Name: Anbau von Säugetierzellen mit einem Einweg-Bioreaktorsystem Pneumatische (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Lernen Sie den Anbau von Säugetierzellen mit einem pneumatischen Einweg-Bioreaktor. Diese Methode zeigt Kalibrierung, Montage und Betrieb für kontrollierte Zellkultur mit minimalem Kontaminationsrisiko.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dieses Projekt wurde teilweise von der Johns Hopkins University, Office of the Provost durch die Gateway Science Initiative unterstützt.

1. Login <ol><li> Schalten Sie den Bioreaktor. Klicken Sie irgendwo auf die Login-Seite zu öffnen. Wählen Sie Benutzernamen und Passwort eingeben und auf &quot;Login&quot;. </li></ol> 2. Kalibrierung <ol><li> Kalibrieren pH-Sensor (2-Punkt vor dem Autoklavieren). </li><li> Untersuchen pH-Sensor und bestätigen Sensorspitze mit Elektrolytlösung gefüllt. Bereiten Sie zwei Becher mit pH-Eichlösungen (Elektrolyt) pH 4 und pH 7 und verfügen eine Waschflasche mit destilliertem Wasser. </li><li> Verbinden Sie das Kabel mit dem pH-Wert pH-Sensor. Navigieren Sie zur Registerkarte &quot;Aktionen&quot; auf der Schnittstelle Hallo und klicken Sie auf &quot;Kalibrieren&quot;. Geben Sie Puffertemperatur im Temp-Feld Kalibrierungslösung. </li><li> Zeigen pH-Sensor in Puffer 1 (pH 4) und geben Sie in das Feld Wert &quot;Null&quot;. Warten Sie auf die Grafik, um zu stabilisieren und die auf den Button &quot;kalibrieren 1&quot;. Spülen Sie den pH-Sensor mit destilliertem Wasser. </li><li> Sensor in Puffer 2 (pH 7). Geben Sie Puffer2-Wert im Feld &quot;span&quot;. Warten Sie, Graphen zu stabilisieren und klicken Sie auf Kalibrieren 2-Taste. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Speichern&quot; klicken Sie dann auf &quot;Schließen&quot;. </li><li> Kalibrieren Sie den gelösten Sauerstoff (DO)-Sensor. </li><li> Sicherstellen, dass die DO-Sensor hat, indem er auf das System für mehrere Stunden verbunden polarisiert worden. Navigieren Sie zur Registerkarte &quot;Aktionen&quot; auf der Schnittstelle Hallo, und klicken Sie kalibrieren. Klicken Sie auf die Schaltfläche &quot;DO A&quot;. </li><li> Trennen Sie die DO-Sensor und geben Sie 0 in das Feld &quot;Null&quot;. Warten Sie auf die Grafik, um zu stabilisieren und die klicken Sie auf &quot;Kalibrieren 1&quot;-Taste. </li><li> Schließen Sie den Sauerstoffsensor und geben Sie 100 in das Feld &quot;Span&quot;. Warten Sie auf die Grafik, um zu stabilisieren und die klicken Sie auf &quot;Kalibrieren 2&quot;-Taste. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Speichern&quot; klicken Sie dann auf &quot;Schließen&quot;. </li></ol> 3. Autoklav und installieren Sensoren und Reagenzienbehälter <ol><li> Nach der Kalibrierung Ort Sensoren und Thermalbrunnen in autoLlave Beutel und Autoklaven für 30 min bei 121 ° C, 15 psi. </li><li> Desinfizieren Autoklaven Beutel mit 70% Isopropylalkohol (IPA) und Transfer Beutel zu biologischen Sicherheitsschrank (BSC). Entfernen Sie die äußeren Umhüllungen von Gefäß. </li><li> Desinfizieren Innenverpackung mit 70% IPA und Transportbehälter für die biologische Sicherheitswerkbank (BSC). Entfernen Innenverpackung und das Schiff zu inspizieren und Schläuche für Schäden während des Transports Schaden ein. </li><li> Installieren Sie den pH-Wert und Sauerstoffsensoren in den beiden vorderen Ports. Installieren Sie den Thermalbrunnen auf der linken hinteren Port. Öffnen Sie die Sensorkappe. </li><li> Führen Sie den Sensor durch den Sensor-Port. Fädeln Sie den Sensor fest in den Anschluss. </li><li> Transportbehälter von BSC. </li><li> Hängen Sie die DO und pH-Sensor-Kabel außerhalb des Gefäßes Hülse und überprüfen, dass nichts in der Hülse. Schieben Sie den Behälter in der Hülse, mit den Füßen zuerst. </li><li> Sorgfältig passen die Temperaturfühler in den Behälter Thermalbrunnen. Sicherzustellen, dass der Boden des Behälters liegt, an den Heizungen. </li><li> Entfernender Schlauch setzt aus ihren Taschen. Spiel Farbcodierung auf den Schlauch an die entsprechenden Anschlüsse und Pumpen auf dem Bioreaktor-Steuereinheit. </li><li> Installieren Sie die Hauptgasleitung durch Drücken der Stecker in die Gassteckdose. Installieren Sie die Mikrogasleitung durch Verdrehen der Stecker im Uhrzeigersinn in die Gassteckdose. Installieren Sie den Abluftfilter Schlauch: </li><li> Öffnen Sie die Filter Ofen. Sichere den Abluftfilter auf dem U-Kanal, so das Schlauch geht durch die beiden Haken an den Filter und aus dem Ofen. </li><li> Installieren Sie den Schlauch durch Kondensator Tasche in der Schlauchaufnahme. Schließen Sie die Tür. </li><li> Route zusätzlich Linien A und B, beide Medienleitungen, und die Ernte Linie hinter dem DO-Sensor und auf der Bank neben dem Bioreaktor-Steuereinheit. </li><li> Schließen Sie die Kabel an die DO und pH-Sensoren. </li></ol> 4. Zugabe von Medium und Micro-Träger <ol><li> Navigieren Sie zur Registerkarte &quot;Aktionen&quot; und klicken Sie auf &quot;Systemsteuerung Pumpen&quot; auf der Computer-Schnittstelle. </li><li> Bilden eine Sterile Verbindung zwischen einem unbenutzten Medium zusätzlich Linie (1 Orange-Band) und dem Medium Flasche / Beutel Quelle durch Schweißen der Rohrleitungen oder Armaturen mit Luer. </li><li> Klicken Sie auf den Schieberegler, um auf der Medienpumpe einzuschalten. Klicken Sie auf den Schieberegler, um die Medien wenden Pumpe aus nach Zugabe gewünschte Menge des Mediums. </li><li> Platzieren Mikrokügelchen in Ca 2 +, Mg 2 + freiem PBS für 3 h bei RT. </li><li> Waschperlen mehrmals mit Ca 2 +, Mg 2 + freiem PBS. </li><li> Autoklav für 15 Minuten bei 115 ° C, 15 psi. HINWEIS: In 3 g / l (Trockengewicht) in diesem Experiment. </li><li> Pumpe in Mikroträgern, die hydratisiert, gewaschen und in den Reaktor in der gleichen Weise wurde das Medium im Schritt 4.1 zugegeben wurden autoklaviert. </li></ol> 5. Die Gleichgewichtseinstellung und Ein-Punkt-Kalibrierung DO <ol><li> Stellen Sie die Regler auf Auto und geben Sie die gewünschten Sollwerte. Hier verwenden Agitation Set Point (SP) = 15 min, Temperatur SP = 37,0 ° C, pH = 7,2, DO = 100%. Warten Sie auf die parameter ins Gleichgewicht. </li><li> Sensor bestätigen ist vollständig polarisiert. Bestätigen DO Barwert hat sich stabilisiert. </li><li> Navigieren Sie zur Registerkarte &quot;Aktionen&quot; und klicken Sie auf &quot;Kalibrieren&quot;. Klicken Sie auf &quot;DO A&quot;, klicken Sie auf &quot;One Point&quot;. </li><li> Geben Sie &quot;100&quot; in das Feld &quot;Span&quot;. Klicken Sie auf &quot;Kalibrieren 1&quot;, klicken auf &quot;Speichern&quot; und klicken Sie auf &quot;Schließen&quot;: </li></ol> 6. Starten eines Run <ol><li> Navigieren Sie zur Registerkarte Aktionen. Klicken Sie auf &quot;Batch&quot;. Verwenden des On-Screen-Tastatur oder eine externe Tastatur an eine Batch-Namen eingeben 16 Zeichen oder weniger. </li><li> Klicken Sie auf die Schaltfläche Tastatur auf dem Bildschirm &quot;Hide&quot;. Klicken Sie auf &quot;Start Batch&quot; bestätigen Sie mit &quot;Start&quot; in der Überlagerung. </li></ol> 7. Impfen mit Zellen <ol><li> Bilden eine sterile Verbindung zwischen einem unbenutzten Medium zusätzlich Linie (1 Orange Band) und die Zelle Flasche / Beutel Quelle durch Schweißender Schlauch oder mit Hilfe der Luer Armaturen. </li><li> Installieren der Silikonabschnitt des Schlauchs in der Medienpumpe, so dass der Pfeil in Richtung der Rohrleitung zwischen der Pumpe und dem Behälter. </li><li> Überprüfen Schlauchklemme ist offen und seine verzweigte Schlauchklemme geschlossen ist. Klicken Sie auf den Schieberegler, um die Medienpumpe einzuschalten, und klicken Sie auf &quot;Aus&quot; nach der Zugabe von Zellen. </li><li> Navigieren Sie zur Registerkarte &quot;Aktionen&quot; und klicken Sie auf &quot;Systemsteuerung Pumpen&quot;. </li></ol> 8. Probenahme <ol><li> Nach Impfen und so oft wie gewünscht, um die Kultur zu überwachen, zeichnen Sie eine Probe aus der Kultur, in der folgenden Weise: </li><li> Navigieren Sie zur Registerkarte &quot;Aktionen&quot; und klicken Sie auf &quot;Probe nehmen&quot;. Legen Sie die Sampling-Schlauch in der Probenahmepumpe und nach den Anweisungen auf dem Bildschirm manipulieren die Sampling-Hahn. </li><li> Führen Sie mindestens eine tägliche mikroskopische Beobachtung und Zellzahl an diesen Proben. </li><li> Wenn die Zellen die gewünschte Dichte in diesem C erreichtase 1,2 x 10 6 Zellen / ml, infizieren die Zellen durch die Zugabe eines Virus-Inokulum. </li><li> Aseptisch das Inokulum in den 20-ml-Spritze, und verbinden Sie die Spritze mit einem der Ersatz zusätzlich Ports auf den Reaktor. Einführung des Inokulums in den Reaktor durch Druck auf den Spritzenkolben. </li><li> Weiter Probenahme und der Analyse der Kultur für die Adenovirus intrazellulären Partikelkonzentration. </li></ol>

