Name: Analyse von Membranrohrnetze in Herzmuskelzellen von Vorhöfe und Kammern (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Lernen Sie die Analyse von Membranrohrnetzen in Herzmuskelzellen aus Vorhöfen und Kammern von Mäusen. Diese Methode ermöglicht quantitative Bildanalyse des TATS-Netzwerks in lebenden Zellen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB 1002 (Teilprojekte A05 und B05 bis S.E.L.) und KFO 155 (Teilprojekt 4 bis S.E.L.), einen Preis der Halbach-Stiftung für S.E.L. zur Unterstützung von E.W., ein Stipendium der Deutschen Gesellschaft für Kardiologie für S.B. und ein DAAD-Austauschprogramm zur Unterstützung von T.K. als Gast an der University of Maryland. Die Forschung, die zu diesen Ergebnissen führt, wurde aus dem Siebten Rahmenprogramm der Europäischen Gemeinschaft FP7/2007-2013 im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. HEALTH-F2-2009-241526, EUTrigTreat (zu S.E.L.). S.E.L. ist Principal Investigator des Deutschen Zentrums für Herz-Kreislauf-Forschung (DZHK).

<ol><li>Prosser, B. L., Ward, C. W., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+Ca2%2B+signaling+in+the+heart+the+role+of+ryanodine+receptor+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Subcellular Ca2+ signaling in the heart the role of ryanodine receptor sensitivity.</a> J Gen Physiol. 136 (2), 135-142 (2010).</li>
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<li>Cheng, H., Cannell, M. B., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Propagation+of+excitation-contraction+coupling+into+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Propagation of excitation-contraction coupling into ventricular myocytes.</a> Pflugers Arch. 428 (3-4), 415-417 (1994).</li>
<li>Williams, G. S., Chikando, A. C., Tuan, H. T., Sobie, E. A., Lederer, W. J., Jafri, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+calcium+sparks+and+calcium+leak+in+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Dynamics of calcium sparks and calcium leak in the heart.</a> Biophys J. 101 (6), 1287-1296 (2011).</li>
<li>Sperelakis, N., Rubio, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R.+orderly+lattice+of+axial+tubules+which+interconnect+adjacent+transverse+tubules+in+guinea-pig+ventricular+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">R. orderly lattice of axial tubules which interconnect adjacent transverse tubules in guinea-pig ventricular myocardium.</a> J Mol Cell Cardiol. 2 (3), 211-220 (1971).</li>
<li>Soeller, C., Cannell, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B.+of+the+transverse+tubular+system+in+living+cardiac+rat+myocytes+by+2-photon+microscopy+and+digital+image-processing+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">B. of the transverse tubular system in living cardiac rat myocytes by 2-photon microscopy and digital image-processing techniques.</a> Circ Res. 84 (3), 266-275 (1999).</li>
<li>Song, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((et+al.+ryanodine+receptors+in+the+failing+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">et al. ryanodine receptors in the failing heart.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (11), 4305-4310 (2006).</li>
<li>Oort, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disrupted+junctional+membrane+complexes+and+hyperactive+ryanodine+receptors+after+acute+junctophilin+knockdown+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Disrupted junctional membrane complexes and hyperactive ryanodine receptors after acute junctophilin knockdown in mice.</a> Circulation. 123 (9), 979-988 (2011).</li>
<li>Wagner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulated+emission+depletion+live-cell+super-resolution+imaging+shows+proliferative+remodeling+of+T-tubule+membrane+structures+after+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Stimulated emission depletion live-cell super-resolution imaging shows proliferative remodeling of T-tubule membrane structures after myocardial infarction.</a> Circ Res. 111 (4), 402-414 (2012).</li>
<li>Asghari, P., Schulson, M., Scriven, D. R., Martens, G., Moore, E. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axial+tubules+of+rat+ventricular+myocytes+form+multiple+junctions+with+the+sarcoplasmic+reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Axial tubules of rat ventricular myocytes form multiple junctions with the sarcoplasmic reticulum.</a> Biophys J. 96 (11), 4651-4660 (2009).</li>
<li>Lukyanenko, V., Ziman, A., Lukyanenko, A., Salnikov, V., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+groups+of+ryanodine+receptors+in+rat+ventricular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Functional groups of ryanodine receptors in rat ventricular cells.</a> J Physiol. 583 (Pt 1), 251-269 (2007).</li>
<li>Shacklock, P. S., Wier, W. G., Balke, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Ca2%2B+transients+%28Ca2%2B+sparks%29+originate+at+transverse+tubules+in+rat+heart+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Local Ca2+ transients (Ca2+ sparks) originate at transverse tubules in rat heart cells.</a> J Physiol. 487 (Pt 3), 601-608 (1995).</li>
<li>Reynolds, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctophilin-2+is+necessary+for+T-tubule+maturation+during+mouse+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Junctophilin-2 is necessary for T-tubule maturation during mouse heart development.</a> Cardiovasc Res. 100 (1), 44-53 (2013).</li>
<li>Di Maio, A., Karko, K., Snopko, R. M., Mejia-Alvarez, R., Franzini-Armstrong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-tubule+formation+in+cardiac+myocytes+two+possible+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Muscle+Res+Cell+Motil%22%5BJournal%5D)">T-tubule formation in cardiac myocytes two possible mechanisms.</a> J Muscle Res Cell Motil. 28 (4-5), 231-241 (2007).</li>
<li>He, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduction+in+density+of+transverse+tubules+and+L-type+Ca%282%2B%29+channels+in+canine+tachycardia-induced+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Reduction in density of transverse tubules and L-type Ca(2+) channels in canine tachycardia-induced heart failure.</a> Cardiovasc Res. 49 (2), 298-307 (2001).</li>
<li>Heinzel, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+T-tubules+and+reduced+synchrony+of+Ca2%2B+release+in+myocytes+from+chronically+ischemic+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Remodeling of T-tubules and reduced synchrony of Ca2+ release in myocytes from chronically ischemic myocardium.</a> Circ Res. 102 (3), 338-346 (2008).</li>
<li>Lyon, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+T-tubules+and+other+changes+to+surface+topography+in+ventricular+myocytes+from+failing+human+and+rat+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Loss of T-tubules and other changes to surface topography in ventricular myocytes from failing human and rat heart.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106 (16), 6854-6859 (2009).</li>
