Name: Probenvorbereitung Strategien für Massenspektrometrie Imaging von 3D-Zellkulturmodelle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-12-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Lernen Sie die Probenvorbereitung für Massenspektrometrie-Imaging von 3D-Zellkulturen. Dieses Protokoll zeigt Einbettung, Kryoschnitt und MALDI-MSI-Analyse zur Detektion von Biomolekülen.

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Diese Arbeit wurde von der Walther Cancer Foundation im Rahmen des Programms "Advancing Basic Cancer Research" für das Harper Cancer Research Institute der University of Notre Dame (DARW) und dem 2011 Starter Grant der Society for Analytical Chemists of Pittsburgh (ABH) unterstützt. Vielen Dank auch an die Mitarbeiter der Mass Spectrometry and Proteomics Facility für die nützlichen Diskussionen.

1. 3D-Zellkultur und Vorbereitung für Imaging <ol><li> Kultur einer geeigneten Zelllinie, dh HCT116 Koloncarcinomzelllinie, in zweidimensionale, Monoschichtkultur. </li><li> Wachsen HCT 116-Zellen in einem T-25-Kolben mit McCoy 5A Medium + 10% fetales Rinderserum in einer 5% CO 2 kultiviert, bis 50-70% Konfluenz, was im allgemeinen einige Tage. </li><li> Release-Zellen mit 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung und besitzt eine Teil der Zellen mit einer Zählkammer und Trypanblaufärbung für die Zelldichte und die Lebensfähigkeit zu überprüfen. </li><li> Nach dem Zählen verdünnten Zellen mit vollständigem Medium, um eine geeignete Aussaatdichte von 6.000 Zellen / Vertiefung zu erreichen, oder 30.000 Zellen / ml. </li></ol> 2. Bereiten Agarose Coated 96 Well Platten <ol><li> Hinzufügen 0,19 g Agarose auf 10 ml Standard Medium in einem 50 ml konischen Röhrchen (1,5% Agarose-Lösung in Medien) 10. Achten Sie darauf, die Aufnahme von leichtem Mischen. Autoklavieren der Agarose in einem Wasserbadfür 20 min. </li><li> Mit einer Mehrkanal-Pipette absaugen 50 ul der Agarose + Medien-Gemisch in den 60 zentralen Vertiefungen der mit flachem Boden 96-Well-Platte Kulturplatte. Als die Löcher an peripheren Kanten der Platte haben etwas höhere Verdampfungsraten, fügen Sie 200 ul 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), anstatt die Agarose zu diesen Kanten. </li><li> Nachdem die Agarose-Mischung auf den inneren Brunnen hinzugefügt wurde, stellte den Teller beiseite, um abzukühlen ~ 37 ° C vor der Zugabe der Zellen. </li></ol> 3. Samen und Neigen der dreidimensionalen Kultur HINWEIS: Mehr oder weniger Zellen in Abhängigkeit von den Anforderungen der Kultur verbunden ausgesät werden, aber es ist festgestellt worden, dass diese Bedingungen führen zu 3D-Zellkultur-Strukturen von etwa 1 mm Durchmesser nach 10-14-tägiger Kultur (Daten nicht gezeigt) . <ol><li> Fügen Sie 200 ul der entsprechenden Zelllösung (verdünnt auf ~ 6.000 Zellen enthalten), um die Agarose-beschichteten96-Well-Platte. Die Platte abdecken und in befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2 für das Zellwachstum eingestellt auf 37 ° C. </li><li> Ändern Zellmedien mindestens jede 48 Stunden, oder wenn die Medien scheint sich zu ändern Farbe. <ol><li> Ändern Medien durch vorsichtiges Absaugen des alten Medien aus der Umgebung der kleinen 3D-Zellkultur (mit bloßem Auge von Tag 2) an der Unterseite der Agarose. Fügen Sie 200 ul frisches Medium sanft über die 3D-Zellkultur. </li><li> (Optionaler Schritt) In diesen Medien ändert, fügen Chemotherapeutika oder anderen Drogen zum Testen. Verdünnen Sie das Mittel der Wahl, um die Endkonzentration mit kompletter Medien und fügen Sie die erforderlichen 200 ul in jede Vertiefung. </li><li> Überwachen 3D-Zellkulturwachstum mit einem optischen Mikroskop, bis die 3D-Zellkulturen sind etwa 1 mm im Durchmesser. </li></ol></li></ol> 4. Ernte die 3D-Zellkulturen <ol><li> Verwenden Sie ein 2 ml serologische Pipette vorsichtig die 3D-Zellkultur aus der Agarose Bett. </li> &lt;li&gt; durch vorsichtiges Pipettieren sie in etwa 1 ml PBS in einem wartenden Platte mit 24 Vertiefungen Waschen Sie die 3D-Zellkulturen mit PBS. </li><li> Über geerntet 3D Zellkulturen über serologische Pipette in Zentrifugenröhrchen für Protein- oder Metaboliten Extraktion oder betten sie in einem Schneidmedium zu schneiden für Imaging-Anwendungen zu unterstützen. </li></ol> 5. Integrieren Sie die 3D-Zellkulturen in Gelatine <ol><li> Bereiten Sie eine Lösung von ~ 175 mg / ml Gelatine in hochreinem Wasser (18 MOhm bevorzugt). 22,23 Mischen Sie die Gelatine kräftig. Beachten Sie die Lösung viskos und schwierig zu handhaben. Setzen Sie den gelatinehaltigen konischen Röhrchen in ein Wasserbad bei ~ 60 ° C warm, bis die Lösung klar und einfach zu saugen. HINWEIS: Die warme Gelatinelösung härtet schnell, wenn sie abkühlt, so führen Sie alle folgenden Schritte schnell vor dem Einfrieren. </li><li> Nachdem es erhitzt wird, nehmen Sie die Gelatine sofort an die Zellkultur Kapuze. Halten Sie das Röhrchen mit Gelatine in einer beaker mit vorgewärmte Wasser bei etwa 60 ° C, um die Härtung der Gelatinelösung zu vermeiden. </li><li> Mit einem 2 ml serologische Pipette einzahlen 0,6 ml der warmen Gelatinelösung in die Vertiefung einer Flachbodenplatte 24. Das Volumen ist ausreichend, um den Boden in einer dünnen Schicht