Name: Ein hoher Gehalt Imaging Assay zur Identifizierung von Botulinum Neurotoxin-Inhibitoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 10 s
Description: Lernen Sie einen hochauflösenden Bildgebungs-Assay zur Identifizierung von Botulinum-Neurotoxin-Inhibitoren in motorischen Neuronen. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Erfassung mehrerer phänotypischer Endpunkte.

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Die Finanzierung wurde vom Joint Science and Technology Office – Chemical Biological Defense (JSTO-CBD), der Defense Threat Reduction Agency (DTRA) unter der Sponsor-Projektnummer CCAR# CB3675 und den National Institutes of Health (1 R21 AI101387-01 und 5 U01AI082051-05) bereitgestellt.

Platten 20.000 differenziert Maus-ES-Zellen (MES) / Well in einer 96-Well Poly-D Lysin beschichteten Platten und aufrechtzuerhalten in Motoneuronen-terminalen Differenzierung Medien für 5-7 Tage. 1. Verbindung Verwaltung und Intoxikation mit BoNT / A Führen Sie alle der folgenden Arbeit in einem BSL2 Gehäuse, um die Einhaltung CDC / NIH-Richtlinien zu halten. <ol><li> Herstellung von 10 mM Stammlösungen der einzelnen Bibliotheksverbindung in 100% DMSO in 96-Well-Polypropylenplatten. Nutzen Sie die 10 mM Stamm um eine Zwischenverdünnungsplatte, die 10-fach größer als die gewünschte Screening Konzentration vorzubereiten. Bereiten 100 uM Zwischenplatte durch den Verzicht 10 mM Stamm in 96-Well-Platte und verdünnen Sie es mit Kulturmedien bis 100 &amp; mgr; M. Verzichtet werden 10 &amp; mgr; l der Verbindungen auf 90 ul Medium auf den Zellen 11. Testen Sie die Verbindungen bei 10 uM Endkonzentration und sorgen für die endgültige Prozentsatz der DMSO 0,5% nicht überschreiten. </li><li> Führen Sie alle Bolzenies, die lebenden Zellen und aktives Toxin unter Biosicherheitsstufe 2 Bedingungen zu nutzen. Ersetzen Sie die alten Medien in den 96-Well-Platten mit 80 ml frisches terminalen Differenzierung Medien mit einem 12-Kanal-Handpipette. Führen Sie Aspiration und verzichten Schritte durch Reihen, um die Exposition der Zellen gegenüber der Umgebungsluft zu vermeiden, ohne Medien. </li><li> Vorzubehandeln Zellen mit Verbindungen vor der Applikation von Toxin durch Zugabe von 10 ul 10x-Verbindungen von der Quelle-Platte unter Verwendung einer 12-Kanal Pipette, gefolgt von Mischen durch Absaugen (zweimal). Für jede 96-Well-Platte, behandeln zwei Spalten mit 6 Vertiefungen mit 10x DMSO in den Medien verdünnt, um als High-Signal und niedrige Signalsteuerungen dienen. Die Säule ohne BoNT-Behandlung weist das höchste Niveau der vollen Länge SNAP-25 (High-Signal-Steuerung). Behandeln Sie die anderen Säule mit BoNT allein (ohne Verbindungen) als Low-Signal Kontrolle. Verwenden Sie niedrige Steuer, um die Effizienz von BoNT Spaltung SNAP-25 und dessen Nachweis mit der BACS-Antikörper zu beobachten (Abbildung 2). </li><li> Inkubieren Zellen mit Verbindungen für 30 min bei 37 ° C und 6% CO 2 in den Zellkulturbrutschrank. </li><li> Vorbereitung Botulinum Neurotoxin A aus einer 1 mg / ml kommerziellen Quelle in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) auf eine Arbeitsstamm 10x durch Verdünnen mit terminalen Differenzierung Medien. </li><li> Initiate Intoxikation durch Zugabe von 10 ul 10x BoNT / A Lager in für die Behandlung und Low-Signal steuert mit einer Mehrkanalpipette (Abbildung 2) Kavitäten