Name: Hydrogel-Nanopartikel Ernte von Plasma oder Urin zum Nachweis geringer Menge Proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-07T20:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Erfahren Sie, wie Hydrogel-Nanopartikel niedrig konzentrierte Biomarker aus Plasma oder Urin anreichern und erhalten. Diese Methode verbessert die Nachweisempfindlichkeit für diagnostische Proteinanalysen erheblich.

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Michael Henry, Dublin City University, freundlich mit der Datenerhebung und Analyse in Abbildung 5 dargestellt unterstützt. Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt von (1) George Mason University, (2) die italienische IstitutoSuperiore di Sanita &#39;, die im Rahmen des Italien / USA Kooperationsvereinbarung zwischen dem US Department of Health and Human Services, George Mason University, und dem italienischen Gesundheitsministerium, (3) NIH, IMAT Programm Zuschüsse 1R21CA137706-01 und 1R33CA173359-01 LAL, und (4) Ceres Nanowissenschaften, Inc .

Humanplasma und Urin wurde von gesunden freiwilligen Spendern gesammelt, mit schriftlicher Einwilligung, nach der George Mason University Institutional Review Board genehmigt Protokolle. Spender wurden zu gleichen Teilen Männer und Frauen kaukasischen im Alter zwischen 25 und 42 Proben wurden einzeln analysiert zwischen verteilten und wurden nicht vereinigt. 1. Nanopartikel Verarbeitung von Serum-oder Plasma-Proben Potential niedrigen reichlich Biomarker im Plasma erfasst, in Lösung, mit Hydrogel-Nanopartikel. Die Teilchen dem Plasma inkubiert, durch Zentrifugation abgetrennt, gewaschen wird und die gefangenen Proteine ​​eluiert werden. Die eluierten Proteine ​​werden unter Stickstoffstrom für Downstream-Massenspektrometrie-Sequenzierung und Identifizierung getrocknet. <ol><li> 500 ul verdünnte Serum 1: 2 mit 50 mM Tris-HCl, pH 7 (500 ul Serum + 500 ul Tris-HCl) in einem Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Fügen Sie 500 ul von Poly (NIPAm / AAC) Kern NanOpArtikel. Inkubieren für 15 min bei RT. </li><li> Drehen die Probe bei 16.100 × g, 25 ° C für 10 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. </li><li> Gib 500 ul Natriumthiocyanat (25 mM) zu dem Pellet. Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. </li><li> Drehen die Probe bei 16.100 × g, 25 ° C für 10 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. </li><li> Fügen Sie 500 ul MilliQ Wasser auf die Nanopartikel-Pellets. Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. </li><li> Drehen die Probe bei 16.100 × g, 25 ° C für 10 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor. Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. </li><li> Bereiten Sie frischen Elutionspuffer: In 700 ul Acetonitril bis 300 ul Ammoniumhydroxid in ein sauberes Röhrchen. Achtung: Ammoniumhydroxid ist ätzend. Verwenden Sie bei entsprechender Belüftung. Hinweis: Der Elutionspuffer muss prep seinaRoten unmittelbar vor der Verwendung. Bewahren Sie die Elutionspuffer. </li><li> Werden 300 ul Elutionspuffer an das Nanopartikel Pellets. Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. Inkubieren für 15 min bei RT. </li><li> Drehen die Probe bei 16.100 × g, 25 ° C für 10 min in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor. Entfernen und speichern Sie das Eluat in einem sauberen, beschriftet Mikrozentrifugenröhrchen. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 1,9 bis 1,10. Kombinieren Sie die beiden Eluate in einem Reaktionsgefäß. </li><li> Trocknen Sie die Eluate unter Stickstoffstrom in einem Stickstoffverdampfer Verteiler an 42,1 ° C, mit einem Luftstrom bis 8 (2F) eingestellt. </li><li> Das getrocknete Eluat bei RT O / N Lagerung oder bei -20 ° C für die Langzeitspeicherung, vor Massenspektrometrie, Western Blot oder ELISA-Tests (optional). </li></ol> 2. Nanopartikel Verarbeitung von Urinproben Normaler Urin enthält weniger als 30 mg / dl Protein undweniger als 1 + Blut. Doch viele Krankheiten / Bedingungen können die normalen Niveaus der Urin-Protein und Blut verändern. Um bei der Bestimmung der optimalen Volumen von Nanopartikeln auf die Urinprobe hinzu zu erleichtern, wird eine Urinanalyse vor Nanopartikel Ernte durchgeführt wird. Urin Biomarker in extrem niedrigen Konzentrationen, was erfordern kann, die Optimierung des Verhältnisses von Nanopartikeln Urinvolumen vorhanden ist. Dieses Verfahren beschreibt, Nanopartikel-Ernte von Urinproben für nachfolgende Western-Blot-Analyse. <ol><li> Sammeln Urinproben in einem sauberen, trockenen Plastikbecher. Ein 22 ml Minimalvolumen ist erforderlich. Shop Urinproben bei -80 ° C bis bereit zu analysieren. </li><li> Auftauen den gefrorenen Urin bei RT oder bei 4 ° CO / N. Kurz mischen auf einem Vortex-Mixer. Gießen von mindestens 22 ml Urin in einem 50 ml Polypropylen-Röhrchen mit konischem Boden. </li><li> Drehen Sie das Urin in einer Zentrifuge mit Ausschwingrotor bei 3.700 g für 15 min. Man dekantiert die Urin, ohne das Pellet zu stören, in eine saubere 50 ml konischen Boden polypropylene Röhre. Entsorgen Sie die Pellets. </li><li> Urinanalyse durchgeführt mit Hilfe eines Multi-Analyt &quot;Urinstäbchen&quot; Reagensstreifen. Hinweis: Die Teststreifen zu speichern in einem dicht geschlossenen Behälter vor direkter Sonneneinstrahlung und Feuchtigkeit 17, 18. <ol><li> Legen Sie den Reagensstreifen, face-up, auf einem sauberen, trockenen Papiertuch. </li><li> Verwenden Sie einen Einweg-Pipetten zu 1 ml Urin in Schritt 2.3 vorbereitet anzusaugen. </li><li> Stellen Sie einen Timer für 2 min aber starten Sie nicht. Schnell verzichtet werden 1 - 2 Tropfen Urin auf jedem Testkissen des Reagenzstreifens. Der Timer sofort zu starten. Hinweis: Das Reagenz Streifen direkt in der Urinbehälter Tauchen Sie. Die Farbstoff / chemischen Indikatoren im Reagenz Streifen kann möglicherweise aus dem Reagensstreifen auslaugen in den Urinbehälter. </li><li> Zu dem Zeitpunkt, zu dem Reagenzstreifen Behälter angegeben, erfassen die qualitativen Ergebnisse der verschiedenen Analyten auf dem Reagenzstreifen durch Vergleich der Farbe der einzelnen Reagenzstreifen zur entsprechenden farbcodierten indicatoren auf der Reagenzienbehälter. Typische normale Urin Ergebnisse sind: (normal oder negativ) für Blut, Eiweiß, Leukozyten, Nitrit, Glucose, Keton, Bilirubin, Urobilinogen und; Urin-pH (5,5-7,0); spezifisches Gewicht (1,001 bis 1,020). Hinweis: Hohe Proteinspiegel in einer Urinprobe mit dem Protein von Interesse für die Bindungsstellen auf den Nanopartikeln zu konkurrieren. Um Protein Ernte mit Nanopartikeln zu maximieren, kann der Nanopartikel Volumen / Volumen-Verhältnis Urin zu beiden Grenz Konkurrenz