erhitzen Sie bei 100 Grad Celsius in einem trockenen Heizblock fünf Minuten lang bei geöffneten Verschlüssen oder bis das verbleibende Volumen in der Tube nicht mehr als 20 Mikroliter beträgt. Setzen Sie die Kappe auf die Röhren und entfernen Sie die Röhren aus dem Heizblock.Die Probe kann bei minus 80 Grad Celsius gelagert oder sofort für die nachgelagerte Western-Blot-Analyse verwendet werden. Die 1D-Gelelektrophorese mit Silberfärbung demonstriert die Einfangung von Nanopartikeln und die Konzentration des Tumornekrosefaktors alpha aus menschlichem Plasma. Die Bande, die den Tumornekrosefaktor alpha darstellt, ist nur in den Nanopartikel-EITs vorhanden, die mit dem Buchstaben P für Partikel bezeichnet werden, nicht jedoch in den Überständen. Nanopartikel, die mit zwei verschiedenen chemischen Ködern funktionalisiert sind, sind in der Lage, verschiedene Konzentrationen von IL 17 aus dem Plasma-Western-Blot des Überstands und des Nanopartikels zu gewinnen.Das EIT weist eindeutig das Vorhandensein von IL 17 an der 17,5-Kilodalton-Bande im EIT nach, nicht jedoch in den überstehenden Nanopartikeln. Bei der Entnahme von Urinproben können bakterielle Antigene und Zytokine auf dieser silbergefärbten SDS-Seite aufgedeckt werden. Analyse von Urinproben, Proben in den Spuren U vier und U sechs sind Nanopartikel-EITs aus Urinproben, die RET ESAT sechs, ein Mycobacterium tuberculosis-assoziiertes Protein, und IL zwei A-Zytokin enthalten.Diese Proteine sind durch die markanten Banden bei 15 Kilodalton dargestellt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Gel-Nanopartikel verwendet werden können, um geringe verlassene Biomarker in biologischen Flüssigkeiten zu gewinnen, zu konzentrieren und zu konservieren und gleichzeitig unerwünschte verlassene Moleküle auszuschließen, wodurch die Nachweisempfindlichkeit aktueller Analysemethoden drastisch erhöht wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir haben eine Technologie auf mesoporösen Siliciumdioxid-Dünnschicht zur selektiven Rückgewinnung von niedermolekularen Proteinen und Peptiden aus Humanserum. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften unserer mesoporösen Chips wurden fein abgestimmt, um wesentliche Bereicherung in der Peptid-Kontrolle stellen und damit das Profil Serumproteom für diagnostische Zwecke.

Niedermolekulare Protein Enrichment auf mesoporösem Siliciumdioxid Dünnschichten für Biomarker Discovery

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von Exosomen aus menschlichem Urin unter Verwendung einer modifizierten Fällungstechnik.

Eine modifizierte Niederschlag Methode zu Urinary Exosomen Isolieren

Dieses Protokoll zeigt, wie eine femtomolare Nachweisempfindlichkeit von Proteinen in 10 μl Vollblut innerhalb von 30 min erreicht werden kann. Dies kann durch die Verwendung von elektrogesponnenen Nanofasermatten erreicht werden, die in eine Lab-on-a-Disc integriert sind und eine große Oberfläche sowie effektives Mischen und Waschen für ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis bieten.

Vollautomatische Schleuder Mikrofluidik-Vorrichtung zur Ultrasensitive Proteindetektion aus Vollblut

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll exosomen von Plasma und Serum mit reduzierter CO Reinigung nicht Exosomal Blut zu reinigen. Das optimierte Protokoll beinhaltet Ultrafiltration, Protease Behandlung und Größe Ausgrenzung Chromatographie. Verbesserte Reinigung von exosomen Vorteile nachgeschalteten Analysen, einschließlich genauere Quantifizierung von Vesikeln und Proteomic Charakterisierung.

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Die Verwendung von photoabbaubaren Hydrogelen zur Isolierung von Bakterienzellen unter Verwendung eines hochauflösenden Lichtmusterwerkzeugs wird berichtet. Wesentliche experimentelle Verfahren, Ergebnisse und Vorteile des Verfahrens werden überprüft. Die Methode ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Isolierung von Zielbakterien mit seltenen oder einzigartigen Funktionen aus heterogenen Gemeinschaften oder Populationen.

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Hydrogel-Nanopartikel Ernte von Plasma oder Urin zum Nachweis geringer Menge Proteine

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