Name: Isolierung und Anreicherung von menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen für verbesserte Osteogenesis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Lernen Sie die Isolierung von menschlichen ASCs mit erhöhtem osteogenem Potenzial mittels Durchflusszytometrie. Diese Methode ermöglicht die Anreicherung spezifischer Zellpopulationen für die regenerative Medizin.

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Diese Studie wurde von der National Institutes of Health Research Stipendium R01-DE021683-01 und National Institutes of Health Forschungsstipendium R01-DE019434 zu MTL unterstützt; Howard Hughes Medical Institute Forschungsstipendium zu MTCDCW wurde von der ACS Franklin Martin Fakultät Research Fellowship, The Hagey Labor für Pädiatrische Regenerative Medizin und der Stanford University Child Health Research Institute Fakultät Scholar Award unterstützt.

HINWEIS: Alle Patientenproben wurden mit Einwilligung erhalten, und experimentelle Protokolle wurden überprüft und von der Stanford University Institutional Review Board (Protokoll # 2188 und # 9999) zugelassen. 1. Zell Isolierung und Kultur: <ol><li> Erhalten menschlichen Hautfettgewebe von gesunden weiblichen Patienten nach elektiven lipoaspiration des Bauches, Flanke, und / oder Oberschenkelbereich unter örtlicher / Vollnarkose. Stellen Sie sicher, dass Institutional Review Board (IRB) Approbation ist für die Protokoll zur Isolierung von ASC aus menschlichen Geweben gewonnen wurden, und folgen institutionelle Schutzmaßnahmen beim Umgang mit derartigen Materialien. </li><li> Um die SVF vom lipoaspirated Fettgewebe zu erhalten, zuerst waschen die lipoaspirate dreimal mit gleichen Volumina 1x sterile phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS). Vorsichtig absaugen und entsorgen Sie die untere wässrige Schicht. </li><li> Bereiten Sie die Kollagenase-Verdauungspuffer: 0,075% Typ I Kollagenase in HanksBalanced Salt Solution (HBSS). Bereiten FACS-Puffer: 2% FBS, 1% P188 und 1% Pen-Strep in PBS. Filtern beide Lösungen mit Hilfe eines im Handel erhältlichen 0,22 um Porengrße fast flow Polyethersulfon Filter. </li><li> Zu den gewaschenen Fettgewebe verdauen, ein gleiches Volumen von Kollagenase-Verdauungspuffer und legen Digerierbehälter sicher in einem Schüttelwasserbad für 60 min bei 37 ° C (etwa 180 Shakes / min). HINWEIS: Es empfiehlt sich, ein größeres Volumen Aufschlussgefäß als erforderlich verwenden, da dies ermöglicht eine maximale Verdauung beim Schütteln (dh 250 ml Kollagenaseverdau Puffer, 250 ml gewaschen Fettgewebe in einem 1L sterile Flasche). </li><li> Neutralisieren enzymatische Aktivität durch Zugabe eines gleichen Volumens von FACS-Puffer und Stehenlassen bei RT für 5 min stehen. Als nächstes Zentrifuge bei 233 × g für 20 min bei 4 ° C. </li><li> Vorsichtig absaugen und den Überstand verwerfen, kümmert sich nicht um die hochdichte SVF Pellet stören. </li><li> Das Pellet in 5-10 ml RT rotZelllysepuffer, bezogen auf die Pelletgröße. Verlassen Lösung