Name: A Guide to Modern Quantitative Fluoreszenz Western Blot mit Strategien zur Fehlersuche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-20T16:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Lernen Sie die quantitative Fluoreszenz-Western-Blot-Methode zur sensitiven Proteindetektion in verschiedenen Geweben. Diese Technik ermöglicht präzise Quantifizierung mit hoher Reproduzierbarkeit für die biomedizinische Forschung.

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Wir würden dank mag die folgenden für die finanzielle Unterstützung: BBSRC Institut Strategische Programmfinanzierung - CF &amp; TMW; BBSRC East Bio DTP Finanzierung - LG; Die Darwin Trust of Edinburgh - MLH. Wir möchten auch an Dr. Barry McColl für die Erlaubnis, die TREM2 Optimierung in diesem Manuskript gehören danken.

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Berücksichtigung und Planung ist wichtig vor jeder Experiment und kann letztlich bestimmen den Erfolg der verwendeten Technik. Die Fortschritte in Proteindetektion mit WB kann eine Fülle von potenziellen Stolpersteine ​​darstellen, wenn sie versuchen zu entscheiden, die entsprechenden Antikörper, Transfer und Visualisierungsmethoden zu bedienen. Glücklicherweise mit einer sorgfältigen Checkliste und geeignete Kontrollmaßnahmen QFWB kann routinemäßig verwendet werden, um die Protein Präsenz und immer subtiler Expressionsunterschiede zwischen den Proben zu bestimmen. Dieses Protokoll bietet einen umfassenden Leitfaden für fluoreszierende quantitativen Western Blot sowie ein paar Fehlersuchstrategien zur Vermeidung und / oder zu überwinden einige der vielen Fallstricke mit ihm verbunden. Die kritischen Schritte verwendet, um die Empfindlichkeit zu erhalten und zu erhalten wirklich quantifizierbare und vergleichbare Messungen umfassen: 1) robuste Proteinextraktion aus Gewebeproben; 2) Probenvorbereitung; 3) genaue Protein loading bestimmt durch die Gesamtproteinanalyse; 4) eine optimale Übertragung von Proteinen unter Verwendung von I-Blot; 5) Herstellung von primären und sekundären Antikörper in Blockierungspuffer, enthaltend 0,1% Tween 20, und 6) richtige Visualisierung und Analyse unter Verwendung eines Infrarot-Bildwandler und der zugehörigen Software. Infrarot-Fluoreszenzdetektion ist wirklich quantitative und bietet eine höhere Empfindlichkeit gegenüber traditionelleren ECL-Nachweistechniken 3,11. Dieses Erfassungssystem ist mit mehreren Facetten, und als solche ist nicht auf QFWB beschränkt. Dieses System ist in der Lage Bildgebung von immunhistologischen Kennzeichnung bei niedriger Leistung ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung der gesamten Gewebeabschnitte 12. Dies ist ein Bereich von möglichen zukünftigen Entwicklung hinsichtlich der Auflösung, die weit roten Bildgebung sehen konnte rivalisierenden herkömmlichen Immunfluoreszenz Capturing mit herkömmlichen Mikroskopen im Hinblick auf quantitative Bewertung. Jedoch mit größerer Empfindlichkeit, um feine Änderungen in protein Ausdruck es entscheidend, Variabilität zu gewährleisten wird auf ein Minimum und Kontrollmaßnahmen gehalten sind streng mit robuster Protokolle. Dies beginnt mit strengen Proteinextraktion aus der Gewebeprobe, gefolgt von Produktion von Gesamtprotein gefärbten Gelen die Gewähr zu bieten, dass der Probenbeladung ist einheitlich, Optimierung der Primär- und Sekundärantikörper, um festzustellen, ob Erkennung ist real und Richtlinien des Herstellers testen bezüglich übertragen Zeiten, um eine effiziente Proteintransfer erhalten. Dennoch, auch wenn die Bedingungen für WB optimiert sind, kann es immer noch Probleme mit fließendem Western, die hier nicht vollständig erforscht worden sind, können assoziiert. Diese umfassen, sind aber nicht auf Faktoren einschließlich Protein Solubilisierung und Wahl der Extraktionspuffer begrenzt. Einige Puffer mit Proteinkonzentration Assays stören und einige Gewebe sind besonders schwierig zu solubilisieren, erfordern robustere Techniken wie die Verwendung von automatisierten macerating verschlossenen Behältnissen wie M Rohre zusammen mit einem Macs Dissociator. Zusätzlich können einfache Maßnahmen zur Kontrolle der Speicherung von nicht-extrahierten und extrahierten Materials bei -80 ° C der Unterschied zwischen den Erhalt optimaler Kennzeichnung direkt nach der Extraktion und mit schlechten Ergebnissen Wochen später. Moderne QFWB Methoden sind nachweislich für die Erfassung feine Unterschiede in der Proteinexpression empfindlicher zu sein und sind vielseitiger die gleichzeitige Doppelmarkierungen 3 im Vergleich zu älteren Techniken wie ECL. Es ist lebenswichtig, dass Western-Blot-Protokolle sind robust und leicht wiederholbaren für genaue Quantifizierung und statistische Analyse. Dieses Protokoll ist empfindlich und robust genug ist, um routinemäßig für den Nachweis von Proteinen in einer Vielzahl von verschiedenen Gewebeproben und 3 Arten verwendet werden und ermöglicht die Quantifizierung von niedrigen und hohen Fülle Proteine ​​innerhalb derselben QFWB daher reduziert Verbrauchs Nutzung sowie Zeit pro Experiment 1. 1 Darüber hinaus ist die erhöhte Empfindlichkeit dieser Technik ermöglicht die Validierung von immer beliebter - schaftlichen Studien 9,14 aber Genauigkeit ist entscheidend und Aufnahme geeigneter Kontrollmaßnahmen müssen eingehalten werden, um dadurch eine fehlerhafte Datenerfassung vermieden.