<li>Crossman, D. J., Ruygrok, P. N., Soeller, C., Cannell, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+organization+of+excitation-contraction+coupling+structures+in+failing+human+heart%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Changes in the organization of excitation-contraction coupling structures in failing human heart.</a> PLoS One. 6 (3), e17901(2011).</li>
<li>Kemi, O. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+exercise+training+on+transverse+tubules+in+normal%2C+remodeled%2C+and+reverse+remodeled+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">The effect of exercise training on transverse tubules in normal, remodeled, and reverse remodeled hearts.</a> J Cell Physiol. 226 (9), 2235-2243 (2011).</li>
<li>Sachse, F. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+structures+and+function+of+myocytes+impaired+during+heart+failure+are+restored+by+cardiac+resynchronization+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Subcellular structures and function of myocytes impaired during heart failure are restored by cardiac resynchronization therapy.</a> Circ Res. 110 (4), 588-597 (2012).</li>
<li>Arakel, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+the+electrical+properties+of+the+heart+by+differential+trafficking+of+KATP+ion+channel+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tuning the electrical properties of the heart by differential trafficking of KATP ion channel complexes.</a> J Cell Sciences. 127 (Pt 9), 2106-2119 (2014).</li>
<li>Richards, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transverse+tubules+are+a+common+feature+in+large+mammalian+atrial+myocytes+including+human%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transverse tubules are a common feature in large mammalian atrial myocytes including human.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 301 (5), H1996-H2005 (2011).</li>
<li>Trafford, A. W., Clarke, J. D., Richards, M. A., Eisner, D. A., Dibb, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+microdomains+and+the+t-tubular+system+in+atrial+mycoytes+potential+roles+in+cardiac+disease+and+arrhythmias%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling microdomains and the t-tubular system in atrial mycoytes potential roles in cardiac disease and arrhythmias.</a> Cardiovasc Res. 98 (2), 192-203 (2013).</li>
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<li>Powell, T., Twist, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+technique+for+the+isolation+and+purification+of+adult+cardiac+muscle+cells+having+respiratory+control+and+a+tolerance+to+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium.</a> Biochem Biophys Res Commun. 72 (1), 327-333 (1976).</li>
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<li>Kohl, T., Westphal, V., Hell, S. W., Lehnart, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superresolution+microscopy+in+heart+-+cardiac+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Superresolution microscopy in heart - cardiac nanoscopy.</a> J Mol Cell Cardiol. 58, 13-21 (2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Obwohl Herzmuskelzellen wurden isoliert und untersucht seit Jahrzehnten 32, eine aktuelle Überprüfung ergab, dass eine gleichbleibend hohe Qualität myocyte Zellisolierungen bleiben 27-. Dies spiegelt relativ komplexe Protokolle für die Isolierung von primären Herzmuskelzellen gegenüber einem Mangel an gemeinsamen Standards Ansätze, gemeinsame Metadaten und transparente Zelle Qualitätsdokumentation. Zellisolierung Protokolle werden in der Regel von einzelnen Gruppen angepasst, produzieren unterschiedliche Ergebnisse von Zell isoliert, hängen von individuellen Modelleinstellungen (zB, Art, Alter, Herzerkrankungen nebeneinander), und sind in der Regel für bestimmte Versuchsbedingungen angepasst. Im Rahmen der quantitativen TATS Membran Studien und Protokolle hier vorgestellt, ein wesentlicher Niveau der Qualitätsbewertung und Dokumentation betrifft die konfokale Mikroskopie oder Superauflösung der einzelnen Zelle Membranstrukturen anfällig für metabolische und Isolation Protokoll abhängige Veränderungen, sowohlin AM oder VM. Wichtig ist, auch wenn hohe Ausbeuten an Zell Isolate vorschlagen gesunde, intakte Muskelzellen, müssen die Ermittler zu dokumentieren und kritisch jede einzelne Zelle sorgfältig gegen morphologischen Kriterien der Oberfläche und TATS Membranintegrität gegenüber nicht-spezifische Schäden durch Isolierungsverfahren gegen bestimmte Veränderungen durch verschiedene Arten zu beurteilen von Interventionen im Vergleich zu Bedingungen zu kontrollieren. Eine wichtige Größe bei Herzzellisolierung ist die spezifische Aktivität einer gegebenen Menge Kollagenase. Um eine neue Menge von Kollagenase zu wählen, sollten die enzymatische Aktivität der Kollagenase mehrere Proben gegeneinander durch die Auswertung Kardiomyozyten-Ausbeute und Qualität, und nach den Anweisungen des Herstellers getestet werden. Idealerweise wird eine neue Charge von Collagenase mit Kollagenase-Aktivität gegenüber den Vorjahren erfolgreich viele identifiziert (für erweiterte Evaluierung möglicher Enzymaktivitäten finden Sie in der &quot;Collagenase viel Auswahl-Werkzeug&quot; in der Materialien und Methoden Tabelle). Taken zusammen, quantitative Ansätze der Visualisierung TATS Membran hängen entscheidend von Zellisolierung Qualität und, umgekehrt, Herzzellisolierungen, die zu unspezifischen Membranschädigung durch TATS Mikroskopie dokumentiert sollten kritische Überprüfung und Korrektur der Isolationsverfahren auslösen. Da Zellisolierung Qualität und TATS Membran Visualisierung und Quantifizierung sind untrennbar miteinander verbunden, die in diesem Artikel beschriebenen Protokolle decken alle wichtigen Aspekte einer kontinuierlichen Strategie. Eine zusätzliche Herausforderung und gemeinsame Ausgabe von Herzuntersuchungen, Zellschäden und / oder Zellverlust entstehen durch metabolisch Kompromisse Interventionen zB nach Herzinfarkt 9, noch brauchen, um gegen mögliche unbeabsichtigte Beschädigung zB beurteilt werden, unbemerkt folgenden Luftembolie während der Zellisolierung. Isolierung von Herzmuskelzellen von erkrankten Herzen zu zusätzlichen, erheblichen Zellverlust führen und verminderte Zellausbeuten. Daher ComparIson der Gesamtzahl der isolierten intakten Zellen zwischen Kontrolle und kranken Herzen können sinnvoll sein, wenn der Zellisolierung und Zählung ist ständig durch standardisierte Protokolle eingesetzt. Folglich ist es wichtig, die Integrität der Zelle durch eine entsprechende Kontrollgruppe, die die bestmögliche myocyte Zellisolierung Qualität spiegelt beurteilen. Wichtig ist, dass einzelne Zellqualität und Lebendzellmikroskopie von gesunden gegenüber kranken gegenüber Muskelzellen versehentlich durch die Isolierung beschädigt Verfahren kann die Analyse von Membran TATS Netzwerke wesentlich beeinflussen. Die hier vorgestellten Protokolle betonen daher die Integrität und Stabilität des physiologischen Membrankomponenten während der Zellisolierung und Lebendzellmikroskopie von intakten Membranen. Der gesamte Workflow wird als eine kontinuierliche Strategie zu erreichen und zu bewahren intakt TATS Membrankomponenten unter Ausschluss beschädigte Zellen, da diese zeigen Isolierung abhängige Membran Artefakte wie gestört Membran Tubuli, membrane Bläschen, und veränderte TATS