bei RT für 5 Minuten und Zentrifugation bei 233 × g für 5 min bei RT sitzen. </li><li> Überstand wird abgesaugt und das Pellet durch Zugabe von 5-10 ml traditionellen Wachstumsmedien, bezogen auf die Pelletgröße (Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium [DMEM] / 10% FBS / 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung [Pen-Strep]). </li><li> Filtern der Suspension durch ein 100 um Nylon Zellsieb um Zelltrümmer zu entfernen. </li><li> Zentrifuge bei 233 xg für 5 Minuten bei 4 ° C, und den Überstand verwerfen, ohne dass der Pellets. </li><li> Das Pellet in 5-10 ml traditionellen Wachstumsmedien, bezogen auf die Pelletgröße. </li><li> Je 2 x 10 6 Zellen in einem 15 cm-Standard Kulturschale und stellen Primärkulturen O / N bei 37 ° C / 21% O 2, 5% CO 2. Zu halten, bei sub-konfluenten Ebenen spontane Differenzierung bei 37 ° C / 21% O 2, 5% CO 2 in Wachstumsmedium zu verhindern. HINWEIS: Die Zelldichte in einem vollkonfluenten 15 cm Platte beträgt ca. 4-6 x 10 6 Zellen. </li></ol> 2. Die Färbung <ol><li> Kultur ASC in herkömmlichen Wachstumsmedium bei 37 ° C / 21% O 2, 5% CO 2, für 36 Stunden vor der Färbung / Sortieranlagen. </li><li> Fahrstuhl ASC von Kulturplatten mit Accutase (nach Herstellerprotokoll). </li><li> Waschen Sie die Zellen einmal mit FACS-Puffer (PBS mit 2% FBS und 1% Pen-Strep). </li><li> Zentrifuge bei 233 × g für 5 min bei 4 ° C. </li><li> Überstand verwerfen, ohne dass der Pellets. Die Zellen in 0,5-1 ml FACS-Puffer (je nach Zellzahl und der Menge des Antikörpers gewünscht). ANMERKUNG: Das Volumen der Zellsuspension, in Übereinstimmung mit den Empfehlungen des FACS Antikörper Herstellers bestimmt Antikörperkonzentration. Jedoch Titration von Antikörper-Konzentration, unter Verwendung einer Ausgangskonzentration von 1: 100 wird in der Regel empfohlen, wenn es das erste Mal ist, einen Antikörper zu verwenden. </li><li> Zählen der Gesamtzahl derZellen unter Verwendung eines Hämocytometers. </li><li> Reserve 100 ul Aliquots in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen für eine ungefärbte Probe und einfarbige Kontrollen (entsprechend der Anzahl von fluoreszierenden Antikörpern verwendet wird) verwendet werden. </li><li> Fügen Sie die entsprechenden fluoreszenzmarkierten monoklonalen Antikörpern (in vorgegebenen Konzentrationen, den Anweisungen des Herstellers) und Inkubation für 20 bis 30 Minuten auf Eis, vor Licht geschützt. <ol><li> Osteogene Subpopulation beschriften: Verdünnen anti-CD90 (APC-anti-Mensch CD90 (Thy1)) bzw. anti-CD105 (FITC-Anti-Human CD105 (Endoglin)) in FACS-Puffer auf eine Konzentration von 1:50. </li><li> Um andere Zellpopulationen (zB hämatopoetische und Endothelzellen) zu kennzeichnen: Verdünnen anti-CD45 (Anti-Human CD45 Pacific Blue), Anti-CD34 (Anti-Human CD34 APC), und / oder anti-CD31 (Anti-Human CD31 PE ) in FACS-Puffer auf eine Konzentration von 1:50. </li><li> Wenn nicht mit direkt konjugierten Antikörper, mit einem biotinylierten primären Antikörpers mit einem geeigneten