Anbau von Säugetierzellen mit einem Einweg-Bioreaktorsystem Pneumatische

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, große Mengen an Säugetierzellen zu züchten. Dies wird erreicht, indem zuerst der pH-Wert und der gelöste Sauerstoff kalibriert oder Sonden verwendet werden, und dann der pH-Wert, die Sonden und die Temperatursondenhülse autoklaviert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Sonden und die Hülse in den Behälter einzuführen und den Behälter auf dem Bioreaktor zu positionieren sowie die Abluft, den Filter, die Gasleitungen und den Temperaturfühler anzuschließen.

Der nächste Schritt besteht darin, die DO- und pH-Kabel anzuschließen und das Medium und die Mikroträger, die in den Bioreaktor gepumpt werden, aseptisch zu verbinden. Der letzte Schritt besteht darin, die Regler zu starten, um sicherzustellen, dass der Bioreaktor die gewünschte Laufraddrehzahl, Temperatur und Sauerstoffsättigung erreicht. Letztendlich kann die Kultur nach der Inokulation und Computerüberwachung für die Extraktion und Reinigung des gewünschten Produkts aufbereitet werden.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem wiederverwendbaren Rührkessel-Bioreaktor besteht darin, dass der Luftrad-Bioreaktor einfach zu bedienen ist und das Risiko einer mikrobiellen Kontamination minimiert. Fangen wir an. Um das Protokoll zu starten, melden Sie sich beim Hallo-Bildschirm an.

Überprüfen Sie als Nächstes den pH-Sensor und vergewissern Sie sich, dass die Sensorspitze mit Elektrolytlösung gefüllt ist. Besorgen Sie sich ein Becherglas mit pH-4-Lösung, ein weiteres Becherglas mit pH-7-Lösung und eine Waschflasche mit destilliertem Wasser. Verbinden Sie dann das pH-Kabel mit dem pH-Sensor.

Navigieren Sie zur Registerkarte "Aktionen" in der Hallo-Schnittstelle, und wählen Sie "Kalibrieren" aus. Wählen Sie dann die Registerkarte PHA und die Zwei-Punkt-Kalibrierung aus. Geben Sie die Puffertemperatur in das Feld für die Temperatur der Kalibrierlösung ein.

Platzieren Sie den Sensor in der zu kalibrierenden pH-Vier-Lösung. Geben Sie den Wert in das Nullfeld ein. Sobald sich das Diagramm stabilisiert hat, drücken, kalibrieren und spülen Sie den pH-Sensor mit destilliertem Wasser. Wiederholen Sie die Kalibrierung für pH sieben und speichern Sie die Einstellungen.

Geben Sie den Pufferwert in das span-Feld ein und warten Sie, bis sich das Transplantat stabilisiert hat. Um mit gelöstem Sauerstoff zu beginnen oder eine Kalibrierung durchzuführen. Stellen Sie sicher, dass der DO-Sensor mehrere Stunden lang mit dem System verbunden und auf der Registerkarte "Kalibrierung" polarisiert wurde, und wählen Sie DOA und Zweipunktkalibrierung aus.

Trennen Sie den DO-Sensor. Geben Sie Null in die Registerkarte Null ein und warten Sie, bis sich das Diagramm stabilisiert hat. Bevor Sie "Kalibrieren" auswählen, schließen Sie den do-Sensor wieder an und geben Sie 100 in das Span-Feld ein.

Wenn sich das Diagramm stabilisiert hat, klicken Sie auf Zwei kalibrieren. Speichern Sie anschließend die Einstellungen und schließen Sie das Programm. Legen Sie nach der Kalibrierung die Sensoren und die Thermomulde in Autoklavenbeutel und autoklavieren Sie diese 30 Minuten lang bei 121 Grad Celsius und 15 PSI.

Nachdem der Autoklav fertig ist, desinfizieren Sie die Autoklavenbeutel mit 70%igem Isopropylalkohol und überführen Sie die Beutel in eine biologische Sicherheitswerkbank oder BSC. Desinfizieren Sie das Reagenzgefäß und führen Sie es in das BSC ein. Entfernen Sie die Innenverpackung und überprüfen Sie das Gefäß und die Schläuche auf Beschädigungen.

Installieren Sie als Nächstes den DO-Sensor in der vorderen linken Öffnung des Reagenzgefäßes und die Thermovertiefung in der hinteren linken Öffnung. Setzen Sie den pH-Sensor in den rechten vorderen Anschluss ein, um ihn zu installieren. Öffnen Sie die Sensorkappe und schrauben Sie den Sensor leicht in die Öffnung an der Oberseite des Behälters ein.

Übertragen Sie dann das Gefäß aus dem BSC. Stellen Sie sicher, dass sich die Kabel des pH- und DO-Sensors außerhalb der Behälterhülse befinden und sich nichts in der Hülse befindet. Halten Sie das Gefäß so, dass Sie nach vorne schauen, und schieben Sie das Gefäß mit den Füßen voran in die Hülle.

Stellen Sie sicher, dass der Boden des Gefäßes auf den Heizungen aufliegt. Setzen Sie dann den Temperatursensor vorsichtig in das thermische Gefäß ein. Brunnen. Nehmen Sie anschließend die Schlauchsets aus dem Beutel.