Western Blot (WB) ist eine analytische Technik, die ursprünglich in den späten 1970er Jahren entwickelt, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Proteins von Interesse in einer komplexen biologischen Probe zu bestimmen, wie ein Gewebe-Homogenat 1. Gemeinhin als Protein Immunoblot bezeichnet, aufgrund der Schlüssel Antikörper-Antigen-Wechselwirkung, die Methode besteht aus 5 Einzelschritten: 1) elektrophoretische Trennung der Proteine ​​nach ihrem isoelektrischen Punkt; 2) Übertragung auf eine Nitrocellulose oder Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membran; 3) Markieren mit einem primären Antikörper, der spezifisch an das Protein von Interesse; 4) Inkubation mit einem gegen den primären Antikörper gerichtet sekundären Antikörper; und 5) Visualisierung. Visualisierung Methodik wurde mit der Zeit, um die Sicherheit und die Empfindlichkeit zu verbessern entwickelt. Einige der ersten WB wurden mit radioaktiv markierten Tags, die dann fortgeschritten, kolorimetrische und dann die weitere Verbreitung chemilluminescent (ECL) Verfahren durchgeführt. Radioactivity wurde direkt auf Sonden für spezifische Antigene markiert und ECL wohin kolorimetrische Methoden verwenden eine indirekte Markierungstechnik mit einem Enzym-Reporter, wie alkalische Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase-Streptavidin (HRP) 2. Die Intensität der Markierung des Chromagen oder lumineszierende Produkt wird mit Densitometrie, wobei die Signalstärke, stark oder schwach, zeigt mehr oder weniger das Vorhandensein des Proteins von Interesse in der Probe gemessen. ECL ist die empfindlicher und daher favorisierte Methode 2, aber alle drei Verfahren wurden zunächst auf einem Röntgenfilm mit anspruchsvolleren digitalen bildgebenden Verfahren nachträglich herausstellt, 3 entwickelt. Die Weiterentwicklung der digitalen Abbildung von WB nicht nur erlaubt, einen Forscher, um die Anwesenheit oder Abwesenheit der Protein von Interesse zu bestimmen, sondern auch erlaubt einen Rückschluss auf das Niveau der Expression eines ausgewählten Proteins, als gegen andere Proben verglichen und daher bezeichnet als &quot;semi-quantitative &amp; #8221 ;. Kürzlich wurde ein wirklich quantitative und empfindlichere Western Blotting Technik entwickelt worden, die das Niveau der Fluoreszenz gemessen wird, direkt auf die Menge und die Expression eines einzelnen Proteins in einer Probe bezogen werden: quantitative Fluoreszenz Western Blot (QFWB). Beim Vergleich QFWB mit ECL Kennzeichnung, die Verwendung eines fluoreszierenden sekundären Antikörper erzeugt ein lineares Erfassungsprofil 4. Dies steht im Gegensatz zu ECL Techniken, bei denen Signallinearität tritt in der Regel mit niedrigen Proteinlasten unter 5 ug und Signalsättigung direkt auf Proteinexpression bezogen, dh mit ubiquitär exprimierten Housekeeping-Gene 5,6. Diese Ungleichheit wird wahrscheinlich durch eine höhere Anzahl von Bindungsstellen zur Verfügung für eine Avidin-ECL-Substrat, der einen biotinylierten sekundären binden, was zu einer höheren Wahrscheinlichkeit möglicher Signalsättigung verursacht. Dies ist einer der Hauptgründe für die ECL Basis Immunoblotting ist als ONL bezeichnety &quot;semi-quantitative&quot; 7. Der Sättigungspunkt des Signals ist von entscheidender Bedeutung bei der Messung von feinen Unterschieden in Expressionsniveaus und zu ungenauen Messungen führen. In den vergangenen Jahren das Aufkommen von verbreiteten Proteomiktechniken Detaillierung immer höheren Empfindlichkeit und Identifizierung von subtilen Expressionsunterschiede hat eine ständig zunehmende Abhängigkeit von wirklich quantitative Western-Blotting-Experimente zur Validierung 8,9 resultierte. Die Anwendung von empfindlichen, robust und wirklich quantitative Methodik ist daher von entscheidender Bedeutung. Viele &quot;optimiert&quot; Western-Blot-Methoden wurden von unabhängigen Labors, die häufig als schwierig erweisen aufgrund subtiler methodische Anpassungen, die nicht offensichtlich in der formalen dokumentierten Protokolle sein kann zum Einrichten oder replizieren genutzt. Dies ist eine etablierte und robustes Protokoll für QFWB und zusätzlich wertvolle Strategien für die Problembehandlung gemeinsame Probleme that kann bei der Umsetzung entstehen. Dieses Protokoll wurde ursprünglich zur Verwendung mit murinen Gehirnhomogenaten optimiert, aber seitdem effektiv über einen weiten Bereich von Gewebeproben und Arten 4,9,10 verwendet. Mögliche Protokollvarianten für spezifische Problembehandlung erforderlich sind, enthalten.

