Name: Folgenabschätzung Wiederholte Exposition von organotypischen 3D bronchiale und nasale Zellkulturmodelle zu Whole Zigarettenrauch (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 50 s
Description: Erfahren Sie die Auswirkungen wiederholter Zigarettenrauchexposition auf organotypische 3D-Bronchial- und Nasengewebe. Diese Methode ermöglicht die Bewertung von Zilienfrequenz und Transkriptomänderungen.

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Die Autoren bedanken sich bei Maurice Smith und Marja Talikka für ihre Durchsicht des Manuskripts danken.

<ol><li>Pezzulo, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+air-liquid+interface+and+use+of+primary+cell+cultures+are+important+to+recapitulate+the+transcriptional+profile+of+in+vivo+airway+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+-+Lung+Cellular+and+Molecular+Physiolog%22%5BJournal%5D)">The air-liquid interface and use of primary cell cultures are important to recapitulate the transcriptional profile of in vivo airway epithelia.</a> American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiolog. 300, L25-L31 (2011).</li>
<li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews+Molecular+cell+biolog%22%5BJournal%5D)">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature reviews Molecular cell biolog. 8, 839-845 (2007).</li>
<li>Dvorak, A., Tilley, A. E., Shaykhiev, R., Wang, R., Crystal, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do+airway+epithelium+air%E2%80%93liquid+cultures+represent+the+in+vivo+airway+epithelium+transcriptome%5BTitle%5D)+AND+%22American+journal+of+respiratory+cell+and+molecular+biolog%22%5BJournal%5D)">Do airway epithelium air–liquid cultures represent the in vivo airway epithelium transcriptome.</a> American journal of respiratory cell and molecular biolog. 44, 465(2011).</li>
<li>Wiszniewski, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+cultures+of+polarized+airway+epithelial+cells+from+patients+with+cystic+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biolog%22%5BJournal%5D)">Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biolog. 34, 39-48 (2006).</li>
<li>Balharry, D., Sexton, K., BéruBé, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+approach+to+assess+the+toxicity+of+inhaled+tobacco+smoke+components%3A+nicotine%2C+cadmium%2C+formaldehyde+and+urethane%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicolog%22%5BJournal%5D)">An in vitro approach to assess the toxicity of inhaled tobacco smoke components: nicotine, cadmium, formaldehyde and urethane.</a> Toxicolog. 244, 66-76 (2008).</li>
<li>Mathis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bronchial+epithelial+cells+exposed+in+vitro+to+cigarette+smoke+at+the+air-liquid+interface+resemble+bronchial+epithelium+from+human+smokers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physio%22%5BJournal%5D)">Human bronchial epithelial cells exposed in vitro to cigarette smoke at the air-liquid interface resemble bronchial epithelium from human smokers.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physio. 304, L489-L503 (2013).</li>
<li>Cho, M. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bioluminescent+cytotoxicity+assay+for+assessment+of+membrane+integrity+using+a+proteolytic+biomarker%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+in+Vitr%22%5BJournal%5D)">A bioluminescent cytotoxicity assay for assessment of membrane integrity using a proteolytic biomarker.</a> Toxicology in Vitr. 22, 1099-1106 (2008).</li>
<li>Stewart, C. E., Torr, E. E., Mohd Jamili, N. H., Bosquillon, C., Sayers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+Differentiated+Human+Bronchial+Epithelial+Cell+Culture+Systems+for+Asthma+Research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Allerg%22%5BJournal%5D)">Evaluation of Differentiated Human Bronchial Epithelial Cell Culture Systems for Asthma Research.</a> Journal of Allerg. 2012, 11(2012).</li>
<li>Blume, L. F., Denker, M., Gieseler, F., Kunze, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+corrected+transepithelial+electrical+resistance+%28TEER%29+measurement+to+quantify+rapid+changes+in+paracellular+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmazi%22%5BJournal%5D)">Temperature corrected transepithelial electrical resistance (TEER) measurement to quantify rapid changes in paracellular permeability.</a> Pharmazi. , 19-24 (2010).</li>
<li>Chhin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beating+recovery+in+deficient+human+airway+epithelial+cells+after+lentivirus+ex+vivo+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+genetic%22%5BJournal%5D)">Ciliary beating recovery in deficient human airway epithelial cells after lentivirus ex vivo gene therapy.</a> PLoS genetic. 5, e1000422(2009).</li>
<li>Jiao, J., Meng, N., Wang, H., Zhang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+human+nasal+epithelial+cells+grown+as+explant+outgrowth+cultures+or+dissociated+tissue+cultures+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Me%22%5BJournal%5D)">Comparison of human nasal epithelial cells grown as explant outgrowth cultures or dissociated tissue cultures in vitro.</a> Front Me. 7, 486-491 (2013).</li>
