Produktion und Targeting von Monovalenter Quantenpunkte

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein einfaches und verallgemeinerbares Protokoll für die Herstellung monovalenter Quantenpunkte für die Einzelmolekül-Bildgebung von Zielmembranproteinen in lebenden Zellen bereitzustellen. Dies wird erreicht, indem zunächst eine stöchiometrische Menge eines langen Polyphospho-Oligonukleotid-Liganden in einen Quantenpunkt eingebracht wird. Die lange DNA umhüllt den Quantenpunkt vollständig und verhindert die Bindung eines zweiten DNA-Moleküls, wodurch ausschließlich und quantitativ monovalente Quantenpunkte entstehen. Getrennt.

Benzo guine-funktionalisierte, DNA-tragende komplementäre Sequenzen sind so vorbereitet, dass sie auf Snap-markierte Membranproteine abzielen, die auf lebenden Zellen exprimiert werden. Als nächstes führt die sequentielle Behandlung von lebenden Zellen, die snap-markierte Membranproteine mit Benzo guine, DNA, gefolgt von monovalenten Quantenpunkten, exprimieren, zu einer selektiven Markierung des Zielrezeptors. Der letzte Schritt besteht darin, die Verteilung und die Diffusionsbahnen des Zielproteins mittels Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie abzubilden.

Letztendlich werden dynamische raumzeitliche Echtzeitinformationen von Zielproteinen in lebenden Zellen extrahiert, um zu zeigen, wie die Zielmoleküle in vivo funktionieren. Der Hauptvorteil dieses Ansatzes zur Synthese monovalenter Quantenpunkte ist seine Einfachheit und allgemeine Zugänglichkeit. Im Gegensatz zu vielen anderen Ansätzen, die besondere Fähigkeiten oder Ausrüstung erfordern, ist dieser Ansatz relativ einfach.

Als Konsequenz sollte es für jedes Labor und für jede Disziplin verfügbar sein. Die Idee zu dieser Methode hatten wir, als Zeva und ich anfingen, darüber zu diskutieren, wie unsere Expertise in der DNA-Nanopartikelsynthese kombiniert werden könnte, um die Reaktivität von Nanopartikeln besser zu kontrollieren. Die ersten Versuche zum Zulassungsprinzip haben wir gemeinsam an einem Wochenende durchgeführt.

Zunehmend funktionierte unser erster Versuch erfolgreich. In diesem Video verwenden wir monovalente Quantenpunkte, um die Einzelteilchendynamik des Notch-Rezeptors in lebenden Säugetierzellen zu untersuchen. Diese monovalenten Quantenpunkte sollten jedoch einen breiten Nutzen für alle Studien finden, die eine Einzelteilchenverfolgung erfordern.

Im Allgemeinen werden Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten haben, da nicht alle kommerziell erhältlichen Quantenpunkte gleich sind, weder geometrisch noch chemisch. Daher sind einige Optimierungen erforderlich. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist bei Ihrem Phasentransfer von entscheidender Bedeutung, und Phosphor-I-bezogene DNA-Zugabeschritte könnten für ein Labor ohne Erfahrung in der multisynthetischen Chemie einschüchternd sein.

Verdünnen Sie zunächst 200 Mikroliter einer einmikromolaren Lösung von Quantenpunkten der organischen Phase mit 400 Mikrolitern Chloroform in einem Fünf-Milliliter-Glasfläschchen. Kombinieren Sie diese Quantenpunkte mit einer Mischung aus 400 Mikrolitern 0,3 molaren Tetrabutylammoniumbromid-Chloroform-Lösung und 36 Mikrolitern reinem Pec-Thiol und schütteln Sie sie über Nacht. Fügen Sie dann 800 Mikroliter einer wässrigen 0,2-molaren Natriumhydroxidlösung hinzu und schütteln Sie sie 30 Sekunden lang.