von Hochfluss-Proteine ​​reguliert werden, oder optimiert werden, um Proteine, die in sehr geringen Konzentrationen vorhanden ernten werden. Wenn der Urin-Protein-Wert ist 1 + oder höher, fügen 2x Volumen von Nanopartikeln in Schritt 2.5 unten. Wenn der Analyt von Interesse ein sehr geringer häufigste Protein, kann es notwendig sein, das Volumen der Nanopartikel bis zu 2 ml (Figur 3) zu erhöhen. </li></ol></li><li> 20 ml des geklärten Urin aus Schritt 2.3 in ein sauberes 50-ml-Polypropylen-Röhrchen mit konischem Boden. Unterlassen Siestören jeglichen Schmutz / Pellet, das in dem Boden des Urinröhre sein kann. Geben Sie 200 ul von Nanopartikeln auf die 20 ml Urinprobe. Kurz mischen auf einem Vortex-Mixer. Hinweis: Wenn der Urin-Protein-Wert ist 1 + oder höher, fügen Sie 400 ul von Nanopartikeln auf 20 ml Urin. </li><li> Inkubieren der Urin / Nanopartikelmischung für 30 min bei RT ohne Schaukel / Mischen. </li><li> Drehen Sie das Urin / Nanopartikel-Suspension in einer Zentrifuge mit Ausschwingrotor ausgestattet bei 3.700 g für 10 min. Hinweis: Wenn ein Pellet ist nicht sichtbar Nach der Zentrifugation spinnen die Proben für eine zusätzliche 2 - 7 min. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. Fügen Sie 500 ul MilliQ Wasser auf die Nanopartikel-Pellets. </li><li> Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. Übertragen Sie die Nanopartikel-Lösung für ein sauberes 1,5 ml Reaktionsgefäß. </li><li> Dreh die Nanopartikel in einer Zentrifuge mit einem Festwinkelrotor bei 16.100 × g für 10 min. Hinweis: Wenn ein Pellet nicht sichtbar ist folgenden Zentrifugation, drehen Sie die Proben für eine zusätzliche 2 - 7 min. </li><li> Entfernen und entsorgen Sie den Überstand. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 2.8 und 2.11 (zweimal) mit 200 ul 18 MilliQ-Wasser, um die Nanopartikel zu waschen. </li><li> Bereiten Sie frischen Elutionspuffer: In 970 ul Acetonitril bis 30 ul Ammoniumhydroxid in ein sauberes Röhrchen. Achtung: Ammoniumhydroxid ist ätzend. Verwenden Sie bei entsprechender Belüftung. Hinweis: Der Elutionspuffer muss unmittelbar vor der Anwendung hergestellt werden. Bewahren Sie die Elutionspuffer. </li><li> Mit 20 ul Elutionspuffer an das Nanopartikel Pellets. Resuspendieren der Nanopartikel durch kräftiges und Abpipettieren mehrmals. Inkubieren für 15 min bei RT. </li><li> Dreh die Nanopartikel-Proben bei 16.100 g für 10 min. Entfernen und den Überstand in ein sauberes 1,5 ml Reaktionsgefäß. Stören Sie nicht die Nanopartikel-Pellets. Entsorgen Sie die Pellets in der Biohazard Papierkorb. </li><li> Legen Sie die Proben in einem Rack in einem Laborabzug. Öffnen Sie die Kappen und incUbate bei RT für 30 min. Alternativ legen Sie die Proben unter Stickstoffstrom bei 40 ° C bis trocken (1 - 2 h). </li><li> Werden 15 ul Tris-Glycin-SDS-Probenpuffer (2 x) zu den Proben. Hitze bei 100 ° C in einer trockenen Wärmeblock für 5 min mit den Kappen offenen oder bis das Volumen in dem Rohr bleibt, ist nicht mehr als 20 ul. Hinweis: Verwenden Sie kein kochendes Wasserbad. Die Feuchtigkeit aus dem Wasserbad wird die Verdampfung des Puffers zu verhindern. </li><li> Legen Sie den Deckel auf den Rohren. Die Rohre aus dem Wärmeblock entfernen. Die Probe kann bei -80 ° C gelagert oder sofort für Downstream Western-Blot-Analyse verwendet werden. </li></ol>