pipettieren. Behandeln Sie die so hoch Steuerung mit Medien allein Kavitäten pipettieren. </li><li> Dekontaminieren alle Kunststoffwaren sowie anderen Einmal die in Kontakt mit BoNT / A während der Studie durch Eintauchen in 0,825% Hypochlorit-Lösung in Wasser für mindestens 20 Minuten kommt. Führen Sie alle in der biologischen Sicherheit Schränke und dekontaminieren Arbeitsbereiche vor und nach Experimenten mit 5% Detergens Desinfektionsreiniger wie MicroChem Lösung. </li><li> Beschriften Sie die Platten eindeutig Toxin Gebrauch und Incub bezeichnenaß Platten mit 1 nM / L BoNT / A für 4 h bei 37 ° C und 6% CO 2 in einem Zellkulturbrutschrank behandelt. Anzeige entsprechende Beschilderung an Kollegen, dass Toxin in den Einsatz im Labor zu informieren. </li><li> Stopp BoNT / A proteolytischen Spaltung durch Methanol-Fixierung. Entfernen Sie das Medium Toxin und Verbindungen, die aus jeder Vertiefung mit einer Mehrkanalpipette und entsorgen in 10% Bleichlösung. Hinzufügen eiskaltem Methanol (100 ul), die direkt in jede Vertiefung. </li><li> Platten für 15 min bei Raumtemperatur (RT) inkubieren, damit Fixierung auftritt. </li><li> Nach der Fixierung sicher zu handhaben, die verworfen Reagenzien (legte neutralisiert) mit Sicherheitsstufe 1 Protokolle und entsorgen entsprechend. </li><li> Entsorgen Methanol und verwenden 100 ul PBS, um die Zellen zu waschen und vor deinen Durst sie Immunfärbung. Führen Sie zwei zusätzliche PBS Wäschen. </li><li> Nach dem letzten Waschen, lassen PBS in den Vertiefungen, Dichtungsplatten mit Mikroklebefolie und lagern bei 4 ° C bis zur Analyse. Store-Platten bei 4 ° C for mehrere Tage. </li></ol> 2. Immunfärbung Die Immunfärbung Prozedur ist eine arbeitsintensive, mehrstufigen Vorgang, der sich wiederholenden Reagenz Abgabe / absaugen Zyklen und umfangreiche Plattenwäsche, die der mögliche Einführung von signifikanten Intra und Interplate Variabilität führen kann, schließt. Eine halbautomatische Ansatz angewendet, um die Zeit des Laborpersonals speichern Assay Durchsatz zu erhöhen und die Immunfärbung Variabilität zu minimieren. <ol><li> Verwenden Sie eine automatisierte Arbeitsstation mit einem 96-Loch-Kopf ermöglicht das Übermengen von bis zu 250 &amp; mgr; l und integriert mit einem Roboter-Greifarm, um Laborgeräte in verschiedenen Orten auf dem modularen Deck (siehe Material und Ausrüstung) für dieses Protokoll zu bewegen ausgestattet. <ol><li> Die modulare Plattform wird entworfen, um verschiedene Arten von Laborgeräte hosten und kann bis zu 11 Artikel zu einem beliebigen Zeitpunkt zu unterstützen. Das automatisierte Mikro Handler ist mit einem Dual-Magazin Mikroplatten-Stacker, um zu halten ausgestattet undmanipulieren bis zu 50 Platten pro Zyklus. </li><li> Die automatisierte Arbeitsstation innerhalb einer Klasse II Biosicherheitswerkbank für die Laborautomatisierung Ausrüstung, die der Sterilisation und Sicherheit bieten entfernt. Für Immunfärbeautomaten wird das Deck angeordnet ist, wie in 3 gezeigt, um den Zugang Reagenz nach Bedarf und ohne menschlichen Eingriff zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Pre-load-Platten, die fixierten Zellen in das Plattenmagazin und Transfer zum Deck wie für Liquid Handling benötigt. Nutzen Sie die 96 Pipettenkopf mit 250 ul Tipps versehen, um PBS aus den Vertiefungen auf 10 ul absaugen. Durchdringbar Zellmembranen zu Antikörper-Bindung