<table><tbody><tr><td>RIPA Puffer</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>10230544</td><td></td></tr><tr><td>M Röhrchen</td><td>Miltenyi Biotec Inc.</td><td>130-093-236</td><td></td></tr><tr><td>iBlot Transfer Stack, PVDF Regular</td><td>Life Technologies, Großbritannien</td><td>IB401001</td><td></td></tr><tr><td>MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)</td><td>Life Technologies, UK</td><td>LC5602</td><td>Verwendung in Gel 1 für Western Blotting</td></tr><tr><td>SeeBlue Vorgefärbtes Protein Standard</td><td>Life Technologies, UK</td><td>LC5625&nbsp;</td><td>Verwendung in Gel 2 Gesamtprotein gefärbtes Gel</td></tr><tr><td>NuPAge LDS Probenpuffer 4x</td><td>Life Technologies, UK</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MES SDS Laufpuffer (nur für Bis-Tris Gele) (20x)</td><td>Life Technologies, UK</td><td>NP0002</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1,0 mm, 12 Well</td><td>Life Technologies, UK</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat gepufferte Kochsalztablette</td><td>Sigma-Aldrich, UK</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Micro BCA, Protein Assay Kit</td><td>Fisher Scientific UK Ltd</td><td>10249133</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Blocking-Puffer</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>P/N 927-40000</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Ziege Anti-Kaninchen-IgG (H+L), 0,5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68071</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Donel Anti-Maus IgG (H+L), 0,5 mg&nbsp;</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-68072</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Ziege Anti-Kaninchen-IgG (H + L), 0,5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32211</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800CW Esel Anti-Ziegen-IgG (H + L), 0,5 mg</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td>926-32214</td><td></td></tr><tr><td>ODYSSEY CL Infrarot-Imager</td><td>Li-Cor Biosciences</td><td></td><td>Angebotsanfrage</td></tr><tr><td>iBlot 7-Minuten-Blotting-System</td><td>Life Technologies, Großbritannien</td><td></td><td>Dieses Modell wird nicht mehr hergestellt</td></tr><tr><td>InstantBlue Protein Färbung</td><td>Expedeon, UK</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>Revitablot Western Blot Stripping Puffer&nbsp;</td><td>Rockland Immunochemicals Inc.</td><td>Artikel-Nr.: MB-085-0050</td><td></td></tr></tbody></table>

a guide to modern quantitative fluoreszenz western blot mit strategien zur fehlersuche

