A Guide to Modern Quantitative Fluoreszenz Western Blot mit Strategien zur Fehlersuche

Ziel dieses Verfahrens ist es, die relative Häufigkeit spezifischer Proteine in einer komplexen biologischen Probe mittels quantitativem Fluoreszenztwist und Blotting zu detektieren und genau zu quantifizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst Proteinextrakte mit Hilfe eines vorgefertigten Gradientengels elektrofluoreszierend getrennt werden. Im zweiten Schritt wird die äquivalente Proteinbelastung über alle Probenbahnen hinweg durch Aufbringen einer Gesamtproteinfärbung verifiziert, und dann wird das Eye Block Semi-Dry Fast Transfer System verwendet, um die Proben auf die A-P-V-D-F-Membran zu übertragen.

Schließlich werden die Proteine mit spezifischen Primärantikörpern untersucht, gefolgt von dem entsprechenden fluoreszenzmarkierten Sekundärantikörper, um ihre empfindliche, robuste und lineare Detektion bei infraroten und fernroten Wellenlängen zu erleichtern. Letztendlich kann die quantitative fluoreszierende westliche Blüte verwendet werden, um eine große Anzahl membrangebundener und löslicher Proteine über ein breites Spektrum von Gewebeproben reproduzierbar zu detektieren, zu visualisieren und genau zu quantifizieren. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der ECL-basierten Bildgebung besteht darin, dass sie eine höhere Empfindlichkeit mit verbesserter Präzision auf einer breiten linearen Skala für eine wirklich quantitative Auslesung ermöglicht. Beginnen Sie mit der manuellen Mazeration der Gewebeprobe, gefolgt von der Homogenisierung in frisch vorbereitetem Extraktionspuffer bei etwa einem bis 10 Gewebegewicht pro Puffervolumen, bis ein glattes, konsistentes Homogenat hergestellt wird.

Als nächstes zentrifugieren Sie das Zelllysat 20 Minuten lang bei 20.000 mal G bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie dann das Sat mit den löslichen Proteinen in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen und lagern Sie sowohl das Pellet als auch die S-Überstandsfraktion bei minus 80 Grad Celsius, bis es benötigt wird. Nach der Bestimmung der Proteinkonzentration des Supinats werden 15 Mikrogramm Protein pro Probe in neue Mikrozentrifugenröhrchen überführt.

Bringen Sie dann das endgültige Volumen jeder Probe mit destilliertem Wasser auf 10 Mikroliter und fügen Sie fünf Mikroliter Forex-Ladepuffer hinzu. Rühren Sie die Zelllösungen gründlich durch Vortexen und erhitzen Sie die Proben dann zwei Minuten lang auf 98 Grad Celsius, um die Proteine zu denaturieren. Nach der Denaturierung werden drei Mikroliter eines geeigneten Molekulargewichtsstandards in die erste Vertiefung jedes der Versuchs- und Beladungskontrollgele gegeben.

Laden Sie danach nach der Elektrophorese 10 Mikroliter jeder Probe in die entsprechenden nachfolgenden Vertiefungen. Verwenden Sie ein Gelmesser, um die Gele aus der Kassette zu lösen, und entfernen Sie die Vertiefungen und den Fuß des Gels. Markieren Sie das Gel, um die spätere Orientierung zu erleichtern.

Um die äquivalente Proteinbelastung zu bestimmen, dekantieren Sie dann etwa 30 Milliliter Proteinfleck in eine quadratische Petrischale von 12 x 12 Zentimetern und legen Sie das Ladekontrollgel in den Fleck, wobei Sie sicherstellen, dass die Lösung das gesamte Gel bedeckt. Rühren Sie das Gel mindestens eine Stunde lang bei Raumtemperatur vorsichtig um, entsorgen Sie dann den Proteinfleck und waschen Sie das Gel dreimal in destilliertem Wasser, bevor Sie den Augenblock sichtbar machen. Nach der Elektrophorese bereiten Sie den unteren Transferstapel vor, indem Sie die Folienabdeckung entfernen und die Membran direkt aus dem Geltank mit Laufpuffer vorbenetzen.

Befeuchten Sie das Filterpapier zu diesem Zeitpunkt ebenfalls wieder mit destilliertem Wasser. Laschen Sie dann das experimentelle Gel auf den vorbereiteten unteren Transferstapel, legen Sie dann das Filterpapier aus der Vorarbeit über das Gel und rollen Sie beide so, dass keine Blasen zwischen den Schichten eingeschlossen werden. Legen Sie den oberen Stapel auf das Filterpapier und den unteren Stapel.

Rollen Sie dann das Transferstapel-Sandwich, um Luftblasen zu entfernen. Legen Sie den Schwamm aus dem Transferstapel-Set auf das saugfähige Pad und platzieren Sie das Transferstapel-Sandwich an der dafür vorgesehenen Stelle. Schließen Sie dann den Deckel fest und starten Sie den I-Block zwei, indem Sie die Proteine sieben Minuten lang auf Programm drei übertragen.

Wenn das Programm beendet ist, entfernen Sie den Transferstapel aus der Augenblockmaschine und ziehen Sie den oberen Transferstapel und die Filterpapierschichten ab, so dass das Gel auf dem unteren Transferstapel freigelegt wird. Verwenden Sie ein Skalpell, um das Gel zu schneiden, und achten Sie darauf, nach dem Membrantrimmen einen dreieckigen Schnitt zu Orientierungszwecken auf der Membran zu machen, um die Transfereffizienz des Proteinflecks zu überprüfen, das Gel, wie gerade demonstriert, und bewegen Sie dann die Membran schnell in ein sauberes 50-Milliliter-Röhrchen, das fünf Milliliter PBS für den ersten von drei enthält. Fünfminütige Wäschen auf einer mechanischen Walze. Nach dem dritten Waschen den Waschpuffer entsorgen und die Membran in unverdünntem Blockpuffer mindestens 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren.