<ol><li>Freshney, R. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFreshney%2C+RI+%22Culture+of+Animal+Cells+A+Manual+of+Basic+Techniques+and+Specialized+Applications%22">Culture of Animal Cells A Manual of Basic Techniques and Specialized Applications</a>. , 6th edition, John Wiley & Sons, Inc. Hoboken, NJ. (2010).</li>
<li>Healthcare, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcarrier+Cell+Culture+Principles+and+Methods%5BTitle%5D)+AND+%22GE+Healthcare+Data+File+18-1140-62%22%5BJournal%5D)">Microcarrier Cell Culture Principles and Methods.</a> GE Healthcare Data File 18-1140-62. , (2005).</li>
<li>Simaria, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allogeneic+cell+therapy+bioprocess+economics+and+optimization+Single-Use+cell+expansion+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+and+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Allogeneic cell therapy bioprocess economics and optimization Single-Use cell expansion Technologies.</a> Biotechnol and Bioeng. 111 (1), 69-83 (2014).</li>
<li>Lee, B., Fang, D., Croughan, M., Carrondo, M., Paik, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+novel+pneumatic+mixing+for+single-use+bioreactor+application%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Proc%22%5BJournal%5D)">Characterization of novel pneumatic mixing for single-use bioreactor application.</a> BMC Proc. 5 (S8), O12(2011).</li>
<li>Eibl, R., Eibl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disposable+bioreactors+in+cell+culture-based+upstream+processing%5BTitle%5D)+AND+%22BioProcess+Int%22%5BJournal%5D)">Disposable bioreactors in cell culture-based upstream processing.</a> BioProcess Int. 7 (S1), 18-23 (2009).</li>
<li>Chaubard, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disposable+bioreactors+for+viral+vaccine+production+challenges+and+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Biopharm+Int+Supp%22%5BJournal%5D)">Disposable bioreactors for viral vaccine production challenges and opportunities.</a> Biopharm Int Supp. , (2010).</li>
<li>Croughan, M. S., Hamel, J. F., Wang, D. I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Effects+on+Animal+Cells+Grown+in+Microcarrier+Cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+and+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Effects on Animal Cells Grown in Microcarrier Cultures.</a> Biotechnol and Bioeng. 95 (2), 295-305 (2006).</li>
<li>DePalma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-use+Equipment+on+Cusp+of+Industrialization%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Eng+Biotechnol+News%22%5BJournal%5D)">Single-use Equipment on Cusp of Industrialization.</a> Genet Eng Biotechnol News. 32 (1), (2012).</li>
<li>Baltz, R. H., Demain, A. L., Davies, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBaltz%2C+RH+%22Manual+of+Industrial+Microbiology+and+Biotechnology%22">Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology</a>. , 3rd ed, ASM Press. Washington, DC. (2010).</li>
<li>Applied Technical Bioreactors, , Seminole (FL), USA. <a target="_blank" href="http://www.infors-ht.com/index.php/en/products/bioreactors/bench-top-bioreactors/minifors">http://www.infors-ht.com/index.php/en/products/bioreactors/bench-top-bioreactors/minifors</a> (2012).</li>
<li>Sousa, M. F., Giroux, D., Clemente, J., Lee, B., Carrondo, M. J., Alves, P. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSousa%2C+MF+%22Impact+of+Bioreactor+Design+on+the+Performance+of+Microcarrier+Cultures%22">Impact of Bioreactor Design on the Performance of Microcarrier Cultures</a>. , 3rd ed, Abstract. Cell Culture Engineering XIII. Scottsdale, Arizona. (2012).</li>
</ol>

