Name: Abbildungsintrazellulären Ca 2+ Signale in Striatal Astrozyten von erwachsenen Mäusen mit gentechnisch-kodierte Kalzium Indikatoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 19 s
Description: Lernen Sie die Bildgebung intrazellulärer Kalziumsignale in striatalen Astrozyten erwachsener Mäuse mit gentechnisch kodierten Kalziumindikatoren. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen neuronaler Funktionen.

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Der Großteil der Arbeit und die beteiligten Mitarbeiter wurden von NIH Zuschusses NS060677 und teilweise durch NIH gewährt MH099559 und MH104069 (BSK) unterstützt. Ein Teil der Arbeit wurde auch von der CHDI Foundation unterstützt.

Alle Tier Protokolle waren in Übereinstimmung mit den US National Institutes of Health Guide für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee an der UCLA genehmigt. 1.1) Bereiten Mikropipette und AAV2 / 5 Virus Loading <ol><li> Verwenden Fein Borsilikatglas-Mikropipetten für die Injektion des Virus. Ziehen die Mikropipette unter Verwendung eines zweistufigen Zieh Programm mit einer vertikalen Magnet. Kegel die Pipette in einem Winkel von 40 ° unter Verwendung einer Pipette Mühle. Die Pipette, die ideal für den Einsatz ist wird einen Spitzendurchmesser von 20 bis 40 um und eine Schaftlänge von 6 - 7 mm. Autoklavieren der Pipette und chirurgische Instrumente. Der Bohrer wird durch Abwischen mit 70% Ethanol sterilisiert. </li><li> Speichern des Virus AAV2 / 5-GfaABC 1 D.cyto-GCaMP3.SV40 (1,5 x 10 13 gc / ml), bei -80 ° C in 10 &amp; mgr; l Aliquots. Kurz vor der Operation, nehmen Sie die Aliquots aus dem Gefrierfach und Lagerung auf Eis, bis zum Füllen th verwendete-Mikropipette. </li><li> Füllen Sie die Mikropipette mit Virus mit einer Spritzenpumpe. Dicht verbinden Sie ein Ende eines Rohrstück, durch einen entsprechend dimensionierten Rohr Klemmverschraubung, auf eine Glasspritze mit einem verstärkten Kolben. Befestigen Sie die autoklaviert Mikropipette mit dem anderen Ende des Rohrstück durch einen entsprechend dimensionierten abnehmbare Nadelklemmfitting. </li><li> Vor dem Beladen des viralen Vektor, entfernen Luftblasen aus dem Pumpsystem einschließlich Schlauch, Spritze und Mikropipette durch Befüllen des Systems mit Mineralöl mit Sudanrot IV (~ 1 mg / 50 ml) in einer 1-ml-Spritze mit einer Nadel gefärbt (27 G ). </li><li> Ein sauberes Stück Parafilm unter der Glas-Mikropipette, und Abgeben von 5 bis 10 &amp; mgr; l der Virusvektors auf die Parafilm. </li><li> Saugen den viralen Vektor, der durch Bewegen des Kolbens der Spritze nach hinten in 0.5 &amp; mgr; l / min, und markieren die Grenze zwischen dem Vektor und dem Öl auf der Glaspipette. </li></ol> 1.2) Anästhesie, Haarschneide, Head Fixierung und Vorbereitung zur Kraniotomie <ol><li> Eine Maus (P49-63, C57BL / 6) in die Kammer mit N 2 O und O 2 und 5% Isofluran gefüllt. Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch den Verlust der zielBewegung und einer verlangsamte Atemfrequenz (~ 60-90 / min). Schneiden Sie Haare auf dem Kopf, wenn die Maus betäubt. </li><li> Setzen Sie die Maus in die stereotaktischen Rahmen, mit seinem Kopf durch stumpfe Ohr Bars und seine Nase in eine Anästhesie- und Beatmungssystem platziert gesichert. Pflegen kontinuierliche Isofluran bei 2 - 3%. Künstliche Tränen Salbe auf beiden Augen, da Mäuse verlieren ihre Lidschlussreflexes unter Narkose. </li><li> Verwalten 0,05 ml Buprenorphin (0,1 mg / ml) durch subkutane Injektion zur Schmerzlinderung. </li><li> Sauberen Operationsbereich mit 10% Povidon-Jod und 70% Alkohol dreimal abwechselnd zwischen den beiden Lösungen besteht und mit Povidon-Iod. Starten Sie von vorne und wischen nach hinten, um alle bereits geschnittenen Haare zu entfernen. </li><li> Machen Sie eine Hautschnitt an der Spitze of der Kopf, der zwischen den Augen beginnt und endet zwischen den Ohren. </li></ol> 1.3) Kraniotomie und Mikroinjektionen <ol><li> Entfernen Sie die Knochenhaut durch Streichen mit einem Wattestäbchen und dann trocknen Sie die Oberfläche des Schädels mit Zahnwattebällchen. Machen Sie eine Markierung an der Injektionsstelle, und