Streptavidin-konjugierten zweitenary-Antikörper, wie beispielsweise Streptavidin PE-Cy7, bei einer Verdünnung von 1: 100. </li></ol></li><li> Nach der Inkubation wurden die Zellen werden zweimal: Füllrohre mit FACS-Puffer und Zentrifugieren bei 233 × g für 5 min bei 4 ° C, Absaugen Stand. </li><li> Die Zellen in 400 bis 500 &amp; mgr; l FACS-Puffer und Filterproben durch einen 70 &amp; mgr; m Nylon Zellsieb um Zellklumpen zu entfernen. </li><li> Übertragen markierten Zellen in FACS-Röhrchen mit Filter oben und halten Proben auf Eis für die Dauer der Analyse. </li></ol> 3. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung Hinweis: Die folgenden Schritte Mandat Vorkenntnisse in fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) oder die Hilfe von einem Fachmann. <ol><li> Mit der entsprechenden Software FACS, Konstruktionsanalyse Grundstücke zum Vorwärtsstreuung (FSC), Seitenstreuung (SSC) zu untersuchen, Phycoerythrin (PE) -Texas Red, Pacific Blue, Fluoresceinisothiocyanat (FITC), Allophycocyanin (APC) und andere Fluorophor Verwendungd, um Zellen zu markieren. </li><li> Vor dem Laden in den Zellsortierer, Vortexen jede Probe, um die Zellen zu resuspendieren. </li><li> Beginnen Sie mit der Analyse der ungefärbten Probe, um Tore zu der gesamten Zellpopulation gesetzt, um Zelltrümmer ausschließen und die Baseline Autofluoreszenz zu bestimmen. </li><li> Hinzufügen Propidiumiodid (PI) auf die ungefärbten Probe und zu analysieren, um die Population von lebenden Zellen in der Gesamtzellpopulation zu visualisieren. Konstruieren Sie ein Tor um diese Bevölkerung. </li><li> Analysieren Sie einen einfarbigen Kontrollprobe für jedes Fluorochrom um Fluoreszenzkompensation eingestellt. </li><li> Analysieren Sie die gefärbten Probe, um die Position der Tore für die Sortierung festlegen. </li><li> Fügen PI auf die gefärbte Probe, um abgestorbene Zellen zu färben. </li><li> Die markierten Zellpopulationen zu sortieren. Sortieren entweder in 1,5 ml Zentrifugenröhrchen oder konische Röhren (15 ml) enthaltenden Kulturmedium. </li><li> Manuell einzustellen Sortier, wenn die erforderliche Menge von Zellen erhalten worden ist. </li><li> Unsing FACS, führen eine Überprüfung der Reinheit durch Analyse eines kleinen Bruchteil (z. B. 500 Zellen) der erfassten Zellpopulation. HINWEIS: Dieser Schritt bestätigt die Reinheit der sortierten Zellpopulationen. Idealerweise sollte die Reinheit größer als 90-95% betragen. </li><li> Zentrifuge Zellen bei 233 g für 5 min bei 4 ° C unmittelbar nach der Beendigung des Sortierens und Resuspension in 1 ml frischem Medium, enthaltend 10% FBS. HINWEIS: Die Menge des verwendeten Mediums kann auf der Grundlage der Größe der Zellpellet erhöht werden. </li><li> Platte auf mit Gelatine beschichtete Platten Lebensfähigkeit der Zellen zu verbessern. Abhängig von dem jeweiligen Zellausbeute, Platte 300.000 Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 6 Vertiefungen, 100.000 Zellen pro Vertiefung in einer Platte mit 12 Vertiefungen. </li></ol>