Autoren D. Giroux und Y. Hashimura sind Mitarbeiter von PBS Biotech, die Reagenzien und Instrumente in diesem Artikel verwendet wird, erzeugt.

Diese Einweg-Bioreaktor-System ist relativ einfach zu bedienen und bietet Echtzeit-Analysen für Reaktor Überwachung und Analyse. Es ist sehr gut für Säugetier und Insektenzellkultur mit Zelldichten erreicht über 30 Millionen Zellen / ml geeignet. Außer in diesem Bericht beschriebenen 11 A549-Zellen, haben wir SF-9 Insektenzellen im Bioreaktor als auch gewachsen. Die schonende Durchmischung durch den pneumatischen Luft Rad vorgesehen reduziert Zellschäden. Mehrere Schritte sind entscheidend bei der Einrichtung dieses Reaktors. Zuerst richtige Kalibrierung des pH und Sauerstoffsensoren ist für eine optimale Kontrolle der Kultur und für die Zugabe von Reagenzien, um den pH oder die Sauerstoff in dem System anzupassen. Zweitens muss das Reagenz und Saatgut Flaschen gefüllt werden, und die Luer-Anhänge in einer sterilen Umgebung, wie einem BSC. Sobald die Reagenzien sind aus der sterilen Umgebung bewegt wird, müssen die Anschlüsse an den Bioreaktor Zuleitungen mit Sorgfalt vorgenommen werden, um mikrobielle Kontamination zu vermeiden. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; Während dieses Bioreaktorsystem funktioniert gut für Säuger und Insektenzelllinien ist es nicht für Bakterienkulturen entwickelt. Das System kann nicht die schnelle Vermischung und Sauerstoffversorgung, die für die Bakterienzellen erforderlich ist. Bakterielle Wachstum wird am besten in einem Rührkessel-Bioreaktor durchgeführt. Im Vergleich zu anderen Einzel Bioreaktoren für Säugetier oder Insektenzellkultur ist dieses System einfach zu bedienen, bietet ausreichend Daten für die Analyse von Läufen, und hat ähnliche oder bessere Zellwachstum als die anderen Einzelnutzung System das wir geprüft haben. Der Einweg-Bioreaktorsystem pneumatische hat das Potenzial, viele der Forschung und klinische Anwendungen in den Bereichen von Biotherapeutika, Impfstoffe zu treffen, Stammzellen, und personalisierte Medizin 4. Darüber hinaus ist die Flexibilität dieses Systems ermöglicht Batch, Fed-Batch-, Perfusions-und Transfektion bezogen Bioreaktor Anwendungen 5. Schließlich haben Einweg-Bioreaktorsystemen der potenTiAl auf die Bedürfnisse von großen industriellen Produktion gerecht zu werden und um Leitlinien und Empfehlungen der nationalen und internationalen Aufsichtsbehörden 6-10 einzuhalten.