Netzwerke irrtümlich unter Kontrollbedingungen und Kompromisse weitere quantitative Analyse. Umgekehrt, sind die gleichen Strategien entscheidend für Interventionsstudien mit dem Potenzial, TATS Membranen, die sich kritisch auf aussagekräftigen Vergleich zwischen Kontrollen wahr gesunde gegenüber wahr erkrankten Zelle mit TATS Membran Veränderungen hängen zu stören. Darüber hinaus beschäftigen wir uns mit Verfahren, um die technisch viel anspruchsvoller Isolierung von AM Zellen zu erreichen. Trotz der Fortschritte und verbesserte Protokolle, ist es wichtig zu betonen, dass es nicht trivial ist, um qualitativ hochwertige Zell Isolierungen von VMs reproduzieren und noch weniger zuverlässig für AMS. Dies ist aufgrund der insgesamt geringeren Ertrag von AM Zellen, in denen auch kleine Fehler oder Abweichungen in der Zellisolierung kann zum Ausfall der Zellisolierung Uhr abzuschließen, während ein milder Grad der VM Zellschäden können in Zellsuspension weniger offensichtlich sein, aufgrund der relativ hohen Zell Zahlen im Vergleich zu Uhr. Seit AM Zellen könnten c werdennach der Isolierung urved, kann die Analyse durch mehrere ROIs von Vorteil sein, wie unter Schritt 4.3 beschrieben. Nach einer detaillierten Verfahren der Zellisolierung Schritte, bieten wir ein Protokoll für den direkten integralen Membranfärbung und konfokaler Bildgebung oder STED-Superauflösung von TATS Netzwerke sowohl für VMs und AMS. Diese Protokolle ermöglichen sowohl quantitative Analyse und Differenzierung von ausgewählten Komponenten der TATS Membranen durch vorher festgelegten Parametern. Im Vergleich zu VMs, sind die 3D-Organisation und funktionale Verhaltensweisen des Vorhof TATS Netzwerk AMS derzeit weniger verstanden. Die Verfahren, die Bild TATS Membranen in lebenden Zellen (Schritte 3.1 bis 3.7) wurden mit kommerziellen konfokalen (Tabelle der Materialien / Ausrüstung) und maßgeschneiderte STED Fluoreszenzmikroskope 9 entwickelt. Um die Einstellungen für Fluoreszenzmikroskop Bilderzeugung und quantitative Analyse TATS zu optimieren, von allgemeiner Bedeutung, die die folgenden Punkte: <ul><li> Ziel </strong&gt; Um kleine Details TATS Membranstrukturen lösen, empirisch testen, welche Zielsetzung die höchste Bildqualität bietet bei gleichzeitiger Konzentration mehrere Mikrometer tief in der Zelle. Bestimmte konfokale Mikroskope können besser mit Wasser oder Glycerol Ziele durchzuführen, im Gegensatz zu dem 63X 1,4 NA Öl-Objektiv verwendet. Ziele mit 100-facher Vergrößerung für Superresolution-STED-Mikroskopie verwendet wird, den Handel aus einer kleineren Sichtfeld für Nanometerauflösung 34. </li><li> Anregung und Gewinn Die optimalen Einstellungen der Erregerleistung und Detektorverstärkung hängen von Lichtwegs im Mikroskop, Laser-Leistung und Probeneigenschaften. Im Idealfall, Laserleistung und Verstärkung eingestellt werden, um die gesamte Bandbreite des Detektors zu nutzen, noch zu vermeiden Bildsättigung. Handels Mikroskopie-Software-Pakete bieten in der Regel Lookup-Tabellen, die die untere und obere Grenze des Dynamikbereichs zu visualisieren. Darüber hinaus minimiert Farbbleichung beschäftigen die bestmöglichen lAser Macht, die immer noch eine ausreichende Struktur TATS Membran Details. Auch sollte Erregerleistung niedrig genug sein, um zu vermeiden, kumulative Foto Schäden, die zu myocyte Kontrakturen und Tod. </li><li> Pixelgröße Verwenden Sie einen Pixelgröße mit Nyquist-kompatibel, etwa die Hälfte der mit den gegebenen Einstellungen erreichte Auflösung. Für die konfokale Abbildung eine Pixelgröße von 100 nm x 100 nm kompatibel ist, was auch begrenzen Bleichen. Superresolution-Mikroskopie für deutlich kleinere Pixelgrößen sind zB 20 nm x 20 nm für die STED-Mikroskopie 9 verwendet. </li><li> Verweilzeit Konfokale Mikroskope bieten eine Mittelungsfunktion. In der Regel verwenden die kürzest mögliche Pixelverweilzeit Bleich in Kombination mit Signalmittelung zB vermeiden, Line-Mittelung ≥ 8, um das Signal-zu-Rausch-Verhältnis zu verbessern. </li><li> Dokumentieren Sie die Angewandte Mikroskopie Einstellungen Durch Meta-Daten Sobald die Einstellungen wieBilddetails TATS Membranstrukturen wurden auf einem bestimmten konfokalen Mikroskop optimiert, sicher und / oder dokumentieren Sie die Einstellungen (Protokoll Meta-Daten). Erwerben Sie alle Bilder in einem (oder zwischen) Gruppe (n) von Zellen mit dem gleichen Ziel, Erregerleistung, Verstärkung, Pixelgröße, Pixel Verweilzeit und Mittelungsfunktion. Gleich Abbildungsbedingungen ermöglichen den direkten Vergleich und die Quantifizierung in einem (oder zwischen) Gruppe (n) der Zellen. </li><li> Zur allgemeinen Orientierung und weitere Details zu Grundlagen und Anwendungen der konfokalen Mikroskopie beziehen sich auf das Handbook of Biological konfokale Mikroskopie (Pawley JB, 3. Auflage, 2006, Springer Science + Business Media, LLC). </li></ul> Im Gegensatz zu den direkten Analyse Strategien hier vorgestellten bisherigen Publikationen beschreiben TATS Membranen und krankheitsbedingte Veränderungen wurden regionale Gesamtanzeigen von T-Tubuli Dichte wie quantitative Strategie 16,17 oder indirekte regionale Strategien basierend auf Fourier transf verwendetormationen Analyse der quergestreiften Membran Signale, um T-Tubuli Komponente Regelmäßigkeit 7 zu bewerten. Im Gegensatz dazu sind die hier beschriebenen quantitativen Ansätzen direkt an einzelne TATS Komponenten bezogen und bieten eine Reihe von zusätzlichen Parametern, einschließlich Membranwerkeigenschaften und spezifische Komponenten wie der Anteil der A-Tubuli. Weiterhin kann die Netzwerkdichte TATS als normierte Länge des gesamten Skeletts extrahiert pro ROI-Bereich quantifiziert werden. Die Anzahl der Dreifachübergänge der drei einzelnen, kontinuierlich verbunden Tubulus Komponenten als Maß für die Komplexität der Verzweigungs TATS Membran Netzwerk verwendet werden. Wir stellen fest, dass eine Analyse der kleinsten TATS Komponenten hängt von den Färbeverfahren. Nach unserer Erfahrung sind 800 ul einer 50 uM di-8-ANEPPS Lösung ausreicht, um komplette TATS Netzwerke in einer Zelle Pellet mit 50.000 VM 9 Zellen färben. Wenn jedoch das Zellpellet enthält, eine geringere Anzahl von HerzmuskelzellenWenn leistungsstarke Fluoreszenzdetektoren vorhanden sind, und wenn die konfokale Abbildung der gesamten TATS Netzverteilung statt kleinsten Membrandaten und quantitative Veränderungen von Interesse sind, niedriger Farbstoffkonzentrationen können anhand von empirischen Tests verwendet werden. Schließlich kann ein Software-Makros für die beschriebene Analyse geschrieben werden die Bildverarbeitungsschritte zur Analyse großer Datenmengen, die für den Vergleich zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen (zum Beispiel Arzneimittel), Zelltypen, besonders nützlich ist, zu erleichtern automatisieren (zB AM gegen VM ) und pathophysiologischen Interventionen (zB Schein gegen Myokardinfarkt). Für die Bildanalyse von TATS Netzwerken wird die folgende Sequenz von Schritten aufgetragen Prinzip: 1) rollenden Ball Hintergrund-Subtraktion (4.5.1), um räumliche Schwankungen in der Hintergrundintensität zu entfernen; 2) lokale Kontrastverstärkung (4.5.2). 