<li>Talbot, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assessment+of+reproductive+toxicity+of+tobacco+smoke+and+its+constituents%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+defects+research.+Part+C%2C+Embryo+today+%3A+review%22%5BJournal%5D)">In vitro assessment of reproductive toxicity of tobacco smoke and its constituents.</a> Birth defects research. Part C, Embryo today : review. 84, 61-72 (2008).</li>
<li>Port, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tobacco+smoke+induces+CYP1B1+in+the+aerodigestive+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesi%22%5BJournal%5D)">Tobacco smoke induces CYP1B1 in the aerodigestive tract.</a> Carcinogenesi. 25, 2275-2281 (2004).</li>
<li>Hoeng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+network-based+approach+to+quantifying+the+impact+of+biologically+active+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Toda%22%5BJournal%5D)">A network-based approach to quantifying the impact of biologically active substances.</a> Drug Discov Toda. 17, 413-418 (2012).</li>
<li>Iskandar, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+approaches+evaluating+the+perturbation+of+xenobiotic+metabolism+in+response+to+cigarette+smoke+exposure+in+nasal+and+bronchial+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+In%22%5BJournal%5D)">Systems approaches evaluating the perturbation of xenobiotic metabolism in response to cigarette smoke exposure in nasal and bronchial tissues.</a> Biomed Res In. 2013, 512086(2013).</li>
<li>Karp, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiated+human+airway+epithelia.+Methods+for+establishing+primary+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+molecular+biolog%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiated human airway epithelia. Methods for establishing primary cultures.</a> Methods in molecular biolog. 188, 115-137 (2002).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22ISO+3402%3A+Tobacco+and+tobacco+products+--+Atmosphere+for+conditioning+and+testing%22">ISO 3402: Tobacco and tobacco products -- Atmosphere for conditioning and testing</a>. , International Organization for Standardization. (1999).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22R%3A+A+Language+and+Environment+for+Statistical+Computing%22">R: A Language and Environment for Statistical Computing</a>. , The R Core Team. (2011).</li>
<li>Gautier, L., Moller, M., Friis-Hansen, L., Knudsen, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+mapping+of+probes+to+genes+for+Affymetrix+chips%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatic%22%5BJournal%5D)">Alternative mapping of probes to genes for Affymetrix chips.</a> BMC Bioinformatic. 5, 111(2004).</li>
<li>Hermida, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confero%3A+an+integrated+contrast+data+and+gene+set+platform+for+computational+analysis+and+biological+interpretation+of+omics+data%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+genomic%22%5BJournal%5D)">Confero: an integrated contrast data and gene set platform for computational analysis and biological interpretation of omics data.</a> BMC genomic. 14, 514(2013).</li>
<li>Thomson, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+assessment+of+biological+impact+using+transcriptomic+data+and+mechanistic+network+models%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+applied+pharmacolog%22%5BJournal%5D)">Quantitative assessment of biological impact using transcriptomic data and mechanistic network models.</a> Toxicology and applied pharmacolog. 272, 863-878 (2013).</li>
<li>Teff, Z., Priel, Z., Gheber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+forces+applied+by+cilia+depend+linearly+on+their+frequency+due+to+constant+geometry+of+the+effective+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+journa%22%5BJournal%5D)">The forces applied by cilia depend linearly on their frequency due to constant geometry of the effective stroke.</a> Biophysical journa. 94, 298-305 (2008).</li>
<li>Hilgendorf, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caco-2+versus+Caco-2%2FHT29-MTX+co-cultured+cell+lines%3A+permeabilities+via+diffusion%2C+inside-+and+outside-directed+carrier-mediated+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharm+Sc%22%5BJournal%5D)">Caco-2 versus Caco-2/HT29-MTX co-cultured cell lines: permeabilities via diffusion, inside- and outside-directed carrier-mediated transport.</a> J Pharm Sc. 89, 63-75 (2000).</li>
<li>Sutto, Z., Conner, G. E., Salathe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+human+airway+ciliary+beat+frequency+by+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+physiolog%22%5BJournal%5D)">Regulation of human airway ciliary beat frequency by intracellular pH.</a> The Journal of physiolog. 560, 519-532 (2004).</li>
<li>Zhang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Similarities+and+differences+between+smoking-related+gene+expression+in+nasal+and+bronchial+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+genomic%22%5BJournal%5D)">Similarities and differences between smoking-related gene expression in nasal and bronchial epithelium.</a> Physiological genomic. 41, 1-8 (2010).</li>
</ol>

Diese Studie wurde von Philip Morris International finanziert.