zu bedecken. Die 3D-Zellkulturen vorsichtig abzuscheiden unmittelbar auf der Gelatineschicht mit einem anderen 2-ml-Pipette zu vermeiden Zerreißen der 3D-Struktur. HINWEIS: Es muss zu diesem Zeitpunkt treffen nicht auf PBS in die Gelatine platzieren werden. Wenn dies geschieht, aber entfernen PBS von der Oberseite der Gelatine unter Verwendung einer 200 ul-Pipette. </li><li> Nachdem die 3D-Zellkulturen auf die Oberfläche der Gelatine-Schicht angeordnet ist, sorgfältig zu pipettieren Weitere 0,6 ml der warmen Gelatinemischung in den 3D-Zellkulturen, so dass die Position der Kulturen nicht zu stören. Nachdem die zweite Schicht angeordnet ist, ein Einfrieren der Gelatine eingebettete 3D-Zellkulturen bei 80 ° C. </li></ol> 6. Scheibe und Thaw Berg the Gelatine eingebettete 3D-Zellkulturen für die bildgebenden Massenspektrometrie <ol><li> Entfernen Sie die Platte mit 24 Vertiefungen, die 3D-Zellkulturen aus dem Gefrierschrank enthält. Wärmen Sie die Unterseite der Platte mit der Wärme aus der Hand, bis eine Pinzette oder einem Skalpell wird sanft an der Seite des gut gleiten. </li><li> Sanft gleiten die Pinzette oder Skalpell, die Befreiung der Gelatine ohne Auftauen der Mitte. Einen Tropfen von Wasser zu dem Kryostaten unterstützt und verwendet dies, um die Gelatineplatte an dem Träger haften. <ol><li> 3D-Zellkulturen in Gelatine eingebettet sind nach ihrer Eignung für das Schneiden bei -30ºC. Reinigen des Kryostaten Klinge und Glas mit 70% igem Ethanol vor der Verwendung. Verwenden einen anderen Teil der Laufschaufel oder eine neue Klinge für jedes 3D-Zellkultur-Gelatinescheibe Abstumpfen der Klinge zu verhindern. </li></ol></li><li> Mit dem Kryostaten, sanft Gesicht das überschüssige Gelatine, bis die 3D-Zellkulturen sichtbar werden. </li><li> An dieser Stelle langsam in Scheiben schneiden 3D-Zellkulturen mit einer gleichmäßigen Bewegung in 12-16 um-Schnitte. HINWEIS: Kritische Faktoren slicing umfassen die Entfernung des Glases an der Klinge, der Klingenwinkel, die Temperatur des Kryostaten und der Winkel der Platte auf dem Träger, so dass alle von ihnen überprüft, um konsistente Ergebnisse sicherzustellen. </li><li> Vorsichtig auftauen die Scheiben und montieren sie auf Indium-Titan-Oxid (ITO) beschichteten Glasobjektträger entsprechend gekennzeichnet und speichern sie in einem Exsikkator. Nutzen Sie die Scheiben so schnell wie möglich für maximale Qualität. </li></ol> 7. Matrix Anwendung und Probenvorbereitung für MALDI-Imaging <ol><li> Vor der MALDI-Imaging, bereiten Scheiben mit der entsprechenden Matrix. <ol><li> Für kleine Molekülanalyse sind keine Waschschritte benötigt. Für intaktes Protein-Nachweis, wäscht die Scheiben in kaltem 100% Aceton, um Carnoy-Flüssigkeit oder 70% / 95% Isopropanol kleine Moleküle, wie Lipide, die das Signal überdecken könnten, zu entfernen. 24 - 26 </li><li> Wäsche leicht für nicht mehr als 30 s zu einem Zeitpunkt. Unterlassen Sieum alle Scheiben zu stören. </li></ol></li><li> Bereiten Matrix in eine Lösung aus organischem Lösungsmittel und Wasser mit 0,1% TFA. Für kleine Moleküle, wie α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA) benutzen 60% ACN: 40% H 2 O: 0,1% TFA (10 mg / ml). Für Proteinnachweis wie Sinapinsäure (30 mg / ml), das gleiche Lösungsmittel-Lösung. Für eine optimale Löslichkeit der Sinapinsäure ersten aufzulösen in Acetonitril vor Zugabe des TFA: H 2 O-Lösung. Andere Matrices können gegebenenfalls verwendet werden. HINWEIS: Matrix kann mit verschiedenen Verfahren aufgebracht werden, aber es sollte angemerkt werden einige Matrices gefunden worden, zusammen kristallisieren mit der Gelatine, wie Ferulasäure, wodurch die Probe unbrauchbar werden. Kleinere Kristalle produzieren konsequenter Massenspektren und sorgt für mehr Molekülarten zu erfassen und auf biologische Unterschiede statt Matrixeffekte zurückzuführen. </li><li> Bewerben Matrix durch handspotting Verfahren. <ol><li> Verwenden Sie einen spitzen Spritze zu 0,5 ul der matr geltenix Lösung auf dem 3D-Zellkultur in Scheiben schneiden und damit die Matrix zu kristallisieren. </li></ol></li><li> Alternativ können Sie die Airbrush-Verfahren. Füllen Sie eine handelsübliche Airbrush mit dem Matrix-Lösung. <ol><li> Halten Sie die Spritze 8-12 cm entfernt von dem Objektträger, wollen einen feinen Sprühnebel auf der Scheibe. In zwischen den Durchgängen, damit die Matrix trocknen für 1 min für die beste Kristallbildung zu ermöglichen. Bis zu 10-20 Durchläufe der Airbrush ist erforderlich, um eine optimale Matrixschicht 22 zu erzeugen. </li></ol></li><li> Alternativ können Sie die Sublimationsverfahren an anderer Stelle beschrieben. 25,27 </li><li> Trocken gleitet in einem Exsikkator für mindestens 30 min vor der MALDI-MSI, unabhängig von der Methode der Matrix-Anwendung. 