3) Bildglättung (4.5.3); 4) statistische Region Verschmelzung (4.5.4); 5) definiert, dieSchwelle von Bild Binarisierung (4.5.6); und 6) Berechnung der Skelettdaten (4.5.8). Ein entscheidender Schritt bei der Skelettierung von Fluoreszenzbildern TATS ist die in 6 gezeigte Bild Binarisierung. Die zugehörigen Schwellen Schritten letztlich bestimmen, welche wahre Membranstrukturen erkannt werden, um die darunterliegende Komponenten gegen TATS durch Fehler vom Hintergrundrauschen erkannt potentiell falsche Strukturen darstellen. Die Ermittlung der richtigen Schwelle für binäre Bildanalyse sollte mit den wahren TATS Membranstrukturen, die auf einem ausreichend hohen Signal-zu-Rausch-(SNR) jedes der konfokalen Mikroskopie und Hochauflösungs-Ansätze hängt entsprechen. Daher sollte eine ausreichende Bildqualität und anschließend mit ersten kritischen Urteil von Einzelzellqualität einschließlich Dokumentation von Hellfeld-Bildern kombiniert, wie beschrieben eingerichtet werden. Alternativen, um die Bildsegmentierung Protokoll für einen gegebenen Objektdatenausgang und / oder anzupassen physiologische Fragen sind Bilddekonvolution und andere Schwellenwertverfahren wie &quot;Otsu&quot; oder &quot;Iso-Daten&quot;, wie ImageJ Plugins zur Verfügung. Unabhängig von der letzten Segmentierungsverfahren halten wir den Vergleich zwischen extrahiert und Rohdaten von Bild-Overlay die obligatorische Qualitätskontrolle Schritt. Zusammenfassend wird morphologischen und Membranintegrität der einzelnen isolierten Myocyten ausreichende Färbung von intrazellulären Membranen TATS, Parameteroptimierung für die Fluoreszenzbildgebung und Lagerungssteuer extrahierter Gerippedaten tragen zur Qualität von Fluoreszenz TATS Bildern und quantitative Ergebnisse. Wenn größere Arten als Maus zur Zellisolierung verwendet wird, kann die Protokolle ohne weiteres entsprechend angepasst werden. Für die nächsten größeren Arten kann Rattenherzen mit einer stumpfen Kanüle 14 G (Außendurchmesser 2,1 mm) kanüliert und 8 ml / min durchströmt werden. Deutlich älter oder krank Herzen können auch größere Kanüle Größen erfordern. In der Gen-RAL kann Herzperfusion entweder mit konstantem Druck durchgeführt werden, zB unter Verwendung einer 1 m hohen Wassersäule zwischen dem Behälter und der Aorta oder durch konstante Strömung unter Verwendung einer peristaltischen Pumpe. Zur Zellisolierung von kleinen Nagetieren Herzen wie Mäusen und Ratten kann konstant Fluss vorteilhaft sein, da Kollagenaseverdau schließlich stören koronaren Widerstandsgefäße, die zu übermäßiger Perfusionsraten aus undichten Gefäßbetten, die zu einem gewissen Grad durch konstante Durchflussprotokolle gesteuert wird. Im Gegensatz dazu ist konstanter Druck Perfusion vorteilhaft, wenn die Überwachung der Durchflussrate und korrekte Kanülierung eine Priorität, die zur Intervention Modelle mit veränderten Blutgefäßwiderstandsverhalten als auch für die Ausbildung der Zellisolierungsverfahren vorteilhaft ist. Wie oben dargelegt, ist ausreichend Zellqualität für quantitative Studien der endogenen Membransystemen sehr wichtig. Doch während der Herzdurchblutung und Kollagenaseverdau zahlreichen Faktoren CRitically Einfluss auf die Qualität der Zellisolation, die nie während der Protokolloptimierung oder Fehlersuche, 27 zu unterschätzen ist. Insbesondere sollte die Aktivität einer gegebenen Menge Collagenase für den spezifischen Gewebe von Interesse zB Atrien oder Ventrikel vor der Ausführung der Versuchs bona fide Studien zur Isolierung Bedingungen fest bestimmt den Rest der Studie aufrechterhalten wird. Außerdem wird die Wasserqualität, pH, Temperatur, Optimierung und Reinigung der Perfusion Einrichtung die Gefahr einer unbeabsichtigten Beschädigung durch Verunreinigungen und Embolien zu minimieren, und möglicherweise weiteren Faktoren überwacht werden müssen, um eine optimale homöostatischen Bedingungen während der Zellisolierung zu schaffen. BDM (2,3-Butandion-monoxim) ein reversibler Inhibitor der Myosin-ATPase Querbrücken wird üblicherweise während Gewebedissektion und Verdauung verwendet, um die Herzmuskelentspannung, die die Ausbeute an Zellisolierungen erhöht aufrechtzuerhalten. Dennoch müssen die Ermittler to beachten Sie, dass BDM kann unspezifische Phosphatase-Aktivitäten, die zu Off-Target-Effekte zB Hemmung der Na + / Ca 2 + Wechselströme unter bestimmten Bedingungen 33 auszuüben. Bei einigen Experimenten es vorteilhaft, BDM durch blebbistatin als Kardioplegie-Lösung, einem Inhibitor mit einer hohen Affinität für Myosin in mikromolaren Konzentrationen, ist jedoch toxisch und relativ teuer zu ersetzen sein könnte und kann andere Nebeneffekte haben. Ruhen gesunden Herzmuskelzellen sollten keine Kontraktionen in Abwesenheit von elektrischer Stimulation und solche Zellen von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden, zeigen. Auf der anderen Seite, Kardiomyozyten-Kontraktion und Relaxation als Reaktion auf elektrische Stimulation bei physiologischen extrazellulären Ca 2 +-Konzentrationen können verwendet werden, um normale kontraktile Verhalten als zusätzliche Maßnahme zu schaffen, um funktionelle Zellqualität und / oder Verhaltensstörungen in der Herzkrankheit und gesunden Kontroll beurteilen Zellen. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Zusammenfassend sind die Protokolle für die Einzelzellisolierung und quantitative hier beschriebenen Bildanalyse wurden erfolgreich für die konfokale Mikroskopie und Superresolution des TATS Membran-Netzwerk in VM 9 Zellen 21 sowie für die quantitative Analyse der Mikrotubuli-Netzwerke in der angewandten und AM feste Herzmuskelzellen (Daten nicht gezeigt). Diese und zukünftige Anwendungen der Protokolle kann Wege für eine Vielzahl von experimentellen Fragen wie die Charakterisierung von Membranen TATS in verschiedenen Entwicklungsstadien oder die Analyse von membranassoziierten Protein oder Organellen Strukturen, die die TATS Netzwerk Kontakt offen auszuüben stark lokalisierten, Domain-spezifische Signal Funktionen in AM und VM-Zellen.

Bei gesunden gestreiften Muskelzellen, sind röhrenförmige Membranstrukturen mit &quot;quer&quot; Orientierungen (T-Tubuli) senkrecht zu den Hauptzellenachse reichen. Folglich haben T-Tubuli als kontinuierliche Verlängerungen der Hauptmuskelzelle &quot;seitlich&quot; Oberflächenmembran (Sarkolemm), die tief in das Cytosol der Zelle zu durchdringen Zentrum gekennzeichnet. Die physiologische Rolle der T-Tubuli kontinuierlich mit der Außenfläche der Membran eine schnelle elektrische Kopplung der Fernintrazellulären Kompartimenten durch SER Organell Kontaktbereiche im gesamten verhältnismäßig großen Herzmuskelzellvolumens von nanometrischen Nähe Kopplung von spannungsaktivierten L-Typ-Ca 2 + gebildet Kanäle (Cav1.2) nach innen (I Ca) Aktivieren benachbarten Ryanodinrezeptor (RyR2) SER Ca 2 +-Releases. In ventrikulären Myozyten (VMs), die nicht-kontinuierliche Membran Kontakte (&quot;junctions&quot;) zwischen den Knoten-SER-Domänen und T-tubules sind gedacht, um Tausende von Einzelintrazelluläre Ca2 + Freisetzung Nanodomänen in jeder Zelle 1 zu steuern. Für jede gegebene Kontakt Domäne die nebeneinander liegenden Membranteile jeder der T-Tubuli und dem Peripheriegerät (junctions) SER etwa 15 nm nahe