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Keiner der Autoren ein finanzielles Interesse in irgendwelchen der Produkte, Geräte oder in diesem Manuskript erwähnt Drogen. Keiner der Autoren haben eine konkurrierende finanzielles Interesse zu berichten.

Derzeit bleibt die Isolierung homogene Subpopulationen von ASC vom SVF menschlichen Fettgewebe eine anspruchsvolle aber wünschenswertes Ziel. Isolation von Pro-osteogenen ASC Subpopulationen ist besonders wünschenswert, da solche Zellen verwendet werden, um die Bildung und die Homöostase von Skelettgewebe zu untersuchen. Die SVF von Fettgewebe birgt jedoch erhebliche Heterogenität bezüglich Stammzellenkapazität und Differenzierungspotential. 11 wird die molekulare Grundlage dieser Heterogenität nicht aus gepo...

Die heterogene Natur von Stammzellpopulationen ist noch nicht vollständig verstanden und bleibt ein großes Hindernis für die Entwicklung klinisch wirksamer stammzellbasierter therapeutischer Anwendungen. Eine der gebräuchlichsten Methoden zur Charakterisierung einer heterogenen Stammzellpopulation ist die Verwendung einer Zellsortiermethode, wie z. B. der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS), um Zellen basierend auf ihren Oberflächenmarker-Expressionsprofilen zu trennen. Mit zunehmender Komplexität der Sortiermethoden wird es möglich, spezifischere funktionelle Subpopulationen von Zellen zu identifizieren. Mikrofluidik-basierte Technologien werden immer häufiger bei der Analyse der Genexpression auf Einzelzellebene eingesetzt. Die geplexte quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) in einem mikrofluidischen Chip ermöglicht eine effektive und zuverlässige hochauflösende Einzelzell-Transkriptionsanalyse. 1-5
In einer früheren Studie, in der Einzelzell-Transkriptionsprofile von 48 Genen verwendet wurden, wurde eine beträchtliche transkriptionelle Heterogenität zwischen ASCs beobachtet. 6 Die Verteilung der Gene MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 zeigte jedoch eine starke Assoziation mit einem Cluster von Zellen mit hochgradig osteogenen Transkriptionsprofilen. Um Zellen entsprechend diesem osteogenen Genexpressionsprofil zu isolieren, wurden Oberflächenantigen-Expressionsmuster mit Transkriptionsmustern korreliert, und anschließend wurde entdeckt, dass die Oberflächenmarkerexpression von Endoglin (CD105) eng mit einem erhöhten osteogenen Differenzierungspotenzial von ASCs korreliert. Unabhängig von der CD105-Expression war die Expression des Oberflächenrezeptors Thy-1 (CD90), eines Glykosyl-Phosphatidylinositol-gebundenen Membranproteins, von dem Chen et al. zuvor gezeigt hatten, dass es mit Osteoprogenitorzellen assoziiert ist, auch mit der osteogenen Genexpression korreliert. 6,7 Diese Ergebnisse bieten die Möglichkeit, Subpopulationen innerhalb des größeren heterogenen Pools von ASCs mit erhöhter osteogener Kapazität für zellbasierte Bone Tissue Engineering-Anwendungen prospektiv zu isolieren.

<table><tbody><tr><td>Konische Einwegröhrchen 250 ml</td><td>Corning (Thomas Scientific)</td><td>2602A43</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hoher Glukosegehalt, GlutaMAX Supplement</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Betadine - Antiseptisches Povidon/Jod-Lösung</td><td>Purdue&nbsp;</td><td>PFC-67618015017</td><td></td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution, 1X</td><td>Cellgro</td><td>21-023-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum, zertifiziert, US-Herkunft</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase aus&nbsp; Clostridium histolyticum</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130-5G</td><td></td></tr><tr><td>ACCUTASE Zellablösungslösung</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>APC Maus Anti-Human CD90</td><td>BD Pharmingen</td><td>559869</td><td></td></tr><tr><td>FITC Maus Anti-Human CD105 (Endoglin)</td><td>BD Pharmingen</td><td>561443</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue Ersatz)</td><td>eBioscience</td><td>48-9459-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD34 APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0349-41</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD31 (PECAM-1) PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0319-41</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin PE-Cy7</td><td>eBioscience</td><td>25-4317-82</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Aria II Instrument</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva Software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung und anreicherung von menschlichen fettgewebe gewonnene stromazellen für verbesserte osteogenesis

Isolation and Enrichment of Human Adipose-derived Stromal Cells for Enhanced Osteogenesis

Aus dem Knochenmark stammende mesenchymale Stromazellen (BM-MSCs) gelten als Goldstandard für stammzellbasierte Tissue Engineering-Anwendungen. Der Prozess, mit dem sie entnommen werden müssen, kann jedoch mit einer signifikanten Morbidität an der Spenderstelle verbunden sein. Im Gegensatz dazu sind aus Fettgewebe gewonnene Stromazellen (ASCs) häufiger vorhanden und leichter zu ernten, was sie zu einer attraktiven Alternative zu BM-MSCs macht. Wie BM-MSCs können sich ASCs in osteogene Zellen differenzieren und in Tissue-Engineering-Anwendungen verwendet werden, z. B. bei der Aussaat auf Gerüsten für den Einsatz bei kraniofazialen Skelettdefekten. ASCs werden aus der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) von verdautem Fettgewebe gewonnen, das eine heterogene Mischung aus ASCs, vaskulären Endothel- und Muralzellen, glatten Muskelzellen, Perizyten, Fibroblasten und zirkulierenden Zellen ist. Die durchflusszytometrische Analyse hat gezeigt, dass das Oberflächenmarkerprofil für ASCs ähnlich ist wie für BM-MSCs. Trotz mehrerer veröffentlichter Berichte, die Marker für den ASC-Phänotyp etabliert haben, besteht immer noch kein Konsens über Profile zur Identifizierung von Osteoprogenitorzellen in dieser heterogenen Population. Dieses Protokoll beschreibt, wie eine Subpopulation von ASCs mit erhöhter osteogener Kapazität isoliert und verwendet wird, um Schädelbaddefekte kritischer Größe zu reparieren.