25 </li></ol> 8. MALDI-MSI Analyse mithilfe eines MALDI-TOF-System (dh Autoflex III) HINWEIS: Dieser Abschnitt enthält Anweisungen und Ratschläge zum Einstellen von Parametern für eine MALDI-TOF-Imaging-Experiments. In Abhängigkeit von den instrument Hersteller und Software verwendet wird, kann das Verfahren zu variieren. <ol><li> Setzen Sie die Dias in einem Adapter, um sicher zu halten, 75 mm x 25 mm Dias, um Bild die 3D-Zellkulturscheiben auf ITO-beschichtete Objektträger befestigt. Laden Sie den Schiebeadapter in das Gerät. </li><li> Bereiten Sie das Gerät für MALDI-MSI durch Auswahl eines geeigneten Kalibrierungsstandard für den Massenbereich in Frage. Zur Abfrage von kleinen Molekülen, die erfassten Signale, die auf die Matrix verwendet, α-CHCA entsprechen, sind eine gemeinsame Gruppe von Eichsubstanzen. Für die Analyse von Proteinen, sind bekannte Proteinstandards (dh Ubiquitin, Trypsinogen) im Massenbereich von Interesse ausgewählt und gesichtet benachbart zu den 3D-Zellkulturen als Eichsubstanzen. Kalibrieren Sie das Gerät, bevor Sie mit der Methodenentwicklung voran. </li><li> Vor der Bildgebung, entwickeln Methoden der Datenerfassung für die Massenbereich bei Verwendung der vom Gerätehersteller zur Verfügung gestellte Software. Siehe Figuren 1 und 2 fürkleinen Molekülen und Proteinen Bildgebung. Für kleine Molekül Bildgebung verwenden Reflektronmodus für die höchste Massenauflösung. <ol><li> Stellen Sie den Massenbereich für kleine Molekül Datenerfassung zwischen 100-1.000 m / z und für Proteine ​​zwischen 8.000 25.000 m / z. Stellen Sie den Massenbereich, die Region der Wahl umfassen, während die höchste Massenauflösung mit dem Gerät möglich. </li><li> Passen Sie die Laserleistung, Frequenz, Anzahl der Laserschüsse und Spotgröße mit Hilfe der Kalibrierungslösung und eine in der Nähe &quot;Opfer &#39;3D-Zellkultur-Slice. Beachten Sie diese Einstellungen in der Hauptgerätesteuerung Software. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen als empfohlene Anfangspunkt: 60% Energie, 400 Laserschüsse, ultra kleinen Spotgröße. Diese Einstellungen werden über Instrumente und Methoden variieren, so optimieren, Geräteparameter, die höchste Qualität Spektren für jede spezifische Instrument geben. Andere Parameter, die eingestellt werden können, umfassen die Detektorverstärkung, die Abtastrate, und elektronische Verstärkung. Save diese Methode für den Einsatz in der Bildbearbeitungssoftware (dh., AutoExecute Methode, dass FlexImaging wird zurückgreifen). HINWEIS: Unterdrücken-Ionen unter dem Massenbereich von Interesse (wieder in der Gerätesteuerung zu finden), um nicht den Nachweis stören. </li><li> Entwickeln Proteindatenerfassungsmethoden für die Massenbereich der Wahl. Folgen Sie den gleichen oben beschriebenen Schritte, aber für die mittleren bis hohen Massenbereichen, oberhalb von etwa 3 kDa, verwenden linearen Modus. HINWEIS: Die Einstellungen werden von den für kleinmolekularen Methoden abweichen. </li></ol></li><li> Setup-spezifische MS Geräteparameter mit Hilfe der Imaging-Software vom Hersteller des Instruments, wie FlexImaging für Bruker MALDI-TOF-Systeme zur Verfügung gestellt. <ol><li> Erstellen Sie eine neue Bilddatei und den Ordner mit den vor entwickelt und gespeicherten Methoden. Wählen Sie die Geräteparameter wie Rasterpunktgröße (Wechsel von der Standard etwa 200 um bis 50 um), die Gerätesteuerung Methode (Setup in Schritt 8.3.2 oder 8.3.3) eingestellt und position, wo man über die 3D-Zellkultur zu scannen. </li><li> Wählen Sie drei geeignete Teachpunkte auf der Probe, Bewegen des Lasers sich nacheinander. Besorgen Sie sich die optische Fotografie von der MALDI-TOF-Lasersteuerungssoftware mit &quot;Print Screen&quot;. HINWEIS: Viele Bildbearbeitungsprogramme erfordern eine optische Fotografie von der Probe zu &quot;lehren&quot; die Software, wo der Laser befindet, die mit einem Scanner oder oft das Instrument Kamera erhältlich ist. </li></ol></li><li> Dann starten Sie den Bildgebungsprozess von der Imaging-Software (nicht die Gerätesteuerung) und erwerben Massenspektren von jeder Scheibe. Beachten Sie die meisten Massen über die 3D-Zellkultur und andere auf bestimmte Bereiche lokalisiert. </li></ol> 9. Optional Datenanalysemethoden <ol><li> Für gezielte Analysen, führen Sie eine manuelle Analyse der Spektren, indem Sie auf eine Masse im mittleren Spektrum, oder lassen Sie die Imaging-Software, um automatisch Massen nehmen ab einer bestimmten Schwelle (z. B. Spitzen above die obere Schwelle von 20%). Für die Qualitätskontrolle, die Aufteilung von Matrix-Gipfel oder die mittlere Spektrum. </li><li> Führen Sie statistische Auswertungen mit extrahierten Datensätzen in der mathematischen Software wie R oder Matlab. <ol><li> Export Einzelspektren im ASCII-Format, eine lesbare Textdatei zum Laden in die Software der Wahl. </li><li> Konvertieren Sie die Einzelspektren in ASCII, mzXML, der mzML Format zum Lesen von verschiedenen Software-Programme, 28 -. 31 oder die Daten zu exportieren als Analysieren (.img) Format-Datei, ein gemeinsames Muster für andere bildgebende Anwendungen wie MRI verwendet 32 Zwei Open-Source-Optionen für die Analyse sind MSiReader und BioMap 32,33. </li><li> Sobald die Dateien werden in ein lesbares Format der Software ausgeführt werden, laden Sie die Datenmenge über den Anweisungen in der jeweiligen Software. Nach dem Laden, führen nach dem Erwerb Verarbeitung, wie Basisentfernung und Normalisierung. </li><li> Mit diesem Datensatz, führen statistical Behandlungen wie Hauptkomponentenanalyse der hierarchischen Cluster entweder benutzerdefinierte Skripts oder Algorithmen in Software integriert wie Matlab 18. </li></ol></li></ol>