an intrazelluläre Ziele mit Permeabilisierung Puffer (0,1% Triton-X 100) zu erleichtern. Verzichtet Permeabilisierung Puffer (100 ul) in jede Vertiefung der Platten vor der Rückkehr zu dem zweiten Speichermagazin der Mikrostapel für eine 15 min Inkubation bei Raumtemperatur (RT). </li><li> Entfernen Permeabilisierung Puffer und perform Waschen der Platte mit PBS (zweimal), wie zuvor in Schritt 1.13. </li><li> Nach dem letzten Waschschritt entfernt das PBS-Puffer zubereitet, und 100 &amp; mgr; l Blockierungspuffer, enthaltend 1% Pferdeserum und 0,1% Tween 20 in PBS in alle Mikrotiterplatten, bevor er sie an den Plattenmagazin 1 h Inkubation bei RT. </li><li> Verwenden Sie zwei primäre Antikörper für Immunfärbung: einen polyklonalen Kaninchen-Anti-Maus-Antikörper BACS, für den Nachweis von Volllängen-SNAP-25 und einem monoklonalen Maus-Anti-III Tubulin-Antikörper zum Nachweis von Neuronen (siehe Material und Ausrüstung). Nach 60 min Inkubation entfernen Blocking-Puffer und 50 ul verzichtet 4UG / ml des Antikörpers GA und 0,5 ug / ml III-Tubulin in Blockierungspuffer in alle Platten. </li><li> Inkubieren für 1 h bei RT Entfernen der primären Antikörper und wasche 3mal mit 100 ul PBS, enthaltend 0,05% Tween (PBST). </li><li> Verwenden eines Anti-Maus-IgG mit Alexa Fluor 647 markiert die -III-Tubulin und Anti-Kaninchen-IgG mit Alexa F markiert visualisierenluor 568 die BACS-Antikörper sichtbar zu machen. Vorbereitung sowohl Antikörper als 2 &amp; mgr; g / ml-Verdünnung in Blockierungspuffer und abzug 50 ul der Mischung in jeder Vertiefung. HINWEIS: Die sekundären Antikörper für die Immunfärbung ausgewählt werden mit verschiedenen Fluorophoren markiert, um den Nachweis der emittierten Fluoreszenzlicht bei unterschiedlichen Wellenlängen mit unterschiedlichen Kanälen innerhalb des Detektors der hohen Gehalt Imager ermöglichen. </li><li> Inkubation für 1 h bei RT. Saugen Sie die Sekundärantikörper und 3x waschen mit 100 ul PBST. </li><li> Nach dem letzten Waschen werden 100 &amp; mgr; l PBS, das Hoechst-Farbstoff (32 uM), um die DNA für die Kerne Erfassungs färben. </li><li> Dichten Sie die Platten mit einer lichtundurchlässigen Folie, um die Fluorophore von Photobleaching zu schützen. Platten können bei 4 gelagert werden &#160; ° C wochenlang ohne signifikanten Verlust des Signals. </li></ol> 3. Imaging HINWEIS: Führen Sie die Bildaufnahme mit High Content Imaging System (siehe Materialien und Ausrüstung). <ol><li> Spezifikation der High Content Imager Definitionen: <ol><li> Wählen Plattentyp, Layout, Anzahl der Felder, Ziel: Greiner u klar, 96-Well-Format, 16, 20X Wasser auf. </li><li> Kanäle auswählen: Kern Anregungs EX: 405 nm als Kanal 4; Zytoplasma EX: 644 nm als Kanal 2; Antigen-spezifische Antikörper Kanal EX: 561 nm, wie Kanal 3 und Set up Erregerleistung jedes Lasers, Setup-Experiment als 2 Expositionen, Belichtung 1 mit einer Anregung bei 644 nm, Belichtung 2 mit zwei Anregungen bei 405 nm und 561 nm. Wählen Binning als BIN2. </li><li> Verwenden Sie qualitativ Kontrollvertiefungen für Belichtungsoptimierung mit maximaler Intensität wie SNAP-25-Kanal und geringe Kontrollvertiefungen für minimale Intensität. </li><li> Einstellung der Belichtung, so daß die Intensität von jedem Kanal beträgt etwa die Hälfte der Sättigungspegel (2000-2500 relativen Einheiten). </li><li> Identifizieren Sie die optimale Z-Ebene