Hier haben wir die Anwendbarkeit des menschlichen organotypischen Bronchien und Nasengewebemodelle, die Auswirkungen der wiederholten CS Exposition beurteilen demonstriert. Als eine Alternative zu Tierversuchen, wurde eine Reihe von Belichtungssystemen für toxikologische Beurteilungen der Aerosolexposition in vitro entwickelt (z. B. VITROCELL, Cultex, ALICE, etc.). Diese Expositions Module können auch für eine toxikologische Bewertung von Luftschadstoffen, luftgetragene Partikel, Nanopartikel, etc. In dieser Studie verwendet werden können, haben wir die VITROCELL System, das bis zu 48 verschiedene Proben gleichzeitig aufnehmen kann, so dass für größere Experimente und niedriger Variabilität zwischen Behandlungen. Für jede Aerosolexposition in vitro bleibt die Gefahr von Gewebekultur Kontamination eine große Gefahr, deren Eindämmung erfordert eine sorgfältige Handhabung der Gewebekulturen während der gesamten Experimente. Messung von Partikelabscheidung in Echtzeit auf dem Mikrowaage während der exposure Experiment erlaubt es, zu überwachen, dass die CS-Dosen aus dem Belichtungssystem generiert werden, entsprechend den Erwartungen. Um die Genauigkeit der gemessenen Partikelabscheidung zu gewährleisten, Einrichten der Online-Messung korrekt vor der Belichtung ist critial zB die Einrichtung der Skala auf 0 Darüber hinaus, da der Unterschied zwischen den Bereichen der Mikrowaage (cm 2) und die Gewebekultureinsatz (0,33 cm 2), passten wir die endgültige Berechnung der Fläche des Kultureinsatz: nur noch 33% der Ablagerung auf der Mikrowaage die tatsächliche Ablagerung in der Kultureinsatzes. Messung des TEER zu eng Kontaktbarriere Funktionalität zu ermitteln und zu einer Störung der Epithelschicht zu bewerten ist ein relativ einfaches Verfahren zu implementieren, die wir hier berichtet wird. , Da die Bronchien und Nasengewebe Modelle enthalten Schleim-produzierenden Becherzellen durchsetzt, muss jedoch apikal Wasch vor den TEER Messdurchgeführt werdensung. Der apikale Wasch ist kritisch, da die Gegenwart der Schleimschicht und der Variabilität ihrer Dicke vorspannen kann die Messung des TEER, interferring mit den Auswirkungen der CS-Exposition. Dieser Begriff ist in Übereinstimmung mit dem, was wurde von Hilgendorf und Kollegen, in dem die Durchlässigkeit von Caco-2-Zellen wurde durch die Co-Kultivierung mit dem Schleim-produzierenden Becherzelllinie HT29 23 betroffen ausgewiesen. Der Schleim muss weg vor TEER Mess gewaschen werden, da apikal Wasch direkt vor der Exposition kann mit den Gewebereaktionen auf CS stören. Daher wird die Messung drei Tage vor der Belichtung durchgeführt wird, und nicht direkt vor Belichtung. Wir zeigten, dass CYP1A1 / CYP1B1 Aktivität kann sich von den organotypischen Kulturmodellen folgenden CS Exposition gemessen werden, obwohl die Aktivität wurde nur geringfügig durch CS erhöht. Dieses schwache Signal kann durch eine längere Inkubation des CYP1A1 / 1B1 Substrat amplifiziert werden (dh., Luciferin-CEE), beispielsweise für24 h (Daten nicht gezeigt). Eine der Einschränkungen des CYP Aktivitätsmessung in der vorliegenden Arbeit ist das Fehlen Normierung auf die CYP Proteinebene oder auf die Zellzahl, die unter Berücksichtigung der für zukünftige Studien unternommen werden könnten, um sicherzustellen, dass die Änderung auf die Enzymaktivität nicht beeinflusst durch die Änderung entweder der Proteinebene oder der Zellzahl. Wir berichteten, dass CS Exposition hemmte die Zilienschlag sowohl in der nasalen und bronchialen Gewebemodelle. Ähnliche Beobachtungen wurden in verschiedenen Säugetieren und Nichtsäugetiermodelle 12 getan. Für Zilienschlag Messung, so dass das Gewebe behandelt und in ähnlicher Weise behandelt werden, ist kritisch, wenn beispielsweise mittlere Änderung implementiert wird, sollte es für alle Proben angewandt werden. Sutto und Kollegen berichteten, dass pH-Wert beeinflusst die Säugetier ciliary Schlagfrequenz 24. So beim Vergleich Schlagen Frequenzen zwischen Zellen mit verschiedenen Kombinationspräparate / Mischungen, pH behandeltAnpassung sollte in Betracht gezogen, um die Variabilität der Zilienschlag Messung zu minimieren. Darüber hinaus ist die Temperatur, bei der die Messung durchgeführt wird ebenfalls kritisch, da die Frequenz des Zilienschlag sinkt mit abnehmender Temperatur. Die Variabilität aufgrund dieser Änderungen eine Tischinkubation Inkubator mit Temperatur, CO 2, und Feuchtigkeitskontrolle ausgestattet war in dieser Studie verwendet minimieren. Trotzdem wurde beobachtet, dass die Zilienschlag Frequenzen in den Bronchialgewebe nach CS Exposition sehr variabel (dh., Zunahme der Einlage und Abnahme in der anderen Einlage), was darauf hindeutet, dass die Zilienschlag stark gestörten unmittelbar nach Exposition. Im Gegensatz dazu beobachtet man die Abwesenheit von messbaren Zilienschlag Frequenzen im Nasengewebe nach CS Exposition, was darauf hindeutet, daß die Reaktion des Nasengewebe ist empfindlicher und konsistent. Dies ist in Übereinstimmung mit einer früheren Veröffentlichung zeigt, dass das Nasengewebe hat eine geringere Kapazität als entgiftenverglichen mit dem Bronchus 25. Schließlich haben wir gezeigt, dass Genexpressions vom organotypischen Bronchien und Nasengewebe Modelle CS ausgesetzt könnte Auswirkungen von CS auf Fremdstoffmetabolismus zu demonstrieren. Interessanterweise war die beobachtete Veränderung im Fremdstoffmetabolismus im organotypischen bronchiale und nasale in vitro-Modellen zu CS ausgesetzt ähneln, dass die in vivo Situation bei Rauchern, wie detaillierter in einer früheren Veröffentlichung 15 diskutiert. Für Genexpressionsanalysen mit Hilfe der Robotic-Instrument macht ein Hochdurchsatz-Analyse möglich. Außerdem automatischen Roboterhandhabung weiter erhöht die Konsistenz und Genauigkeit der Genexpressionsergebnisse. Dennoch schnelle Sammlung der Gewebeproben war entscheidend für den RNA-Abbau während der RNA-Extraktion vermeiden. Die RNA-Prozessierung und beschriebenen transkriptomischen Ansätze können auch für in vivo Gewebeproben angewandt werden.