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

Die Ende der 1970er Jahre sah die erste öffentlich berichtet Nutzung des Western-Blot, eine Technik für die Beurteilung des Vorliegens und relative Häufigkeit bestimmter Proteine ​​in komplexen biologischen Proben. Seitdem hat Western Blot Methode sich zu einem gemeinsamen Komponente des Molekularbiologen experimentellen Repertoire. Eine oberflächliche Suche in PubMed mit dem Begriff &quot;Western-Blot&quot; legt nahe, dass mehr als 220.000 veröffentlichten Manuskripte Verwendung dieser Technik bis zum Jahr 2014. Wichtig ist gemacht, haben die letzten zehn Jahre technische Bild Fortschritte gekoppelt mit der Entwicklung gesehen empfindlicher Fluoreszenzmarkierungen, die Empfindlichkeit verbessert und lieferte noch größere Bereiche der linearen Detektion. Das Ergebnis ist ein jetzt wirklich quantifizierbare Fluoreszenz Western Blot (QFWB), die Biologen die Durchführung vergleichender Expressionsanalyse mit größerer Empfindlichkeit und Genauigkeit als je zuvor ermöglicht. Viele &quot;optimiert&quot; Western-BlotMethoden existieren und werden in verschiedenen Laboratorien verwendet. Diese erweisen sich oft als schwierig zu implementieren aufgrund der Anforderung der subtilen, aber nicht dokumentierte Verfahrensänderungen. Dieses Protokoll stellt eine umfassende Beschreibung eines etablierten und robusten QFWB Verfahren, komplett mit Fehlersuchstrategien.

Als QFWB Empfindlichkeit und den linearen Bereich der Erfassung größer ist als herkömmliche ECL-Nachweis, gibt es eine Reihe von Kontrollmaßnahmen, die von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, daß genaue Daten gesammelt werden, wodurch eine effektive Auslegung unterstützt wird. Erstens die Aufnahme von positiven Kontrollproben, wie in 1 gezeigt ist. Zweitens, die Optimierung der Übertragung auf äquivalente Bewegung der hohen und niedrigen Molekulargewichts-Proteine ​​aus dem Gel auf die Membran zu gewährleisten, wie in Figur 2 gezeigt wird. Drittens, die Optimierung der Antikörper, insbesondere Sekundär Antikörper, deren Optimierung wird oft übersehen, die aber können unspezifische produzieren Banding in der Lage, sich störend auf korrekte Interpretation der Protein (e) von Interesse. Siehe 3. Viertens kann es auch der Fall sein, dass, wenn ein Protein scheint nicht nachweisbar, aber voraussichtlich anwesend zu sein, kann dies auch ein sekundärer Antikörper Frage, die durch die Verwendung eines sekundären rais korrigiert werden kannin einer anderen Spezies Host ed. Siehe 4. Fünftens ist die Gesamtproteinmarkierung und Analyse eine weitaus robuster und quantifizierbare Verfahren im Vergleich zu der Verwendung von herkömmlichen, Protein (e), die ubiquitär internen Referenzstandards 3 ausgedrückt werden. Viele dieser Einzelproteine ​​gefunden wurden differentiell in Modellen neurodegenerativer Erkrankungen sowie zwischen verschiedenen Gewebeproben ausgedrückt werden und die Gleichförmigkeit des Ausdrucks innerhalb des gleichen Gewebes 3 ändern. Daher wird die Produktion eines Ladesteuer Gel die Gleichförmigkeit der Probenbeladung zu bestätigen, wenn mit einer Gesamtproteinanalyse durch Vergleichen und Quantifizierung der Proteinbelastung in jeder Spur in verschiedenen Molekulargewichten im Bereich vor jedem Muster kombiniert werden, um Standard-Fehler anzuzeigen, wie in 6 gezeigt, . Wichtig ist, dass alle diese Techniken zur Fehlerbehebung und Kontrollen sind nur so effektiv wie die Sensitivität und Konsistenz der Analyse tools durch den Betreiber (5) aufgebracht wird. Schließlich eignet sich dieses Verfahren zum Abziehen und Wieder Sondieren von Membranen mit mehr Flexibilität als ECL aufgrund von Faktoren, einschließlich, aber nicht zu einer erhöhten Empfindlichkeit, verringert Hintergrund, dual Farberkennung und Membranstabilität unter Langzeitlagerungsbedingungen beschränkt. Siehe Abbildung 7.