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Dieser Artikel ist Teil einer Sonderausgabe zum Thema Multimodale präklinische Bildgebung, die von Bruker Biospin gesponsert wird. Das MALDI-TOF-System, das zur Erzielung der repräsentativen Ergebnisse verwendet wird, ist ein Bruker AutoFlex III.

Unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren kann 3D-Zellkulturen gezüchtet und mit MALDI-MSI analysiert werden. Viele immortalisierte Zelllinien werden 3D-Strukturen zu bilden, wenn kultiviert angemessen. 9,10 ist darauf zu Zellen, die nicht zu oft übergeben wurden, das heißt, eine geringe Durchgangsnummern pflegen werden. Im Allgemeinen werden Zellen mit Durchgangszahlen von zehn und unteren optimal für wachsenden 3D-Zellkulturen. Wachsende die 3D-Zellkulturen in einem traditionellen Agarose-Unterstützung stellt eine kostengünstige Möglichkeit für Forschungsgruppen, die sich in der 3D-Zellkultur, dieses System zu versuchen. Dieses Verfahren verwendet wenige Komponenten nicht schon in den meisten Säugerzellkulturlaboratorien. Besondere Aufmerksamkeit muss der Vorbereitung der Agaroseplatten Wachstums geachtet werden, dass die 3D-Zellkulturen mit einheitlicher Größe und Form; Einige Aspekte, die besondere Aufmerksamkeit erfordern, schließen die Überprüfung, dass keine Luftblasen in der Mischung, und daß eine richtige Meniskus an dem Boden jedes w gebildeten eingeschlossenenell. Wenn der Meniskus nicht richtig zu bilden, können die Zellen in nicht-kugelförmigen Formen oder in kleine Klumpen wachsen. Auch muss darauf geachtet werden, dass PBS in die Gelatine mit der Sphäroide zu erteilen. Ist dies der Fall, entfernen Sie das PBS von der Spitze der Gelatine mit einer 200 ul Pipette. Wenn die Kosten keine Rolle spielen, sind ultra-geringe Bindungsrundbodenplatten im Handel erhältlich und bieten eine Vereinfachung dieser Schritte. Während andere Gewebeeinbettung Methoden können auch teuer und nicht-Massenspektrometrie kompatibel zu sein, ist Gelatine-Einbettung sich gezeigt, sowohl kostengünstig und vielseitig. Vorbereitung Strategien oben umrissen wurden optimiert für 3D-Zellkulturen, um die hochwertigsten Daten zu erhalten. Während Gelatine-Einbettung ist gezeigt worden, mit Massenspektrometrie-Analyse kompatibel ist, macht diesen Prozess einzugrenzen die verfügbaren Matrizen durch Co-Kristallisation. Wenn sie gefroren ist, werden die 3D-Zellkulturen, solange sie nicht gefriertaut für Monate stabil. Die Gelatine wird undurchsichtig, wenn eingefroren, und der 3D-ZellKulturen sind von einer ähnlichen Farbe, so ist es ratsam, vor dem Einfrieren, die 3D-Zellkultur-Platzierung in Slicing helfen zu dokumentieren ist. Bei der Herstellung von Folien, kann Matrix mit verschiedenen Verfahren aufgebracht werden, aber es sollte angemerkt werden, dass einige Matrices gefunden worden, zusammen kristallisieren mit der Gelatine, wie Ferulasäure, wodurch die Probe unbrauchbar werden. Kleinere Matrixkristalle erzeugen konsequenter Massenspektren. Während handspotting ist die einfachste Methode der Matrix-Anwendung kann der größeren Lösungsmittelvolumen in größeren Kristallgrößen und bedeutsamen Analyten Migration führen. Bei dem Massenspektrometer, schreitet in MALDI-MSI Technologien haben die für den Beginn Analysen erforderlichen Fachwissen verringert. Datenerfassung und Analyse ist einfach auf den meisten Systemen, so dass auch ein Anfänger, qualitativ hochwertige Informationen aus ITO-beschichtete Folien zu erhalten. Die sorgfältige Auswahl der Geräteparameter, auf dem nahe gelegenen Nichtbild würdig 3D-Zell cultur optimiertes ist kritisch, um qualitativ hochwertige Daten. So kann beispielsweise zunehmender Laserleistung Spitzenintensität zu erhöhen, aber abnehmende Laserleistung kann die Auflösung zu verbessern und geben mehr symmetrische Peakformen. 3D-Zellkulturen sollten nach dem Schneiden, um eine optimale Qualität zu gewährleisten Probe schnell eingesetzt werden. Der Abbau von Protein-Signal kann in weniger als einer Woche, ohne fachgerechte Lagerung (Exsikkator / -80 ° C Tiefkühlschrank) gesehen werden, vor allem in der hohen Massenbereich (über 20 kDa). Aufgrund der wachsenden Nachfrage haben viele verschiedene Visualisierungs-Software-Programme entwickelt und sind frei, die Forschung der Öffentlichkeit. Die meisten bildgebenden Massenspektrometer haben die erforderlich sind, um einzelne Massen mit den proprietären Formaten auf jedem Instrument visualisieren Software installiert. Diese Software-Programme verwendet werden, um Einzelmassen Bilder die Daten zu erhalten und zu exportieren. Die meisten Software ermöglicht auch die Überlagerung von zwei oder mehr Massen von Interesse. Darüber hinaus haben viele verschiedene Betrachter für MSI Daten können kostenlos heruntergeladen werden, wie zum Beispiel ein MSiReaderd BioMap. 32,33 Die Massenspektrometrie gewonnenen Daten können auch verarbeitet werden nach der Übernahme mit Leichtigkeit, bringen weitere nützliche Informationen in den Vordergrund. Von Pharmazeutika an Lipide, Proteine, wobei das System oben beschrieben ermöglicht eine schnelle Erfassung von Daten, um die Verteilung von Molekülen von Interesse in einem 3D-Zellkultur Struktur auszuwerten. Serienschnitte, um die Bild die gesamte 3D-Struktur durch den Bau von jeder 2D-Bild der ein Stück von der 3D-Zellkultur genommen werden. Die Techniken und die Noten im Protokoll von Nutzen Forscher, die dreidimensionale Zellkultur als eine Brücke zwischen einer Monoschichtkultur und Tiermodellen zu beginnen. Einmal gemeistert, können diese Techniken auf mehrere Arten von 3D-Zellkulturen, Geweben und Zellkulturen verwendet werden, so dass die Forscher Bild je nachdem Proben sie wählen.