Lungen sind direkt und ständig eingeatmeter Luft ausgesetzt, die verschiedene Giftstoffe wie Schadstoffe und Bestandteile von Zigarettenrauch (CS) enthalten kann. Die Untersuchung der Auswirkungen der Exposition gegenüber diesen Giftstoffen auf das Atemwegsgewebe ist am informativsten, wenn sie auf eine Weise durchgeführt wird, die einer In-vivo-Exposition ähnelt. Im Vergleich zu den klassischen 2D-immersiven Zellkulturen (z.B. normale humane Bronchialepithelzellen (NHBE)) rekapitulieren 3D-Organotypisches Gewebemodelle die morphologischen, physiologischen und molekularen Aspekte des menschlichen Atemwegsepithels in vivo besser 1,2: Die 3D-Gewebemodelle enthalten die Vielfalt der in vivo beobachteten Zelltypen, einschließlich differenzierter Epithelzellen, Flimmer- und Nicht-Flimmerzellen, Becherzellen und Basalzellen. Sie haben funktionelle Tight Junctions und weisen einen mukoziliären Phänotyp 1-3 auf. Darüber hinaus können die Kulturen auf einer durchlässigen porösen Membran in einer Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche gezüchtet werden, was eine direkte Exposition gegenüber Aerosol auf der apikalen Seite (während die basolaterale Seite in Kulturmedium eingetaucht ist) ermöglicht 3-5. Dvorak und Kollegen berichteten, dass die Genexpressionsprofile von Bronchialgewebemodellen denen ähnelten, die aus menschlichen Bronchialbürsten gewonnen wurden 3. Darüber hinaus zeigten Mathis und Kollegen, dass die Reaktionen dieser Gewebemodelle auf CS ähnlich waren wie die Unterschiede, die zwischen Bronchialepithelzellen von Rauchern und Zellen von Nichtrauchern beobachtet wurden 6. Da die Bronchialgewebemodelle schließlich bis zu mehreren Monaten kultiviert werden könnten 4,5, könnten sie möglicherweise verwendet werden, um die Auswirkungen einer Langzeitexposition von Testobjekten zu untersuchen. 
Zytotoxizitätsbewertungen sind gängige Parameter, die nach chemischen Beleidigungen oder zur Beurteilung der Toxizität bestimmter Verbindungen oder Gemische gemessen werden. So kann beispielsweise die Membranintegrität durch einen Lumineszenz-Assay gemessen werden und ermöglicht die Messung einer dosisabhängigen zytotoxischen Wirkung auf die Zellkultur 7. Um die pathophysiologischen Wirkungen von Verbindungen bei subtoxischen Konzentrationen zu beurteilen, sollten jedoch andere Parameter gemessen werden. So stellt beispielsweise die Gewebeintegrität, die mit dem TEER-Assay (Transepithelialer elektrischer Widerstand) bestimmt wird, die Funktionalität von Tight Junctions sicher und überwacht die Disruption der Epithelschicht 8,9. Die ziliäre Schlagfrequenz ermöglicht auch die Messung von CS-bedingten Effekten auf das Atemgewebe. Eine normale Schlagfrequenz für die Flimmerhärchenschleimhaut, die an die oberen und unteren Atemwege grenzt, ist wichtig zum Schutz vor Atemwegsinfektionen 10. Jede der flimmernförmigen säulenförmigen Epithelzellen des respiratorischen Epithels weist 200 bis 300 Zilien auf, die mit einer bestimmten Frequenz schlagen, um Infektionserreger oder eingeatmete Partikel zu eliminieren, die in dem Schleim eingeschlossen sind, der von eingestreuten Becherzellen freigesetzt wird 11. CS enthält Chemikalien, die den Ziliarschlag hemmen können 12, was zu einem verminderten Schutz der Atemwege führt. Diese Arbeit zeigt, dass die Ziliarschläge in organotypischen Gewebemodellen gemessen werden können. Mit diesem Ansatz kann beurteilt werden, ob Epithelzellen in der organotypischen Gewebekultur ihre normale Funktion aufweisen. CS aktiviert auch xenobiotische Stoffwechselreaktionen in den Atemwegen, um Tabakrauchbestandteile zu metabolisieren 13. Die Aktivität der xenobiotischen Phase-I-Metabolismusenzyme CYP1A1 und CYP1B1 der Gewebemodelle kann gemessen werden. Darüber hinaus kann, wie bereits berichtet, die globale Genexpression in den organotypischen Bronchialgewebemodellen gemessen werden 6,14,15. Ein transkriptomischer daten- und netzwerkbasierter systembiologischer Ansatz wird genutzt, um den Einfluss von CS auf den xenobiotischen Stoffwechsel zu bewerten 15. 
Die Methoden, die verwendet werden, um organotypische 3D-Bronchial- und Nasengewebemodelle mit einem In-vitro-Expositionssystem dem Mainstream CS zu exponieren und die Gewebereaktionen auf diese Exposition im Vergleich zur Frischluftexposition (Kontrolle) zu messen, werden hier detailliert beschrieben.