Zellen, die in Suspension wachsen, Zellen, die als Zuschlagstoffe zu wachsen, und die Zellen, die mit einem Substrat verankert wachsen: Säugerzelllinien können in eine von drei Kategorien auf der Basis ihrer Wachstumseigenschaften klassifiziert werden. Obwohl die Luft-Rad-Bioreaktor, in diesem Video gezeigt, in der Lage, alle drei Arten von Zellen wachsen, wird dieses Video Verwendung des Bioreaktors zur Verankerung abhängigen Zellen auf Mikroträgern wachsen zu demonstrieren. Wobei die Zellen selbst sind das Produkt - verankerungsabhängigen Säugetierzellen können zum Zwecke der Herstellung von mehr Zellen gezüchtet werden. Beispielsweise menschlichem Knochenmark abgeleiteten mesenchymalen Stammzellen werden zur Zeit mit dem Zweck der Ernte der Zellen und deren Injektion in die erkrankte Gewebe kultiviert. Der pneumatische Bioreaktor in diesem Video gezeigt hat für die Herstellung solcher mesenchymaler Stammzellen für diese Anwendung als geeignet erwiesen (Serra et al., Persönliche Mitteilung, 2013). Anchorage dependent Säugetierzellen werden in der Regel gewachsen kleinen Maßstab in 2D Kulturgefäße wie Zellkulturplatten, Zellkulturflaschen oder Rollerflaschen, wo sie auf eine speziell behandelte Oberfläche 1 Wachstum zu halten. Wenn mehrere Zellen erwünscht sind, können die Platten oder Flaschen durch Verwendung von mehr oder größere Gefäße erweitert werden. Aber für kostengünstigere Kultivierung großer Mengen von verankerungsabhängigen Zellen, wodurch die Oberfläche für die Zellanheftung kann mit kleinen festen Kügelchen genannte Mikroträgern durchgeführt werden. In Abhängigkeit von den Bindungsmerkmalen der Zelle gibt verschiedene Arten von Mikroträger im Handel erhältlich, wie Dextran, ein Peptid oder Kollagen beschichtet ist. Mikroträger haben eine große Oberfläche im Verhältnis zum Volumen bietet eine größere Fläche für das Zellwachstum; und die Mikroträger in Suspension unter Rühren, das die Zellen zu hohen Dichten in Bioreaktorsystemen 2 kultiviert werden können beibehalten werden. Derzeit sind die Arten von bioreactors wo adhärenten Zellen auf Mikroträgern gewachsen sind Spinnerflaschen und Rührkessel-Systeme, die axiale Laufräder verwenden, um Aussetzung der Zelle resistenten Mikrounternehmen zu erhalten. Mehrere Faktoren sind wichtig für die erfolgreiche Kultivierung von Zellen, einschließlich der Sauerstoffspannung, Scherspannung, Oberflächenmatrix und Nährstoff-und Metabolit-Konzentrationen. Die Verwendung von Bioreaktoren ermöglicht die Echtzeitüberwachung der Wachstumsbedingungen und der Potential signifikant niedrigeren Produktionskosten 1. Es gibt verschiedene Designs Bioreaktor für in-vitro-Zellkultivierung einschließlich gerührten Suspension, rotierenden Wandgefäß, Hohlfaser-, Beutel-Bioreaktor auf einer Wippe Plattform und Wirbelschichtsysteme 3. Viele dieser Systeme präsentieren einzigartige Probleme für die Zellkultivierung und skalieren -up, wie hohe Kosten, Nährstoff Konzentrationsgradienten, hydrodynamische Scher, Zellaggregation und Schwierigkeiten bei der Probennahme, Überwachung und Steuerung cell Scale-up. Verschiedene adhärenten Zelllinien sind in der Herstellung von Viren, entweder bei der Herstellung von viralen Impfstoffen oder zur Herstellung viraler Vektoren für die Gentherapie-Anwendungen verwendet. In diesem Video mit dem einmaligen Gebrauch pneumatische (Luft-Rad) Bioreaktorsystem, zeigen wir die Kultur der Menschenlungenkarzinomzellen (A549) Zellen auf Mikroträgern für die Produktion eines onkolytischen Adenoviren. Der pneumatische Bioreaktor Design verwendet eine vertikale Bewegung Rad, das durch den Auftrieb des Gases in dem Boden des Bioreaktors gespült angetrieben wird. Diese sanfte Methode begrenzt Rühren hydrodynamische Scherkräfte, aber immer noch gewährleistet eine optimale Medium und Zell Mischen von 4. Im Vergleich zum Rührkessel, hat die pneumatische Reaktor geringer Wandschubspannung auch bei hoher Lautstärke Air-Rad-Bioreaktorsystemen (Abbildung 1). Im Gegensatz zu Rührkesselreaktoren, wird die vertikale Laufrad dieser einmaligen Gebrauch Reaktor durch einen Strom von Gasblasen innerhalb gedrehtDas Schiff, das für die schonende und gleichmäßige Durchmischung Medium (Abbildung 2) ermöglicht.

<table><tbody><tr><td>PBS 3&nbsp;</td><td>PBS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Single Use Assembly</td><td>PBS Humane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lungenkarzinomzellen (A549)</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose Medium</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Rinderserum</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA, 0,25 %</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Cytodex 1 Microcarrier</td><td>GE</td><td>3781</td><td></td></tr><tr><td>Antischaum C</td><td>Sigma</td><td>A8011</td><td></td></tr></tbody></table>