bohren um den Rand der Marke mit einem kleinen Stahl Grat angetrieben von einem High-Speed-Bohrer. </li><li> Entfernen Sie die Knochen und reinigen Sie die Oberfläche mit Kochsalzlösung. </li><li> Platzieren Sie die Pipette in die linke Rücken seitlich mit den folgenden Koordinaten (mm) Striatum: anterior-posterioren 0,8, medial-lateral: 2,0, dorsal-ventrale vom Pia-Oberfläche: -2,4 13. Beachten Sie, dass diese Koordinaten bedeutet, dass die Spitze der Mikroinjektionsnadel sitzt direkt über dem dorsolateralen Striatum (1A, B), was bedeutet, dass er nur geringfügig innerhalb dieses Kerns eindringt. Vermeiden schädlicher Blutgefäße. Wenn die Pipette passiert zu sein Recht auf ein Blutgefäß, leicht einzustellen dasKoordinaten von ~ 0.1 - 0.2 mm. </li><li> Starten Einspritzung mit Einspritzrate bei 0,2 ml / min eingestellt, und in der Regel zu injizieren 1 bis 1,5 &amp; mgr; l-Virus. </li><li> Verlassen Sie die Pipette anstelle nach der Injektion für 10 Minuten, und dann langsam zurückziehen der Pipette. </li><li> Beenden Sie durch Schließen der Operationswunde mit fortlaufenden Naht externen Nylonnaht. </li></ol> 1.4) Wiederherstellung <ol><li> Setzen Sie die Maus in einem sauberen Käfig auf einem Heizkissen für 24 Stunden. Sie eine Maus, die Operation, um der Gesellschaft von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück. Lassen Sie die Maus unbeaufsichtigt, bis es ausreichend das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten. </li><li> In Trimethoprim Sulfamethoxiazole (5 ml pro 500 ml Wasser, das 40 mg Trimethoprim und 200 mg sulfamethoxiazole) im Wasser für eine Woche. Verwaltung Buprenorphin zweimal pro Tag für bis zu 3 Tage nach der Operation. </li><li> Pflegen Sie die Maus auf einem 12 Stunden Licht-Dunkel-Zyklus, gefüttert und täglich bewässert, einnd wird einmal pro Tag bis zu 3 Tage nach der Operation gewichtet. In diesen 3 Tagen wird jede Maus mit einem Verlust von mehr als 10% Körpergewicht gelten als gefährdet und werden anstatt an Versuchen unterworfen eingeschläfert werden. </li><li> Getrennt, ändern Sie die Maus Käfig zweimal pro Woche, und mindestens einmal pro Tag zu überwachen für die allgemeine Gesundheit. 3 Wochen nach der stereotaktischen Mikroinjektionen - Typischerweise wird die Maus innerhalb von 2 verwendet. </li></ol> 2. akuten Hirnschnittpräparat für die konfokale Ca 2+ Imaging 2.1) Herstellung von Schnitt- und Recording Solutions. <ol><li> Vorbereitung Schneid Lösung aus (mM): 194 Sucrose, 30 NaCl, 4.5 KCl, 10 D-Glucose, 1 MgCl 2, 1,2 NaH 2 PO 4 und 26 NaHCO 3, mit 95% O 2 und 5% CO 2 gesättigt. </li><li> Vorbereitung Aufzeichnungslösung, umfassend (mM): 124 NaCl, 4,5 KCl, 1 MgCl 2, 10 D-Glucose, 2 CaCl 2, 1,2 NaH 2 PO 4 </sub&gt; und 26 NaHCO 3; pH 7,3 bis 7,4, 290 bis 295 mOsm, mit 95% O 2 und 5% CO 2 gesättigt. Füllen Sie den Hirnschnitt hält Becher mit Aufzeichnungslösung, und halten Sie sie bei 34 ° C. </li></ol> 2.2) Slicing <ol><li> Zwei bis drei Wochen nach der stereotaktischen Mikroinjektionen, tief und unheilbar betäuben die Maus und dann enthaupten es. </li><li> Extrahieren Sie das Gehirn, und verwenden Sie ein Messer, um die injizierten rechten Hemisphäre zu entfernen, und montieren Sie die linke auf die Vibratom Tablett mit Superkleber. Füllen Sie den Vibratom Tablett mit eiskaltem Schneid Puffer und halten sättigt sie mit 95% O 2 und 5% CO 2. </li><li> Schneiden koronaler oder sagittaler striatalen Hirnschnitten bei 300 &amp; mgr; m Dicke. Normalerweise 4-5 koronalen oder 6 - 7 können sagittale striatalen Scheiben gesammelt werden. </li><li> Übertragen Sie die Scheiben auf die Scheibe Holdingbecher erwärmt bei 34 ° C, und es halten sie für 30 Minuten vor dem Ablegen bei Raumtemperatur für nachfolgende recording. </li><li> Inkubieren der Hirnschnitten in oxygenierten Aufzeichnungspuffer bei Raumtemperatur für mindestens 30 min vor der [Ca 2+] i-Bildgebung. </li></ol> 3. Immunhistochemie (IHC) <ol><li> Zwei Wochen nach Virusinjektion, perfuse die Maus transkardial mit PBS, gefolgt von 10% Formalin in PBS. </li><li> Entfernen, post-fix über Nacht, und cryoprotect das Gehirn in gepufferten 