auf die Zellmaskenkanal mittels Delta-Korrektur-Skript. Siehe FiAbbildung 5 für Ergebnisse nach Immunfärbung und Imaging. Exportieren von Daten an den Server, wo die Bildanalyse-Software ist wohnhaft. </li></ol></li></ol> 4. Bildanalyse (Abbildung 6) HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben die Anwendung der Columbus Software-Algorithmen. <ol><li> Wählen Sie einen geeigneten Algorithmus zur Segmentierung des Primärobjekte (Kerne). Falls erforderlich, passen Sie Hintergrundschwelle und Kontrast-Parameter. Das Columbus-Software bietet 4 Kerne Nachweismethoden. Wählen Sie die Methode, dass die Segmentkerne genau durch Sichtprüfung segmentiert Kerne (in B ild 6a Verfahren M ausgewählt ist). </li><li> Wählen Sie das Neuriten-Algorithmus (CSIRO Neuriten Analyse 2) zum Segment der Neuriten Falls erforderlich, passen Sie Hintergrundschwelle und Kontrast-Parameter in den Hintergrund zu entfernen. Siehe Abbildung 6b für Parameter verwendet, um Neuriten erkennen. </li><li> Identifizieren Sie die Neuriten Regionen (Neuriten Segmente) based auf Sekundärobjekte (Neuriten) unter Verwendung eines Pixel -3 Expansion des β-III-Tubulin-Kanal (Alexa Flour 640) als Maske (6c). </li><li> Berechnen Intensität der Signalkanäle (SNAP-25 (Alexa Flour 568) für das Neuriten-Region und β-III-Tubulin-Kanal (6d &amp; 6e). </li><li> Wählen Sie die gewünschten Parameter für den Export, wie Neuritenlänge, mittleren Intensitäten des SNAP-25, β-III-Tubulin, Kernzahl, Neuriten Segmentnummer usw. (6f). </li><li> Übertragungsplatten aus Plattenstapler mit dem Roboter und Last in die High Content Imager für die Bilderfassung. </li></ol> 5. Datenanalyse: Um die Robustheit des Assays entwickelt beurteilen, Berechnen der folgenden Parameter von der Plattenbasis Experiments. <ol><li> Signal (S) in den Hintergrund (B): S / B = mittlere Intensität hohe Signalsteuerung) / mittlere Intensität niedrige Signalsteuerung </li> &lt;li&gt; Variationskoeffizient (CV) von Signal und Hintergrund (um die Einheitlichkeit des spezifischen Signals messen): CV = (Standardabweichung (SD) / Mittelwert der Stichprobe) * 100 (%), um die Variabilität in Liquid Handling bestimmen, Reagenzien usw. </li><li> Signal to Noise: S = (mittlere Intensität des Signals - mittlere Intensität niedrige Signalsteuerung) / SD niedriger Steuer <ol><li> Der Z-Faktor &quot;Berechnen mit Intoxikation von einer Hälfte einer 96-Well-Platte und einem Mock Rausch der anderen Hälfte. Z &#39;= 1-3 * (SD hoher Signalsteuerung + SD der niedrigen Signalsteuerung) / (Mittelwert der hohen Signalkontrolle - Mittel der niedrigen Signalsteuerung). Für die weitere Analyse der Screening-Daten, zu normalisieren einige der Primärrohstoffe Parameter auf einem Teller Grundlage zum Vergleich zwischen den Platten und zwischen den verschiedenen Tagen der Experimente zu ermöglichen. </li></ol></li><li> Prozent der Spaltung, was die Reduzierung des Signals mit voller Länge SNAP-25 durch spezifische Antikörper nachgewiesen (BACS) zugeordnet:% Dekolleté = 100% * (mean Intensität von Hochsignalsteuerung - Intensität der Probe) / mittlere Intensität hohe Signalsteuerung. </li><li> Prozent der Inhibition der Spaltung:% Hemmung = 100% * (Intensität der Probe - mittlere Intensität niedrige Signalsteuerung) / (mittlere Intensität hohe Signalsteuerung - mittlere Intensität niedrige Signalsteuerung). </li></ol>