Die Weiterentwicklung des Western Blotting mittels Fluoreszenz hat den Nachweis subtiler Veränderungen in der Proteinexpression ermöglicht, was quantitative Analysen ermöglicht. Hier beschreiben wir eine robuste Methodik zum Nachweis einer Reihe von Proteinen über eine Vielzahl von Spezies und Gewebetypen hinweg. Eine Strategie zur Überwindung häufiger technischer Probleme wird ebenfalls vorgestellt.

A Guide to Modern Quantitative Fluoreszenz Western Blot mit Strategien zur Fehlersuche

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

Ziel dieses Verfahrens ist es, die relative Häufigkeit spezifischer Proteine in einer komplexen biologischen Probe mittels quantitativem Fluoreszenztwist und Blotting zu detektieren und genau zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Proteinextrakte mit Hilfe eines vorgefertigten Gradientengels elektrofluoreszierend getrennt werden. Im zweiten Schritt wird die äquivalente Proteinbelastung über alle Probenbahnen hinweg durch Aufbringen einer Gesamtproteinfärbung verifiziert, und dann wird das Eye Block Semi-Dry Fast Transfer System verwendet, um die Proben auf die A-P-V-D-F-Membran zu übertragen.Schließlich werden die Proteine mit spezifischen Primärantikörpern untersucht, gefolgt von dem entsprechenden fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper, um ihre empfindliche, robuste und lineare Detektion bei infraroten und fernroten Wellenlängen zu erleichtern. Letztendlich kann die quantitative fluoreszierende westliche Blüte verwendet werden, um eine große Anzahl membrangebundener und löslicher Proteine über ein breites Spektrum von Gewebeproben reproduzierbar zu detektieren, zu visualisieren und genau zu quantifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der ECL-basierten Bildgebung besteht darin, dass sie eine höhere Empfindlichkeit mit verbesserter Präzision auf einer breiten linearen Skala für eine wirklich quantitative Auslesung ermöglicht. Beginnen Sie mit der manuellen Mazeration der Gewebeprobe, gefolgt von der Homogenisierung in frisch vorbereitetem Extraktionspuffer bei etwa einem bis 10 Gewebegewicht pro Puffervolumen, bis ein glattes, konsistentes Homogenat hergestellt wird.Als nächstes zentrifugieren Sie das Zelllysat 20 Minuten lang bei 20.000 mal G bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie dann das Sat mit den löslichen Proteinen in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie sowohl das Pellet als auch die S-Überstandsfraktion bei minus 80 Grad Celsius, bis es benötigt wird. Nach der Bestimmung der Proteinkonzentration des Supinats werden 15 Mikrogramm Protein pro Probe in neue Mikrozentrifugenröhrchen überführt.Bringen Sie dann das endgültige Volumen jeder Probe mit destilliertem Wasser auf 10 Mikroliter und fügen Sie fünf Mikroliter Forex-Ladepuffer hinzu. Rühren Sie die Zelllösungen gründlich durch Vortexen und erhitzen Sie die Proben dann zwei Minuten lang auf 98 Grad Celsius, um die Proteine zu denaturieren. Nach der Denaturierung werden drei Mikroliter eines geeigneten Molekulargewichtsstandards in die erste Vertiefung jedes der Versuchs- und Beladungskontrollgele gegeben.Laden Sie danach nach der Elektrophorese 10 Mikroliter jeder Probe in die entsprechenden nachfolgenden Vertiefungen. Verwenden Sie ein Gelmesser, um die Gele aus der Kassette zu lösen, und entfernen Sie die Vertiefungen und den Fuß des Gels. Markieren Sie das Gel, um die spätere Orientierung zu erleichtern.Um die äquivalente Proteinbelastung zu