Ein hoher Gehalt Imaging Assay zur Identifizierung von Botulinum Neurotoxin-Inhibitoren

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Entwicklung eines phänotypischen Screening-Assays, der die Spaltung seines Substrats SNAP 25 durch IES-Botulinum vermittelt, mit dem Ziel, kleine Moleküle zu identifizieren, die die Toxinfunktion während der normalen Nervensignalübertragung hemmen. Das Aktionspotenzial bewirkt, dass SNAP 25 das synaptische Vesikel an die Plasmamembran des Motoneuronen-Endes bindet, was zur Freisetzung von Neurotransmittern führt. Wenn jedoch Botulinum-Neurotoxin vorhanden ist, wird es von der Endozytose aufgenommen und im synaptischen Buton freigesetzt, wo es SNAP 25 spaltet und so die Freisetzung von Neurotransmittern stört, was zu Lähmungen führt.

Dieser Assay identifiziert Moleküle, die die Botulinumtoxin-Aktivität hemmen und somit die Spaltung von SNAP 25 in Gegenwart von Botulinumtoxin verhindern und so die Freisetzung von Neurotransmittern in der neuromuskulären Verbindung wiederherstellen können. Ein High-Content-Imaging-Assay, der mit Motoneuronen der Maus durchgeführt wurde, wird verwendet, um die Konservierung von SNAP 25 zu demonstrieren, was zur Identifizierung kleiner Moleküle führt, die die Metalloproteaseaktivität von Botulinum-Neurotoxin hemmen können. Der Hauptvorteil dieser Technologie oder bestehender Methoden wie zellfreier biochemischer Assays besteht darin, dass mehrere phänotypische Endpunkte gleichzeitig aus einer einzigen Vertiefung erfasst werden können, die Motoneuronen enthält, die mit Screening-Verbindungen und Toxinen behandelt wurden.

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zu beantworten, die beim Bibliotheksscreening auftreten, wie z. B. die Quantifizierung der zellbasierten Aktivität und Zytotoxizität. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie der Botulinumvergiftung, da sie Inhibitoren identifizieren kann, die entweder direkt durch Blockierung der Metallproteaseaktivität oder indirekt durch Verhinderung der Toxinaufnahme, der Verarbeitung oder möglicherweise anderer Mechanismen wirken. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Optimierung der Immunfärbebedingungen, die für den SNAP 25-Nachweis erforderlich sind, eine Herausforderung darstellen kann.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da der Schritt der Immunfärbung schwer zu perfektionieren ist, da ein Motor um sich herum ziemlich empfindlich ist. Die Stand- und Waschschritte sind der Schlüssel zur Entwicklung qualitativ hochwertiger Bilder, die für die nachgelagerte Analyse erforderlich sind. Alle Studien, die lebende Zellen und aktive Toxine verwenden, werden unter Bedingungen der Biosicherheitsstufe zwei durchgeführt, dekontaminieren Sie die Arbeitsbereiche sowohl vor als auch nach diesen Experimenten mit einem 5%igen Reinigungs- und Desinfektionsreiniger, wie z. B. Mikrochemielösung.

Nach der Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in Motoneuronen, wie im Textprotokoll beschrieben, verwenden Sie eine manuelle 12-Kanal-Pipette, um das alte Medium zu ersetzen. In den 96 Well-Platten mit 80 Mikrolitern frischen terminalen Differenzierungsmedien führen Sie die Aspirations- und Dispensierschritte Reihe für Reihe durch, um die Exposition der Zellen gegenüber der Umgebungsluft zu minimieren. Fügen Sie anschließend mit einer 12-Kanal-Pipette 10 Mikroliter von 10 x der Testverbindungen von der Ausgangsplatte hinzu und aspirieren Sie dann zweimal, um x zu mischen.

Behandeln Sie zwei Säulen mit sechs Wells mit 10 X-D-M-S-O, die in den Medien verdünnt sind, um als Regler für hohe und niedrige Signale zu dienen. Inkubieren Sie die Zellen mit den Verbindungen für 30 Minuten bei sieben Grad Celsius und 6 % Kohlendioxid. Als nächstes verdünnen Sie das Botulinum-Neurotoxin A in PBS mit terminalen Differenzierungsmedien, um unter Verwendung einer Mehrkanalpipette einen endgültigen 10-fachen Arbeitsstock zu erhalten, und fügen Sie 10 Mikroliter von 10 x Botulinum-Neurotoxin A-Vorrat zu den für die Behandlung vorgesehenen Vertiefungen und auch zu den Kontrollwellen mit niedrigem Signal hinzu.