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Krishna P Kota ist ein Angestellter von Perkin Elmer Inc. in Waltham, MA, das Instrumente und Software herstellt, die in diesem Manuskript verwendet werden. Der Inhalt dieser Veröffentlichung spiegelt nicht unbedingt die Ansichten oder Richtlinien des US-Gesundheitsministeriums, des US-Verteidigungsministeriums, des US-Armeeministeriums oder der mit den Autoren verbundenen Institutionen und Unternehmen wider.

Die hohe Wirksamkeit von Botulinum Neurotoxine und der relativen Leichtigkeit ihrer Bewaffnung hat in ihrer Einstufung als Kategorie A (höchste Priorität) biothreat Agenten von den US Centers for Disease Control and Prevention geführt. Leider gibt es keine von der FDA zugelassenen Therapeutika zur BoNT-Intoxikation zu begegnen, nachdem das Toxin von den Motoneuronen verinnerlicht worden. Alle druggable Mechanismus, der neuronalen Wiederaufnahme von BoNT-Intoxikationen fördert könnte in Richtung der Entwicklung einer pot...

Das Bakterium Clostridium botulinum produziert Botulinum Neurotoxin, einem der potentesten biologischen Giftstoffen auf den Menschen bekannt 1. Es gibt 7 verschiedene BoNT-Serotypen (BoNT / AG). BoNT / A-Gall induzieren die Lähmung an der neuromuskulären Synapse durch SNARE-Komplex Proteolyse 2,3. SNARE Proteolyse verhindert Neurotransmitter-Vesikel-Membranfusion und damit Blöcke Exozytose von Neurotransmittern 4. Die spezifische SNARE Ziel ist abhängig von der jeweiligen BoNT Serotyp im Rausch Prozess beteiligt. BoNT / A und BoNT / E spalten SNAP-25 in der Erwägung, BoNT / C spaltet sowohl SNAP-25 und Syntaxin 5. Die verbleibenden Serotypen spalten Synaptobrevin (auch Vesikel-assoziiertes Membranprotein (VAMP) genannt. BoNT / A wurde für die Assay-Entwicklung gewählt, da es einen hohen Anteil von natürlich vorkommenden Botulismus verantwortlich und hat die längste Wirkdauer. 6 die Entwicklung des kleinen Moleküls Therapeutika gegen BoNT / A ist ein wichtiges Ziel fürunsere Wirkstoffforschungsprogramm und hat die traditionelle Zielbasierte Methoden genutzt, um aktive Zentrum proteolytischen Inhibitoren 7 identifizieren, 8-10. Jedoch wird die Schaffung von aktiven Zentrum Inhibitoren mit breiten Wirkungsspektrum gegen mehrere Serotypen und Postexpositions Wirksamkeit wahrscheinlich schwierig sein. Daher haben wir eine innovative, phänotypische Wirkstoffforschungsansatz, BoNT SNAP-25-Spaltung als funktionelle Endpunkt an kleine Moleküle, die BoNT-vermittelten motorischen Neurons Intoxikation blockieren identifizieren können verwendet implementiert. SNAP-25 ist für die Freisetzung von Neurotransmittern erforderlich, wie Abbau von SNAP-25 ist prädiktiv für Lähmung und Letalität in vivo. Zum Beispiel könnten zellbasierte Screening zur Entdeckung neuer Modulatoren zellulärer Faktoren für Toxin Inaktivierung oder Hemmung der Toxin-Bahn-Innere Zielzellen verantwortlich führen. Ein wichtiger Faktor bei der phänotypischen Assay-Entwicklung ist die Auswahl der physiologisch relevanten biologischen Modellen. We und andere haben embryonalen Stammzellen (ES) Zellen abgeleiteten Motorneuronen, welche die immunologischen Charakter des primären Motoneuronen zu rekapitulieren, einschließlich der Expression von SNAP-25 11- 13 beschrieben. Wichtig ist, dass diese zellulären Systeme sind sehr empfindlich auf BoNT / A-Intoxikation und zeigen Dosis-abhängige Spaltung von SNAP-25 in Reaktion auf ansteigende Konzentrationen des Toxins 11,12. Das differenzierte Motorneuronen sind ebenfalls in Mengen, die ausreichend für die Hochdurchsatzanalyse basiert Platte sind, und erlaubt die Konstruktion einer Reihe von zellulären Assays hergestellt. Die phänotypische Assay ist ein Immunfluoreszenzverfahren, das zwei verschiedene Antikörper zur Spaltung der endogen exprimierten voller Länge SNAP-25 während der BoNT / A Rausch der Maus Motor Neuron Kultur quantifizieren. Ein carboxylterminalen BoNT / A-Spaltung empfindlichen (BACS) Antikörper, der nur in voller Länge SNAP-25 erkennt erlaubt die Beurteilung von BoNT / A vermittelten Proteolyse von SNAP-25Expression in der Maus Motoneuronen 10. Ein schematisches Diagramm des HCl-Assay ist in 1 dargestellt.