<table><tbody><tr><td>MucilAir-humane Fibroblasten-Bronchien</td><td>Epithelix S&aacute; rl, Genf, Schweiz</td><td>http://www.epithelix.com/content/view/122/19/lang,en/</td><td></td></tr> <tr><td>MucilAir Kulturmedium</td><td>Epithel S&aacute; rl, Genf, Schweiz</td><td>http://www.epithelix.com/content/view/84/16/lang,en/</td><td></td></tr> <tr><td>VITROCELL</td><td>VITROCELL systems GmbH, Waldkirch, Deutschland</td><td>http://www.vitrocell.com/index.php?Nav_Nummer=2&R=</td><td></td></tr><tr><td>3R4F Referenzzigarette</td><td>University of Kentucky</td><td>http://www2.ca.uky.edu/refcig/</td><td></td></tr> <tr><td>30-Port Karussell-Rauchmaschine SM2000</td><td>Philip Morris, Int.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CiliaMetrix Kamera und Software</td><td>La Haute &Eacute; cole de gestion (HESGE), Genf, Schweiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Leica DMIL Mikroskop&nbsp;</td><td>Leica, Heerbrugg, Schweiz</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LED-Lichtquelle</td><td>Titan Tool Supplies, Buffalo, NY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Essstäbchenelektrode STX-2</td><td>World Precision Instruments</td><td>http://www.wpiinc.com/products/physiology/stx2-chopstick-electrode-set-for-evom2/</td><td></td></tr> <tr><td>EVOMXTM Epithel-Voltohmmeter&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>http://www.wpiinc.com/products/physiology/evom2-evom2-epithelial-voltohmmeter-for-teer/</td><td></td></tr> <tr><td>Luciferin-Detektionsreagenz&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MagNA Lyser Instrument&nbsp;</td><td>Roche</td><td>http://www.roche.com/products/product-details.htm?region=us&type=product&id=66</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en&region=</td><td></td></tr><tr><td>QIAwürfel&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>9001882</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Scientific</td><td>http://www.nanodrop.com/</td><td></td></tr> <tr><td>Agilent 2100 Bioanalysator&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>http://www.genomics.agilent.com/en/Bioanalyzer-System/2100-Bioanalyzer-Instruments/?cid=AG-PT-106</td><td></td></tr><tr><td>Affymetrix GeneChip Hoher Durchsatz 3' IVT Express Kit</td><td>Affymetrix</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/prod370001/AFFY/High-Throughput-(HT)-Whole-Transcript-(WT)-Kit</td><td></td></tr><tr><td>Scanner 3000 7G&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>http://www.affymetrix.com/catalog/131503/AFFY/Scanner-3000-7G</td><td></td></tr></tbody></table>

folgenabschätzung wiederholte exposition von organotypischen 3d bronchiale und nasale zellkulturmodelle zu whole zigarettenrauch

Impact Assessment of Repeated Exposure of Organotypic 3D Bronchial and Nasal Tissue Culture Models to Whole Cigarette Smoke

Zigarettenrauch (CS) hat einen großen Einfluss auf die Lungenbiologie und kann zur Entwicklung von Lungenkrankheiten wie chronisch obstruktiver Lungenerkrankung oder Lungenkrebs führen. Um die zugrundeliegenden Mechanismen der Krankheitsentstehung zu verstehen, wäre es wichtig, die Auswirkungen der CS-Exposition direkt auf das Lungengewebe zu untersuchen. In epidemiologischen Studien ist dieser Ansatz jedoch nur schwer umsetzbar, da die Entnahme von Lungengewebe komplex und invasiv ist. Alternativ können Gewebekulturmodelle die Abschätzung der Auswirkungen der Exposition auf das Lungengewebe erleichtern. Zu diesem Zweck werden traditionell submerse 2D-Zellkulturen verwendet, wie z. B. normale humane Bronchialepithel-Zellkulturen (NHBE). Sie können jedoch nicht in ähnlicher Weise wie bei der In-vivo-Exposition direkt dem Rauch ausgesetzt werden. Kürzlich entwickelte 3D-Gewebekulturmodelle spiegeln die In-vivo-Situation besser wider, da sie an der Luft-Flüssig-Grenzfläche (ALI) kultiviert werden können. Ihre basalen Seiten sind in das Kulturmedium eingetaucht; während ihre apikalen Seiten der Luft ausgesetzt sind. Darüber hinaus repräsentieren organotypische Gewebekulturen, die unterschiedliche Zelltypen enthalten, die Physiologie des Gewebes in vivo besser. In dieser Arbeit wird die Verwendung eines in vitro Expositionssystems demonstriert, um humane organotypische Bronchial- und Nasengewebemodelle dem Mainstream CS auszusetzen. Die ziliäre Schlagfrequenz und die Aktivität von Cytochrom P450s (CYP) 1A1/1B1 wurden gemessen, um die funktionellen Auswirkungen von CS auf das Gewebe zu beurteilen. Darüber hinaus wurden zur Untersuchung von CS-induzierten Veränderungen auf molekularer Ebene Genexpressionsprofile aus den Geweben nach der Exposition erstellt. Ein leichter Anstieg der CYP1A1/1B1-Aktivität wurde in CS-exponierten Geweben im Vergleich zu luftexponierten Geweben beobachtet. Ein auf Netzwerken und Transkriptomik basierender systembiologischer Ansatz war robust genug, um CS-induzierte Veränderungen des xenobiotischen Stoffwechsels zu zeigen, die denen ähnelten, die in den Bronchialepithelzellen von Rauchern beobachtet wurden.