30% Saccharose für mindestens 2 Tage. </li><li> Bereiten Sie 40 um Abschnitte mit einem Kryostat-Mikrotom. </li><li> Spülen Sie den Abschnitten 3 mal mit PBS bei 10 min-Intervall. </li><li> Abschnitte Inkubation für 1 h in PBS mit 10% normalem Ziegenserum und 0,5% Triton X-100. </li><li> Abschnitte über Nacht Inkubation bei 4 ° C in primären Antikörpers in PBS mit 0,5% Triton X-100 hergestellt. Die primären Antikörper verwendet wurden, waren wie folgt: Huhn anti-GFP 1: 1.000, Maus anti-S100β 1: 400, Maus-anti-NeuN 1: 600, Maus-Anti-Glutamin-Synthetase 1: 300. </li><li> Spülen Sie den Abschnitten 3 mal mit PBS auf 10 min Intervallen. </li><li> Inkubieren Abschnitte mit den sekundären Antikörpern in PBS mit 10% normalem Ziegenserum für 2 Stunden bei Raumtemperatur hergestellt. Der zweite Antikörper waren wie folgt: Ziege anti-Maus Alexa546 1: 500, Ziege-Anti-Huhn Alexa488 1: 500. </li><li> Montieren Sie die Teile auf Glasobjektträger, trocken und mehrere Tropfen Antifade Eindeckmediums, dann langsam decken die Schnitte mit einem Deckglas. Lagern Sie die Folien bei 4 ° C. </li><li> Nehmen Bilder auf einem konfokalen Mikroskop mit einem 40x-Ölimmersionsobjektiv mit einer numerischen Apertur von 1,3. </li></ol> 4. Die konfokale [Ca 2+] i Imaging HINWEIS: [Ca 2 +] i-Bildgebung erfolgte mit einem konfokalen Mikroskop mit einem 40x Wasserimmersionsobjektivlinse mit einer numerischen Apertur von 0,8. <ol><li> Zwischen 1 und 5 Stunden nach dem Schneiden, Ort Scheibe im Aufnahmeraum und superfuse mit sauerstoffAufzeichnungsPuffer bei Raumtemperatur mit Durchflussrate von 1-2 ml proMinute Dann legen Sie eine Platin Harfe mit Nylonsaiten auf der Oberseite der Scheibe, um die Bewegung während des Experiments zu minimieren. </li><li> Visualisieren und suchen Sie das dorsale Striatum mit Hellfeld Lumineszenz unter einem 10X Wasserimmersionsobjektiv. </li><li> Wechseln Sie auf die 40X Wasserimmersionsobjektiv Objektiv, und schalten Sie den 488-nm-Linie des Argon-Laser. Durch die Veränderung der Brennebene, finden Zellen etwa 20 &amp; mgr; m unterhalb der Scheibenoberfläche befindet, zeigt basale Fluoreszenz in Soma, Niederlassungen und Zweigstellen. Zu beachten ist, kompromittiert Zellen zeigen meist Fluoreszenzniveau über dem Durchschnitt, die vermieden werden sollten. </li><li> Verwenden Sie Modus &#39;Bildabtastintervalle&#39;, um das Scannen zu starten. Üblicherweise wird die Laserintensität auf 0,5 eingestellt - 5% des maximalen Ausgangs ausreicht, um Bild [Ca 2+] i mit Zyto-GCaMP3. Zur Überwachung [Ca 2+] i Dynamik im gesamten Gebiet der Astrozyten ist die &quot;Rahmenscan &#39;mit einer Abtastrate von 1 Sekunde pro Frame oder schneller EMPFEHLUNDED, aber das muss je nach Experiment in Frage entschieden werden. </li><li> Wenn nötig, um die Bild [Ca 2+] i in Prozessen verwenden digitale Vergrößerung von 2 - 3 fach zu überwachen 1-2 Astrozyten im gesamten Sichtfeld. </li><li> Zu gesättigten Pixel bei einer Aufnahme zu vermeiden, verwenden Lookup-Modus &quot;Hilo&quot;, um die Zellen Pseudocolor. Immer mit einem &quot;Pilot Aufnahme&quot; für ca. 5 min zu starten, um zu testen, ob rote Farbe erscheint als Hinweis auf Sättigung. Wenn dem so ist, senken Sie die Laserausgangsleistung, oder senken Sie die PMT / Gain / Offset-Werte und führen Sie eine weitere Pilotaufzeichnung zu testen die Pixelwerte im nicht gesättigten Bereich. Typischerweise für die Bildgebung Astrozyten verwendet die kombinierten Parameter [Ca 2+] i im Striatum sind wie folgt: Laserausgangsleistung von 0,5 bis 5% (von 10 mW), PMT 550-650 Volt, Gewinn 2,0 - 3.5X und Offset 0 - 5%. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die hier beschriebenen Verfahren haben uns erlaubt, Zyto-GCaMP3 in striatalen Astrozyten in vivo für die anschließende [Ca 2+] i-Bildgebung in situ auszudrücken. Dieses Verfahren hat Vorteile gegenüber der Verwendung von transgenen oder Knockout-Mäusen, wie robust der Expression des Zielproteins, Geschwindigkeit und Flexibilität der experimentellen Durchführung und anatomischen Besonderheiten. Der Ausdruck GCaMP3 mit AAV2 / 5 wurde als spezifisch und robust. Die Kombination von GF...