<table><tbody><tr><td>Botulinum-Neurotoxin A&nbsp;</td><td>Metabiologics</td><td>NA</td><td>Keine Katalognummer</td></tr><tr><td>Mikrotiterplatten</td><td>Greiner&nbsp;</td><td>655946</td><td>Poly-D-Lysin 96-Well-Platten</td></tr><tr><td>BAC-Antikörper</td><td>Lampire Biological</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microchem</td><td>National</td><td>0255</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Thermo Scientific</td><td>A412-20</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd</td><td>Thermo Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>PE JANUS MDT Mini Automated Workstation</td><td>Perkin Elmer</td><td>AJMDT01</td><td></td></tr><tr><td>Opera</td><td>Perkin Elmer</td><td>OP-QEHS-01</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>BIII Tubulin-Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>BAM1195</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379-1L</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342dye&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>3570</td><td></td></tr><tr><td>Antimaus IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A21236</td><td></td></tr><tr><td>Anti Kaninchen IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>Columbus Bildanalysesoftware</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 2.4</td><td></td></tr><tr><td>Spotfire</td><td>Perkin Elmer</td><td>Ver 5.5</td><td></td></tr><tr><td>Clorox</td><td>Bleiche Fisher Scientific</td><td>18-861-284</td><td></td></tr><tr><td>PlateStack</td><td></td><td></td><td></td> (Englisch)</tr></tbody></table>

ein hoher gehalt imaging assay zur identifizierung von botulinum neurotoxin-inhibitoren

A High Content Imaging Assay for Identification of Botulinum Neurotoxin Inhibitors

Synaptosomal-assoziiertes Protein-25 (SNAP-25) ist ein Bestandteil des löslichen NSF-Attachment-Protein-Rezeptors (SNARE)-Komplexes, der für die Freisetzung von synaptischen Neurotransmittern essentiell ist. Botulinum-Neurotoxin Serotyp A (BoNT/A) ist eine Zinkmetalloprotease, die die Exozytose des Neurotransmitters blockiert, indem sie die SNAP-25-Komponente des SNARE-Komplexes spaltet. Derzeit gibt es keine zugelassenen Medikamente zur Behandlung von BoNT/A-Vergiftungen nach Internalisierung des Toxins durch Motoneuronen. Die Entwicklung wirksamer therapeutischer Maßnahmen zur Bekämpfung der BoNT/A-Intoxikation war begrenzt, was zum Teil auf den Mangel an robusten Hochdurchsatz-Assays für das Screening kleiner Molekülbibliotheken zurückzuführen ist. Hier beschreiben wir einen High-Content-Imaging-Assay (HCI) mit Nutzen für die Identifizierung von BoNT/A-Inhibitoren. Erste Optimierungsbemühungen konzentrierten sich auf die Verbesserung der Reproduzierbarkeit von Inter-Platten-Ergebnissen über mehrere, unabhängige Experimente hinweg. Es wurde festgestellt, dass die Automatisierung von Immunfärbung, Bildaufnahme und Bildanalyse die Assay-Konsistenz erhöht und die Variabilität minimiert und gleichzeitig die Multiparameter-Bewertung experimenteller Verbindungen in einem murinen Motoneuronensystem ermöglicht.