anbau von säugetierzellen mit einem einweg-bioreaktorsystem pneumatische

Cultivation of Mammalian Cells Using a Single-use Pneumatic Bioreactor System

Jüngste Fortschritte in der Kultivierung und dem Scale-up von Säugetieren, Insekten und Stammzellen haben enorme Möglichkeiten für neue Therapeutika und Innovationen in der personalisierten Medizin geschaffen. Um diese Fortschritte in therapeutische Anwendungen umzusetzen, sind jedoch In-vitro-Systeme erforderlich, die robuste, flexible und kostengünstige Bioreaktorsysteme ermöglichen. Es gibt mehrere Bioreaktorsysteme, die derzeit in der Forschung und im kommerziellen Umfeld eingesetzt werden. Viele dieser Systeme sind jedoch nicht optimal für die Etablierung, Erweiterung und Überwachung des Wachstums verschiedener Zelltypen. Zu den Kulturparametern, die in diesen Systemen am schwierigsten zu kontrollieren sind, gehören die Minimierung der hydrodynamischen Scherung, die Verhinderung der Bildung von Nährstoffgradienten, die Etablierung einer gleichmäßigen Belüftung des Kulturmediums, die Verhinderung mikrobieller Kontamination sowie die Überwachung und Anpassung der Kulturbedingungen in Echtzeit. Anhand eines pneumatischen Einweg-Bioreaktorsystems demonstrieren wir den Zusammenbau und Betrieb dieses neuartigen Bioreaktors für Säugetierzellen, die auf Mikrocarriern gezüchtet werden. Dieses Bioreaktorsystem beseitigt viele der Herausforderungen, die mit den derzeit verfügbaren Systemen verbunden sind, indem es die Bildung von hydrodynamischer Scherung und Nährstoffgradienten minimiert und eine gleichmäßige Belüftung des Kulturmediums ermöglicht. Darüber hinaus ermöglicht die Software des Bioreaktors die Echtzeit-Fernüberwachung und die Anpassung der Betriebsparameter des Bioreaktors. Dieses Bioreaktorsystem hat auch ein enormes Potenzial für das Scale-up von adhärenten und suspensionsbasierten Säugetierzellen für die Produktion einer Vielzahl von therapeutischen Proteinen, monoklonalen Antikörpern, Stammzellen, Biosimilars und Impfstoffen.

In Abbildung 3 sind die Parameter für die Auslösung der Bioreaktorlauf gezeigt. Diese Abbildung zeigt den Bildschirm vor der Einstellung der Parameter Temperatur, Sauerstoffgehalt, pH-Wert und Agitation. Nachdem die Parameter festgelegt sind, werden die Laufparameter kontinuierlich überwacht und Einstellungen vorgenommen, um die erforderlichen Bedingungen aufrecht zu erhalten. Die Software erzeugt einen kontinuierlichen Anzeige, die für die einfache Identifizierung von Problemen ermöglicht. In diesem Experiment wurde unter Verwendung von 2,5 l DMEM mit 10% FBS, 250 ppm SAFC Anti-Schaum-C, 2 mM L-Glutamin und 3 g / l Mikroträger wird das System stabilisiert, so dass die Prozent Sauerstoff beträgt 50%, die Temperatur 37 ° C, und der pH-Wert beträgt 7,2. Der Reaktor wird mit A549-Zellen bei einer Konzentration von 7 x 10 4 Zellen / ml (oder 10 Zellen / Mikroträger) inokuliert. Die für diese Ausführung gewählten Parameter führte bei der Mehrzahl der Zellen innerhalb von 2 h (4) haften, um die Mikroträger. Nach 12 Stunden sind die Zellen Dämonentrier Zeichen der Abflachung und Ausbreitung auf der Mikroträgeroberfläche (5). Um 24 h, haben Mikroträger eine relativ gleichmäßige Verteilung der Zellen, ohne Mikro-Träger ohne Zellen und ohne große Klumpen von Zellen auf den Mikroträgern (Abbildung 6). Der Anteil der Mikroträger Kolonisierung durch A549-Zellen 75% bis 24 h und anschließend 90% (Figur 7). Die Zellen weiterhin exponentiell zu ca. 1 Million Zellen / ml nach 48 Stunden (Figur 8) wachsen. Nach Infektion mit einer Dosis von onkolytische Adenovirus (2 x 10 8 Virionen / ml) bei 50 Stunden, erhöht sich die Dichte auf 1,2 Millionen Zellen / ml und begann dann zu verringern, wie die lytische Infektion fortgeschritten ist. Es war ~ 10.000-fach Verstärkung des viralen Impfstoff. In vorherigen Experimenten haben wir festgestellt, dass die Überwachung und Anpassung Gasstrom ist für die Maximierung des Zellwachstums (unveröffentlichte Daten). Schnell wachsende Zellen können das System mit Sauerstoff abzureichern die DO-Ebene zu Null abgesenkt. Während die Zellen weiter zu wachsen, war es bei einer viel langsameren Geschwindigkeit. Es ist wichtig, Überwachung und Anpassung der Sauerstofffluss, um die Zell Anforderungen während der logarithmischen Wachstumsphase zu erfüllen. Jeder Lauf kann für ein optimales Wachstum durch den Vergleich der pH-Wert, DO und Temperatur mit täglichen Zellzahlen analysiert werden. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig1highres.jpg"> Abbildung 1. Fluiddynamik des Pneumatik-Bioreaktorsystem (PBS), verglichen mit einem Rührkessel-Bioreaktor Messung der Wandscherkräfte an verschiedenen Reaktorvolumen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig2highres.jpg"> Abbildung 2. Pneumatische Air-Rad-Reaktor Laufrad. 52008 / 52008fig3highres.jpg "/&gt; Abbildung 3. Pneumatische Luft Rad Software Screenshot von Parametern, den Bioreaktor Lauf zu initiieren. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg"> Abbildung 4. Micro-Träger Besiedlung mit A549-Zellen 2 h nach der Inokulation. (Durchschnittliche Mikroträger Durchmesser ~ 180 um.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig4highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig5highres.jpg"> Figur 5. 12 Stunden nach der Initiation der Kultur werden die Zellen A549 Anbringen Abflachung und Verteilen auf den Mikroträgern.5highres.jpg "target =" _blank "&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg"> Abbildung 6. Micro-Träger mit den Zellen nach 24 h in Kultur beschichtet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52008/52008fig6highres.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig7highres.jpg"> Abbildung 7. Prozentualer Anteil der Mikroträger Kolonisierung durch A549-Zellen nach der Inokulation. <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/52008/52008fig8highres.jpg"> Abbildung 8. Die Anzahl der lebensfähigen A549-Zellen in Kultur vor und nach Infektion mit adenoviruns. Beachten Sie, dass die Virusinfektion Schritt erfolgte bei 50 Stunden.