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</ol>

Benjamin Espina ist ein Mitarbeiter von Ceres Nanosciences, Inc., das die in diesem Artikel verwendeten Reagenzien herstellt. Lance Liotta, Alessandra Luchini und Virginia Espina halten Patente (US-Patent 7,935,518 und/oder 8,497,137) auf die in diesem Artikel verwendete Nanopartikeltechnologie. Als Universitätsangestellte haben sie Anspruch auf Lizenzgebühren aus diesen Patenten gemäß den Richtlinien der Universität. Lance Liotta und Alessandra Luchini sind Anteilseigner von Ceres Nanosciences und gehören dem wissenschaftlichen Beirat an.

Klinische Relevanz Eine Serum oder Plasmaprobe wird angenommen, niedrig-abundanten zirkulierenden Proteinen und Peptiden, die eine reiche Quelle von Informationen über den Zustand des Organismus als Ganzes bereitstellen können, enthalten. Trotz der Versprechen der Serum Proteomik, gibt es drei grundlegende und schwerwiegende physiologische Barrieren Vereitelung Entdeckung von Biomarkern und die Übersetzung in die klinische Nutzen 10, 11, 16, 25. <p class="jove...

Trotz der Beendigung der Sequenzierung des menschlichen Genoms, hat bedeutende Fortschritte bei der Identifizierung von Biomarkern nicht prädiktiv frühen Stadium der Erkrankung durchgeführt wurden oder dass mit therapeutischen Ergebnis, Prognose oder 1 korrelieren. Ein Grund für diesen Mangel an Fortschritt ist, dass viele potenziell signifikante Biomarker in einer Konzentration unterhalb der Nachweisgrenze der konventionellen Massenspektrometrie und andere Biomarker Discovery-Plattformen existieren. Massenspektrometrie (MS) und Multiple Reaction Monitoring (MRM) eine Erfassungsempfindlichkeit in der Regel mehr als 50 ng / ml, während die Mehrheit der Analyten von Immunoassays in klinischen Labors fallen in den Bereich gemessen zwischen 50 pg / ml und 10 ng / ml . Dies bedeutet, dass viele Biomarker, insbesondere im frühen Stadium einer Krankheit nicht durch konventionelle MS MRM und 2 erkannt werden. Neben der Anwesenheit von Hochfluss-Proteine, wie Albumin und Immunglobulin in komplexen biologischen Flüssigkeiten Maske oft Milliarden fache excess Nieder Fülle, geringes Gewicht Proteine ​​und Peptide Molekular 3, 4. Aus diesem Grund mehrere Probenvorbereitungsschritte sind erforderlich, vor der Massenspektrometrie-Sequenzierung und Identifizierung. Eine solche vorbereitenden Schritt setzt die Erschöpfung der Hochfluss-Proteine ​​mit handelsüblichen Erschöpfung Spalten 5-8. Leider ist dieser Schritt führt zur Verringerung der Ausbeute von Biomarker-Kandidaten, weil sie oft nicht-kovalent mit Trägerproteinen, die entfernt werden verbunden. Eine weitere Herausforderung wird durch die Stabilität der Biomarker-Kandidaten Ex-vivo dargestellt, sobald die Proben werden gesammelt. Proteine ​​unterliegen einem Abbau durch endogene oder exogene Proteasen 9. Hydrogel-Nanopartikel können diese kritischen Herausforderungen durch Verstärkung des mutmaßlichen Biomarker-Konzentration auf ein Niveau im Bereich des Assays zu überwinden, während der Schutz für das Protein vor dem Abbau 10-13. Es ist wichtig zu beachten, thbei LMW-Proteinen im Blut sind ein Gemisch von kleinen intakte Proteine ​​als auch Fragmente von großen Proteinen. Gewebe-abgeleitete Proteine ​​größer als 60 kDa sind zu groß, um den Blutstrom durch das Gefäß Basalmembran passiv geben, aber sie können im Blut als Peptide oder Proteinfragmente 14 dargestellt werden. Unser Ziel ist es, neue Umlauf Biomarker, die Kandidaten für die Früherkennung von Krankheiten, zur Stratifizierung von Patienten für die Therapie und Überwachung des Ansprechens auf die Therapie sein kann, zu messen. Unsere Nanopartikel sind geschaffen, um selektiv auszuschließen hoher Häufigkeit Immunglobuline und Albumin, wobei gleichzeitig die Erfassung kleiner Proteine ​​und Peptide und konzentriert sie bis zu 100-fach in Abhängigkeit von dem Ausgangsvolumen. Unsere Gruppe identifiziert