Im unten beschriebenen Ergebnisse waren die organotypischen Gewebe primären humanen epithelialen Zellen von gesunden, Nichtraucher getrennt, Europäischer Spendern und wurden mit Fibroblasten 15 wiederhergestellt. 3D Bronchien und Nasengewebe Modelle In vitro bronchiale und nasale organotypischen Modelle ähneln auf zellulärer Ebene das Epithel menschlichen Atemwege (Abbildung 2). CS Exposition Organotypische Bronchien und Nasengewebe Modelle wiederholt, um Mainstream-CS an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche ausgesetzt werden. Die Rauchexposition experimentelle Verfahren für die hier dargestellten Ergebnisse verwendet wird, in Figur 1 dargestellt ist. Aufzeichnung von Zilienschlag Cilia Prügel in der Luft ausgesetzten Geweben wie in den Videos dargestellt aufgezeichnet. CS Exposition war mit einer Reduktion des ciliary Schlagfrequenz verbunden: die stärkere Spitze um beobachtet4 Hz in der schein-exponierten und vor der Belichtung wird nicht mehr nach CS Exposition (Abbildung 3) beobachtet. Diese reduzierte Frequenz würde die Zilien machen schlagen weniger effizient Schleim und Infektionserreger 22 zu entfernen. Messung des TEER und CYP1A1 / 1B1 Aktivität TEER wurde 48 Stunden nach der letzten Exposition gemessen, um sicherzustellen, das Gewebe noch funktionsfähig ist. CYP1A1 / 1B1 Aktivität wurde ebenfalls gemessen 48 h nach Beendigung der Exposition wie in Abbildung 1 dargestellt. Die TEER-Werte in den CS-exponierten Geweben waren nicht signifikant unterschiedlich im Vergleich zu den der Luft ausgesetzten Geweben bestätigt, dass es keinen großen zytotoxische Wirkung von Rauch bei dieser Konzentration. An der 48 Stunden nach der Belichtung wurde CYP1A1 / 1B1 Aktivität der Gewebe leicht erhöht, was auf einen leichten Anstieg der Gewebeschutzmechanismus nach der Exposition (Abbildung 4). Genexpressionsprofile und netzwerkbasierten Systeme biology Ansatz, um die Auswirkungen von CS-Exposition auf die Veränderung der Fremdstoffmetabolismus studieren Die Gewebe wurden nach 48 Stunden nach der Exposition Zeitpunkten gesammelt. Anschließend wurden Mikroarray-Analyse durchgeführt, um Genexpressionsprofile der CS- und Luft ausgesetzten Gewebe zu erzeugen. Auswirkungen der CS Exposition auf Fremdstoffmetabolismus wurde mit Hilfe eines Netzwerk-basierten systembiologischen Ansatz aus den Genexpressionsprofilen genutzt und untersucht, wie zuvor 15 ausgewiesen. Mit einem Netzwerk-basierten systembiologischen Ansatz zeigt, dass CS Exposition Auswirkungen auf der Ebene der Backbone-Knoten in der Fremdstoffmetabolismus Netzwerkmodell waren schön zwischen der In-vitro- und In-vivo-Datensätzen (Abbildung 5) korreliert. Im Gegensatz dazu auf der Ebene jedes einzelnen Genexpressionsänderungen, schlechte Korrelationen zwischen der in vitro (CS lichteten vs. Luft ausgesetzten) und in vivo (Raucher vs. Nichtraucher) beobachtet. Abbildung 1. Schematischer Ablauf der wiederholte Exposition von CS zu den organotypischen Bronchialgewebe Modelle Abkürzungen:. CYP, Cytochrome P450; CS, Zigarettenrauch; TEER, transepithelialen elektrischen Widerstandes. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig2.jpg" /> Abbildung 2. Organotypische Bronchien und Nasen epithelialen Zellkulturmodellen. Karikatur, die die Bronchien (A) und Nasen (B) Zellkultur-Einsatz an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche. Die in vitro-Modelle enthalten in der apikalen Schicht der Hämatoxylin &amp; Eosin gefärbten Zellen gezeigt Geißelzellen (C für bronchiale, D für die nasale), wie zuvor 15 ausgewiesen. Die Modelle wurden mit Fibroblasten, die wichtig sind, kokultiviert<html> für das Wachstum und die Differenzierung von Epithelzellen (durch Pfeile angedeutet). Die Färbung der Atemwege Linie Marker: p63 (E für bronchiale, F für die nasale) und MUC5AC (G für bronchiale, H für die nasale) gezeigt wie zuvor 15 gemeldet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig3.jpg" /> Abbildung 3. Cilia Schlagfrequenz. Cilia Schlagfrequenz (CBF) wurde in Luft ausgesetzten und in der Kultur vor und nach der Exposition gemessen. Verminderte CBF wurde nach CS Exposition gesehen (werden repräsentative Ergebnisse aus zwei Einsatz als Replikat 1 (R1 gezeigt) und replizieren 2 (R2)). ad / 52.325 / 52325fig4.jpg &quot;/&gt; Abbildung 4. Messung von CYP1A1 / CYP1B1 Aktivität und TEER. Left pannels zeigen die CYP1A1 / CYP1B1 Aktivität im bronchiale (A) und Nasen (B) Gewebemodelle. Rechts Panels zeigen TEER Messung im bronchiale (C) und Nasen (D) Gewebemodelle. Mittelwert ± Standardabweichung dargestellt. Abkürzungen: CS, Zigarettenrauch; CYP, Cytochrom P450; TEER, transepithelialen elektrischen Widerstand; RLU relativ Lumineszenzlabor Einheit. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52325/52325fig5.jpg" /> Abbildung 5: Netzwerkbasierte systembiologischer Ansatz für die Bewertung der Auswirkungen der CS Exposition im Rahmen der Fremdstoffmetabolismus. Die Veränderungen der Genexpression Ebenen wurden verwendet, um die Aktivierung der Backbone-Knoten des Fremdstoffmetabolismus Netzwerkmodell (A) zu berechnen </<html> strong&gt; wie in einer früheren Veröffentlichung 15 ausgewiesen. Die Abbildung rechts zeigt das Konzept der Quantifizierung der Backbone-Knoten, auch bekannt als &quot;Differenz Netzwerk-Backbone-Wert&quot; mit dem NPA-Ansatz. Die blauen Ovale repräsentieren die Aktivität der Backbone-Knoten (dh., Die Funktionsschicht) und die grüne Kugeln stellen die Expression von Genen (dh., Die Transkriptionslage). Auswirkungen von CS Exposition in organotypischen Bronchialgewebe (in vitro, CS-exponierten vs. Luft ausgesetzten) an der 48 h von Postexpositions wurden mit denen des Rauchens auf die menschlichen bronchialen Epithelzellen durch Bronchoskopie und nasale Epithelzellen gesammelt durch burshing der unteren Nasenmuschel Vergleich (GSE16008 ) (in vivo, Raucher vs. Nichtraucher) (B). Einsätze ändert Korrelation der Genexpression zwischen der in vitro- und in vivo-Datensätzen. Abkürzungen: CS, Zigarettenrauch; NPA, Netzstörungsamplitude.ove.com/files/ftp_upload/52325/52325fig5large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.

Das Ziel dieses Protokolls ist es, menschliche organotypische 3D-Bronchial- und Nasengewebemodelle dem Mainstream-Zigarettenrauch (CS) an der Luft-Flüssig-Grenzfläche auszusetzen. Der Einfluss von CS auf das Gewebe wird dann mit Hilfe eines Cytochrom-P450-Aktivitätsassays, einer Zilienschlagmessung und eines systembiologischen Ansatzes untersucht.

Folgenabschätzung Wiederholte Exposition von organotypischen 3D bronchiale und nasale Zellkulturmodelle zu Whole Zigarettenrauch

Cigarette smoke (CS) has a major impact on lung biology and may result in the development of lung diseases such as chronic obstructive pulmonary disease ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Auswirkungen der wiederholten Exposition von organotypischen 3D-Bronchial- und Nasengewebekulturmodellen gegenüber Vollzigarettenrauch zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst organotypische, bronchiale und nasale Gewebekulturmodelle an der Grenzfläche zwischen Luft und Flüssigkeit kultiviert werden. Der zweite Schritt besteht darin, mit einer Räuchermaschine Aerosol zu erzeugen und die Gewebekulturen entsprechend dem Versuchsdesign in einem Expositionssystem zu belichten.Anschließend werden die Auswirkungen der Exposition bewertet, indem die Ziliarschlaghäufigkeit und die Gewebeintegrität der Kultur gemessen werden. Der letzte Schritt besteht darin, den durch das Aerosol induzierten Transkriptomaustausch mit Hilfe der Microarray-Technologie zu messen. Letztendlich wurden netzwerkbasierte systembiologische Ansätze verwendet, um den Einfluss von Zigarettenvollrauch auf die Gewebekultur zu zeigen.Der Hauptvorteil dieser Techniken bestehender Methoden in der Atemtoxikologie besteht darin, dass die Ansätze mit den Anforderungen der Zulassungsbehörden abgestimmt sind, um Alternativen zu Tierversuchen zu finden, und sie ermöglichen die Bewertung der Auswirkungen einer kurzfristigen Zigarettenrauchexposition auf Zellen, die an der illiquiden Grenzfläche gezüchtet wurden, und ahmen die Bedingungen nach, die in den menschlichen Atemwegen auftreten. Um das Experiment zu beginnen, geben Sie 0,7 Milliliter vorwarmes Nährmedium in jede Vertiefung einer sterilen 24-Well-Platte. Entfernen Sie anschließend die Gewebeverpackung und übertragen Sie die Gewebekultureinsätze auf die frisch vorbereitete 24-Well-Platte.Bewahren Sie die Gewebekultur in einem Inkubator auf und tauschen Sie das Medium während des Medienwechsels alle zwei Tage aus. Untersuchen Sie das Gewebe unter einem Lichtmikroskop, um sicherzustellen, dass es frei von Verunreinigungen ist und kein Medium austritt. Waschen Sie drei Tage vor den Expositionsexperimenten die apikale Seite der Gewebekultur mit 200 Mikrolitern Nährmedium.Anschließend