Mit einem pneumatischen Bioreaktor demonstrieren wir den Aufbau, den Betrieb und die Leistung dieses Einweg-Bioreaktorsystems für das Wachstum von Säugetierzellen.

Anbau von Säugetierzellen mit einem Einweg-Bioreaktorsystem Pneumatische

Recent advances in mammalian, insect, and stem cell cultivation and scale-up have created tremendous opportunities for new therapeutics and personalized ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, große Mengen an Säugetierzellen zu züchten. Dies wird erreicht, indem zuerst der pH-Wert und der gelöste Sauerstoff kalibriert oder Sonden verwendet werden, und dann der pH-Wert, die Sonden und die Temperatursondenhülse autoklaviert werden. Der zweite Schritt besteht darin, die Sonden und die Hülse in den Behälter einzuführen und den Behälter auf dem Bioreaktor zu positionieren sowie die Abluft, den Filter, die Gasleitungen und den Temperaturfühler anzuschließen.Der nächste Schritt besteht darin, die DO- und pH-Kabel anzuschließen und das Medium und die Mikroträger, die in den Bioreaktor gepumpt werden, aseptisch zu verbinden. Der letzte Schritt besteht darin, die Regler zu starten, um sicherzustellen, dass der Bioreaktor die gewünschte Laufraddrehzahl, Temperatur und Sauerstoffsättigung erreicht. Letztendlich kann die Kultur nach der Inokulation und Computerüberwachung für die Extraktion und Reinigung des gewünschten Produkts aufbereitet werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem wiederverwendbaren Rührkessel-Bioreaktor besteht darin, dass der Luftrad-Bioreaktor einfach zu bedienen ist und das Risiko einer mikrobiellen Kontamination minimiert. Fangen wir an. Um das Protokoll zu starten, melden Sie sich beim Hallo-Bildschirm an.Überprüfen Sie als Nächstes den pH-Sensor und vergewissern Sie sich, dass die Sensorspitze mit Elektrolytlösung gefüllt ist. Besorgen Sie sich ein Becherglas mit pH-4-Lösung, ein weiteres Becherglas mit pH-7-Lösung und eine Waschflasche mit destilliertem Wasser. Verbinden Sie dann das pH-Kabel mit dem pH-Sensor.Navigieren Sie zur Registerkarte "Aktionen" in der Hallo-Schnittstelle, und wählen Sie "Kalibrieren" aus. Wählen Sie dann die Registerkarte PHA und die Zwei-Punkt-Kalibrierung aus. Geben Sie die Puffertemperatur in das Feld für die Temperatur der Kalibrierlösung ein.Platzieren Sie den Sensor in der zu kalibrierenden pH-Vier-Lösung. Geben Sie den Wert in das Nullfeld ein. Sobald sich das Diagramm stabilisiert hat, drücken, kalibrieren und spülen Sie den pH-Sensor mit destilliertem Wasser. Wiederholen Sie die Kalibrierung für pH sieben und speichern Sie die Einstellungen.Geben Sie den Pufferwert in das span-Feld ein und warten Sie, bis sich das Transplantat stabilisiert hat. Um mit gelöstem Sauerstoff zu beginnen oder eine Kalibrierung durchzuführen. Stellen Sie sicher, dass der DO-Sensor mehrere Stunden lang mit dem System verbunden und auf der Registerkarte "Kalibrierung" polarisiert wurde, und wählen Sie DOA und Zweipunktkalibrierung aus.Trennen Sie den DO-Sensor. Geben Sie Null in die Registerkarte Null ein und warten Sie, bis sich das Diagramm stabilisiert hat. Bevor Sie "Kalibrieren" auswählen, schließen Sie den do-Sensor wieder an und geben Sie 100 in das Span-Feld ein.Wenn sich das Diagramm stabilisiert hat, klicken Sie auf Zwei kalibrieren. Speichern Sie anschließend die Einstellungen und schließen Sie das Programm. Legen Sie nach der Kalibrierung die Sensoren und die Thermomulde in Autoklavenbeutel und autoklavieren Sie diese 30 Minuten lang bei 121 Grad Celsius und 15 PSI.Nachdem der Autoklav fertig ist, desinfizieren Sie die Autoklavenbeutel mit 70%igem Isopropylalkohol und überführen Sie die Beutel in eine biologische Sicherheitswerkbank oder BSC. Desinfizieren Sie das Reagenzgefäß und führen Sie es in das BSC ein. Entfernen Sie die Innenverpackung und überprüfen Sie das Gefäß und die Schläuche auf Beschädigungen.Installieren Sie als Nächstes den DO-Sensor in der vorderen linken Öffnung des Reagenzgefäßes und die Thermovertiefung in der hinteren linken Öffnung. Setzen Sie den pH-Sensor in den rechten vorderen Anschluss ein, um ihn zu installieren. Öffnen Sie die Sensorkappe und schrauben Sie den Sensor leicht in die Öffnung an der Oberseite des Behälters ein.