Astrozyten sind allgegenwärtig und reichlich Gliazellen des Gehirns. Es ist gut bekannt, dass Astrozyten dienen wichtige Unterstützung und homöostatischen Rollen einschließlich Pufferung der K + -Konzentration in den extrazellulären Raum, Aufnahme von Neurotransmittern sowie Bereitstellung von Nährstoffen. Neuere Studien zeigen jedoch, dass sie [Ca 2+] i-Signale, die spontan auftreten und werden durch neuronale Aktivität 1 erhöht zeigen auch. Die Existenz von Astrocyten [Ca 2+] i-Signalisierung wurde immer angenommen, dass die Kommunikation mit den Neuronen auslösen, und hat als solche als eine Form von &quot;Ca 2+ Erregbarkeit&quot; in Astrozyten interpretiert. Die verfügbaren Daten über die letzten zwei Jahrzehnte deuten zwei Einstellungen in dem Astrozyten und Neuronen kommunizieren kann, vielleicht in einer bidirektionalen Art und Weise. Ersten, Astrozyten reagieren häufig mit einer Zunahme der [Ca 2+] i, wenn sie von Neurotransmittern und AktivNeuromodulatoren von Neuronen 2 veröffentlicht. Zweitens [Ca 2+] i steigt innerhalb Astrozyten bewirken die Freisetzung von Signalmolekülen aus Astrozyten, die wiederum Nervenzellen und Blutgefäße beeinflussen. Hinweise darauf, dass Moleküle aus Astrozyten Freigabe über Astrozyten-to-Neuron Signalisierungs Änderungen in den Funktionen der Synapsen, Schaltungen und schließlich 3-5 Verhalten führen. Allerdings bleibt diese eine sich schnell entwickelnde Forschungsgebiet, und es wurde argumentiert, dass eine bessere und detailliertes Verständnis der Astrozyten [Ca 2+] i wird benötigt, um einige der derzeitigen Unsicherheiten 6 lösen. In früheren Arbeiten wurde gezeigt, dass das Laden von mehreren organischen Ca 2+ Indikatorfarbstoffe in Astrozyten nicht zuverlässig zu erfassen [Ca 2+] i-Signale innerhalb gesamte Astrozyten in der Kultur und in situ 7-10. Diese Ergebnisse wurden von uns und anderen 6,11,12 diskutiert. Die Emerging Bild ist, dass [Ca 2+] i-Signale innerhalb Astrozyten Verfahren (zum Beispiel, Zweige und Ästchen), die die primären Standorte für Interaktionen mit Neuronen und Blutgefäße sind, haben nur selten im Detail erforscht. Vor kurzem hat die Anwendung genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren (GeCIS) wie zytosolischen GCaMP3, GCaMP5G und GCaMP6 und Plasmamembran tethered Versionen (zB Lck-GCaMP3) hat das Studium der [Ca2 +] i-Signale in kleine Fächer von Astrozyten wie erlaubt so dünn Prozesse, in der Nähe der Plasmamembran und im gesamten Hoheitsgebiet zu 7,8. Allerdings GeCIS einen Nachteil gegenüber organischen Ca 2+ Indikatorfarbstoffe und das ist die Voraussetzung für genetische Methoden, um die kodierenden Gene selektiv Astrozyten in vivo für Zeiträume von Wochen zu liefern für die GeCIS angemessen sein ausgedrückt. Expression in vivo wird typischerweise unter Verwendung von transgenen Mäusen erreicht, knock-in Mäuse oder mit Virus basierte Auslieferung AppKakerlaken. In der vorliegenden JoVE Artikel berichten wir Methoden und Verfahren eingesetzt, um GeCIS zu striatalen Astrozyten mit Adeno-assoziierten Viren liefern. Wir konzentrieren uns auf Cyto-GCaMP3 als ein Beispiel, aber die gleichen grundlegenden Verfahren funktioniert für jede andere GECI oder fluoreszierendes Protein basierten Reporter.