eine Reihe von kleinen organischen Farbstoffe, die als hohe Affinität molekularen Köder erfolgreich agieren kann für Proteine ​​und Peptide. Protein-Farbstoff-Bindungs ​​wird angenommen, dass durch eine Kombination von hydrophoben und elektrostatischen Wechselwirkungs. Die aromatischen Ringe auf dem Farbstoff zu verschachteln mit Proteinen über hydrophobe Taschen auf der Proteinoberfläche 11. Die Köder, abhängig von ihrer Chemie, zeigen eine besondere Affinität für ausgewählte Klassen von Analyten. Die Köder konkurrieren mit den Trägerproteinen, wie Albumin, die für die Proteine ​​oder Peptide. Die niedermolekularen Proteine ​​/ Peptide werden im Partikel gefangen. Hochmolekulare Proteine ​​wie Albumin und Immunglobulin Eindringen von Teilchen durch die Sieb-Fähigkeit aufgrund der restriktiven Poren des Hydrogels 11 (Figur 1) verhindert. Hydrogel-Nanopartikel werden durch Fällung Polymerisation durch Ammoniumpersulfat 11 eingeleitet synthetisiert. N-Isopropylacrylamid (NIPAm) sind Comonomere Acrylsäure (AAc) und Allylamin (AA) und Vernetzer N, N&#39;-Methylenbisacrylamid (BIS) bei 70 ° C für 6 Stunden in verdünnter Lösung 1 reagieren1, 13. Die hohe Proteinbindungsaffinität von Poly (N-isopropylacrylamid-co-Acrylsäure) (Poly (NIPAm-co-AAc) nanoparticlesis durch kovalente Einbau aminogruppenhaltige Farbstoffe (dh., Sulfonatedanthraquinonetriazine Farbstoffe) in die Nanopartikel durch erreicht eine Amidierungsreaktion in wässrigen oder organischen Lösungsmitteln in Abhängigkeit von den hydrophilen / hydrophoben Eigenschaften der Farbstoffe durchgeführt 11, 13. nucleophile Substitution der Amingruppen in dem Nanopartikel mit dem Chloratom eines anthraquinonetriazine Farbstoff wird verwendet, um farbstoffhaltige Poly (NIPAm erstellen -CO-allylamin) (AA) Nanopartikel 11, 12. Ein zweistufiges Polymerisationsverfahren wird verwendet, um Hydrogel-Nanopartikel eine äußere Hülle aus Vinylsulfonsäure (VSA) 11, 13 enthält, zu schaffen. Hydrogel-Nanopartikel können auf verschiedenen biologischen Flüssigkeiten, wie Vollblut, Plasma, Serum, Zerebrospinalflüssigkeit, Schweiß und Urin verwendet werden. In einem Schritt, in Lösung, die nanoparticles führen Sie eine schnelle (innerhalb von Minuten) Beschlagnahme und Konzentration der niedermolekularen Analyten 10, 11, 13, 15-18. Proteine ​​werden anschließend von den Nanopartikeln eluiert und detektiert unter Verwendung von Western-Blotting 19-21, Massenspektrometrie 10, 11, 13, 15, 18, ​​22, 23, Immunoassays / ELISA 10, 11, 15, 18, ​​oder Umkehrphasen-Protein-Microarray 16, 24 Assays. Nanopartikel mit chemischen Köder funktionalisiert, und präsentiert eine Kern oder Kern-Schale-Architektur, erfassen und konzentrieren Proteine ​​auf der Grundlage der Köder / Schale physikalisch-chemischen Eigenschaften. Verschiedene Farbstoffe in die Nanopartikel eingebracht werden daher erfassen unterschiedliche Untergruppen von Proteinen mit unterschiedlicher Effizienz bezogen auf die Farbstoffaffinität, pH-Wert der Lösung und die Anwesenheit / Abwesenheit von konkurrierenden hochkonzentrierten Proteine ​​13. Darüber hinaus wird die Menge der Nanopartikel in Bezug auf das Volumen der Lösung, die Proteinausbeute aus den Nanopartikeln beeinflussen. Diese Aspekte derHydrogel-Nanopartikel Ernte werden mit drei verschiedenen Nanopartikel Köder zum Ernten von Proteinen aus Plasma-Proben, die große Mengen an Protein enthalten, nachgewiesen und von Urinproben, die in der Regel große Mengen an Protein enthalten. In diesem Protokoll Ernte und konzentriert Tumor-Nekrose-Faktor alpha (TNF) aus Plasmaproben unter Verwendung von Poly (NIPAm-co-AAC), Poly (NIPAm / Farbstoff) und Kern-Schale-Nanopartikel zeigen wir (Poly (NIPAm-co-VSA)) . Poly (NIPAm / Farbstoff) Nanopartikel gezeigt, Mycobacterium-Spezies-Antigen, das für die menschliche Urinproben hinzugefügt wurde, zu konzentrieren, um Mycobacterium tuberculosis infizierte Personen zu imitieren.