Übertragen Sie dann das Gefäß aus dem BSC. Stellen Sie sicher, dass sich die Kabel des pH- und DO-Sensors außerhalb der Behälterhülse befinden und sich nichts in der Hülse befindet. Halten Sie das Gefäß so, dass Sie nach vorne schauen, und schieben Sie das Gefäß mit den Füßen voran in die Hülle.Stellen Sie sicher, dass der Boden des Gefäßes auf den Heizungen aufliegt. Setzen Sie dann den Temperatursensor vorsichtig in das thermische Gefäß ein. Brunnen. Nehmen Sie anschließend die Schlauchsets aus dem Beutel.Stimmen Sie die Farbcodierung auf dem Schlauch mit den entsprechenden Anschlüssen und Pumpen an der Bioreaktorsteuerung ab. Verlegen Sie die Medienzugabe- und Probenahmeleitungen hinter dem DO-Sensor und der Thermik. Führen Sie den Schlauch in die farbcodierte Pumpe auf der linken Seite des Bioreaktors ein.Verbinden Sie die Haupt- und die Mikrogasleitung. Drücken Sie den Hauptanschluss der Gasleitung in den Gasauslass, um die Hauptgasleitung zu installieren. Drehen Sie dann den Mikrogasleitungsstecker im Uhrzeigersinn in seinen Gasauslass So installieren Sie die Mikrogasleitung.Um den Schlauch des Filterofens zu installieren, öffnen Sie den Filterofen und befestigen Sie den Abluftfilterschlauch am Schlauch. Stellen Sie sicher, dass der Schlauch durch die beiden Haken zum Filter und aus dem Ofen führt. Führen Sie die untere Linie durch den Haken am Boden des Filterofens und schließen Sie die Tür.Verbinden Sie dann die Kabel mit den DO- und pH-Sensoren. Stellen Sie nach Abschluss der Installation mit Hilfe von Köderanschlüssen eine sterile Verbindung zwischen einer unbenutzten Leitung der mittleren Auflage und der Quelle des mittelgroßen Flaschenbeutels her. Navigieren Sie zur Registerkarte "Aktionen" auf der Hello-Oberfläche.Klicken Sie auf Pumpen steuern, wählen Sie Medienpumpe aus und klicken Sie auf den Schieberegler, um die Medienpumpe zu aktivieren. Fügen Sie dann 1,5 bis 3,0 Liter Medium hinzu und klicken Sie auf den Schieberegler, um die Pumpe auszuschalten. Die Anlage ist nun bereit, zuvor vorbereitete Microcarrier in den Reaktor zu pumpen.Diese können über eine Additionszeile hinzugefügt werden. Befestigen Sie die MICROCAR-Flasche mit einem sterilen Köderverschluss an der entsprechenden Zuführleine. Schalten Sie die Zusatzpumpe im Bildschirm der Steuerpumpe ein.Schalten Sie nach dem Hinzufügen der Mikroträger die Pumpe mit dem Schieberegler aus, navigieren Sie zurück zum Hauptbildschirm auf der Hallo-Oberfläche, wählen Sie Aktionen und dann Erweitert. Wählen Sie den entsprechenden Controller aus, um die Einstellungen zu bearbeiten. Stellen Sie die Regler auf Auto und geben Sie die Sollwerte ein.Schalten Sie nach dem Einstellen der Regler die Luftpumpe ein. Schauen Sie in das Reagenzgefäß, um sicherzustellen, dass sich das Luftrad dreht. Stellen Sie sicher, dass der DO-Sensor vollständig polarisiert ist und dass sich der DO-Wert stabilisiert hat.Kalibrieren Sie dann die Do-Sensor-Form, eine sterile Verbindung zwischen einer unbenutzten Medienzugabeleitung, die durch eine orangefarbene Bande gekennzeichnet ist, und der Quelle des Zellflaschenbeutels unter Verwendung von Köderanschlüssen. Installieren Sie als Nächstes den Silikonabschnitt des Schlauchs in der Medienpumpe. Stellen Sie sicher, dass die Schlauchschelle geöffnet und die verzweigte Schlauchschelle geschlossen ist.Navigieren Sie zur Registerkarte Steuerpumpe und schalten Sie die Medienpumpe ein. Fügen Sie die Zellen hinzu und schalten Sie die Medienpumpe aus. Navigieren Sie nach der Impfung zur Registerkarte "Aktionen" und wählen Sie "Probe entnehmen" aus.Stellen Sie sicher, dass sich der Probenahmeschlauch in der Probenahmepumpe befindet, und manipulieren Sie den Probenahmehahn gemäß den Anweisungen auf dem Bildschirm. Entfernen Sie die Spritze mit der Probe für die Zellzählung und andere nachgelagerte Anwendungen, um Zellzählungen durchzuführen. Schließlich, wenn die Zellen die gewünschte Dichte von 1,2 mal 10 zu den sechs Zellen pro Milliliter erreicht haben, gibt man das Virus-Inokulum septisch in eine 20-Milliliter-Spritze.Schließen Sie die Spritze an eine Ersatzzugabe am Reaktor an. Verwenden Sie den Bildschirm der Steuerpumpe, um die Zusatzpumpe einzuschalten und das Virus-Inokulum hinzuzufügen. Die Mehrzahl der A 5 49 Zellen haftete innerhalb von zwei Stunden an den Mikrocarriern.Nach 12 Stunden zeigten die Zellen Anzeichen von Abflachung und Ausbreitung auf der Oberfläche des Mikroautos. Nach 24 Stunden zeigten die Mikrocarrier eine gleichmäßige Verteilung der Zellen. Die Besiedlung mit Mikroautos geschieht schnell, wie hier gezeigt.Der prozentuale Anteil der Mikrocar-Besiedlung durch 54 9 Zellen beträgt 75% nach 24 Stunden. Diese Grafik zeigt die Anzahl lebensfähiger 54 bis 9 Zellen in Kultur vor und nach der Infektion mit dem Adenovirus. Die Zellen wachsen nach 48 Stunden exponentiell weiter auf 1 Million Zellen pro Milliliter.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen Luftrad-Bioreaktor zusammenbauen und betreiben, um Säugetierzellen mit hoher Dichte für die Zell- oder Proteinproduktion zu züchten. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.

cultivation-mammalian-cells-using-single-use-pneumatic-bioreactor

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir beschreiben eine Chip-basierte Plattform für die dreidimensionale Kultivierung von Zellen in Mikro-Bioreaktoren. Ein Chip kann bis zu 10 Mio. Zellen, die unter genau definierten Bedingungen im Hinblick auf die Strömung, Sauerstoffspannung etc. in einem sterilen, geschlossenen Kreislauf kultiviert werden können.