zueinander, also als Nanodomänen definiert. Dadurch werden sehr kleine zytoplasmatische einzelnen Teilräume getrennt, welche quasi-autonomen Zellenabteil Verhalten ermöglichen. Wenn ein eingehender Aktionspotential aktiviert Cav1.2-Kanäle in den T-Tubuli von VMs, einem relativ kleinen Ca 2 + Einstrom wird rasch zunehmen den Unterraum Ca 2 +-Konzentration [Ca2 +] S in der Größe Attolitervolumina Nanodomänen 1. Nächsten, aktiviert der S Zunahme [2 + Ca] Ca 2 + -regulierte Ryanodinrezeptoren (RyR2) in Nanometer in der Nähe nebeneinander SER Membran Kreuzung, und das Kupplungsvorgang in ganz elektrisch Paar auftrittd myocyte Nanodomänen. RyR2s auftreten als dichte Multi-Channel-Cluster mit einem geschätzten Stöchiometrie von 1 Cav1.2-Kanal für 5-10 RyR2 Kanäle 2. Seit der SER-to-Cytosol [Ca 2 +] Steigung ist sehr steil (Verhältnis 10 4: 1) und RyR2s funktionieren als Hoch Leitfähigkeit Ca2 +-Kanäle in Release funktionell gekoppelt Cluster, RyR2 Aktivierung führt zu einer quantitativ großen Ca 2 + Auslösestrom von T-Tubuli gekoppelt junctional SER Domains Erhöhung der lokalen Unterraum [Ca 2 +] S bis 100 um oder mehr innerhalb von 1-2 ms 3,4. Diese Herzsignalverstärkung Verhalten wird auch als Ca 2 + induzierten Ca2 + Freisetzung (ZPK) bezeichnet. Zusammengenommen T-Tubuli sind wesentliche Membranstrukturen, die während der Erregung und Kontraktion (EG) Kupplung schnell aktivieren Ca2 + Freisetzung Signale durch junktionale Nanodomänen SER Kontakte und Zell-breite IKRK. Neben T-Tubuli, axial Tubuluss (A-Tubuli) mit deutlich unterschiedlicher Ausrichtung parallel zu den Haupt (längs) Zellenachse durch Elektronenmikroskopie (EM), konfokale und 2-Photonen-Mikroskopie Studien dokumentiert. So wurde beispielsweise eine Zelle weiten kontinuierlichen Gitter von A-Tubuli zwischen Myofibrillen mit T-Tubuli in der Nähe von Sarkomer Z-Leitungen miteinander verbunden durch extrazelluläre Tracer und EM-Bildgebung des Anlage Meerschweinchen VMs 5 gezeigt. Mit extrazellulären Dextran-linked Fluoreszeinfärbung und leben 2-Photonen-Imaging von Ratten VMs, wurde eine komplexe netzartige 3D-Röhrchen Netzwerk visualisiert, bestehend aus ~ 60% T-Tubuli und ~ 40% A-Tubuli 6. Diese Studie nicht nur 3D-Visualisierung von reichlich A-Röhrchen geführt, sondern auch zu der Erkenntnis, dass die Schneiden zum EM-Visualisierung ist inhärent für die Analyse von komplexen und dynamischen Membran Netzwerke wie queraxialer Tubulus System (TATS) begrenzt. Folglich konfokale Live Cell Imaging TATS Membranen direkt mit Bunt di-8-ANNEPS entwickelt. Wenn Live CellTATS Netzwerke werden durch Fourier-Transformation analysiert werden, wird der reguläre Auftreten von T-Tubuli Komponenten im Raum in der Nähe Sarkomerlänge Z-Linien von dem Ensemble Leistungsspektrums von einem Bereich der quergestreiften Signale 7 reflektiert. Diese indirekte Analyse Strategie wurde verwendet, um die Zellweit regionale Veränderungen in TATS Komponente Regelmäßigkeit in Krankheitsmodellen 7 zu erkennen. Zum Beispiel verursacht shRNA vermittelten junctophilin-2 knock-down Herzinsuffizienz und die Isoform spezifische Protein-Mangel führte zu T-Tubuli Reorganisation mit Nanodomänen Ca 2 + Release 8 Dysfunktion. Wir haben vor kurzem erweitert die Analyse von Membran TATS Netze durch direkte quantitative Ansätze und weiter durch Superresolution-Mikroskopie an lebenden Zellen der einzelnen Komponenten in TATS Maus VMs, die stimulierte Emission Depletion (STED) Nanoskopie 9. Nanometrischen Bildauflösung für die direkte Analyse von kleineren Einzel TATS Komponenten, die eine 50:50 Verteilung der Quernähern erlaubtgegenüber dem axialen Röhrchen Orientierungen, quantitativ bestätigt zwei reichlich noch unterschiedlich orientierte Einzel TATS Komponenten bei gesunden Mäuseherzen 9. Diese Strategien werden in dem Protokoll weiter unten beschrieben werden. Während die physiologische Rolle der reichlich vorhandenen A-Tubulus Komponenten im erwachsenen Herzen hat rätselhafte blieb, haben EM-Studien SER mit A-Tubuli was darauf hindeutet, endogenen Ca2 + Freisetzung Nanodomänen in Meerschweinchen und Ratte VMs 5,10 verbundenen Membranstrukturen dokumentiert. Konfokale Analyse der Cav1.2 und RyR2 fanden eine hohe Kolokalisation bei A-Tubulus Gänge 10. Da ca. 20% der spontanen Ca2 + Funken in Ratten VMs entstand relativ weit entfernt von Z-Linie Streifen, wo T-Tubuli treten typischerweise auf, hat ein Argument gewesen, dass A-Röhrchen verbunden Nanodomänen kann in der Tat existieren und funktionieren, wie Ca2 + Freisetzung Websites 11,12. Interessant ist, dass T-Tubuli Bildung und Reifung ocCURS erst nach der Geburt und verläuft parallel zum Wachstum der Herzzellen, beispielsweise durch Austreiben von Vorläufer sarkolemmalen Einstülpungen an P5 und unreife verzweigte TATS Netzwerk Baugruppen bei P10 in 13 Mäuse. Es scheint, dass Junctophilin-2 ist besonders wichtig für postnatalen Reifung TATS Netzwerk seit shRNA knock-down verhindert die Verankerung der T-Tubuli Membranen SER Gänge, die zu verzögerten Ca2 + Freisetzung und pathologischen TATS Organisation, die mit unreifen A-Tubulus dominiert Architekturen VMs 13. Diese Beobachtungen können letztlich zu Proof-of-Concept, die T-Tubuli bilden durch Membranprozesse während eine Einstülpung-Tubuli kann durch zusätzliche oder sogar alternative intrazelluläre Mechanismen 14 morphen führen. Charakterisierung von Membran TATS Veränderungen der Herzkrankheit ist zu einem wichtigen Forschungsbereich für pathophysiologische Fragen. Erste Berichte in einem Hundemodell der Stimulation-induzierte Herz failure zeigte einen Verlust von T-Tubuli und Cav1.2 (I Ca) 15. Ein Schweinemodell des ischämischen Kardiomyopathie zeigte T-Tubuli Dichten reduziert und ein reduziertes Synchronität der intrazellulären Ca 2 + frei 16. Mit Hilfe eines spontan hypertensiven Ratten (SHR) Modell der Herzinsuffizienz, wurde ein Verlust von T-Tubuli mit reduzierter Nanodomänen Kopplung von Cav1.2 und RyR2 durch die vorgeschlagene Mechanismus der &quot;RyR2 verwaisen&quot; assoziiert 7. Ein Verlust der T-Tubuli hat auch in der Human VMs von ischämischen, erweiterte und hypertrophe Kardiomyopathie Proben 17 gezeigt. Darüber hinaus wurde eine Zunahme in A-Tubuli in Gewebeschnitten von menschlichen Kardiomyopathie 18 gemeldet. Nach Myokardinfarkt, zeigten wir eine Differentialmechanismus TATS Reorganisation in der Maus VMs mit einer signifikanten Abnahme der T-Tubuli im Gegensatz zu Erhöhungen der A-Tubulus Komponenten 9. Wichtig ist, Verbesserung der lokalen Membran dagegen durch Lebendzell superre erreichtLösung der STED-Mikroskopie konnten detaillierte quantitative Komponentenanalyse durch direkte Messungen, die erhebliche Vermehrung der A-Tubuli mit insgesamt steigt der TATS Netzlänge und Verzweigung Komplexität 9 zeigte. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass körperliches Training kann T-Tubuli Umbau bei Ratten nach Myokardinfarkt und 19, dass die kardiale Resynchronisationstherapie kann dazu führen, Umbau der T-Tubuli bei Hunden mit Vorhof tachypacing induzierten Herzinsuffizienz 20 rückwärts umzukehren. Zusammengenommen werden Studien sowohl in erkrankten menschlichen und tierischen VMs sowie mögliche therapeutische Interventionen wohl aus hochwertigen Zellisolationsverfahren und detaillierte quantitative Analyse Strategien profitieren, wie im Protokoll beschrieben und Ergebnisse Abschnitten. Darüber, wie kürzlich durch Seitenfläche demonstriert gegen TATS Membrantransport von KATP-Kanal-Isoformen 21, ist es wichtig, Vorhof m betrachtenyocytes (AMS) als biologisch verschieden sowie vergleichende Herzzellmodell gegenüber VMs. T-Tubuli wurden kürzlich bei Schafen und menschlichen BM 22 dokumentiert. Aktuelle Hinweise darauf, dass einige T-Tubuli existieren in AM-Zellen und in der Regel in größeren Säugetieren wie Schafe und Menschen, aber nicht in 23 kleine Nagetiere. Im Gegensatz zu VMs, AMS intrazelluläre Ca2 + Freisetzung wird durch Diffusion in Richtung der Zellenmitte, die in räumlicher und zeitlicher gekennzeichnet Ca 2 +-Gradienten führt zu 23 von der Zelloberfläche ausbreitet, auftritt. In diesem Rahmen erscheint es wichtig, die Mechanismen der intrazellulären Ca 2 +-Signalisierungs Instabilität für die gemeinsame Krankheitsformen wie Vorhofflimmern 24 aufzuklären. Zusammenfassend werden sowohl AM und VM Zellisolierung und jeweils für gesunde und kranke Herz üblicherweise verwendeten Protokolle. Nur wenn der Zellisolierung richtig gemacht wird, wie durch mikroskopische Dokumentation ausreichender Zellqualität erachtet wird, sollte AM und VM Proben ca seinrried vorwärts für die quantitative Analyse TATS. Dementsprechend sind die folgenden Abschnitte Protokoll entscheidend von Qualitätszelle Isolate aus der Maus oder anderen Spezies, gefolgt von Lebendzellmikroskopie zu intakten Membranen TATS analysieren. Wie zuvor erwähnt, Charakterisierung von Membranen TATS ist eine anspruchsvolle Forschungsbereich mit einem Hang zur Fixierung und Vorbereitung Artefakte 6, Membranveränderungen durch osmotische Änderungen und Auflösung Grenzen der konventionellen Lichtmikroskopie 9. Wir stellen fest, dass die jüngsten state-of-the-Art-Protokolle für die Isolierung von humanen BM für Ca2 + Imaging und Patch-Clamp-und Ratten VMs für die Zellkultur wurden bereits in dieser Zeitschrift veröffentlicht 25,26.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Chemikalien und Enzyme</td></tr><tr><td>2,3-Butandion-Monoxim</td><td>Sigma-Aldrich, München, Deutschland</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>Rinder-Kälberserum</td><td>Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland</td><td>SH30073</td><td>Triple 0,1 &micro; m steril gefiltert.</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, München, Deutschland</td><td>21115</td><td>1:10 in MQ>Wasser verdünnt, um eine CaCl2-</Unterstammkonzentration von 100 mM zu erhalten.</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ II</td><td>Worthington via Cell Systems, Troisdorf, Deutschland</td><td>auf Anfrage</td><td>Die enzymatische Aktivität hängt von den einzelnen Kollagenase-Chargen ab. Kollagenase II und andere Enzymaktivitäten (Caseinase, Clostripain, Tryptic) können im "Kollagenase-Chargenauswahltool" bewertet werden. Bestimmen Sie die Zellausbeute und -qualität individuell für jede neue Charge Kollagenase.</td></tr><tr><td>Glukose</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>HN06.1</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Rotexmedica, Trittau, Deutschland</td><td>PZN-03862340</td><td>In 0,9 % NaCl verdünnt und subkutan in die Bauchhaut injiziert.</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>Forene 100% (V/V)</td><td>Abbott, Libertyville, IL, USA</td><td>B506</td><td>Wirkstoff: Isofluran, 250 ml. Verwenden Sie ca. 2 Vol% in einem Luft-/Sauerstoffspendergerät.</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>6781,3</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>3904.2</td><td></td></tr><tr><td>Laminin (2 mg/ml)</td><td>BD Biosciences, Heidelberg, Deutschland</td><td>354232</td><td>Laminieren wird in Schritt 2.1 beschrieben.</td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>2189,2</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>8283.2</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4&middot; 2H2O</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>4984.2</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>HN01.1</td><td></td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland</td><td>4721.2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Dyes</td></tr><tr><td>Di-8-ANEPPS</td><td>Molecular Probes, Life Technologies, Darmstadt, Deutschland</td><td>D-3167</td><td>Stammlösung 2 mM in DMSO</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Sigma-Aldrich, München, Deutschland</td><td>T8154</td><td>Trypanblau wird vor der Zellzählung im Neubauer Zytometer 1:1 über eine 1 ml Kunststoffpipette mit Spitzenschnitt vorsichtig 1:1 mit Zellsuspension gemischt.</td></tr><tr><td colspan="4">Langendorff Perfusion Setup</td></tr><tr><td>Zirkulationsthermostat</td><td>Lauda, Lauda-K&ouml; nigshofen, Deutschland</td><td></td><td>Bitte beziehen Sie sich auf Louch et al. (JMCC 2011). Thermostat und Puffer in Perfusionsschläuchen auf 37 Grad aufheizen; C 15 min vor Gebrauch.</td></tr><tr><td>Flexibler Silikonschlauch Tygon für Schlauchpumpe</td><td>VWR, Darmstadt, Deutschland</td><td>224-2252</td><td>Der Schlauch muss regelmäßig gewechselt werden.</td></tr><tr><td>Flexibler Silikonschlauch Tygon für Thermostat</td><td>VWR, Darmstadt, Deutschland</td><td>228-4340</td><td></td></tr><tr><td>Heizschlangenumrandung Perfusionsschlauch</td><td>Rettberg, G&ouml; ttingen, Deutschland</td><td>Sonderanfertigung</td><td>Heizschlange und Schläuche müssen nach Gebrauch gründlich mit MQ-Wasser gereinigt werden. Verwenden Sie keine Reinigungsmittel. Glaskomponenten sollten regelmäßig gebadet werden&nbsp; in 10 mM NaOH über Nacht.</td></tr><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Ismatec, Wertheim, Deutschland</td><td>ISM830</td><td></td></tr><tr><td>Dreiwege-Absperrhahn Discofix C Luer Lock 10 cm</td><td>Braun, Melsungen, Schweiz</td><td>16500C</td><td></td></tr><tr><td>Dreiwege-Absperrhahn Discofix 3SC</td><td>Braun, Melsungen, Schweiz</td><td>4095146</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Instruments</strong</td></tr><tr><td>>42 mm Glas-Deckgläser</td><td>Menzel Gl&auml; ser über Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland</td><td>auf Anfrage</td><td>0,13-0,16 mm dicke</td></tr><tr><td>Kanüle 21 G</td><td>Becton, Dickinson and Company, Franklin Lake, NY, USA</td><td>304432</td><td>Auf eine Länge von ~5 mm geschnitten, mit Schleifpapier aufgeraut.</td></tr><tr><td>Deckgläser für Neubauer Zytometer 24 x 24 mm</td><td>Menzel Gl&auml; ser via Thermo Scientific, Schwerte, Deutschland</td><td>auf Anfrage</td><td>0,38-0,42 mm Dicke</td></tr><tr><td>Graefe Pinzette, 0,5 mm Spitzen, leichte Kurve</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland</td><td>11151-10</td><td></td></tr><tr><td>LSM 710 NLO</td><td>Carl Zeiss, Jena, Deutschland</td><td></td><td>63X 1,4 NA Ölobjektiv</td></tr><tr><td>Neubauer verbessertes Zytometer</td><td>Labor Optik, Friedrichsdorf, Deutschland</td><td>1100000</td><td>Zählverfahren: Wischzytometer und Deckglas, die mit der Zählkammer geliefert werden, mit 70 % Ethanol abwischen. Drücken Sie das Deckglas vorsichtig auf die Zählkammer, so dass die beiden Glasflächen in Kontakt stehen und die Newtonschen Ringe zu sehen sind. Anschließend 10-20 &Mikro; Die L-Zellsuspension kann auf den Rand des Deckglases aufgetragen werden, um durch Kapillarwirkung in den Hohlraum gesaugt zu werden. Zählen Sie die intakten vs. defekten Myozyten anhand der Quadrate des Zytometergitters, das 100 nl anzeigt. Wiederholen Sie den Zählvorgang auf dem zweiten Gitter auf dem Zytometer. Berechnen Sie die Dichte der Zellen in Ihrer ursprünglichen Zellsuspension, indem Sie etwaige Verdünnungen und Zählkürzel berücksichtigen.