<table><tbody><tr><td>Hydrogel-Nanopartikel</td><td>Ceres Nanoscience</td><td>CS003</td><td>NanoTrap ESP Partikel</td></tr><tr><td>18 M&Omega;-cm Wasser</td><td></td><td></td><td>Typ 1 Reagenzqualität Wasser</td></tr><tr><td>Tris HCl, 50 mM pH 7,0</td><td>VWR</td><td>IC816116</td><td>50 mM, pH 7</td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>BDH</td><td>BDH1103-4LP</td><td>Erhältlich bei VWR</td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid NH4OH</td><td>BDH</td><td>BDH3014</td><td>Erhältlich bei VWR, untersucht bei 28-30 % NH3</td></tr><tr><td>Natriumthiocyanat 25 mM</td><td>Acros Organics</td><td>419675000</td><td>Für Serum-/Plasmaproben</td></tr><tr><td>Multi-Analyt Urin-Reagenzstreifen</td><td>Siemens</td><td>2161</td><td>Für Urinproben</td></tr><tr><td>Tris-Glycin SDS-Probenpuffer (2X)</td><td>Life Technologies</td><td>LC2676</td><td>Verwendung bei RT, um die Ausfällung</td></tr> <tr><td>von SDS zu verhindernTrockenbad-Inkubator (100 oC) mit Heizblock</td><td>Barnstead</td><td>11-715-125DQ</td><td>Ersetzen Sie kein Siedewasserbad</td></tr><tr><td>Stickstoff-Verdampfer-Verteiler</td><td>Organomation Associates</td><td>Microvap118</td><td>Für Serum-/Plasmaproben</td></tr><tr><td>Zentrifuge, Ausschwingrotor</td><td>Sorvall</td><td>Legend Serie</td><td>50 ml Röhrcheninhalt, rcf 3.700 x g</td></tr><tr><td>Zentrifuge, Festwinkelrotor</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>1,7 ml Mikrozentrifugenkapazität, RCF 16.000 x g</td></tr><tr><td>50 ml konische Zentrifuge&nbsp; Röhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Mit Schraubverschlüssen für Urinproben</td></tr><tr><td>1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Mischer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-949-755</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S04782</td><td>Sekunden/Minuten</td></tr></tbody></table>

hydrogel-nanopartikel ernte von plasma oder urin zum nachweis geringer menge proteine

Hydrogel Nanoparticle Harvesting of Plasma or Urine for Detecting Low Abundance Proteins

Roman Entdeckung neuer Biomarker spielt eine entscheidende Rolle bei der Bereitstellung von empfindlicher und spezifischer Nachweis von Krankheiten. Leider sind viele Niedrigfluss Biomarkern, die in biologischen Flüssigkeiten vorliegen können nicht leicht mit Massenspektrometrie oder Immunassays, weil sie in sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden sind, sind labil und werden häufig durch Hochfluss Proteine ​​wie Albumin oder Immunglobulin maskiert detektiert werden. Köder, die Poly (N-isopropylacrylamid) (NIPAm) auf Basis Nanopartikel sind in der Lage, diese physiologischen Barrieren zu überwinden. In einem Schritt sind sie in der Lage, zu erfassen, zu konzentrieren und zu bewahren Biomarkern aus Körperflüssigkeiten. Niedermolekularen Analyten geben Sie den Kern der Nanopartikel und werden von verschiedenen organischen chemischen Farbstoffen, die als hohe Affinität Protein Köder handeln gefangen genommen. Die Nanopartikel können die interessierenden Proteine ​​von mehreren Größenordnungen zu konzentrieren. Dieser Konzentrationsfaktor ausreicht, um den Proteingehalt zu erhöhen, so daß die Proteine ​​in derNachweisgrenze von Strom-Massenspektrometer, Western Blot und Immuntests. Nanopartikel können mit einer Vielzahl von biologischen Flüssigkeiten inkubiert werden und sie in der Lage, die Konzentration der Proteine ​​und Peptide Gewicht niedermolekulare stark anreichern, während ohne Albumin und andere Proteine ​​Gewichtshochmolekularen sind. Unsere Daten zeigen, dass eine 10000-fachen Verstärkung der Konzentration eines bestimmten Analyten erreicht werden kann, wodurch Massenspektrometrie und Immunoassays, zuvor nicht nachweisbar Biomarker zu detektieren.