bestimmen, dekantieren Sie dann etwa 30 Milliliter Proteinfleck in eine quadratische Petrischale von 12 x 12 Zentimetern und legen Sie das Ladekontrollgel in den Fleck, wobei Sie sicherstellen, dass die Lösung das gesamte Gel bedeckt. Rühren Sie das Gel mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur vorsichtig um, entsorgen Sie dann den Proteinfleck und waschen Sie das Gel dreimal in destilliertem Wasser, bevor Sie den Augenblock sichtbar machen. Nach der Elektrophorese bereiten Sie den unteren Transferstapel vor, indem Sie die Folienabdeckung entfernen und die Membran direkt aus dem Geltank mit Laufpuffer vorbenetzen.Befeuchten Sie das Filterpapier zu diesem Zeitpunkt ebenfalls wieder mit destilliertem Wasser. Laschen Sie dann das experimentelle Gel auf den vorbereiteten unteren Transferstapel, legen Sie dann das Filterpapier aus der Vorarbeit über das Gel und rollen Sie beide so, dass keine Blasen zwischen den Schichten eingeschlossen werden. Legen Sie den oberen Stapel auf das Filterpapier und den unteren Stapel.Rollen Sie dann das Transferstapel-Sandwich, um Luftblasen zu entfernen. Legen Sie den Schwamm aus dem Transferstapel-Set auf das saugfähige Pad und platzieren Sie das Transferstapel-Sandwich an der dafür vorgesehenen Stelle. Schließen Sie dann den Deckel fest und starten Sie den I-Block zwei, indem Sie die Proteine sieben Minuten lang auf Programm drei übertragen.Wenn das Programm beendet ist, entfernen Sie den Transferstapel aus der Augenblockmaschine und ziehen Sie den oberen Transferstapel und die Filterpapierschichten ab, so dass das Gel auf dem unteren Transferstapel freigelegt wird. Verwenden Sie ein Skalpell, um das Gel zu schneiden, und achten Sie darauf, nach dem Membrantrimmen einen dreieckigen Schnitt zu Orientierungszwecken auf der Membran zu machen, um die Transfereffizienz des Proteinflecks zu überprüfen, das Gel, wie gerade demonstriert, und bewegen Sie dann die Membran schnell in ein sauberes 50-Milliliter-Röhrchen, das fünf Milliliter PBS für den ersten von drei enthält. Fünfminütige Wäschen auf einer mechanischen Walze. Nach dem dritten Waschen den Waschpuffer entsorgen und die Membran in unverdünntem Blockpuffer mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.Als nächstes inkubieren Sie die Membran in einem Primärantikörper, der in fünf Millilitern Blockierungspuffer und 0,1 zwischen 20 über Nacht bei vier Grad Celsius unter ständigem Rühren verdünnt ist. Waschen Sie die Membran am nächsten Morgen nach dem Verwerfen der primären Antikörperlösung sechsmal fünf Minuten lang in PBS, wie gerade gezeigt. Dann inkubieren Sie die Membran im Dunkeln mit einem fluoreszierenden, markierten Sekundärantikörper, der in fünf Millilitern Blockierungspuffer und 0,1 % zwischen 20 unter ständigem Rühren dilatiert wird, gefolgt von sechs fünfminütigen PBS-Waschungen für alle Bildgebungen.Melden Sie sich zunächst am Computer und Imager an. Öffnen Sie dann die Bildgebungssoftware, um den Western Blot abzubilden. Öffnen Sie zunächst den Deckel des Imagers und gießen Sie eine kleine Menge PBS auf das Glas.Platzieren Sie die Membran in der unteren linken Ecke des Imagers auf dem PBS und stellen Sie sicher, dass sie rechtwinklig zur Achse des Imagers steht und dass zwischen der Membran und der Gitterachse ein Abstand von einem Zentimeter verbleibt. Rollen Sie die Membran, um sicherzustellen, dass keine Blasen zwischen dem Glas und der Membran eingeschlossen sind, und zählen Sie dann die Anzahl der Quadrate, die die Membran