Chip-basierte dreidimensionale Zellkultur in perfundierten Micro-Bioreaktoren

Unsere Gruppe hat einen Bioreaktor Kultur-System, das die physiologische pulsatile Belastungen des Herz-Kreislauf-System, um implantierbare kleinem Durchmesser Gefäßprothesen regenerieren imitiert entwickelt.

Engineering Biological-Based Gefäßprothesen Mit einem Pulsatile Bioreaktor

In diesem Protokoll wird die Herstellung, der Aufbau und die grundlegende Bedienung eines mikrofluidischen Pikoliter-Bioreaktors (PLBR) für die Einzelzellanalyse von prokaryotischen Mikroorganismen vorgestellt. Industriell relevante Mikroorganismen wurden als Proof of Principle analysiert, was Einblicke in die Wachstumsrate, Morphologie und phänotypische Heterogenität über bestimmte Zeiträume ermöglicht, was mit herkömmlichen Methoden kaum möglich ist.

Mikrofluidischer Picoliter-Bioreaktor für die mikrobielle Einzelzellanalyse: Herstellung, Systemaufbau und Betrieb

Wir haben eine automatisierte Zellkultur und Verhör Plattform für Mikro-Skala-Zell-Stimulation Experimente entwickelt. Die Plattform bietet eine einfache, vielseitige und präzise Kontrolle in den Anbau und die Förderung kleiner Populationen von Zellen und Gewinnen Lysate für molekulare Analysen. Die Plattform wird auch auf Studien, die kostbaren Zellen und / oder Reagenzien geeignet.

Eine vielseitige automatisierte Plattform für Mikro-Skala Handy Stimulation Experimente

Die Nährstoffregulierung durch kontinuierliche, wachstumsangepasste Fütterung verbessert die Wachstumsraten von Säugetierzell-Sphäroiden im Vergleich zur intermittierenden Chargenfütterung für Kulturen in gerührten Suspensionsbioreaktoren.  Diese Studie zeigt die Methoden, die für die Etablierung einfacher Kulturen mit angepasstem Zinssatz erforderlich sind.

Nährstoff Verordnung durch kontinuierliche Zufuhr für eine groß angelegte Expansion von Mammalian Cells in Sphäroiden

Das funktionale Verhalten der Zellen in Kultur können -ähnlichen 3-dimensional Kulturumgebungen 16-21 in mehr in vivo durch Züchten verbessert werden. Dieses Manuskript beschreibt den Aufbau und den Betrieb eines Hohlfaser - Bioreaktor - System für In - vivo - -ähnlichen Säugetiergewebekultur.

Hohlfaser-Bioreaktoren für<em&gt; In Vivo</em&gt; -ähnlichen Mammalian Gewebekultur

Ein detailliertes Protokoll für den gleichzeitigen Betrieb von 48 parallel Zellkulturen unter unterschiedlichen Bedingungen in einem Microbioreactor-System wird vorgestellt. Zellprozess Kultur, Ernte und anschließende Antikörper-Titer Analyse werden beschrieben.

Einsatz von Hochdurchsatz-automatisierte Microbioreactor-System für die Produktion des Modells IgG1 in CHO-Zellen

Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren zur Ausführung eines Experimentsentwurfs in einem automatisierten Mikrobioreaktor vor, gefolgt von der Zellernte und der Proteinquantifizierung mit einer Protein-A-Säule.

Prozessoptimierung mit automatisierten Mikro-Bioreaktoren mit hohem Durchsatz in der chinesischen Hamster-Ovarialzell-Kultivierung

Wir stellen hier eine Methode vor, die die Verwendung von chemischer epigenetischer Auslöschung mit mechanosensing-bezogenen Hinweisen kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren effizient zu erzeugen, ohne dass Gentransfektion oder retrovirale Vektoren erforderlich sind. Diese Strategie ist daher vielversprechend für die translationale Medizin und stellt einen bemerkenswerten Fortschritt in der Stammzellorganoidtechnologie dar.

Eine zweistufige Strategie, die epigenetische Modifikation und biomechanische Hinweise kombiniert, um pluripotente Zellen von Säugetieren zu erzeugen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, um die Herstellung von adhärenten Zellen in großem Maßstab durch ein vollständig geschlossenes System auf der Basis von auflösbaren Mikroträgern in GMP-Qualität zu erreichen. Die Kultivierung von humanen mesenchymalen Stammzellen, HEK293T Zellen und Vero-Zellen wurde validiert und erfüllte sowohl die Quantitätsanforderungen als auch die Qualitätskriterien für die Zell- und Gentherapieindustrie.

Großtechnische Zellproduktion auf Basis von auflösbaren porösen Mikroträgern in GMP-Qualität

Dieses Protokoll beschreibt, wie das Einzelzell-Mikroliter-Tröpfchen-Kultur-Omics-System (MISS-Zelle) verwendet wird, um die mikrobielle monoklonale Isolierung, Kultivierung und Entnahme durchzuführen. Die MISS-Zelle erreicht einen integrierten Arbeitsablauf auf der Grundlage der Tröpfchen-Mikrofluidik-Technologie, die eine hervorragende Tröpfchen-Monodispersität, eine hohe parallele Kultivierung und einen Hochdurchsatz-Biomassenachweis bietet.

Automatisierte mikrobielle monoklonale Kultivierung und Ernte mit hohem Durchsatz mit dem Einzelzell-Mikroliter-Tröpfchen-Kultur-Omics-System

Lernen Sie den Anbau von Säugetierzellen mit einem pneumatischen Einweg-Bioreaktor. Diese Methode zeigt Kalibrierung, Montage und Betrieb für kontrollierte Zellkultur mit minimalem Kontaminationsrisiko.

Anbau von Säugetierzellen mit einem Einweg-Bioreaktorsystem Pneumatische

Weitere Videos entdecken