Behandeln Sie die als Hochkontrolle gekennzeichneten Vertiefungen ausschließlich mit Medien, dekontaminieren Sie alle Kunststoffe und andere Einwegartikel, die mit Botulinum-Neurotoxin in Kontakt kommen. A durch Eintauchen in 0,825%ige Hypochloritlösung in Wasser für mindestens 20 Minuten. Beschriften Sie die Platten deutlich mit der Kennzeichnung des Toxinverbrauchs und inkubieren Sie die Platten nach der Inkubation vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 6 % Kohlendioxid.

Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um das Medium, das das Toxin und die Verbindungen enthält, aus jeder Vertiefung zu entfernen, und entsorgen Sie es in einer 10%igen Bleichlösung. Geben Sie dann 100 Mikroliter eiskaltes Methanol direkt in jede Vertiefung, um das Botulinum-Neurotoxin zu stoppen. Eine proteolytische Spaltung.

Inkubieren Sie die Platten anschließend 15 Minuten lang bei Raumtemperatur, damit die Fixierung erfolgen kann. Nach der Fixierung sind die weggeworfenen neutralisierten Reagenzien mit Protokollen der Biosicherheitsstufe eins zu behandeln und entsprechend zu entsorgen. Nachdem Sie das Methanol verworfen haben, waschen Sie die Zellen dreimal mit 100 Mikrolitern PBS, um sie vor der Immunfärbung zu rehydrieren.

Die Immunfärbung, die in einer Biosicherheitswerkbank der Klasse zwei durchgeführt wird, wird an einer automatisierten Arbeitsstation durchgeführt, die so angeordnet ist, dass der Zugang zu den Reagenzien bei Bedarf und ohne menschliches Eingreifen ermöglicht wird. Laden Sie die Platten mit den festen Zellen in das PLATE-Magazin und übertragen Sie es bei Bedarf für Liquid-Handling-Vorgänge auf das Deck. Mit dem Pipettenkopf 96, der mit 250-Mikroliter-Spitzen ausgestattet ist, saugt die Workstation PBS aus den Wells bis auf 10 Mikroliter ab.

Die Workstation dosiert 100 Mikroliter Blockierungspuffer mit 1 % Pferdeserum und 0,1 % Tween 20 in PBS in alle Mikrotiterplatten. Anschließend werden die Platten für eine einstündige Inkubation bei Raumtemperatur wieder in das Plattenmagazin gelegt. Entfernen Sie nach der Inkubation den Blockierungspuffer und geben Sie 50 Mikroliter mit vier Mikrogramm pro Milliliter BS-Antikörper und 0,5 Mikrogramm pro Milliliter Beta-3-Tubulin in Blockierungspuffer in alle Platten.

Inkubieren Sie die Platten eine Stunde lang bei Raumtemperatur, entfernen Sie dann die primären Antikörper und waschen Sie sie dreimal mit 100 Mikrolitern PBST. Bereiten Sie zwei Mikrogramm pro Milliliter vor, Verdünnungen von Sekundärantikörpern, die mit verschiedenen Fluorvieren markiert sind, wie im Textprotokoll beschrieben. Geben Sie 50 Mikroliter der Mischung in jede Vertiefung und inkubieren Sie eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation aspirieren Sie die Sekundärantikörper und waschen Sie sie dreimal mit 100 Mikrolitern PBST.

Als nächstes bei 100 Mikrolitern PBS mit 32 mikromolaren Haken Farbstoff zur Färbung der DNA für den Zellkernnachweis. Zum Schluss versiegeln Sie die Platten mit einer lichtundurchlässigen Folie, um die Fluorvier vor Photobleichen zu schützen. Die Platten können wochenlang bei vier Grad Celsius gelagert werden, ohne dass das Signal wesentlich verloren geht.

Geben Sie im Bilderfassungssystem den Plattentyp als Schleifer u. Löschen Sie das Layout auf 96. Formatieren Sie die Anzahl der Felder als 16 und das Ziel als 20 x Wasser.

Wählen Sie dann die Kanäle für die Kernanregung von 405 Nanometern aus. Wählen Sie Kanal vier für die Zytoplasmaanregung von 640 Nanometern. Wählen Sie Kanal zwei für die Antigen-spezifische Anregung des Antikörperkanals von 561 Nanometern, wählen Sie Kanal drei.

Stellen Sie als Nächstes die Anregungsleistung jedes Lasers ein. Das Experiment besteht aus zwei Expositionen: Die Stimulation wird auf 640 Nanometer und die Exposition zwei auf zwei Anregungen auf 405 Nanometer und 561 Nanometer festgelegt. Wählen Sie Benning als Behälter zwei aus.