Massenspektrometrie-Bildgebung (MSI) ist eine leistungsfähige Technik, um die Verteilung von Molekülspezies über interessierende Proben zu untersuchen. Forscher haben mit dieser Technik biologische Proben von ganzen Tieren bis hin zu einzelnen Zellen abgebildet. 1–4 Mit MSI können Hunderte von Analyten gleichzeitig abgebildet werden, anstatt bei Einzelsubstrattechniken die Entwicklung zusätzlicher Fluorophore für die traditionelle konfokale Mikroskopie oder die Färbung für die Histologie zu erfordern. 5–7 Darüber hinaus kann MSI entweder gezielt oder entdeckungsbasiert eingesetzt werden, was es zu einem attraktiven Ansatz macht, um die Überlappung zwischen der Verteilung chemischer Spezies zu untersuchen. Vorgestellt werden Methoden für das Wachstum, die Präparation und die matrixgestützte Laserdesorptionsionisation/-desorption (MALDI) von kleinen Proben (~1 mm Durchmesser) von dreidimensionalen multizellulären Zellkulturen. 8–11 Uhr
3D-Zellkulturen sind für die biologische Gemeinschaft von besonderem Interesse als Vermittler zwischen traditionellen Monolayer-Kulturen und in vivo Tumoren. Wie der Name schon sagt, handelt es sich bei 3D-Zellkulturen um heterogene zelluläre Aggregate, die viele der chemischen Gradienten in der Mikroumgebung enthalten, die in kleinen avaskulären Tumorknötchen beobachtet werden, was sie zu einem realistischeren Modellsystem für die native Tumorumgebung macht als Monolayer-Kulturen. 10 Viele humane Zelllinien können als 3D-Kulturen gezüchtet werden, einschließlich Zelllinien, die aus Dickdarm-, Brust-, Eierstock-, Prostata-, Nieren- und Lungengewebe gewonnen werden. 10 Die Bildgebung dreidimensionaler Zellkulturen ist mit Herausforderungen verbunden, da sie kleiner sind als viele Proben, die üblicherweise für die massenspektrometrische Bildgebung verwendet werden, und daher eine sorgfältige Probenvorbereitung erfordern. 7 Zu den Vorteilen dieser handhabbaren Modellsysteme gehören jedoch geringere Kosten und eine schnellere Wachstums- und Analysezeit im Vergleich zu Tiermodellen. Infolgedessen können Studien mit dreidimensionalen Zellkulturen einen höheren Durchsatz aufweisen als herkömmliche Tierversuche. 12–14 Uhr
All diese Vorteile haben dazu geführt, dass dreidimensionale Zellkulturen in der biologischen Forschung immer beliebter werden; es besteht ein entsprechender Bedarf, neue analytische Strategien zu entwickeln, um sowohl die Zusammensetzung als auch die räumliche Verteilung von Molekülen in diesen Systemen zu untersuchen. 12,15–21 Das Ziel dieses Manuskripts ist es, die Adaption von massenspektrometrischen, bildgebenden Verfahren und der Probenvorbereitung an dreidimensionale Zellkulturen zu beschreiben.

<table><tbody><tr><td>HCT116 Zelllinie</td><td>ATCC</td><td>ATCC CCL-247</td><td>Potenzielle Gefahr, vorsichtig behandeln</td></tr><tr><td>McCoy's 5A Medien</td><td>Gibco</td><td>16600-108</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>0,25% Trypsin-EDTA-Lösung</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat Gepufferte Kochsalzlösung</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine, geschmacksneutraler</td><td>Knox</td><td></td><td>Erhältlich in den meisten Lebensmittelgeschäften in Einzelpackungen</td></tr><tr><td>ITO-beschichtete Objektträger</td><td>Delta Technologies, Limited</td><td>CG-90IN-S115</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-Cyano-4-hydroxyzimtsäure (CHCA)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8982</td><td></td></tr><tr><td>Sinapic Acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85429</td><td></td></tr><tr><td>0,3 mm Schwerkraftzufuhr Dual-Action Airbrush Farbspritzpistole Set</td><td>RoyalMax Airbrush</td><td></td><td>Viele Optionen auf Websites wie Amazon.com</td></tr></tbody></table>

probenvorbereitung strategien für massenspektrometrie imaging von 3d-zellkulturmodelle