Ein Phasenübergang erfolgt innerhalb weniger Minuten, was durch den Übergang der farbigen Partikel in die wässrige Phase oberhalb der dichteren organischen Phase angezeigt wird. Wenn sich die Partikel in einer dritten Phase zwischen der wässrigen und der organischen Phase aggregieren, erhöhen Sie die Inkubationszeit mit dem Pec-Regler. Bleibt die wässrige Phase klar, haben die Quantenpunkte keinen Phasentransfer vollzogen.

Erhöhen Sie die Konzentration von pec dial, um einen schlechten Phasentransfer zu lindern. Als nächstes stellen Sie die farbige wässrige Phase wieder her. Dann konzentrieren Sie die gesammelten Quantenpunkte mit der Racon-Spin-Säule auf einen Milliliter.

Geben Sie die konzentrierte Quantenpunktlösung in einen cidex NEP 10-Säulen-Pree, der mit 10 millimolaren Tris-Puffern äquilibriert ist, die 30 millimolares Natriumchlorid enthalten. pH 8 eluiert die Quantenpunkte mit 1,5 Millilitern Elutionspuffer durch Schwerkraft. Fahren Sie mit der Messung der Konzentration von Quantenpunkten mit Absorptionsspektroskopie bei 350 Nanometern fort.

Um eine monovalente zielgerichtete Quantenpunkt-Phospho-Acht-DNA herzustellen oder zu synthetisieren, bereiten Sie einen Milliliter 100 anomolare Quantenpunktlösung in 10 Millimolar Tris-Puffer her, der 30 Millimolare Natriumchlorid-pH-Werte enthält. Fügen Sie als Nächstes 500 Mikroliter der 100 nanomolaren Phospho IO Eight DNA-Lösung hinzu. Eine Minute lang unter kräftigem Rühren tropfenweise auf die wässrigen Quantenpunkte geben.

Rühren Sie um oder geben Sie die Mischung für weitere neun Stunden auf einen Shaker. Entfernen Sie etwa 10 Mikroliter der Quantenpunktmischung, um sie auf einem analytischen Agros-Gel laufen zu lassen. Entfernen Sie außerdem eine ähnliche Konzentration von unkonjugierten Quantenpunkten in wässriger Phase.

Dann bei etwa zwei Mikrolitern sechs x fi Call Ladepuffer, um die Lösungsdichte zu erhöhen. Führen Sie diese beiden Proben zusammen 15 Minuten lang bei 150 Volt mit einem AROS-Gel mit einem Volumen von 0,8 % in Natriumbide-Puffer durch. Das Ergebnis sollte eine einzelne Bande in der unkonjugierten Kontrollspur sein, die in der Nähe der Vertiefung wandert, und zwei Banden in der Spur mit konjugierten Quantenpunkten.

Berechnen Sie den Anteil der unkonjugierten Quantenpunkte anhand der relativen Intensität der beiden Bänder. Verwenden Sie dann diesen Bruch, um das zusätzliche Volumen von 100 nanomolaren Phospho-Acht-DNA-Lösungen zu berechnen, das erforderlich ist, um die Anzahl der Quantenquantenpunkte zu erreichen. Wiederholen Sie den Vorgang noch einmal mit diesem berechneten Volumen oder bis die konjugierten Quantenpunkte zu einer einzigen Bande auf dem Gel kollabieren, was auf die vollständige Konjugation aller Quantenpunkte hinweist.

Fügen Sie als nächstes 100 Mikroliter 10 millimolares Carboxy hinzu. Binden Sie sechs Alkanthiol an die konjugierten monovalenten Zielquantenpunkte und schütteln Sie sie 10 Minuten lang. Um überschüssiges Alkan pegol zu entfernen, fügen Sie 0,5 Milliliter der Quantenpunktlösung zu ACE fitex knap fünf Säulen voräquilibriert mit elucianischem Puffer hinzu.