</td></tr><tr><td>POC-R2 Bildgebungskammer</td><td>Pecon, Erbach, Deutschland</td><td></td><td>Volumen der Zellsuspension: 800 &Mikro; l; gewünschte Beschichtungsdichte: ~1.000 AM und ~10.000 VM</td></tr><tr><td>Federschere, 8 mm Klingen gerade, stumpf</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland</td><td>15025-10</td><td></td></tr><tr><td>Student dumont #7 Pinzette, inox</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland</td><td>91197-00</td><td></td></tr><tr><td>Student Irisschere, gebogen, 11,5 cm</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland</td><td>91461-11</td><td></td></tr><tr><td>Student Irisschere, gerade, 11,5 cm</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Studentische Surcigalschere, gerade, scharf, 12 cm</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland</td><td>91402-12</td><td></td></tr><tr><td>Gewebezange, 1 x 2 Zähne, schlank, 10 cm</td><td>Fine Science Tools, Heidelberg, Deutschland</td><td>11023-10</td><td></td></tr></tbody></table>

analyse von membranrohrnetze in herzmuskelzellen von vorhöfe und kammern

Analysis of Tubular Membrane Networks in Cardiac Myocytes from Atria and Ventricles

In kardialen Myozyten steuert ein komplexes Netzwerk von Membrantubuli - das transversal-axiale Tubulussystem (TATS) - tiefe intrazelluläre Signalfunktionen. Während die äußere Oberflächenmembran und die zugehörigen TATS-Membrankomponenten kontinuierlich zu sein scheinen, gibt es erhebliche Unterschiede im Lipid- und Proteingehalt. In ventrikulären Myozyten (VMs) sind bestimmte TATS-Komponenten sehr häufig vorhanden und tragen zu geradlinigen Tubulusnetzwerken und regelmäßig verzweigten 3D-Architekturen bei. Es wird angenommen, dass periphere TATS-Komponenten Aktionspotentiale von der Zelloberfläche zu Tausenden von entfernten intrazellulären Membrankontaktdomänen des sarkoendoplasmatischen Retikulums (SER) propagieren und dadurch intrazelluläre Ca2+-Freisetzungseinheiten (CRUs) aktivieren. Im Gegensatz zu VMs ist die Organisation und funktionelle Rolle von TATS-Membranen in atrialen Myozyten (AMs) signifikant anders und viel weniger verstanden. Insgesamt ist die quantitative strukturelle Charakterisierung von TATS-Membrannetzwerken in gesunden und kranken Myozyten eine wesentliche Voraussetzung für ein besseres Verständnis der funktionellen Plastizität und pathophysiologischen Reorganisation. Hier stellen wir eine strategische Kombination von Protokollen für die direkte quantitative Analyse von TATS-Membrannetzwerken in lebenden VMs und AMs vor. Zu diesem Zweck begleiten wir primäre Zellisolierungen von Maus-VMs und/oder AMs mit kritischen Qualitätskontrollschritten und direkten Membranfärbeprotokollen für die Fluoreszenzbildgebung von TATS-Membranen. Mit Hilfe eines optimierten Workflows für die konfokale oder superauflösende TATS-Bildverarbeitung werden binarisierte und skelettierte Daten für die quantitative Analyse des TATS-Netzwerks und seiner Komponenten generiert. Im Gegensatz zu bisher veröffentlichten Strategien zur indirekten regionalen aggregierten Bildanalyse ermöglichen unsere Protokolle die direkte Charakterisierung spezifischer Komponenten und leiten komplexe physiologische Eigenschaften von TATS-Membrannetzwerken in lebenden Myozyten mit hohem Durchsatz und frei zugänglichen Softwarewerkzeugen ab. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die kombinierte Protokollstrategie problemlos für quantitative TATS-Netzwerkstudien während der physiologischen Myozytenanpassung oder Krankheitsveränderungen, den Vergleich verschiedener Herz- oder Skelettmuskelzelltypen, die Phänotypisierung transgener Modelle und pharmakologische oder therapeutische Interventionen angewendet werden kann.

In Herzmuskelzellen, röhrenförmigen Membranstrukturen intrazellulären Netzwerken. Wir beschreiben optimierte Protokolle für i) Isolierung von Myozyten aus Maus Herz einschließlich der Qualitätskontrolle, ii) Lebendzellfärbung für state-of-the-Art-Fluoreszenzmikroskopie, und iii) die direkte Bildanalyse, um die Komponente Komplexität und die Plastizität der intrazellulären Membran quantifizieren Netzwerken.

Analyse von Membranrohrnetze in Herzmuskelzellen von Vorhöfe und Kammern

In cardiac myocytes a complex network of membrane tubules - the transverse-axial tubule system (TATS) - controls deep intracellular signaling functions. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die tubulären Membrannetzwerke in atrialen und ventrikulären Myozyten zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst atriale und ventrikuläre Myozyten aus einem adulten Mausherz isoliert werden. Im zweiten Schritt wird das transversale axiale Tubulussystem oder die Tätowierungen in den intakten lebenden isolierten Herzmyozyten angefärbt.Als nächstes wird das Tats-Membrannetzwerk durch konfokale oder stationäre Fluoreszenzmikroskopie sichtbar gemacht, und dann werden die Komponenten des Netzwerks quantitativ analysiert. Letztendlich können die Unterschiede zwischen den Membrannetzwerken verschiedener Zelltypen oder zwischen Schein- und Behandlungsgruppen durch die quantitative tats-Bildanalyse aufgedeckt werden. Der Hauptvorteil dieser Zellisolations- und Analysetechnik besteht darin, dass ein umfassender Arbeitsablauf des Isolierungsprozesses zu einer direkten Fluoreszenzbildgebung der Myozyten führt, was eine quantitative Datenanalyse des Berührungsmembrannetzwerks ermöglicht.Diese Methode kann Einblicke in die Organisation komplexer Membrannetzwerke in lebenden gesunden Kardiomyozyten geben, aber auch auf Myozyten von erkrankten oder transgenen Tieren angewendet werden. Neulinge in diesem Protokoll profitieren von einer zusätzlichen Einführungsschulung, um eine konsistente Isolierung von hochwertigen kardialen Myozyten zu erreichen und eine wichtige Voraussetzung für die Durchführung der Technik zu schaffen: Um die Myozyten zu isolieren, beginnen Sie mit der Perfusion des Herzens einer Maus ab 12 Wochen mit 37 Grad Celsius sauerstoffhaltigem Perfusionspuffer für vier Minuten, sobald die Organentnahme möglich ist. Untersuchen Sie anschließend das Herz acht bis 10 Minuten lang mit 37 Grad Celsius heißem Verdauungspuffer und überwachen Sie den Fortschritt der Gewebeverdauung, um die Undurchsichtigkeit, Weichheit und Säure auf der gesamten sichtbaren Herzoberfläche zu erhöhen.Nach der Verdauung wird das rechte Vorhofohr abgelenkt und der rechte Vorhof direkt über den Vorhofklappen präpariert. Setzen Sie die Dissektion mit dem linken Vorhof fort und präparieren und verwerfen Sie dann den fibrösen Klappenapparat. Beenden Sie die Dissektion, indem Sie die linke und rechte freie Ventrikelwand sowie das Septum und kleinere Gewebeteile nach Bedarf befreien.