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Dreidimensionale Zellkulturen sind attraktive Modelle für die biologische Forschung. Sie kombinieren die Flexibilität und Kosteneffizienz der Zellkultur mit einem Teil der räumlichen und molekularen Komplexität von Gewebe. Zum Beispiel bilden viele Zelllinien 3D-Strukturen, wenn geeignete In-vitro-Bedingungen gegeben sind. Darmkrebszelllinien bilden 3D-Zellkultur-Sphäroide, in vitro Imitika von avaskulären Tumorknötchen. Während die Immunhistochemie und andere klassische bildgebende Verfahren beliebt sind, um die Verteilung spezifischer Analyten zu überwachen, untersucht die massenspektrometrische Bildgebung die Verteilung von Molekülklassen auf unvoreingenommene Weise. Während die massenspektrometrische Bildgebung von MALDI ursprünglich entwickelt wurde, um Proben aus Menschen- oder Tiermodellen zu untersuchen, beschreibt dieser Bericht die Analyse von dreidimensionalen In-vitro-Zellkulturen, einschließlich Verbesserungen bei den Probenvorbereitungsstrategien. Hierin werden Verfahren zum Züchten, Ernten, Schneiden, Waschen und Analysieren von 3D-Zellkulturen mittels matrixgestützter Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie (MALDI-MS) Bildgebung beschrieben. Unter Verwendung von 3D-Zellkulturen des Dickdarmkarzinoms als Modellsystem demonstriert dieses Protokoll die Fähigkeit, Analyten auf unvoreingenommene Weise über das gesamte 3D-Zellkultursystem mit MALDI-MSI zu überwachen.

MSI-Bildgebung hat das Potential, offenbaren verschiedene molekulare Verteilung in 3D-Zellkulturen. Verwendung der oben beschriebenen Methode kann Arten von kleinen Molekülen (Abbildung 1), um große Proteine ​​(Abbildung 2) in der Kultur verfolgt werden. Diese Ergebnisse zeigen, Visualisierung eines einzelnen Ions mit dem kostenlosen Tool MSiReader. 32 Die Ergebnisse können für die einzelnen Ionen von Interesse in der 3D-Zellkultur mit Visualisierungs-Software entweder in einer Region von Interesse oder das gesamte gescannte Region analysiert werden. Darüber hinaus die meisten Software-Ionen über eine bestimmte Schwelle durch den Benutzer, die Forschungsbemühungen zu unterstützen kann automatisch eingestellt visualisieren. Sobald Einzelionen Karten erhalten werden, sind die meisten Software die Fähigkeit, um die Bilder zu überlagern, um die Co-Lokalisierung von Ionen zu sehen. Entweder in Discovery-basierte Ansätze oder gezielt, ist die Massenspektrometrie Bildgebung ein leistungsfähiges Werkzeug zur 3D-Zellkulturen zu untersuchen. Abbildung 1. Repräsentative Ergebnisse der 3D-Zellkulturwachstum und Schnitte. Links) Optisches Bild einer intakten kolorektalen HCT-116-3D-Zellkultur-Struktur am 14. Tag vor der Ernte angesehen. Rechts) Optische Bild eines etwa äquatorialen Scheibe eines kolorektalen 3D Zellkultur Tauwetter auf ein ITO-beschichteten Objektträger für die Bildgebung montiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig2highres.jpg" /> Abbildung 2. Repräsentative Ergebnisse von Kleinmolekül-MALDI-MSI von einer äquatorialen Abschnitt einer 3D-Zellkultur. Top) Durchschnittliche Massenspektren mit α-CHCA im geringen Masse (kleines Molekül) Bereich erreicht. Bottom) Vertreter Bildereine einzige Masse: 327,8 m / z Wesentlichen auf das Innere des 3D-Zellkultur und lokalisiert 429,7 m / z Wesentlichen auf der Kante des 3D-Zellkultur lokalisiert. Eine gestrichelte Linie zeigt den ungefähren Rand der Sphäroid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52313/52313fig3highres.jpg" /> Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse von Protein-Bildgebung mittels MALDI-MSI von einer äquatorialen Abschnitt einer 3D-Zellkultur. Top) Durchschnittliche Massenspektren mit Sinapinsäure in der höheren (Protein) Massenbereich erreicht. Unten) Repräsentative Bilder eines einzelnen Masse: 10.871 m / z Wesentlichen auf der Kante des Sphäroids lokalisiert und 12.184 m / z mehr in Richtung des Inneren des Sphäroids lokalisiert. Eine gestrichelte Linie zeigt den ungefähren Kante des Sphäroids. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52313/52313fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a>

Verewigt Krebszelllinien können als 3D-Zellkulturen, ein wertvolles Modell für die biologische Forschung angebaut werden. Dieses Protokoll beschreibt Massenspektrometrie Bildgebung von 3D-Zellkulturen, einschließlich Verbesserungen in der Probenzubereitung Plattform. Das Ziel des Protokolls ist es, die Benutzer anweisen, 3D-Zellkulturen für die Massenspektrometrie Bildanalyse vorzubereiten.

Probenvorbereitung Strategien für Massenspektrometrie Imaging von 3D-Zellkulturmodelle