Daten aus hohen und niedrigen Kontrollen erstellt zwei verschiedene Populationen mit der Differenz zweier Mittelwerte von mehr als 3 Standardabweichungen (7A). Das Ziel des Screenings ist, um die Verbindungen in der Probenpopulation mit Werten näher positive Kontrollpopulation zu finden, unter der Annahme einer Normalverteilung innerhalb der Probenpopulation (7B, (i)). Datenpunkte, die drei Standardabweichungen über dem Mittelwert liegen werden als statistisch von dem Lärm und als aktiv...

Botulinum-Neurotoxin ist eines der stärksten Toxine unter den Biobedrohungsstoffen der Kategorie-A, dennoch ist kein Postexpositionstherapeutikum verfügbar. Der High-Content-Imaging-Ansatz ist eine leistungsfähige Methode zur Identifizierung neuartiger Inhibitoren, da er ein Multiparameter-Screening mit biologisch relevanten Motoneuronen, dem primären Ziel dieses Toxins, ermöglicht.

Ein hoher Gehalt Imaging Assay zur Identifizierung von Botulinum Neurotoxin-Inhibitoren

Synaptosomal-associated protein-25 (SNAP-25) is a component of the soluble NSF attachment protein receptor (SNARE) complex that is essential for synaptic ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist die Entwicklung eines phänotypischen Screening-Assays, der die Spaltung seines Substrats SNAP 25 durch IES-Botulinum vermittelt, mit dem Ziel, kleine Moleküle zu identifizieren, die die Toxinfunktion während der normalen Nervensignalübertragung hemmen. Das Aktionspotenzial bewirkt, dass SNAP 25 das synaptische Vesikel an die Plasmamembran des Motoneuronen-Endes bindet, was zur Freisetzung von Neurotransmittern führt. Wenn jedoch Botulinum-Neurotoxin vorhanden ist, wird es von der Endozytose aufgenommen und im synaptischen Buton freigesetzt, wo es SNAP 25 spaltet und so die Freisetzung von Neurotransmittern stört, was zu Lähmungen führt.Dieser Assay identifiziert Moleküle, die die Botulinumtoxin-Aktivität hemmen und somit die Spaltung von SNAP 25 in Gegenwart von Botulinumtoxin verhindern und so die Freisetzung von Neurotransmittern in der neuromuskulären Verbindung wiederherstellen können. Ein High-Content-Imaging-Assay, der mit Motoneuronen der Maus durchgeführt wurde, wird verwendet, um die Konservierung von SNAP 25 zu demonstrieren, was zur Identifizierung kleiner Moleküle führt, die die Metalloproteaseaktivität von Botulinum-

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Ein Protokoll, um Trichothecene (Mykotoxine, die für die menschliche Gesundheit) mit einem neu entwickelten Screening-Methode auf einem wettbewerbsfähigen immunchemischen Verfahren und eine endgültige elektrochemischer Detektion basierte Erkennung demonstriert.

ELIME (Enzyme Linked Immuno Magnetic Elektrochemische) Verfahren zur Mykotoxin-Erkennung

Das Botulinum-Neurotoxin Typ A Leichtkette (BoNT/A LC) ist eine Metalloprotease, die in Motoneuronen eindringt, ihr Substrat SNAP-25 spaltet und die Neurotransmission stört, was zu schlaffer Lähmung führt. Unter Verwendung eines hochdurchsatzkompatiblen FRET-basierten Assays können große Bibliotheken kleiner Moleküle auf ihre Auswirkungen auf die enzymatische Aktivität von BoNT/A LC untersucht werden.

Eine hochdurchsatzkompatible FRET-basierte Plattform zur Identifizierung und Charakterisierung von Botulinum-Neurotoxin-Leichtkettenmodulatoren

Die Botest Matrix Botulinum-Neurotoxin (BoNT) Nachweisassays schnell zu reinigen und zu quantifizieren BoNT aus einer Reihe von Probenmatrix. Hier präsentieren wir ein Protokoll für den Nachweis und die Quantifizierung von BoNT sowohl aus festen und flüssigen Matrices und zeigen die Assay mit BOTOX, Tomaten und Milch.