Hydrogel Nanopartikelgröße und Gleichmäßigkeit Poly (NIPAm-AAC) Teilchen mit extrem hoher Ausbeute und Reproduzierbarkeit zwischen und innerhalb der Serie gefertigt. Die Teilchen haben eine sehr gute kolloidale Stabilität bei RT während der Zeit für die Erfassung, Speicherung, und die Elution von Proteinen (mindestens 48 Stunden) erforderlich ist und Nanopartikel Fällung wurde nicht beobachtet (Abbildung 1) 11. Die kolloidale Stabilität kann für d...

Mehrere pathologische Biomarker können mit den derzeitigen Techniken aufgrund ihrer geringen Konzentration in biologischen Flüssigkeiten, des Vorhandenseins von abbauenden Enzymen und großer Mengen an Proteinen mit hohem Molekulargewicht nicht leicht nachgewiesen werden. Chemisch funktionalisierte Hydrogel-Nanopartikel können Proteine mit geringer Abundanz ernten, konservieren und konzentrieren, was den Nachweis von bisher nicht nachweisbaren Biomarkern ermöglicht.

Hydrogel-Nanopartikel Ernte von Plasma oder Urin zum Nachweis geringer Menge Proteine

Novel biomarker discovery plays a crucial role in providing more sensitive and specific disease detection. Unfortunately many low-abundance biomarkers ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Biomarker mit geringer Häufigkeit und niedrigem Molekulargewicht aus biologischen Flüssigkeiten in geeigneten Konzentrationen zu gewinnen, zu konzentrieren und zu konservieren. Bei Standard-Proteinassays wird dies erreicht, indem zunächst chemisch funktionalisierte Hydrogel-Nanopartikel in die biologische Flüssigkeit mit niedrigem Molekulargewicht gegeben werden. Analyten dringen in den Kern des Nanopartikels ein und werden von verschiedenen organischen chemischen Farbstoffen eingefangen, die als hochaffine Proteinköder fungieren.Der zweite Schritt besteht darin, die Partikel durch Zentrifugation aus dem Biofluid zu trennen. Die Nanopartikel konzentrieren die interessierenden Proteine um mehrere Größenordnungen. Die Nanopartikel werden dann mit Wasser gewaschen, um Fremdproteine zu entfernen.Der letzte Schritt besteht darin, die eingefangenen Proteine aus den Nanopartikeln zu eluieren. Letztendlich werden Western Blotting, Massenspektrometrie oder Aminoassays verwendet, um das Vorhandensein und/oder die Konzentration der zuvor nicht nachweisbaren geernteten Biomarker mit geringer Abundanz nachzuweisen. Im Allgemeinen werden Personen,

hydrogel-nanoparticle-harvesting-plasma-or-urine-for-detecting-low

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir haben eine Technologie auf mesoporösen Siliciumdioxid-Dünnschicht zur selektiven Rückgewinnung von niedermolekularen Proteinen und Peptiden aus Humanserum. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften unserer mesoporösen Chips wurden fein abgestimmt, um wesentliche Bereicherung in der Peptid-Kontrolle stellen und damit das Profil Serumproteom für diagnostische Zwecke.

Niedermolekulare Protein Enrichment auf mesoporösem Siliciumdioxid Dünnschichten für Biomarker Discovery

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von Exosomen aus menschlichem Urin unter Verwendung einer modifizierten Fällungstechnik.

Eine modifizierte Niederschlag Methode zu Urinary Exosomen Isolieren

Dieses Protokoll zeigt, wie eine femtomolare Nachweisempfindlichkeit von Proteinen in 10 μl Vollblut innerhalb von 30 min erreicht werden kann. Dies kann durch die Verwendung von elektrogesponnenen Nanofasermatten erreicht werden, die in eine Lab-on-a-Disc integriert sind und eine große Oberfläche sowie effektives Mischen und Waschen für ein verbessertes Signal-Rausch-Verhältnis bieten.