Sammeln Sie dann die monovalenten Zielquantenpunkte mit einem Milliliter Elu-Puffer durch Schwerkraft. Konzentrieren Sie die gesammelten Quantenpunkte mit einer zentrischen con-Spin-Säule. Diese monovalenten zielgerichteten Quantenpunkte können bei vier Grad Celsius pro Monat gelagert werden, die monovalenten Quantenpunkte werden kurz vor einem Bildgebungsexperiment mit Reagenzien wie Kasein- oder Rinderserumalbuminplattenzellen gegessen, die das Snap-Tagg-Protein auf Totalreflexion, Fluoreszenz oder Torfglas exprimieren.

In diesem speziellen Experiment verwenden wir eine U2-OS-Zelllinie, die einen Snap-Tagged-Notch-One-Rezeptor und hochwertige Glasoberflächen exprimiert, nachdem sich die Zellen an das Glas anheftet haben, entfernen das Wachstumsmedium und waschen es mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder PBS. Dann inkubieren Sie die Zellen für 10 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur in PBS oder Zellmedien, die Benzoylguinea-DNA enthalten, die wie im Textprotokoll nach der Inkubation mit Benzo-Guin-DNA hergestellt wurden, waschen Sie die Zellen vorsichtig mit PBS oder Zellmedien, dann inkubieren Sie die Zellen für etwa fünf bis 10 Minuten mit den monovalenten Quantenpunkten. Waschen Sie die ungebundenen monovalenten Quantenpunkte und geben Sie die Zellen wieder in einen Puffer oder ein Medium zurück, das sowohl für die Bildgebung als auch für das Kulturbild geeignet ist.

Die Zellen, die ein Rasenmikroskop verwenden, sammeln aufgrund der Helligkeit monovalenter Quantenpunkte Bilder mit hohen Bildraten im Rasen, während sie die basale Seite einer lebenden Zelle abbilden. Sobald die Quantenpunkte mit der negativ geladenen DNA beschichtet sind, sollten sie auf einem Gel getrennt von den nicht gerappten Quantenpunkten wandern, wobei ein Aliquot von unverpackten Quantenpunkten als Kontrolle verwendet wird. Ein zweites, schneller migrierendes Band sollte bei Zugabe des Phosphol IO acht DN erscheinen. Eine vollständige Bildung der monovalenten Quantenpunkte wird mit dem Verlust des unbeweglichen Bandes und dessen Kollaps in das mobile Band demonstriert.

Wenn ein Aliquot des monovalenten Quantenpunktprodukts als einzelne Bande migriert, die von den unverpackten Quantenpunkten trennbar ist, dann sind die Quantenpunkte tatsächlich monovalent und bereit, in weiteren Schritten verwendet zu werden. Hier ist eine repräsentative Markierung von Zellen zu sehen, die ein Snap-Notch-M-Kirschkonstrukt bei verschiedenen monovalenten Quantenpunktkonzentrationen exprimieren. Monovalente Quantenpunkte, passiviert mit PEG 12, co-lokalisiert mit M-Kirsche, was auf eine spezifische Markierung hinweist.

Niedrigere Markierungsdichten sind im Allgemeinen für die Einzelpartikelverfolgung vorzuziehen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein fluoreszierendes Nanopartikel synthetisiert, das hell modular monovalent und zielgerichtet ist Sobald diese Technik gemeistert ist, kann sie in zwei Datenaufbereitung der monovalenten Quantenpunkte und einer einstündigen Fotozellenmarkierung durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass wir mit kommerziell erhältlichen Startreagenzien monovalente Quantenpunkte mit hervorragenden photophysikalischen Eigenschaften herstellen können, die für lange Einzelteilchen-Tracking-Experimente verwendet werden können.

Nach diesem Verfahren können andere Proteine mit Snap-Tag-Fusionen markiert werden, um ihre Molekulardynamik auf lebenden Zellen zu verfolgen. Die Arbeit mit dem Quantenpunkt kann extrem schwer zu entstauben sein, also vergessen Sie nicht, während dieses Verfahrens eine Schutzbrille, Handschuhe und Laborkittel zu tragen.