auf der x- und y-Achse einnimmt. Schließen Sie anschließend den Deckel des Imagers und geben Sie die Anzahl der Quadrate in die Computersoftware ein.Wählen Sie den geeigneten Infrarotkanal und die entsprechende Intensität aus und starten Sie den Scan, um die Gesamtproteinfärbung des Ladekontrollgels zu visualisieren. Reparieren Sie das Gel und den Imager, wie gerade für die experimentelle Membran gezeigt, und wählen Sie dann den 700-Kanal aus. Stellen Sie die Intensität auf fünf ein und starten Sie den Scan.Um die Scandaten zu quantifizieren. Beginnen Sie damit, die Helligkeits- und Kontrasttasten der gescannten Datei anzupassen, um die beste Bildqualität zu erzielen, und drehen Sie die Bilder, die erforderlich sind, um die gewünschte Ausrichtung zu erreichen. Wählen Sie als Nächstes ein Rechteck aus dem Menü "Formen" aus und zeichnen Sie damit ein Rechteck um die gesamte Spur.In der ersten Beispielspur. Kopieren Sie das Shape, und fügen Sie es um die erste Bahn ein, um die zweite Spur zu erfassen. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass bei der Hintergrundmessung kein Signal in die nächste Spur einbezogen wird, zeichnen Sie ein Rechteck um jede Spur für den Rest der Beispielspuren.Zeigen Sie dann das Signal für die Formentabelle für jedes Rechteck an, das in beliebigen Fluoreszenzeinheiten gezeichnet wird, und speichern Sie das Bild als tiff-Galle. Es gibt eine Reihe von Kontrollmaßnahmen, die entscheidend sind, um sicherzustellen, dass während des quantitativen fluoreszierenden Western Blottings genaue Daten gesammelt werden. So ist es beispielsweise wünschenswert, Positivkontrollproben einzubeziehen.Zweitens ist es wichtig, die Transferzeit zu optimieren, um eine gleichwertige Bewegung von Proteinen mit hohem und niedrigem Molekulargewicht vom Gel zur Membran zu gewährleisten. Drittens müssen die geeigneten primären und sekundären Antikörperverdünnungen bestimmt werden, um eine falsche Interpretation der interessierenden Proteine aufgrund unspezifischer Bandenbildung zu vermeiden, wie in diesen Bildern dargestellt. Viertens ist es wichtig zu prüfen, ob ein Sekundärantikörper, der in einer anderen Wirtsspezies gebildet wird, erforderlich sein könnte, insbesondere in Fällen, in denen eine erwartete Proteinbande nicht nachgewiesen wird.Fünftens kann die Herstellung eines Beladungskontrollgels die Gleichmäßigkeit der Probenbeladung bestätigen. In Kombination mit einer Gesamtproteinanalyse kann das Gel dann verwendet werden, um die Proteinbelastung in jeder Spur in verschiedenen Molekulargewichtsbereichen, gemessen an jeder Probe, zu vergleichen und zu quantifizieren. Schließlich eignet sich diese Technik für das Abisolieren und erneute Untersuchen von Membranen mit größerer Flexibilität als die Kemi-Lumineszenz aufgrund von Faktoren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf eine erhöhte Empfindlichkeit, einen reduzierten Hintergrund, eine zweifarbige Detektion und Membranstabilität unter Langzeitlagerbedingungen.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie quantitatives Fluoreszenz-Western-Plotting verwenden, um interessante Proteine zu erkennen und genau zu quantifizieren, sowie wie Sie häufige Probleme beheben können, die bei der Durchführung dieser Technik auftreten können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieser technische Artikel beschreibt eine Standard-Western-Blot-Verfahren unter Verwendung der kommerziell erhältlichen NuPAGE Elektrophorese Mini-Gel-System von Invitrogen.