Als nächstes inkubieren Sie die Membran in einem Primärantikörper, der in fünf Millilitern Blockierungspuffer und 0,1 zwischen 20 über Nacht bei vier Grad Celsius unter ständigem Rühren verdünnt ist. Waschen Sie die Membran am nächsten Morgen nach dem Verwerfen der primären Antikörperlösung sechsmal fünf Minuten lang in PBS, wie gerade gezeigt. Dann inkubieren Sie die Membran im Dunkeln mit einem fluoreszierenden, markierten Sekundärantikörper, der in fünf Millilitern Blockierungspuffer und 0,1 % zwischen 20 unter ständigem Rühren dilatiert wird, gefolgt von sechs fünfminütigen PBS-Waschungen für alle Bildgebungen.

Melden Sie sich zunächst am Computer und Imager an. Öffnen Sie dann die Bildgebungssoftware, um den Western Blot abzubilden. Öffnen Sie zunächst den Deckel des Imagers und gießen Sie eine kleine Menge PBS auf das Glas.

Platzieren Sie die Membran in der unteren linken Ecke des Imagers auf dem PBS und stellen Sie sicher, dass sie rechtwinklig zur Achse des Imagers steht und dass zwischen der Membran und der Gitterachse ein Abstand von einem Zentimeter verbleibt. Rollen Sie die Membran, um sicherzustellen, dass keine Blasen zwischen dem Glas und der Membran eingeschlossen sind, und zählen Sie dann die Anzahl der Quadrate, die die Membran auf der x- und y-Achse einnimmt. Schließen Sie anschließend den Deckel des Imagers und geben Sie die Anzahl der Quadrate in die Computersoftware ein.

Wählen Sie den geeigneten Infrarotkanal und die entsprechende Intensität aus und starten Sie den Scan, um die Gesamtproteinfärbung des Ladekontrollgels zu visualisieren. Reparieren Sie das Gel und den Imager, wie gerade für die experimentelle Membran gezeigt, und wählen Sie dann den 700-Kanal aus. Stellen Sie die Intensität auf fünf ein und starten Sie den Scan.

Um die Scandaten zu quantifizieren. Beginnen Sie damit, die Helligkeits- und Kontrasttasten der gescannten Datei anzupassen, um die beste Bildqualität zu erzielen, und drehen Sie die Bilder, die erforderlich sind, um die gewünschte Ausrichtung zu erreichen. Wählen Sie als Nächstes ein Rechteck aus dem Menü "Formen" aus und zeichnen Sie damit ein Rechteck um die gesamte Spur.

In der ersten Beispielspur. Kopieren Sie das Shape, und fügen Sie es um die erste Bahn ein, um die zweite Spur zu erfassen. Nachdem Sie sich vergewissert haben, dass bei der Hintergrundmessung kein Signal in die nächste Spur einbezogen wird, zeichnen Sie ein Rechteck um jede Spur für den Rest der Beispielspuren.

Zeigen Sie dann das Signal für die Formentabelle für jedes Rechteck an, das in beliebigen Fluoreszenzeinheiten gezeichnet wird, und speichern Sie das Bild als tiff-Galle. Es gibt eine Reihe von Kontrollmaßnahmen, die entscheidend sind, um sicherzustellen, dass während des quantitativen fluoreszierenden Western Blottings genaue Daten gesammelt werden. So ist es beispielsweise wünschenswert, Positivkontrollproben einzubeziehen.

Zweitens ist es wichtig, die Transferzeit zu optimieren, um eine gleichwertige Bewegung von Proteinen mit hohem und niedrigem Molekulargewicht vom Gel zur Membran zu gewährleisten. Drittens müssen die geeigneten primären und sekundären Antikörperverdünnungen bestimmt werden, um eine falsche Interpretation der interessierenden Proteine aufgrund unspezifischer Bandenbildung zu vermeiden, wie in diesen Bildern dargestellt. Viertens ist es wichtig zu prüfen, ob ein Sekundärantikörper, der in einer anderen Wirtsspezies gebildet wird, erforderlich sein könnte, insbesondere in Fällen, in denen eine erwartete Proteinbande nicht nachgewiesen wird.

Fünftens kann die Herstellung eines Beladungskontrollgels die Gleichmäßigkeit der Probenbeladung bestätigen. In Kombination mit einer Gesamtproteinanalyse kann das Gel dann verwendet werden, um die Proteinbelastung in jeder Spur in verschiedenen Molekulargewichtsbereichen, gemessen an jeder Probe, zu vergleichen und zu quantifizieren. Schließlich eignet sich diese Technik für das Abisolieren und erneute Untersuchen von Membranen mit größerer Flexibilität als die Kemi-Lumineszenz aufgrund von Faktoren, einschließlich, aber nicht beschränkt auf eine erhöhte Empfindlichkeit, einen reduzierten Hintergrund, eine zweifarbige Detektion und Membranstabilität unter Langzeitlagerbedingungen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie quantitatives Fluoreszenz-Western-Plotting verwenden, um interessante Proteine zu erkennen und genau zu quantifizieren, sowie wie Sie häufige Probleme beheben können, die bei der Durchführung dieser Technik auftreten können.