Probenvorbereitung Strategien für Massenspektrometrie Imaging von 3D-Zellkulturmodelle

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, dreidimensionale Zellkulturen herzustellen und mittels Massenspektrometrie-Bildgebung zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst dreidimensionale Zellkulturen aufgebaut und auf die gewünschte Größe herangewachsen werden. Der zweite Schritt besteht darin, die dreidimensionalen Zellkulturen zu gewinnen und in Gelatine einzubetten.

Anschließend werden die dreidimensionalen Zellkulturen bei minus 30 Grad Celsius mithilfe eines Kryostaten in Schnitte zerlegt und auf leitfähige Objektträger aufgebracht. Der letzte Schritt besteht darin, die Schnitte mit einem Maldi-MSI-Gerät zu analysieren und die detektierten Moleküle auszuwerten. Letztendlich kommt die Massenspektrometrie-Bildgebung zum Einsatz, um die Veränderungen in der Verteilung von Analyten vieler verschiedener Biomolekülklassen innerhalb der dreidimensionalen Zellkultur darzustellen.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Massenverfahren wie der Mikroskopie oder der Autoreniographie besteht darin, dass die massenspektrometrische Bildgebung die Detektion und Lokalisierung mehrerer Analyten wie Proteine, Lipidmedikamente und Metaboliten in einem einzigen Experiment ohne Antikörpermarkierung ermöglicht. Demonstriert wird das Verfahren von Dorothy Alf Wheatcraft, mir selbst, einer Postdoktorandin, und Shin Li, einer Doktorandin aus dem Hamman-Labor. Vor Beginn dieses Verfahrens kultivieren Sie eine geeignete Zelllinie, beispielsweise die HCT116-Kolonkarzinom-Zelllinie, in einer zweidimensionalen Monolayer-Kultur. Danach geben Sie 0,19 Gramm Aros zu 10 Millilitern Standardmedium in eine 50-Milliliter-Konischglasflasche hinzu.

Um die Einbindung sicherzustellen, vorsichtig vermischen und anschließend das Agar in einem Wasserbad 20 Minuten lang im Autoklaven sterilisieren, wobei ein Mehrkanalpipettierer verwendet wird. 50 Mikroliter der Agar-Medien-Mischung in die 60 mittleren Vertiefungen einer flachen 96-Loch-Kulturplatte pipettieren. Da die Vertiefungen an den äußeren Rändern der Platte eine leicht erhöhte Verdunstungsrate aufweisen, 200 Mikroliter einer 1× Phosphat-gepufferten Salzlösung anstelle des Agars an diesen Rändern verwenden.

Nachdem die Aros-Mischung in die inneren Vertiefungen gegeben wurde, stellen Sie die Platte beiseite, um sie auf etwa 37 Grad Celsius abkühlen zu lassen, bevor die Zellen hinzugefügt werden. Geben Sie dann 200 Mikroliter der geeigneten Zelllösung zu der mit Aros beschichteten 96-Loch-Platte, decken Sie die Platte ab und stellen Sie sie in einen befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius für das Zellwachstum. Nach der Inkubation wechseln Sie das Medium, indem Sie vorsichtig das alte Medium von der kleinen dreidimensionalen Zellkultur am Boden der Aros absaugen.

Gegeben Sie dann vorsichtig 200 Mikroliter frisches Medium über die dreidimensionale Zellkultur. Bereiten Sie eine Lösung von etwa 175 Milligramm pro Milliliter Gelatine in hochreinem Wasser vor. Rühren Sie die Gelatine kräftig um, nachdem die Lösung zähflüssig geworden und schwer zu handhaben ist.

Stellen Sie das Röhrchen in ein Wasserbad bei etwa 60 Grad Celsius und erwärmen Sie es, bis die Lösung klar und leicht ansaugbar wird. Geben Sie mithilfe einer zweimilliliter-serologischen Pipette 0,6 Milliliter der warmen Gelatinelösung in die Vertiefungen einer 24-Loch-Platte mit flachem Boden. Setzen Sie die gewaschenen dreidimensionalen Zellkulturen unverzüglich mit einer anderen zweimilliliter-Pipette vorsichtig auf die Gelatinschicht, um eine Beschädigung der dreidimensionalen Struktur zu vermeiden.

Nachdem die Zellkulturen auf die Oberfläche der Gelatinschicht gebracht wurden, pipettieren Sie vorsichtig weitere 0,6 Milliliter der warmen Gelatinmischung darüber, um ihre Position nicht zu stören. Danach einfrieren. Die in Gelatin eingebetteten dreidimensionalen Zellkulturen bei minus 80 Grad Celsius.