<table><tbody><tr><td>Spritzenpumpe</td><td>Harvard Apparat</td><td>704506</td><td></td></tr><tr><td>Glaskapillaren</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100-4</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenabzieher</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipettenschleifer</td><td>Narishige</td><td>EG-40</td><td></td></tr><tr><td>pZac2.1 GfaABC1D.cyto-GCaMP3</td><td>Addgene</td><td>44331</td><td>a Plasmid gesendet zu UPenn Vector Core für Virenverpackung</td></tr><tr><td>1 ml Spritze</td><td>BD</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Spritzennadel</td><td>BD</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>AAV2/5 Virus</td><td>UPenn Vector Core</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Sudan rot IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>67386</td><td></td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>CVS Apotheke</td><td>152355</td><td></td></tr><tr><td>Kryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050 S</td><td></td></tr><tr><td>Stereotaktisches Instrument</td><td>David Kopf Instruments</td><td>900LS</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Rotations-Mikromotor-Kit</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>sc-281692</td><td></td></tr><tr><td>Sekundenkleber</td><td>Krazy&reg; Kleber</td><td>KG925</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Ted Pella</td><td>DTK-Zero 1</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskope</td><td>Olympus</td><td>FV300 und FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Normales Ziegenserum</td><td>Vector</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Huhn Anti-GFP</td><td>Abcam</td><td>ab13970</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-S100&beta;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2532</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-NeuN</td><td>Millipore</td><td>MAB377</td><td></td></tr><tr><td>Maus Anti-Glutamin-Synthetase</td><td>Millipore</td><td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Maus-Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11003</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Huhn-Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11039</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5J</td><td></td></tr><tr><td>Montagemedium</td><td>Vektor</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