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, dreidimensionale Zellkulturen herzustellen und mittels Massenspektrometrie-Bildgebung zu analysieren. Dies wird erreicht, indem zunächst dreidimensionale Zellkulturen aufgebaut und auf die gewünschte Größe herangewachsen werden. Der zweite Schritt besteht darin, die dreidimensionalen Zellkulturen zu gewinnen und in Gelatine einzubetten.Anschließend werden die dreidimensionalen Zellkulturen bei minus 30 Grad Celsius mithilfe eines Kryostaten in Schnitte zerlegt und auf leitfähige Objektträger aufgebracht. Der letzte Schritt besteht darin, die Schnitte mit einem Maldi-MSI-Gerät zu analysieren und die detektierten Moleküle auszuwerten. Letztendlich kommt die Massenspektrometrie-Bildgebung zum Einsatz, um die Veränderungen in der Verteilung von Analyten vieler verschiedener Biomolekülklassen innerhalb der dreidimensionalen Zellkultur darzustellen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Massenverfahren wie der Mikroskopie oder der Autoreniographie besteht darin, dass die massenspektrometrische Bildgebung die Detektion und Lokalisierung mehrerer Analyten wie Proteine, Lipidmedikamente und Metaboliten in einem einzigen Experiment ohne Antikörpermarkierung ermöglicht. Demonstriert wird das Verfahren von Dorothy Alf Wheatcraft, mir selbst, einer Postdoktorandin, und Shin Li, einer Doktorandin aus dem Hamman-Labor. Vor Beginn dieses Verfahrens kultivieren Sie eine geeignete Zelllinie, beispielsweise die HCT116-Kolonkarzinom-Zelllinie, in einer zweidimensionalen Monolayer-Kultur. Danach geben Sie 0,19 Gramm Aros zu 10 Millilitern Standardmedium in eine 50-Milliliter-Konischglasflasche hinzu. Um die Einbindung sicherzustellen, vorsichtig vermischen und anschließend das Agar in einem Wasserbad 20 Minuten lang im Autoklaven sterilisieren, wobei ein Mehrkanalpipettierer verwendet wird. 50 Mikroliter der Agar-Medien-Mischung in die 60 mittleren Vertiefungen einer flachen 96-Loch-Kulturplatte pipettieren. Da die Vertiefungen an den äußeren Rändern der Platte eine leicht erhöhte Verdunstungsrate aufweisen, 200 Mikroliter einer 1× Phosphat-gepufferten Salzlösung anstelle des Agars an diesen Rändern verwenden.Nachdem die Aros-Mischung in die inneren Vertiefungen gegeben wurde, stellen Sie die Platte beiseite, um sie auf etwa 37 Grad Celsius abkühlen zu lassen, bevor die Zellen hinzugefügt werden. Geben Sie dann 200 Mikroliter der geeigneten Zelllösung zu der mit Aros beschichteten 96-Loch-Platte, decken Sie die Platte ab und stellen Sie sie in einen befeuchteten Inkubator mit 5 % Kohlendioxid bei 37 Grad Celsius für das Zellwachstum. Nach der Inkubation wechseln Sie das Medium, indem Sie vorsichtig das alte Medium von der kleinen dreidimensionalen Zellkultur am Boden der Aros absaugen.Gegeben Sie dann vorsichtig 200 Mikroliter frisches Medium über die dreidimensionale Zellkultur. Bereiten Sie eine Lösung von etwa 175 Milligramm pro Milliliter Gelatine in hochreinem Wasser vor. Rühren Sie die Gelatine kräftig um, nachdem die Lösung zähflüssig geworden und schwer zu handhaben ist.Stellen Sie das Röhrchen in ein Wasserbad bei etwa 60 Grad Celsius und erwärmen Sie es, bis die Lösung klar und leicht ansaugbar wird. Geben Sie mithilfe einer zweimilliliter-serologischen Pipette 0,6 Milliliter der warmen Gelatinelösung in die Vertiefungen einer 24-Loch-Platte mit flachem Boden. Setzen Sie die gewaschenen dreidimensionalen Zellkulturen unverzüglich mit einer anderen zweimilliliter-Pipette vorsichtig auf die Gelatinschicht, um eine Beschädigung der dreidimensionalen Struktur zu vermeiden.Nachdem die Zellkulturen auf die Oberfläche der Gelatinschicht gebracht wurden, pipettieren Sie vorsichtig weitere 0,6 Milliliter der warmen Gelatinmischung darüber, um ihre Position nicht zu stören. Danach einfrieren. Die in Gelatin eingebetteten dreidimensionalen Zellkulturen bei minus 80 Grad Celsius.Nachdem die 24-Well-Platte mit den Zellkulturen aus dem Gefrierschrank entnommen wurde, erwärmen Sie den Boden der Platte mit der Hand, bis die Pinzette sanft an der Seitenwand des Wells entlanggleiten kann. Bewegen Sie die Pinzette anschließend gleichmäßig um die Scheibe, um die Gelatine zu lösen, ohne das Zentrum aufzutauen.Ein Tropfen Wasser auf die Kryostatunterlage geben und die Gelatinescheibe darauf befestigen. Anschließend im Kryostat zum Gefrieren platzieren. Nachdem die überschüssige Gelatine abgeschnitten wurde, um die dreidimensionalen Zellkulturen freizulegen, diese langsam mit gleichmäßiger Bewegung in Schnitten von 12 bis 16 µm Dicke schneiden.Nachdem die Schnitte aufgetaut wurden, montieren Sie sie auf mit Indium-Zinn-Oxid beschichteten Objektträgern. Nachdem die Objektträger beschriftet wurden, lagern Sie sie zur intakten Proteinnachweisung in einem Exsikkator. Waschen Sie die Schnitte mit kaltem Aceton, um kleine Moleküle wie Lipide zu entfernen, die das Signal maskieren könnten.Bereiten Sie die Matrix in einer Lösung aus organischem Lösungsmittel und Wasser mit 0,1 % Trichloressigsäure vor. Geben Sie mit einer feinnadeligen Spritze 0,5 Mikroliter der Matrixlösung auf den dreidimensionalen Zellkultur-Schnitt. Nachdem die Matrix kristallisiert ist, trocknen Sie die Objektträger mindestens 30 Minuten in einem Exsikkator vor der Maldi-MALDI-MSI-Analyse.Analysieren Sie zu diesem Zeitpunkt die Präparate, indem Sie sie in einen Adapter einsetzen, der speziell zum sicheren Halten von 75 mm × 25 mm großen Objektträgern für die Bildgebung dreidimensionaler Zellkulturschnitte konzipiert ist. Danach wird der Objektträger-Adapter in das Gerät eingelegt. Nach Erstellung geeigneter Methoden zur Datenaufnahme stellen Sie den Massenbereich für die Erfassung von Daten zu kleinen Molekülen zwischen 101,000 m/z und für Proteine zwischen 8,020 und 5,000 m/z ein.Danach die Laserleistung, Frequenzzahl, Anzahl der Laserimpulse und Spotgröße mithilfe der Kalibrierungslösung und einer benachbarten opferbereiten dreidimensionalen Zellkulturprobe einstellen. Diese Methode für die Verwendung in der vom Gerätehersteller bereitgestellten Bildgebungssoftware speichern. Protein-Datenerfassungsmethoden für den gewünschten Massenbereich wie zuvor beschrieben entwickeln.Danach die spezifischen MS-Geräteparameter mithilfe der Bildgebungssoftware einrichten. Nach der Auswahl der Geräteparameter und Einrichtung der Instrumentensteuerungsmethode die Position festlegen, an der über die 3D-Zellkultur gescannt werden soll. Anschließend drei geeignete Lehnpunkte auf der Probe auswählen, wobei der Laser nacheinander zu jedem dieser Punkte bewegt wird.Entnehmen Sie anschließend das optische Foto über die MALDI-TOF-Laser-Steuerungssoftware mithilfe der Bildschirmkopie-Funktion. Starten Sie dann den Bildgebungsprozess über die Bildgebungssoftware und erfassen Sie Massenspektren von jedem Schnitt für die gezielte Analyse. Führen Sie die manuelle Analyse der Spektren durch, indem Sie eine Masse im Mittelwert-Spektrum anklicken.Schließlich die statistische Analyse mit den extrahierten Datensätzen in mathematischer Software durchführen. Die Massenspektrometrie-Bildgebung hat das Potenzial, zahlreiche unterschiedliche molekulare Verteilungen in dreidimensionalen Zellkulturen aufzudecken. Mithilfe der zuvor beschriebenen Methode können Spezies von kleinen Molekülen bis hin zu großen Proteinen über die gesamte Kultur verfolgt werden.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man dreidimensionale Zellkulturen für die Massenspektrometrie-Bildgebung vorbereitet, schneidet und analysiert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Hier präsentieren wir Protokolle zur Durchführung sowohl der Umgebungsmassenspektrometrie-Bildgebung (MSI) von Geweben als auch der In-situ-Live-Einzelzell-MS (SCMS)-Analyse mit der Einzelsonde, einem miniaturisierten multifunktionalen Gerät für die MS-Analyse.