Verwendung CD90 als ein Marker für Zellen mit erhöhter Osteogenese ergibt Isolierung eines hochangereicherten Populationen menschlicher ASCs (1A, 1B). ASC wurden mit Pacific Blue-konjugierten Anti-Human-CD45 FITC-konjugiertem Anti-Human CD105 und APC-konjugiertem Anti-Human-CD90 gefärbt. Nach dem Sortieren der Reinheitsgrad betrug mehr als 98%, wie durch die Post-Sortieranalyse quantifiziert. Definieren von Gruppen von Zellen auf Basis von Transkriptionsprofilen für angehend...

Die transkriptionelle Heterogenität innerhalb menschlicher Fettgewebe-abgeleiteter Stromazellen kann auf Einzelzellebene mit Hilfe von Zelloberflächenmarkern und osteogenen Genen definiert werden. Wir beschreiben ein Protokoll, das die Durchflusszytometrie zur Isolierung von Zellsubpopulationen mit erhöhtem osteogenem Potenzial verwendet, das zur Verbesserung der kraniofazialen Skelettrekonstruktion verwendet werden kann.

Isolierung und Anreicherung von menschlichen Fettgewebe gewonnene Stromazellen für verbesserte Osteogenesis

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Subpopulationen von humanen Stammzellen aus Fettgewebe mit erhöhtem osteogenem Potenzial zu isolieren, wobei die durchflussunterstützte Zytometrie verwendet wird, um dies zu erreichen. Aus humanem Fett gewonnene Stammzellen oder ASCs werden aus humanem Lipo-Aspirat gewonnen und 36 Stunden lang kultiviert. Die Zellen werden dann mit Antikörpern gefärbt, die ausgewählt wurden, um osteogene Pro-Populationen zu markieren, und die gewünschten Populationen werden mittels durchflussgestützter Zytometrie isoliert.Letztendlich zeigen die alkalische Phosphatase- und Azärin-Färbung ein erhöhtes osteogenes Potenzial der isolierten Zellen. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die regenerative Medizin und die Entwicklung neuer translationaler Therapien, da sie beschreibt, wie eine Subpopulation von ASCs mit verstärkter Osteogenese isoliert werden kann. Das folgende Verfahren wird mit humanem subkutanem Fettgewebe von gesunden Patientinnen durchgeführt, die sich einer elektiven Lipo-Aspiration des Bauch-, Flanken- und/oder Oberschenkelbereichs unter örtlicher Betäubung oder Vollnarkose unterzogen haben.Beginnen Sie mit 500 Millilitern bis einem Liter Gewebe in einem Saugkanister, der direkt aus dem Operationssaal entnommen wird. Beginnen Sie sofort nach der Entnahme mit der Ernte. Dadurch wird die Lebensfähigkeit der Zellen maximiert, um die stromale Gefäßfraktion oder SVF aus dem lipoaspirierten Fettgewebe zu erhalten. Beginnen Sie mit der Zugabe von sterilem PBS in einem Verhältnis von eins zu eins.Schütteln Sie dann den Kanister vorsichtig, um ihn zu mischen. Nach dem Mixen. Lassen Sie die Lösung stehen, bis sie sich in drei Schichten trennt.Die oberste Ölschicht ist klar und gelb. Die mittlere Fettschicht ist zähflüssig, undurchsichtig und gelb, und die untere Blutschicht ist rot. Vorsichtig mit einer serologischen Pipette die untere Blutschicht ansaugen und verwerfen, die obere Ölschicht ansaugen.Wiederholen Sie dies dann. Weitere zwei Mal waschen. Nach der Zubereitung des Kollagenase-Verdauungspuffers und des Faxpuffers, wie im Begleitdokument beschrieben, legen Sie sie zusammen mit dem Lysepuffer für rote Blutkörperchen in die Haube, damit sie sich auf Raumtemperatur erwärmen können.