Verwenden Sie die High-Control-Wells für die Belichtungsoptimierung mit maximaler Intensität als SNAP 25-Kanal und die Low-Control-Wells für minimale Intensität. Passen Sie die Belichtung so an, dass die Intensität jedes Kanals etwa die Hälfte des Sättigungsgrads oder etwa 2000 bis 2.500 relative Einheiten beträgt. Identifizieren Sie als Nächstes die optimale Z-Ebene auf dem Zellmaskenkanal mithilfe des Delta-Korrekturskripts.

Wählen Sie in der Bildanalysesoftware den Neuritenalgorithmus aus, um die Neuriten zu segmentieren. Identifizieren Sie Neuritenregionen anhand der sekundären Objekte, der Neuriten, mit einer Minus-Drei-Pixel-Expansion des Beta-Drei-Tubulin-Kanals als Maske. Berechnen Sie die Intensität der Signalkanäle für die Neuritenregion und den Beta-3-Tubulin-Kanal.

Wählen Sie die gewünschten Parameter für den Export aus, wie z. B. die Neuritenlänge, die mittleren Intensitäten von SNAP 25 beta three, die Anzahl der Tubulinkerne und die Anzahl der Neuritensegmente. Nachdem die Einrichtung abgeschlossen ist. Übertragen Sie die Platten mit dem Roboter aus den Plattenstaplern, laden Sie sie in den High-Content-Imager und beginnen Sie mit der Bildaufnahme.

Hier sehen Sie eine Boxplot-Analyse der prozentualen Spaltung, die aus Kontrollwells berechnet wurde. Das Rosa steht für die hohe Signalsteuerung, d. h. die Brunnen nur mit Medien und ohne Giftstoff. In diesen Vertiefungen ist nur eine sehr geringe Spaltung zu beobachten.

Das Blau steht für die niedrige Signalsteuerung, d. h. die Vertiefungen mit nur Toxin und ohne Probenverbindung. Diese Bohrlöcher wiesen eine signifikante Spaltung auf. Diese Histogrammverteilungen der Kontrollwerte veranschaulichen den Abstand zwischen den beiden Kontrollpopulationen.

Das Ziel des Screening-Prozesses ist es, Verbindungen innerhalb der Stichprobenpopulation zu finden, deren Werte näher an der positiven Kontrollpopulation liegen. Die Verteilung von 192 mit Verbindungen behandelten Proben, die auch Botulinumneurotoxin A enthielten, ist hier in grün dargestellt. Die meisten dieser Vertiefungen zeigten eine signifikante Spaltung.

Es gab jedoch einige statistisch signifikante Ausreißer, die im Vergleich zu Kontrollen keine signifikante Spaltung zeigten. Die Kontrollwerte werden wiederum durch die rosa und blauen Balken in dieser Histogrammverteilung angezeigt. Die grünen Balken zeigten die Überlappung der Stichprobenwerte mit den Kontrollwerten.

Stichprobenwerte, die als Treffer gelten, wurden aus den Ausreißern ausgewählt, deren prozentuale Spaltungswerte weniger als drei Standardabweichungen vom Median der Stichprobenpopulation aufweisen. Diese vier Treffer haben ähnliche Werte wie die hohe Signalkontrolle und repräsentieren die gleiche Verbindung, die ein bekanntes Botulinum-Neurotoxin ist, ein Inhibitor von Synanon, der die Spaltung von SNAP 25 blockiert. Dieser Inhibitor zeigte einen robusten SNAP 25-Schutz gegen Botulinum-Neurotoxin A sowie Brunnen sowohl mit dem Toxin als auch mit diesem Inhibitor verhielt sich ähnlich wie Brunnen ohne Toxin und anders wie Brunnen mit Toxin, jedoch ohne den Inhibitor Einmal gemeistert.

Diese Technik kann in vier bis sechs Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, mehrere Kontrollen einzubeziehen, um die statistische Leistung des Aufsatzes zu berechnen und eine Entscheidung über das Bestehen nicht bestanden für jede einzelne Screening-Platte zu ermöglichen. Andere Methoden, wie z. B. biochemische proteolytische Assays, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z. B. eine Bewertung von Screening-Treffern als direkte oder indirekte Inhibitoren von Bot.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie eine gute Vorstellung davon haben, wie Sie einen phänotypischen Screening-Assay automatisieren können, der die Quantifizierung von SNAP 25 durch Immunfärbung als primären Endpunkt verwendet. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Botulinum-Neurotoxinen äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung persönlicher Schutzausrüstung und die Umsetzung geeigneter Dekontaminations- und Entsorgungsverfahren für Botin. Neurotoxin sollte immer während der Durchführung dieses Verfahrens eingenommen werden.