Western Blot mit dem Invitrogen NuPage Novex Bis Tris Minigele

Western-Blot ist eine analytische Technik verwendet, um bestimmte Proteine ​​in einer Probe von Gewebehomogenat oder Extrakt zu erkennen.

Western Blot: Probenvorbereitung zur Detektion

Das Video zeigt eine auf der Normalisierung von Gesamtproteinen basierende Western-Blotting-Technik zur Quantifizierung der Zielproteinexpression in einer Probe. Unter Verwendung der Gesamtproteinfärbung der Probe wird eine ratiometrische Analyse durchgeführt, um das relative Expressionsniveau des Zielproteins zu bestimmen.

Quantitatives Western Blot zur Abschätzung der Proteinexpressionsniveaus

Dieses Video beschreibt das Chemilumineszenz-basierte Western Blot von immunpräzipitierten Lysaten. Die Technik hilft bei der Bestimmung der Proteinverarbeitung und -aktivierung. Das detektierte Chemilumineszenzsignal ist proportional zum Grad der Proteinverarbeitung während seiner Aktivierung.

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V3-Workflow ist ein Western-Blot-Verfahren mit fleckenfreien Gelen. Die fleckenfreie Technologie ermöglicht es Forschern, die Proteintrennungsqualität zu visualisieren, die Übertragungseffizienz zu überprüfen und vor allem die Veränderung des von Interesse interessierten Proteins mithilfe der gesamten Proteinquantifizierung als zuverlässige Belastungskontrolle zu validieren.

V3 Stain-free Workflow für eine praktische, bequeme und zuverlässige Total Protein Loading Control in Western Blotting

Dieses Protokoll untersucht die neuesten Fortschritte bei der Durchführung von Western-Blot-Analysen. Diese neuen Änderungen setzen eine Bis-Tris-Gel-System mit einer 35 min Elektrophorese Laufzeit, einer 7 min-Dry-Blotting Transfersystem und Infrarot-fluoreszierende Protein Erkennung und Bildgebung, höhere Auflösung, Qualität, Empfindlichkeit und verbesserte Genauigkeit der West Daten erzeugt.

Der schnellste westlichen Stadt: Eine moderne Variante der Classic Western-Blot-Analyse

Wir beschreiben die Verwendung von quantitativen Immunoblotting, Immunfluoreszenz Histologie gepaart mit Bildanalyse als Mittel zur Quantifizierung eines Proteins des Interesses in Formalin fixiert, Paraffin-eingebetteten (FFPE) Gewebeproben zu validieren. Unsere Ergebnisse zeigen den Nutzen der Immunfluoreszenz Histologie für die Ermittlung der relativen Menge Biomarker Proteine im Routine-Biopsie Proben.

Quantitative Immunoblotting Zelllinien als Standard, Immunfluoreszenz zur Quantifizierung der Biomarker Proteine in Routine Gewebeproben zu validieren

Diese Methode beschreibt, einen stabile und reproduzierbaren Ansatz für den Vergleich der Proteingehalte in verschiedenen Geweben und an verschiedenen Entwicklungsstörungen Zeitpunkten mit einem standardisierten quantitativen westlichen befleckenden Ansatz.

Robuste Vergleich der Proteingehalte in Gewebe und in der gesamten Entwicklung mit standardisierten quantitativen Western Blotting

Eine Ultra-High-Speed-Western-Blotting-Technik wird entwickelt, indem die Kinetik der Antigen-Antikörper-Bindung durch zyklische Entwässerungs- und Auffüllungstechnologie (CDR) in Verbindung mit einem Immunreaktions-Verbesserungsmittel verbessert wird.

Ultra-High-Speed Western Blot mit Immunoreaction Enhancing Technology

Mit Luminex Corporation xMAP-Mikrokugel-Technologie haben wir die Multiplex Fluorometric Immunoassay (MFIA) für serologischen Überwachung von verschiedenen Labors Tierarten entwickelt. Die MFIA ist eine Suspension Microarray, wo Antigen, Gewebekontrolle oder Immunglobuline kovalent an farbkodierten Polystyrol-Mikrokügelchen verbunden sind. Die MFIA Prüfverfahren sowie verschiedene Themen zur Fehlerbehebung adressiert ist.

Multiplexed Fluorometric Immunoassay Testing Methodology und Fehlerbehebung

Lernen Sie die quantitative Fluoreszenz-Western-Blot-Methode zur sensitiven Proteindetektion in verschiedenen Geweben. Diese Technik ermöglicht präzise Quantifizierung mit hoher Reproduzierbarkeit für die biomedizinische Forschung.

A Guide to Modern Quantitative Fluoreszenz Western Blot mit Strategien zur Fehlersuche

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