Nachdem die 24-Well-Platte mit den Zellkulturen aus dem Gefrierschrank entnommen wurde, erwärmen Sie den Boden der Platte mit der Hand, bis die Pinzette sanft an der Seitenwand des Wells entlanggleiten kann. Bewegen Sie die Pinzette anschließend gleichmäßig um die Scheibe, um die Gelatine zu lösen, ohne das Zentrum aufzutauen.

Ein Tropfen Wasser auf die Kryostatunterlage geben und die Gelatinescheibe darauf befestigen. Anschließend im Kryostat zum Gefrieren platzieren. Nachdem die überschüssige Gelatine abgeschnitten wurde, um die dreidimensionalen Zellkulturen freizulegen, diese langsam mit gleichmäßiger Bewegung in Schnitten von 12 bis 16 µm Dicke schneiden.

Nachdem die Schnitte aufgetaut wurden, montieren Sie sie auf mit Indium-Zinn-Oxid beschichteten Objektträgern. Nachdem die Objektträger beschriftet wurden, lagern Sie sie zur intakten Proteinnachweisung in einem Exsikkator. Waschen Sie die Schnitte mit kaltem Aceton, um kleine Moleküle wie Lipide zu entfernen, die das Signal maskieren könnten.

Bereiten Sie die Matrix in einer Lösung aus organischem Lösungsmittel und Wasser mit 0,1 % Trichloressigsäure vor. Geben Sie mit einer feinnadeligen Spritze 0,5 Mikroliter der Matrixlösung auf den dreidimensionalen Zellkultur-Schnitt. Nachdem die Matrix kristallisiert ist, trocknen Sie die Objektträger mindestens 30 Minuten in einem Exsikkator vor der Maldi-MALDI-MSI-Analyse.

Analysieren Sie zu diesem Zeitpunkt die Präparate, indem Sie sie in einen Adapter einsetzen, der speziell zum sicheren Halten von 75 mm × 25 mm großen Objektträgern für die Bildgebung dreidimensionaler Zellkulturschnitte konzipiert ist. Danach wird der Objektträger-Adapter in das Gerät eingelegt. Nach Erstellung geeigneter Methoden zur Datenaufnahme stellen Sie den Massenbereich für die Erfassung von Daten zu kleinen Molekülen zwischen 101,000 m/z und für Proteine zwischen 8,020 und 5,000 m/z ein.

Danach die Laserleistung, Frequenzzahl, Anzahl der Laserimpulse und Spotgröße mithilfe der Kalibrierungslösung und einer benachbarten opferbereiten dreidimensionalen Zellkulturprobe einstellen. Diese Methode für die Verwendung in der vom Gerätehersteller bereitgestellten Bildgebungssoftware speichern. Protein-Datenerfassungsmethoden für den gewünschten Massenbereich wie zuvor beschrieben entwickeln.

Danach die spezifischen MS-Geräteparameter mithilfe der Bildgebungssoftware einrichten. Nach der Auswahl der Geräteparameter und Einrichtung der Instrumentensteuerungsmethode die Position festlegen, an der über die 3D-Zellkultur gescannt werden soll. Anschließend drei geeignete Lehnpunkte auf der Probe auswählen, wobei der Laser nacheinander zu jedem dieser Punkte bewegt wird.

Entnehmen Sie anschließend das optische Foto über die MALDI-TOF-Laser-Steuerungssoftware mithilfe der Bildschirmkopie-Funktion. Starten Sie dann den Bildgebungsprozess über die Bildgebungssoftware und erfassen Sie Massenspektren von jedem Schnitt für die gezielte Analyse. Führen Sie die manuelle Analyse der Spektren durch, indem Sie eine Masse im Mittelwert-Spektrum anklicken.

Schließlich die statistische Analyse mit den extrahierten Datensätzen in mathematischer Software durchführen. Die Massenspektrometrie-Bildgebung hat das Potenzial, zahlreiche unterschiedliche molekulare Verteilungen in dreidimensionalen Zellkulturen aufzudecken. Mithilfe der zuvor beschriebenen Methode können Spezies von kleinen Molekülen bis hin zu großen Proteinen über die gesamte Kultur verfolgt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man dreidimensionale Zellkulturen für die Massenspektrometrie-Bildgebung vorbereitet, schneidet und analysiert.