Isolierung und Quantifizierung von Botulinum Neurotoxin aus komplexen Matrices Mit den Botest Matrix Assays

Ein benutzerdefiniertes Protokoll wird beschrieben, um ES-Zellen von Mäusen in definierte Populationen von hochreinen Neuronen zu differenzieren, die funktionierende Synapsen und emergentes Netzwerkverhalten aufweisen. Die elektrophysiologische Analyse zeigt den Verlust der synaptischen Übertragung nach Exposition gegenüber Botulinum-Neurotoxin-Serotypen /A-/G und Tetanus-Neurotoxin.

Funktionale Bewertung der biologischen Neurotoxine in Networked Cultures für Stammzell abgeleitete Zentralnervensystem Neuronen

Dieser Artikel beschreibt eine einfache Protein Microarray Methode für Clostridium Difficile Antigene im menschlichen Serum Profilerstellung humorale Immunantworten auf einer 7-Plex Jury hoch gereinigt werden. Das Protokoll kann zur Bestimmung der spezifischen Antikörperantworten in die Vorbereitungen der polyklonalen intravenöses Immunglobulin erweitert werden.

Ein Protein-Microarray-Assay für die serologische Bestimmung der Antigen-spezifische Antikörper Antworten folgende Clostridium Difficile Infektion

Dieses Protokoll stellt eine automatisierte, bildbasierte Hochdurchsatztechnik vor, um Verbindungen zu identifizieren, die die natürliche Killerzell-vermittelte Abtötung von Brustkrebszellen in Gegenwart eines therapeutischen Anti-HER2-Antikörpers modulieren.

High-Content-Screening-Assay zur Identifizierung von Antikörper-abhängigen zellulären Zytotoxizitäts-modifizierenden Verbindungen

Wir beschreiben den Einsatz der Dünnschichtchromatographie, des direkten Bioautographie-Assays und der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie zur Identifizierung von mikrobiellen Naturstoffen, die einen Antagonismus gegenüber pilzlichen Krankheitserregern aufweisen, wobei der Erreger Sclerotinia sclerotiorum und biopestizide Bacillus-Isolate als Modellsystem verwendet werden.

Bioassay-gesteuerte Identifizierung von Naturstoffen für die biologische Kontrolle durch Dünnschichtchromatographie-Direkte Bioautographie

Dieses Protokoll beschreibt eine organotypischen Slice-Assay für die postnatale Gehirn und hochauflösenden Zeitraffer-Bildgebung von Neuroblasten Migration in der rostralen wandernde Stream optimiert.

Ein organotypischen Assay für High-Resolution Time-Lapse Imaging neuronaler Migration in der postnatalen Gehirn

Dieser Artikel beschreibt Techniken zur hochauflösenden funktionellen Kernspintomografie mit 1,2 mm Probenahme in der menschlichen Mittelhirn und subkortikalen Strukturen mit einem 3T Scanner durchführen. Die Verwendung dieser Techniken, um topographische Karten der visuellen Stimulation in der menschlichen Colliculus superior (SC) zu lösen ist als ein Beispiel gegeben.

Hochauflösende Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Mittelhirn

Funktionelle Untersuchungen des Gehörs bei Säugetieren haben traditionell mit räumlich konzentriert Techniken wie elektrophysiologischen Ableitungen durchgeführt. Das folgende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Visualisierung von Großmuster hervorgerufen hämodynamischen Aktivität im auditorischen Kortex der Katze mit Hilfe der funktionellen Kernspintomographie.

Funktionelle Bildgebung Auditory Cortex bei erwachsenen Katzen mit Hochfeld-fMRI

Lernen Sie einen hochauflösenden Bildgebungs-Assay zur Identifizierung von Botulinum-Neurotoxin-Inhibitoren in motorischen Neuronen. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Erfassung mehrerer phänotypischer Endpunkte.

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