Übertragen Sie anschließend das gewaschene Fettgewebe in einen großen Kolben und verdauen Sie es mit einem gleichen Volumen Kollagenase-Verdauungspuffer. Stellen Sie den Kolben 60 Minuten lang sicher in ein Schüttelwasserbad. Bei 37 Grad Celsius.Es ist am besten, ein Aufschlussgefäß mit größerem Volumen als erforderlich zu verwenden, da dies einen maximalen Aufschluss während des Schüttelns ermöglicht. Zum Beispiel sollten 250 Kollagenase-Verdauungspuffer und 250 ml gewaschenes Fettgewebe in einen sterilen Ein-Liter-Kolben gegeben werden. Nach der Inkubation neutralisieren Sie die enzymatische Aktivität, indem Sie ein gleiches Volumen Faxpuffer hinzufügen und das Gewebe fünf Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen lassen.Übertragen Sie anschließend das Verdauungsgewebe in ein konisches 250-Milliliter-Einwegzentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie es bei 233 g oder 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Nach dem Schleudern aspirieren Sie das Supinat und suspendieren das Pel-Pellet erneut, indem Sie fünf bis 10 Milliliter traditionellen Wachstums hinzufügen. Mittel, abhängig von der Größe des Pellets.Pipettieren Sie dann die Suspension durch ein 100-Mikrometer-Nylon-Zellsieb in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen, um Zelltrümmer zu entfernen. Nachdem Sie den Überstand verworfen haben, sollte die Palette wie abgebildet aussehen. Hier, Reese, lassen Sie den Gaumen bei 10 Millilitern Raumtemperatur schweben.Roter Lysepuffer. Lassen Sie die Lösung fünf Minuten lang bei Raumtemperatur ruhen und zentrifugieren Sie sie dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur bei 233 μg. Zentrifugieren Sie anschließend fünf Minuten lang bei 233 g bei vier Grad Celsius und entsorgen Sie die Snat, ohne das Pellet zu stören.Dann Resus, suspendieren Sie das Pellet in fünf bis 10 Millilitern traditionellen Wachstums. Mittel, abhängig von der Größe des Pellets. Nachdem Sie die Zellen gezählt haben, legen Sie 2 Millionen Zellen in eine 10 Zentimeter große Standardkulturschale und etablieren Sie über Nacht Primärkulturen.Halten Sie die SVF-Zellen auf subkonfluenten Ebenen, um eine spontane Differenzierung zu verhindern. 36 Stunden nach der Aussaat heben Sie die Zellen mit Accutane gemäß dem Protokoll des Herstellers an. Waschen Sie die Zellen einmal mit Faxpuffer und zentrifugieren Sie sie dann fünf Minuten lang bei 233 g bei vier Grad Celsius.Nach dem Schleudern die Schlinge wegwerfen, ohne das Pellet zu beschädigen. Resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 bis einem Milliliter Wirkung. Puffer. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer.Ordnen Sie 1,2 Millionen Zellen einer unsortierten Gruppe zu, die separat als Kontrolle plattiert wird. Für dieses Experiment werden 100 Mikroliter Quats in ein 1,5 Milliliter Einorröhrchen überführt. Für jede zu analysierende Probe wird eine ungefärbte Probe plus einfarbige Kontrollen für jeden der zu verwendenden Antikörper vorbereitet und auf Eis gelegt.Neben der Markierung der osteogenen Subpopulation verdünnen Sie Anti-CD 90 oder Anti-CD 1 0 5 in Faxpuffer, um die anderen Zellpopulationen, wie hämatopoetische und endotheliale Zellen, zu markieren, verdünnen Sie Anti-CD 45, Anti-CD 34 und/oder Anti-CD 31 in Faxpuffer. Waschen Sie die Zellen nach der Inkubation zweimal, indem Sie die Röhrchen mit Faxpuffer füllen und fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 233 g zentrifugieren. Nach dem Spin-Aspirat resuspendiert die Snat nach dem zweiten Waschen die Zellen in 400 bis 500 Mikrolitern Wirkung.Pufferfiltrieren Sie die Proben durch ein 70-Mikrometer-Nylon-Zellsieb in ein Zentrifugenröhrchen, um Zellklumpen zu entfernen. Führen Sie eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung durch, wie im beigefügten Protokoll beschrieben. Unter Verwendung von Fakten-Software-Design-Analysediagrammen zur Untersuchung der Vorwärtsstreuseite Streuung fico, eryn, Texas Red Pacific blue fluoreszierendes Isothiocyanat, gesamtes Cyanid und alle anderen Fluor-Vier, die zur Markierung von Zellen verwendet werden.Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Diagramme für die Faktenanalyse angemessen gezeichnet werden, um die gewünschten Zellpopulationen nicht versehentlich auszuschließen. Sortieren Sie die markierten Zellpopulationen entweder in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen oder in konische 15-Milliliter-Röhrchen mit Kultur. Das Medium stoppt die Sortierung manuell.Sobald die erforderliche Menge an Zellen für dieses Experiment erhalten wurde, werden etwa 2 Millionen Zellen benötigt. Als nächstes führen Sie anhand von Fakten eine Reinheitsprüfung durch, indem Sie einen kleinen Teil von etwa 500 Zellen der erworbenen Zellpopulation analysieren. Beachten Sie, dass dieser Schritt die Reinheit der sortierten Zellpopulationen bestätigt.Im Idealfall sollte die Reinheit mehr als 90 bis 95 % betragen, unmittelbar nachdem die Zentrifugenzellen fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 233 g sortiert wurden. Dann resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter frisches Medium mit 10 % FBS-Platte, die Zellen auf gelatinebeschichteten Platten, um die Zellviabilität zu verbessern. Abhängig von der endgültigen Zellausbeuteplatte 300.000 Zellen pro Well in einer Sechs-Well-Platte oder 100.000 Zellen pro Well.In einer 12-Well-Platte zur Isolierung von menschlichem Fett kommen Stromazellen mit erhöhtem osteogenem Potenzial an. ASCs wurden mit Pacific Blue konjugiertem Anti-Human-CD 45, Fitz-konjugiertem Anti-Human-CD 1 0 5 und A-PC-konjugiertem Anti-Human-CD 90 gefärbt und isoliert, wie in diesem Video beschrieben, wie hier gezeigt. Die Sortierung basierend auf einer hohen CD 90- oder niedrigen CD 1 0 5-Expression ergab hochangereicherte Populationen humaner ASCs, um das osteogene Potenzial der beiden Subpopulationen zu charakterisieren. CD 90 positive CD 1 0 5, niedrige und unsortierte ASCs wurden 14 Tage lang in osteogenem Differenzierungsmedium kultiviert, wie in diesem Bild zu sehen ist.Die Färbung der alkalischen Phosphatase, die als Frühindikator für die Knochenbildung dient, war in der CD 90-positiven Kulturpopulation im Vergleich zu den anderen Gruppen erhöht. Die Quantifizierung mit Hilfe einer Bildanalysesoftware bestätigte, dass der beobachtete Unterschied signifikant war. Ebenso war an Tag 14 die Aller- und Rotfärbung, die zum Nachweis der extrazellulären Matrixmineralisierung verwendet wird und als Metrik für die endterminale osteogene Differenzierung dient, in der CD 90-positiven Population im Vergleich zu anderen Gruppen erhöht. Die Quantifizierung mit Hilfe einer Bildanalysesoftware bestätigte ebenfalls, dass der beobachtete Unterschied signifikant war.Diese Daten deuten darauf hin, dass CD 90-positive ASCs in der Lage sind, eine signifikant größere Menge an extrazellulärer Matrix zu mineralisieren als unsortierte Zellen, was darauf hindeutet, dass isolierte ASCs nach der Sortierung weiterhin die Fähigkeit haben, eine osteogene Differenzierung zu durchlaufen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie eine Subpopulation von ASCs mit erhöhtem osteogenem Potenzial isoliert werden kann. Bei der Arbeit mit menschlichen Proben, wie in diesem Protokoll beschrieben, ist es wichtig, immer geeignete Schutzkleidung zu tragen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Developmental Biology

Entwicklungsbiologie

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