abbildungsintrazellulären ca 2+ signale in striatal astrozyten von erwachsenen mäusen mit gentechnisch-kodierte kalzium indikatoren

Imaging Intracellular Ca2+ Signals in Striatal Astrocytes from Adult Mice Using Genetically-encoded Calcium Indicators

Astrozyten zeigen spontane intrazelluläre Ca2+ Konzentrationsschwankungen ([Ca2+]i) und reagieren in verschiedenen Einstellungen auf neuronale Erregung mit verstärkten [Ca2+]i Signalen. Es wurde vermutet, dass Astrozyten ihrerseits Neuronen und Blutgefäße durch kalziumabhängige Mechanismen regulieren, wie z. B. die Freisetzung von Signalmolekülen. Die [Ca2+]i-Bildgebung in ganzen Astrozyten ist jedoch erst seit kurzem mit genetisch kodierten Kalziumindikatoren (GECIs) wie der GCaMP-Serie möglich. Die Verwendung von GECIs in Astrozyten bietet nun die Möglichkeit, Astrozyten-Signale [Ca2+]i in Modell-Mikroschaltkreisen wie dem Striatum, dem größten Kern der Basalganglien, im Detail zu untersuchen. In diesem Bericht werden detaillierte chirurgische Methoden zur Expression von GECIs in Astrozyten in vivo und konfokale Bildgebungsansätze zur Aufzeichnung von [Ca2+]i-Signalen in striatalen Astrozyten in situ beschrieben. Wir heben Vorsichtsmaßnahmen, notwendige Kontrollen und Tests hervor, um festzustellen, ob die GECI-Expression für Astrozyten selektiv ist, und um Anzeichen einer offensichtlichen Astrozytenreaktivität zu bewerten. Wir beschreiben auch detailliert die Bedingungen für Hirnschnitte und Bildgebung, die eine zuverlässige [Ca2+]i-Bildgebung in striatalen Astrozyten in situ ermöglichen. Die Verwendung dieser Ansätze enthüllte das gesamte Territorium einzelner striataler Astrozyten und spontaner [Ca2+]i-Signale innerhalb ihrer Somaten, Äste und Verzweigungen. Die weitere Verwendung und Erweiterung dieser Ansätze im Striatum wird es ermöglichen, die Astrozytensignale [Ca2+]i in den striatalen Mikroschaltkreisen detailliert zu untersuchen.

Für Astrozyten spezifische Expression von Cyto-GCaMP3 im Striatum, verwendeten wir Adeno-assoziierten Virus (AAV) des Serotyp 5 und die GFAP GfaABC 1 D-Promotors (1A), die zuvor gezeigt wurde, robuste und GCaMP3 Reportergen fahren Expression in hippokampalen und kortikalen Astrozyten 8,14. Zwei Wochen nach der Virusmikroinjektion in die Maus-Striatum wurde die Maus (~ 10 Wochen alt) perfundiert und IHC auf dünnen Hirnschnitten durchgeführt, um Cyto-GCaMP3 Expression im Striatum <st...

