Beurteilung der Lebensfähigkeit der Menschen Fat Injektion in Nacktmäusen mit Micro-Computertomographie

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein Mausmodell zu beschreiben, das Mikro-CT verwendet, um die Volumenerhaltung zwischen aufschiebenden Techniken der Fetttransplantatvorbereitung und -abgabe zu vergleichen. Dies wird erreicht, indem zunächst humanes Lipo-Aspirat verarbeitet wird, um Fett zu erhalten, das für die Transplantation bereit ist. Der zweite Schritt besteht darin, Fetttransplantate in die Kopfhaut von Nacktmäusen des Zölias-Thymus zu platzieren.

Als nächstes wird das Überleben des Fetttransplantats wöchentlich durch CT-Scans von Mäusen analysiert, Bilder rekonstruiert und die Volumenretention quantifiziert. Der letzte Schritt besteht darin, die Fetttransplantation am Ende von acht Wochen zu planen und sie nach Gewicht und Histologie zu vergleichen. Letztendlich werden Mikro-CT und Histologie verwendet, um Unterschiede in der Qualität und dem Überleben des Fetttransplantats aufzuzeigen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie dem Wiegen von Fetttransplantaten besteht darin, dass sie die Visualisierung und objektive Quantifizierung des Fetttransplantatvolumens zu mehreren Zeitpunkten nach der ersten Transplantation ermöglicht, ohne dass das Versuchstier geopfert werden muss. Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir begannen, die Mikro-CT zur Analyse von Calva-Defekten einzusetzen. Die Implikationen dieser Technik sind, dass sie ein chirurgisches Modell für alle Studien zur Bewertung von Fetttransplantaten, -retention und -lebensfähigkeit bietet.

Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da es schwierig ist, das Fetttransplantat in der richtigen Position über der Kopfhaut zu halten. Die visuelle Demonstration dieser Technik ist von entscheidender Bedeutung, da die Transplantations- und Rekonstruktionsschritte schwer zu erlernen sind, da es zahlreiche Stadien gibt, in denen eine kleine Abweichung in der Technik das Ergebnis verändern kann. Mit dem Coleman-Verfahren wird menschliches Fettgewebe aus dem Bauch-, Flanken- und Oberschenkelbereich gesunder Patientinnen gewonnen, die sich einer elektiven Fettabsaugung unterziehen.

Um das Lipo-Aspirat für die Transplantation zu verarbeiten, lassen Sie das Fett zunächst 30 Minuten lang absetzen. Lipo-Aspirat setzt sich typischerweise in drei Schichten ab, wobei Öl oben, Fett in der Mitte und Blut unten liegen. Aspirieren und entsorgen Sie die obere Ölschicht, gefolgt von der unteren Blutschicht.

Um verbleibende Tumeszenzflüssigkeit oder Zelltrümmer weiter zu entfernen, zentrifugieren Sie das Fett fünf Minuten lang bei 350 g und vier Grad Celsius. Nach der Zentrifugation wird die untere Blutschicht und die obere Ölschicht abgesaugt. Um die Menge an Fett zu berechnen, die für die Transplantation benötigt wird, wie im Textprotokoll beschrieben, um eine Fetttransplantation durchzuführen, erhalten Sie weibliche homozygote CD 1 Nacktmäuse.

Wählen Sie für die experimentelle Studie Mäuse im Alter von acht bis 12 Wochen aus, um eine Anästhesie einzuleiten. Setzen Sie die Maus in eine Knockdown-Box mit einem Fluorsauerstoffgemisch von 2,5 % bei zwei Litern pro Minute für etwa 10 Minuten, wenn sich die Atemfrequenz der Maus verlangsamt hat. Bestätigen Sie eine ausreichende Sedierung mit einem Zehenkneifen.

Tragen Sie eine veterinärmedizinische Gleitsalbe auf beide Augen der Maus auf und legen Sie die Nase der Maus in einen Nasenkegel, wobei Sie eine Fluorsauerstoffmischung von 2,5 % ISO bei ein bis zwei Litern pro Minute abgeben. Richten Sie als Nächstes ein steriles Feld unter der Maus ein. Sterilisieren Sie dann eine Kopfhaut mit 2,5 % Povidon-Jod, gefolgt von einer 70 %igen Ethanollösung.

Wiederholen Sie die Sterilisation noch zwei weitere Male. Laden Sie eine Ein-Milliliter-Köderverschlussspritze mit einem Milliliter Fett zurück, das auf Raumtemperatur ausgeglichen wurde. Verbinden Sie eine 14 Gauge acht Zentimeter lange Fetttransplantationskanüle mit dem Ende der Spritze.

Bereiten Sie das System vor, indem Sie den Spritzenkolben drücken, bis zwischen 200 und 400 Mikroliter Fett in der Spritze verbleiben. Bestätigen Sie beim Drücken des Spritzenkolbens, dass sich die Kanüle vollständig mit Fett gefüllt hat, indem Sie mit einer feinen Pinzette beobachten, wie das Fett aus dem distalen Kanülenloch austritt. Hebe die dorsale Haut in der Mittellinie an, die über dem hätschelten Aspekt des Schädels liegt.

Machen Sie mit einer feinen Schere einen 1,5 Millimeter großen Schnitt in die Haut. Legen Sie eine Naht aus sechs oh Nylon durch die Mitte des Schnitts, die später verwendet wird, um die Wundränder zusammenzuführen. Binden Sie nach der Transplantation die Naht nicht ab.