Übertragen Sie dann das gesamte ventrikuläre Gewebe in eine 60-Millimeter-Petrischale, die 2,5 Milliliter Verdauungspuffer enthält, und schneiden Sie das Gewebe dann in etwa einen Millimeter große Würfel. Fressen Sie die Gewebestücke langsam mit einer Transferpipette, um die ventrikulären Myozyten sanft in eine Einzelzellsuspension zu dissoziieren, wobei darauf zu achten war, Blasen oder Flüssigkeitsstrahlschäden zu vermeiden. Geben Sie dann 7,5 Milliliter Stopppuffer in die Zellsuspension.Parallel dazu schneiden Sie das verdaute Vorhofgewebe in einem Milliliter Verdauung in etwa einen Millimeter große Würfelstücke, puffern Sie es in einer 60-Millimeter-Petrischale und tritrieren Sie dann die Vorhofmyozyten vorsichtig, wie gerade gezeigt. Nach dem mechanischen Rühren fügen Sie vier Milliliter Stopppuffer hinzu, um die verbleibende Kollagenaseaktivität in der atrialen Myozytensuspension zu stoppen. Übertragen Sie dann die Zellsuspension in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen und lassen Sie die restlichen Gewebestücke 15 Sekunden lang sedimentieren, bevor Sie die isolierten Myozyten mit der Supinatfraktion ernten.Nach einem Waschschritt werden die atrialen Myozyten in fünf Millilitern Perfusionspuffer schonend mit Resus suspendiert und die Zellsuspension in 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen in etwa eins mal 10 zu den drei Zellaliquoten aufgeteilt, um die Membranen der ventrikulären Myozyten zu färben. Zuerst lassen Sie die Zellen durch die Schwerkraft acht Minuten lang zur Ruhe kommen und senden Sie ein 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen zum Färben in die Vorhofmyozyten, lehnen Sie die Zellen für zwei Minuten bei 20-facher G-Temperatur bei Raumtemperatur für beide Zelltypen ab. Entfernen Sie anschließend vorsichtig das Supinat, wobei Sie darauf achten, dass das Zellpellet nicht unnötig bewegt wird.Dann resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig in 800 Mikrolitern des membranspezifischen Tylfarbstofffarbstoffs Farbstoff acht und eps und übertragen Sie die Myozyten sofort auf lamininbeschichtete Deckgläser in einer Bildgebungskammer nach einer 15-minütigen Inkubation in der dunklen Wäsche. Die Abdeckung wird einmal aufgeschoben und dann mit einem Milliliter Perfusionspuffer bedeckt. Nehmen Sie ein Beispielbild eines zentralen intrazellulären Myozytenschnitts und verwenden Sie dann die Zuschneidefunktion, um das Zuschnittsfenster und die endgültige Pixelgröße auf 100 x 100 Nanometer einzustellen.Um die endgültige Bildebene auszuwählen, verwenden Sie einzelne Bildrahmen, um manuell die am besten geeignete Bildebene in Z-Richtung auszuwählen. Vergewissern Sie sich, dass das Membrannetzwerk der TA sowohl t-Röhren- als auch a-Röhrenkomponenten umfasst und in der Fokusebene visuell sichtbar ist. Es ist zu beachten, dass eine typische intrazelluläre Bildgebungsebene einen Zellkern als zentralen intrazellulären Referenzpunkt enthalten kann.Um das tats-Membrannetzwerk und seine Komponenten zu analysieren, öffnen Sie nun die Bilddatei mit der entsprechenden Bildanalysesoftware. Verwenden Sie das Polygonauswahlwerkzeug, um den interessierenden Bereich abzugrenzen, während Sie die äußere Oberflächenmembran ausschließen und intrazelluläre Teile des Tats-Membrannetzwerks einbeziehen, wie in diesem Bild dargestellt. Verwenden Sie anschließend die Befehle Bearbeiten und Externes löschen, um den ausgewählten ROI so zu generieren, dass der ausgewählte intrazelluläre Bereich nur die intrazellulären Membranteile des Tats-Netzwerks, aber keine Teile der Oberflächenmembran enthält.Klicken Sie nun auf Prozess und Hintergrund subtrahieren und stellen Sie den Radius der rollenden Kugel auf fünf Pixel ein. Wählen Sie dann Prozess und lokalen Kontrast verbessern. Und legen Sie die Blockgröße auf 49, die Histogramm-Bins auf 256, die maximale Steigung auf drei und die Maske auf keine fest.Klicken Sie unter Plugins auf "Verarbeiten und glätten", wählen Sie Segmentierung und Zusammenführung statistischer Regionen aus und setzen Sie den Parameter auf Q 100. Klicken Sie dann auf Durchschnittswerte anzeigen. Wählen Sie als Nächstes Bildtyp und Acht-Bit aus, und wählen Sie dann Bildanpassung und Schwellenwert aus, beginnend mit einem Schwellenwert von 40.Beachten Sie, dass die richtige Wahl des Schwellenwerts nur bestimmte Membranstrukturen und keine falsch positiven Signale aufgrund von Hintergrundrauschen erzeugen sollte. Wählen Sie dann unter Plugins Skelett und skelettiertes 2D-3D aus und speichern Sie das skelettierte 2D-Bild als adoptive Datei. Wählen Sie nun wieder Plugins aus und analysieren Sie skeleton 2D 3D, um die skelettierte Bilddatei für die quantitative Datenausgabe zu analysieren.Wählen Sie dann für die Methode "Beschneidungszyklus" die Option "Keine" aus und bestätigen Sie die automatische Generierung der resultierenden Datentabelle. Verwenden Sie nun das Fiji-Plugin directionality, um die einzelnen Ausrichtungen der entsprechenden Steuernetzwerkkomponenten aus den skelettierten Bilddaten zu analysieren. Wählen Sie unter Methode die Option BAUIER-Komponenten, Endbins 180 und einen Histogrammbeginn von minus 45 Grad aus.Überprüfen Sie abschließend die Anzeigetabelle und generieren Sie ein Richtungshistogramm. In dieser ersten Abbildung ist ein repräsentatives skelettiertes Bild der Tattoos in einem gesunden ventrikulären Myozyten dargestellt, das aus transversalen Elementen besteht, die senkrecht zur x-Achse des Bildes stehen, und aus axialen Komponenten, die parallel zur x-Achse verlaufen. Die Anwendung des Direktionalitäts-Plugins führt zu einem Orientierungshistogramm für die ventrikulären Tattoos mit vergleichbaren Peaks bei null Grad, sie stellt das axiale Verhältnis und bei 90 Grad das Querverhältnis dar. Im Gegensatz dazu besteht ein repräsentatives skelettiertes Bild der Taten in einem atrialen Myozyten hauptsächlich aus axialen Komponenten, die parallel zur X-Achse des Bildes verlaufen.So zeigt das entsprechende Orientierungshistogramm einen dominanten Peak um den Null-Grad-Bin, der den axialen Tats-Anteil darstellt, und nur einen kleinen Peak bei 90 Grad, der den transversalen Tats-Anteil darstellt. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Zellqualität in jedem Schritt nach der Zellisolierung, während der Bildgebung und vor allem zu überprüfen. kurz vor der Bildanalyse. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie komplexe Membranstrukturen, tes-Netzwerke und potenziell membranassoziierte Proteine vollständig differenziert werden. Adulte Herzmyozyten können durch konfokale Mikroskopie abgebildet und quantitativ analysiert werden.Bitte vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit lipophilen Membranaugen, Verdauungsenzymen und potenziell infektiösen Herzpatienten eine Gefahr darstellen kann und dass bei der Durchführung dieser Eingriffe immer Vorsichtsmaßnahmen wie eiserner Hautschutz getroffen werden sollten.

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Biotechnik

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