Die Eigenschaften und Funktionen der intrazellulären Ca2+-Signale der Astrozyten im Striatum sind noch unvollständig erforscht. Wir beschreiben Methoden zur Expression genetisch kodierter Calciumindikatoren in striatalen Astrozyten unter Verwendung von Adeno-assoziierten Viren des Serotyps 2/5 (AAV2/5) sowie Verfahren zur zuverlässigen Abbildung von Ca2+-Signalen in striatalen Astrozyten in situ.

Abbildungsintrazellulären Ca 2+ Signale in Striatal Astrozyten von erwachsenen Mäusen mit gentechnisch-kodierte Kalzium Indikatoren

Astrocytes display spontaneous intracellular Ca2+ concentration fluctuations ([Ca2+]i) and in several settings respond to neuronal excitation with ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, intrazelluläre Kalziumsignale in stri-AAL-Astrozyten von erwachsenen Mäusen unter Verwendung genetisch kodierter Kalziumindikatoren wie cyto G CAMP drei abzubilden. Dies wird erreicht, indem das Virus zunächst in das Striatum der Maus injiziert wird. Dann darf sich die Maus nach der Operation zwei bis drei Wochen lang erholen.Als nächstes wird die Maus geopfert und akute Hirnschnitte vorbereitet. Der letzte Schritt besteht darin, eine konfokale Kalziumbildgebung der Hirnschnitte durchzuführen. Letztendlich wird die Immunhistochemie verwendet, um zu zeigen, dass das Cyto G Camp drei nur in Astrozyten, nicht aber in Neuronen exprimiert wird, und dass die Virusinjektion keine offensichtliche Astrozytenreaktivität verursachte.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie transgenen oder nochi M besteht darin, dass sie eine robuste Expression des Zielproteins und eine schnelle und flexible experimentelle Umsetzung ermöglicht. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Bereich der Osteozyten-Kalzium-Signalgebung zu beantworten, z. B. wie man die Signale als Osteozyten-Kalzium in den Ästen und Ästen der Strat

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Research

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Neuroscience

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Wir beschreiben, wie man in der Nähe Membran und globalen intrazellulären Calcium-Dynamik in kultivierten Astrozyten mit Totalreflexion und Epifluoreszenzmikroskopie messen.

Messen in der Nähe Plasmamembran und Global intrazellulären Calcium-Dynamics in Astrozyten

Eine Methode zur subventrikulären Zone (SVZ) Zellen mit Calcium-Indikator Farbstoffe für die Aufnahme Calciumaktivität laden beschrieben. Die postnatale SVZ enthält dicht gepackten Zellen, einschließlich neuralen Vorläuferzellen und Neuroblasten. Anstatt Badbelastung injizierten wir den Farbstoff durch Druck im Inneren des Gewebes eine bessere Farbstoffdiffusion.

Vorbereitung der akuten Subventrikulärzone Slices für Calcium Imaging

Quelle: Bannai, H., et. al., Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators. J. Vis. (2019)Das Video demonstriert die Fluoreszenzbildgebung zur Beobachtung der kompartimentspezifischen spontanen Kalziumdynamik in Astrozyten durch sequentielle Überwachung von Kalzium-sensitiven Proteinen, die auf der Plasmamembran und dem endoplasmatischen Retikulum lokalisiert sind.

Spontane Kalzium-Bildgebung für kompartimentspezifische Dynamik in Astrozyten

Hier beschreiben wir eine Anpassung der Protokolle verwendet, um homöostatische Plastizität in Neuronen für die Untersuchung der Plastizität von Astrozyten G-Protein-gekoppelten Rezeptoren zu induzieren. Kürzlich verwendet werden, um Veränderungen in Astrozyten Gruppe I mGluRs mit jungen Mäusen zu untersuchen, kann das Verfahren auf die Skalierung der verschiedenen Astrozyten GPCRs zu messen, in Gewebe von erwachsenen Mäusen in situ und in vivo, und ein besseres Verständnis für die...