Anwendungen der Einzel-Sonde: Mass Spectrometry Imaging und Einzelzellanalyse unter Umgebungsbedingungen

Dieses Protokoll beschreibt eine reproduzierbare und zuverlässige Methode für die Sublimation-basierte Erstellung von Formalin fixiert Gewebe für bildgebende Massenspektrometrie bestimmt.

Optimale Vorbereitung von Formalin fixiert Proben für Peptid-Matrix basierten Assisted Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie Imaging-Workflows

Ein neuartiges Verfahren der Probenvorbereitung wurde entwickelt, um Platz für Zell- und Coculture um niedermolekulare Exchange über bildgebende Massenspektrometrie zu erkennen.

Erfassung von niedermolekularer Kommunikation zwischen Gewebe und Zellen mit Hilfe von Imaging-Massenspektrometrie

Für den Einsatz in Verbindung mit einem Einzelsonden-Massenspektrometrie-Setup wird eine integrierte Zellmanipulationsplattform für die Online-Analyse einzelner Suspensionszellen unter Umgebungsbedingungen entwickelt.

Integrierte Zellmanipulationsplattform gekoppelt mit der Single-Sonde zur Massenspektrometrie-Analyse von Medikamenten und Metaboliten in einzelförmigen Suspensionszellen

Hier stellen wir detaillierte, robuste und komplementäre Protokolle zur Verfügung, um Färbung und subzelluläre Bildgebung von fixierten dreidimensionalen Zellkulturmodellen im Bereich von 100 μm bis zu mehreren Millimetern durchzuführen und so die Visualisierung ihrer Morphologie, Zelltypzusammensetzung und Wechselwirkungen zu ermöglichen.

Färbung und hochauflösende Bildgebung von dreidimensionalen Organoid- und Sphäroidmodellen

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von drei verschiedenen Arten von Sphäroiden in einer Weise, die sie für ein groß angelegtes High-Content-Screening und -Analyse geeignet macht. Darüber hinaus werden Beispiele vorgestellt, die zeigen, wie sie auf Sphäroid- und Einzelzellebene analysiert werden können.

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Wir stellen ein Protokoll für die Züchtung hochreproduzierbarer Sphäroide und deren phänotypische Charakterisierung mittels Bilderfassung und Proteomik vor.

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In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll zur Herstellung von 3D-biogedruckten Kokulturen von iPSC-abgeleiteten Neuronen und Astrozyten vor. Dieses Kokulturmodell, das in einem Hydrogel-Gerüst im 96- oder 384-Well-Format erzeugt wurde, zeigt eine hohe Post-Print-Viabilität und ein Neuritenwachstum innerhalb von 7 Tagen und zeigt die Expression von Reifemarkern für beide Zelltypen.

Dreidimensionales Bioprinting von humanen iPSC-abgeleiteten Neuron-Astrozyten-Kokulturen für Screening-Anwendungen

Dieses Protokoll zielt darauf ab, Zellmetaboliten für die Einzelzell-Massenspektrometrie (SCMS) zu konservieren, indem es das Waschen flüchtiger Salzlösungen, das schnelle Abschrecken von flüssigem Stickstoff, die Gefriertrocknung und die Lagerung bei -8 °C kombiniert. Es zeigt, dass die Abschreckung von flüssigem Stickstoff für die Aufrechterhaltung von Metabolitenprofilen unerlässlich ist, während eine längere Kühllagerung minimiert werden sollte, um metabolische Veränderungen zu vermeiden.

Probenvorbereitung für Einzelzell-Massenspektrometrie-Metabolomik-Studien: Kombiniertes Waschen, Abschrecken, Trocknen und Lagern von Zellen

Dieses Protokoll beschreibt die Einzelzell-Massenspektrometrie-Bildgebung von OVCAR-8-Zellen unter Verwendung von Desorptionselektrospray-Ionisation, gekoppelt mit Orbitrap-Massenspektrometern für hochauflösende metabolomische Analysen.

Einzelzell-Massenspektrometrie-Bildgebung mit Desorptions-Elektrospray-Ionisation gekoppelt an Orbitrap-Massenspektrometer

Lernen Sie die Probenvorbereitung für Massenspektrometrie-Imaging von 3D-Zellkulturen. Dieses Protokoll zeigt Einbettung, Kryoschnitt und MALDI-MSI-Analyse zur Detektion von Biomolekülen.

Probenvorbereitung Strategien für Massenspektrometrie Imaging von 3D-Zellkulturmodelle

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