Legen Sie dann eine subkutane Tasche über dem Schädel an, indem Sie die Kanüle durch den Hautschnitt einführen und die Kanüle fächerförmig über den Schädel hin und her führen, um alle Bindegewebsansätze an der darüber liegenden Haut zu lösen. Sobald die Tasche erstellt wurde, positionieren Sie die Kanüle in der Mittellinie der Maus direkt über dem Schädel, bis die Spitze an der Theramos-Seite der Tasche liegt. die sich direkt hinter einer Linie befinden sollte, die zwischen den Augen gezogen wird. Injizieren Sie das Fett langsam retrograd, schieben Sie den Kolben vor, während Sie die Kanüle zurückziehen. Führe die Wundränder mit einer Pinzette zusammen und hebe sie an, damit kein Fett aus der Tasche austritt.

Binden Sie die Naht, die zuvor platziert wurde, und achten Sie darauf, dass der erste Knoten leicht auf der Haut aufliegt. Binden Sie drei weitere quadratische Knoten und schneiden Sie die Naht mit einem drei Millimeter langen Schwanz ab. Entfernen Sie die Maus aus der Anästhesie und fahren Sie mit der Genesung fort, wie im Textprotokoll beschrieben.

Kalibrieren Sie das Mikro-CT vor der ersten Untersuchung mit einem bildgebenden Phantom, das zwischen Luft-, Wasser- und Knochenintensität unterscheidet. Nach der Kalibrierung. Platzieren Sie vier Mäuse in ventraler Position in den Scanner, wobei zwei Mäuse oben und zwei unten liegen.

Legen Sie es auf ein Scanbett. Früher aus 60-Milliliter-Spritzen zum Halten des Mauskörpers und 10-Milliliter-Spritzen als Nasenkegel konstruiert. Bestätigen Sie mit einem Scout-Bild, dass der gesamte Schädel der Maus von der Nase bis zum ersten Halswirbel und von der Schädeldecke bis zur Schädelbasis abgebildet wird.

Fahren Sie mit dem Scan fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Öffnen Sie die rekonstruierten Bilder mit einer Mikro-CT-Bildgebungsanalysesoftware, die die Erstellung von Interessenbereichen oder ROIs ermöglicht, indem Voxel mithilfe von Schwellenwerten für die Pixelintensität ausgewählt werden. Beginnen Sie mit dem Laden der rekonstruierten CT-Bilder in zweidimensionaler, koronaler, axialer und sagittaler Ansicht.

Navigieren Sie anhand der axialen Schicht zu der sagittalen Schnitte, die dem Aspekt des Fetttransplantats ganz links entspricht. Wählen Sie einen oberen und unteren Schwellenwert für die Pixelintensität aus, der alle Voxel erfasst, die dem Fetttransplantat entsprechen, aber das umgebende Gewebe und den umgebenden Knochen ausschließt. Definieren Sie in der sagittalen Ansicht einen ROI, der dem Fetttransplantat entspricht.

Wiederholen Sie diesen Vorgang unter Verwendung zuvor definierter Pixelintensitätsschwellenwerte bei jeder fünften sagittalen Schnittnavigation, bis der äußerste rechte Aspekt des Transplantats erreicht ist. Nächstes Interpolieren: Ausgewählte Voxel aus allen 2D-ROIs in einen einzigen kombinierten 3D-ROI zeichnen das von der Software berechnete ROI-Volumen auf. Rendern Sie die 3D-Isooberfläche, um das endgültige Volumen des Fetttransplantats zu visualisieren.

Achten Sie bei der nachfolgenden Analyse darauf, dass die maximalen und minimalen Schwellenwerte für die Pixelintensität mit denen übereinstimmen, die für die Baseline-Analyse verwendet werden, nachdem die Mäuse für den Zeitpunkt der achten Woche gescannt wurden. Euthanasieren Sie die Mäuse wie im Textprotokoll beschrieben. Platzieren Sie die Maus mit einer Tenotomieschere im Operationsfeld, öffnen Sie vorsichtig die Tasche und die darüber liegenden Haut- und Bindegewebsansätze des Fetttransplantats.

Zu diesem Zeitpunkt kann es hilfreich sein, einen Fleck der darüber liegenden Rückenhaut herauszuschneiden, um eine Extraktion des Transplantats zu erleichtern. Bleiben Sie beim Exzitieren so nah wie möglich am Transplantat, um das Bindegewebe, das nach dem Exzidieren des Transplantats aus dem Transplantat entnommen wird, zu minimieren. Messen Sie die Masse auf einer zerrissenen Waage, die auf mindestens 0,01 Gramm genau ist.

Das Volumen der Fetttransplantate nahm im Verlauf der Studie schrittweise ab, was zu einem durchschnittlichen Überleben von 62,2 % in der achten Woche führte. Am Ende des Scans in der achten Woche wurde jedes Fetttransplantat in einem einzigen Stück entnommen. Ein WIL-Coxin-Rangsummentest wurde verwendet, um die Differenz zwischen Volumenmessungen von Fetttransplantaten, die entweder durch Mikro-CT erhalten oder aus der physischen Masse berechnet wurden, zu vergleichen.

Es wurde kein signifikanter Unterschied zwischen diesen beiden Methoden festgestellt. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei Stunden pro Sitzung durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Operationen und Rekonstruktionen jedes Mal auf die gleiche Weise durchzuführen.

Andere Methoden wie Immunfärbung und Q-R-T-P-C-R können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. wie die Vaskularität und Genexpression durch verschiedene Methoden der Transplantation beeinflusst wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Lipo-Aspirat für die Transplantation von seriellen CT-Scan-Transplantaten in vivo verarbeitet, das Überleben des Transplantats bewertet und Transplantate für die Gewichtshistologie und die zukünftige Analyse nach seiner Entwicklung explant. Diese Technik ebnete Forschern auf dem Gebiet der plastischen Chirurgie den Weg, die Fetttransplantation im Spiegelmodell zu erforschen.