Induktion von Plastizität Astrozytäre Rezeptoren durch Manipulation der neuronalen Feuerraten

Hier präsentieren wir ein Protokoll zum Bild Kalzium signalisieren in den Populationen der einzelnen Zelltypen bei der murinen neuromuskulären Synapse.

Ex-Vivo Bildgebung von zellspezifische Kalzium Signalisierung an den dreigliedrigen Synapse der Maus Membran

Genetisch codierte Ca2 + Indikatoren (GECIs) haben sich radikal verändert wie in-situ Ca2 + Bildgebung durchgeführt wird. Um die Wiederherstellung von Daten aus solchen Aufnahmen zu maximieren, ist die entsprechende Analysen von Ca2 + Signale erforderlich. Die Protokolle in diesem Papier erleichtern die Quantifizierung von Ca2 + Signale an Ort und Stelle mit räumlich-zeitliche Zuordnung und partikelbasierten Analyse aufgezeichnet.

Anwendungen der räumlich-zeitliche Zuordnung und Partikel-Analyse-Techniken zu quantifizieren, intrazellulären Ca2 + Signalisierung In Situ

Dieses Proktokol zielt darauf ab, eine Methode für die in vitro und in vivo mitochondriale Ca2+ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen bereitzustellen.

Bildgebung der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme in Astrozyten und Neuronen unter Verwendung von genetisch kodierten Ca2+ Indikatoren (GECIs)

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Herstellung eines großen (6 x 3 mm2) Schädelfensters mit Lebensmittelverpackung, transparentem Silikon und Deckglas. Dieses Schädelfenster ermöglicht in vivo Weitfeld- und Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebungsexperimente in derselben Maus.

Im lebenden Organismus Weitfeld- und Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung einer Maus mit einem großen Schädelfenster

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Exposition des dorsalen Wurzelganglions (DRG) gefolgt von GCaMP3 (genetisch kodierter Ca2+ Indikator; Grün fluoreszierendes Protein-Calmodulin-M13 Protein 3) Ca2+ Bildgebung der neuronalen Ensembles mit Pirt-GCaMP3 Mäusen unter Anwendung einer Vielzahl von Stimuli auf die ipsilaterale Hinterpfote.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung neuronaler Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neurone in intakten dorsalen Wurzelganglien

Dieses Protokoll beschreibt in vivo die GCaMP-Kalziumbildgebung von intakten Trigeminusganglien (TG)-Neuronen. Diese Beschreibung umfasst TG-Expositionsoperationen, konfokale In-vivo-Mikroskopie-Bildgebung von TG-Neuronen, Anwendung somatischer Stimuli während der mikroskopischen Bildgebung von TG-Neuronen und Analyse von in vivo GCaMP-Calcium-Bildgebungsdaten.

Im lebenden Organismus Calcium-Bildgebung von neuronalen Ensembles in Netzwerken primärer sensorischer Neuronen in intakten Trigeminusganglien

Dieses Protokoll bietet eine umfassende Beschreibung einer Methode zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Kalziumsignalen von Neuronen und Astrozyten über mehrere gedächtnisbezogene Hirnregionen hinweg und demonstriert deren Anwendung während eines Lern- und Gedächtnisverhaltensparadigmas.

Eine zweifarbige Faserphotometriemethode zur Aufzeichnung der Aktivität von Astrozytenneuronen über mehrere Gehirnregionen während des Lern- und Gedächtnisverhaltens

Lernen Sie die Bildgebung intrazellulärer Kalziumsignale in striatalen Astrozyten erwachsener Mäuse mit gentechnisch kodierten Kalziumindikatoren. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen neuronaler Funktionen.

Abbildungsintrazellulären Ca 2+ Signale in Striatal Astrozyten von erwachsenen Mäusen mit gentechnisch-kodierte Kalzium Indikatoren (Video) | JoVE Journal

Abbildungsintrazellulären Ca²⁺ Signale in Striatal Astrozyten von erwachsenen Mäusen mit gentechnisch-kodierte Kalzium Indikatoren

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