Vollautomatische Schleuder Mikrofluidik-Vorrichtung zur Ultrasensitive Proteindetektion aus Vollblut

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll exosomen von Plasma und Serum mit reduzierter CO Reinigung nicht Exosomal Blut zu reinigen. Das optimierte Protokoll beinhaltet Ultrafiltration, Protease Behandlung und Größe Ausgrenzung Chromatographie. Verbesserte Reinigung von exosomen Vorteile nachgeschalteten Analysen, einschließlich genauere Quantifizierung von Vesikeln und Proteomic Charakterisierung.

Proteinverdauung, Ultrafiltration und Größe Ausgrenzung Chromatographie, die Isolation der Exosomen aus menschlichem Blutplasma und Serum zu optimieren

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese und Formulierung von injizierbaren, supramolekularen Polymer-Nanopartikel (PNP)-Hydrogel-Biomaterialien. Anwendungen dieser Materialien für die Wirkstoffabgabe, die biopharmazeutische Stabilisierung sowie die Zellverkapselung und -abgabe werden demonstriert.

Injizierbare supramolekulare Polymer-Nanopartikel-Hydrogele für Zell- und Arzneimittelverabreichungsanwendungen

Die Verwendung von photoabbaubaren Hydrogelen zur Isolierung von Bakterienzellen unter Verwendung eines hochauflösenden Lichtmusterwerkzeugs wird berichtet. Wesentliche experimentelle Verfahren, Ergebnisse und Vorteile des Verfahrens werden überprüft. Die Methode ermöglicht eine schnelle und kostengünstige Isolierung von Zielbakterien mit seltenen oder einzigartigen Funktionen aus heterogenen Gemeinschaften oder Populationen.

Photodegradierbare Hydrogel-Grenzflächen für Bakterienscreening, -selektion und -isolierung

Es wird ein Protokoll zur Bestimmung von Biomarkern mit geringer Abundanz aus getrockneten Serumproben vorgestellt, das am Beispiel des Biomarkers Progastrin-freisetzendes Peptid (ProGRP) veranschaulicht wird. Antikörperbeschichtete magnetische Beads werden zur selektiven Aufreinigung und Anreicherung eines proteotypischen ProGRP-Peptids verwendet. Das eingefangene Peptid wird anschließend mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie analysiert.

Microsampling in der gezielten Massenspektrometrie-basierten Proteinanalyse von Proteinen mit geringer Abundanz

Dieser Artikel beschreibt eine Methodik zur Isolierung, Charakterisierung und Quantifizierung von extrazellulären Vesikeln (EV) aus humanem Plasma und stellt einen Arbeitsablauf für die markierungsfreie Analyse des EV-Proteoms mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) vor.

Isolierung, Charakterisierung und proteomische Analyse von aus Plasma gewonnenen extrazellulären Vesikeln zur Entdeckung kardiovaskulärer Biomarker

Dieses Protokoll standardisiert die SDS-PAGE-Analyse für personalisierte Protein-Koronaprofilierungen auf Nanopartikeln und ermöglicht so eine reproduzierbare, skalierbare und kostengünstige Detektion krebsspezifischer Signaturen. Konzipiert für die frühzeitige Diagnose eines pankreatalen ductalen Adokarzinoms, bietet es eine praktische, BERUHIGT ausgerichtete Alternative zu komplexen proteomischen Methoden sowohl in Forschung als auch in klinischen Umgebungen.

Standardisierter SDS-PAGE-Workflow für personalisiertes Protein-Corona-Profiling bei der frühen Krebserkennung

Ein vielseitiges Plasma Lithographie wurde entwickelt, um stabile Oberfläche Muster zur Führung Anheftung der Zellen zu generieren. Diese Technik kann angewendet Cell Networks einschließlich derer, die natürlichen Geweben zu imitieren und hat für das Studium mehrere, unterschiedliche Zelltypen verwendet worden zu erstellen.

Plasma Lithography Oberflächenstrukturierung für die Erzeugung von Cell Networks

Erfahren Sie, wie Hydrogel-Nanopartikel niedrig konzentrierte Biomarker aus Plasma oder Urin anreichern und erhalten. Diese Methode verbessert die Nachweisempfindlichkeit für diagnostische Proteinanalysen erheblich.

Hydrogel-Nanopartikel Ernte von Plasma oder Urin zum Nachweis geringer Menge Proteine

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