Stimmen Sie die Farbcodierung auf dem Schlauch mit den entsprechenden Anschlüssen und Pumpen an der Bioreaktorsteuerung ab. Verlegen Sie die Medienzugabe- und Probenahmeleitungen hinter dem DO-Sensor und der Thermik. Führen Sie den Schlauch in die farbcodierte Pumpe auf der linken Seite des Bioreaktors ein.

Verbinden Sie die Haupt- und die Mikrogasleitung. Drücken Sie den Hauptanschluss der Gasleitung in den Gasauslass, um die Hauptgasleitung zu installieren. Drehen Sie dann den Mikrogasleitungsstecker im Uhrzeigersinn in seinen Gasauslass So installieren Sie die Mikrogasleitung.

Um den Schlauch des Filterofens zu installieren, öffnen Sie den Filterofen und befestigen Sie den Abluftfilterschlauch am Schlauch. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch durch die beiden Haken zum Filter und aus dem Ofen führt. Führen Sie die untere Linie durch den Haken am Boden des Filterofens und schließen Sie die Tür.

Verbinden Sie dann die Kabel mit den DO- und pH-Sensoren. Stellen Sie nach Abschluss der Installation mit Hilfe von Köderanschlüssen eine sterile Verbindung zwischen einer unbenutzten Leitung der mittleren Auflage und der Quelle des mittelgroßen Flaschenbeutels her. Navigieren Sie zur Registerkarte "Aktionen" auf der Hello-Oberfläche.

Klicken Sie auf Pumpen steuern, wählen Sie Medienpumpe aus und klicken Sie auf den Schieberegler, um die Medienpumpe zu aktivieren. Fügen Sie dann 1,5 bis 3,0 Liter Medium hinzu und klicken Sie auf den Schieberegler, um die Pumpe auszuschalten. Die Anlage ist nun bereit, zuvor vorbereitete Microcarrier in den Reaktor zu pumpen.

Diese können über eine Additionszeile hinzugefügt werden. Befestigen Sie die MICROCAR-Flasche mit einem sterilen Köderverschluss an der entsprechenden Zuführleine. Schalten Sie die Zusatzpumpe im Bildschirm der Steuerpumpe ein.

Schalten Sie nach dem Hinzufügen der Mikroträger die Pumpe mit dem Schieberegler aus, navigieren Sie zurück zum Hauptbildschirm auf der Hallo-Oberfläche, wählen Sie Aktionen und dann Erweitert. Wählen Sie den entsprechenden Controller aus, um die Einstellungen zu bearbeiten. Stellen Sie die Regler auf Auto und geben Sie die Sollwerte ein.

Schalten Sie nach dem Einstellen der Regler die Luftpumpe ein. Schauen Sie in das Reagenzgefäß, um sicherzustellen, dass sich das Luftrad dreht. Stellen Sie sicher, dass der DO-Sensor vollständig polarisiert ist und dass sich der DO-Wert stabilisiert hat.

Kalibrieren Sie dann die Do-Sensor-Form, eine sterile Verbindung zwischen einer unbenutzten Medienzugabeleitung, die durch eine orangefarbene Bande gekennzeichnet ist, und der Quelle des Zellflaschenbeutels unter Verwendung von Köderanschlüssen. Installieren Sie als Nächstes den Silikonabschnitt des Schlauchs in der Medienpumpe. Stellen Sie sicher, dass die Schlauchschelle geöffnet und die verzweigte Schlauchschelle geschlossen ist.

Navigieren Sie zur Registerkarte Steuerpumpe und schalten Sie die Medienpumpe ein. Fügen Sie die Zellen hinzu und schalten Sie die Medienpumpe aus. Navigieren Sie nach der Impfung zur Registerkarte "Aktionen" und wählen Sie "Probe entnehmen" aus.

Stellen Sie sicher, dass sich der Probenahmeschlauch in der Probenahmepumpe befindet, und manipulieren Sie den Probenahmehahn gemäß den Anweisungen auf dem Bildschirm. Entfernen Sie die Spritze mit der Probe für die Zellzählung und andere nachgelagerte Anwendungen, um Zellzählungen durchzuführen. Schließlich, wenn die Zellen die gewünschte Dichte von 1,2 mal 10 zu den sechs Zellen pro Milliliter erreicht haben, gibt man das Virus-Inokulum septisch in eine 20-Milliliter-Spritze.

Schließen Sie die Spritze an eine Ersatzzugabe am Reaktor an. Verwenden Sie den Bildschirm der Steuerpumpe, um die Zusatzpumpe einzuschalten und das Virus-Inokulum hinzuzufügen. Die Mehrzahl der A 5 49 Zellen haftete innerhalb von zwei Stunden an den Mikrocarriern.

Nach 12 Stunden zeigten die Zellen Anzeichen von Abflachung und Ausbreitung auf der Oberfläche des Mikroautos. Nach 24 Stunden zeigten die Mikrocarrier eine gleichmäßige Verteilung der Zellen. Die Besiedlung mit Mikroautos geschieht schnell, wie hier gezeigt.

Der prozentuale Anteil der Mikrocar-Besiedlung durch 54 9 Zellen beträgt 75% nach 24 Stunden. Diese Grafik zeigt die Anzahl lebensfähiger 54 bis 9 Zellen in Kultur vor und nach der Infektion mit dem Adenovirus. Die Zellen wachsen nach 48 Stunden exponentiell weiter auf 1 Million Zellen pro Milliliter.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Luftrad-Bioreaktor zusammenbauen und betreiben, um Säugetierzellen mit hoher Dichte für die Zell- oder Proteinproduktion zu züchten. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.