wird die Klimakammer des In-vitro-Systems und das Kultivierungsbasismodul auf 37 Grad Celsius vorgewärmt. Befüllen Sie das Anzuchtbasismodul nach dem Erwärmen mit 17,5 Millilitern Medium pro Reihe. Entnehmen Sie das Gewebe aus dem Inkubator und übertragen Sie die Gewebekultureinsätze von der Kulturplatte in das Kultivierungsbasismodul des In-vitro-Expositionssystems.Decken Sie dann das Kultivierungsbasismodul mit einem Glasdeckel ab. Übertragen Sie das Gewebe in die Klimakammer, um es dem gängigen Zigarettenrauch oder CS auszusetzen. Erzeugen Sie Zigarettenrauch mit einer kalibrierten Karussell-Nebelmaschine mit 30 Anschlüssen.Rauchen Sie die Zigaretten mit einer Standardlänge, die jedoch etwa 35 Millimeter bei 55 Millilitern beträgt. Atmen Sie über zwei Sekunden, zweimal pro Minute und acht Sekunden Pumpenauslasszeit. Der erzeugte Mainstream-Zigarettenrauch wird akkumuliert und an das In-vitro-Expositionssystem abgegeben.Legen Sie das Taschentuch sechs bis sieben Minuten lang frei. Nachdem Sie das Gewebe zurück auf eine Kulturplatte übertragen haben, legen Sie es für eine Stunde zurück in den Inkubator. Nehmen Sie die Gewebekulturplatten aus dem Inkubator und lassen Sie sie 30 Minuten lang bei Raumtemperatur unter der Haube, um die CLIA-Schläge zu stabilisieren.Beobachten Sie das Gewebe nach der Stabilisierung unter einem Lichtmikroskop, das mit der Cliometrics-Software verbunden ist. Notieren Sie als Nächstes die Häufigkeit des Ziliarschlags und messen Sie die Frequenz alle drei Sekunden für eine Minute, 48 Stunden. Nach der Exposition werden 200 Mikroliter Nährmedien auf die apikale Seite des menschlichen Bronchialepithelgewebes gegeben und der Gewebewiderstand gemessen, indem eine Essstäbchenelektrode in das Basalmedium und in das neu hinzugefügte Medium auf der apikalen Seite der Gewebekultur eingeführt wird, ohne das Gewebe zu berühren.Nach den Messungen wird das Medium mit einer Pasterpipette, die an eine Vakuumpumpe angeschlossen ist, vorsichtig von der apikalen Seite der Gewebekulturen entnommen und das Gewebe wieder in den Inkubator zurückgeführt. Um die enzymatische Aktivität von Cytochrom P four 50 zu messen, bereiten Sie eine neue Platte mit zuvor vorbereitetem Luzifer- und CEE-Substrat vor, übertragen Sie die Einsätze in diese Plattenabdeckung und inkubieren Sie die Gewebeeinsätze über Nacht. Nach der Inkubation werden 50 Mikroliter Nährmedium aus jedem Gewebeeinsatz bei Raumtemperatur in eine undurchsichtige weiße Luminometerplatte mit 96 Vertiefungen überführt.Geben Sie dann 50 Mikroliter Luzifer-Detektionsreagenz in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platte 20 Minuten lang bei Raumtemperatur. Sobald die Inkubation abgeschlossen ist, messen Sie die Lumineszenz mit dem Luminometer. Entnehmen Sie die Platte mit den organotypischen 3D-Gewebeeinlagen aus dem Inkubator und waschen Sie jeden Einsatz auf der Platte dreimal mit kaltem PBS und aspirieren Sie das PBS mit einer früheren Pipette zwischen den Wäschen.Nach der letzten Wäsche saugen Sie das PBS an und decken Sie die Platte ab, um ein Austrocknen der Einlage zu verhindern. Schneiden Sie als Nächstes die Einlegebahn für jeden Einsatz aus der Platte aus, bis die Membran flach auf der Klinge aufliegt. Übertragen Sie das Gewebe von der Klinge in das Homogenisierröhrchen und schrauben Sie den Deckel auf das Röhrchen.Dann schütteln, schwenken und auf Trockeneis legen. Tauen Sie die Proben auf und mahlen Sie sie mit dem Homogenisiergerät bei 6.000 U/min für 45 Sekunden. Lassen Sie die Probe fünf Minuten bei Raumtemperatur einwirken, geben Sie dann 140 Mikroliter Chloroform in die Probe und wirbeln Sie sie erneut 15 Sekunden lang.Übertragen Sie die gesamte Probe aus dem Homogenisierröhrchen in ein Phasenregelröhrchen. Legen Sie es auf einen Thermoschüttler und schütteln Sie es zwei Minuten lang bei 1400 U/min bei Raumtemperatur. Dann zwei Minuten bei Raumtemperatur ziehen lassen.Sobald das Schütteln abgeschlossen ist, drehen Sie das Röhrchen 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 12.000 G. Übertragen Sie den Überstand in ein neues Zwei-Milliliter-Röhrchen. Anschließend wird die RNA-Fällung gewaschen, suspendiert und gereinigt. Nach der Extraktion werden die RNAs einer Qualitätskontrolle unterzogen.Um Menge und Integrität zu beurteilen, bereiten Sie das Liquid-Handling-System und die Zielsynthese vor. Platzieren Sie die extrahierte RNA. Die Platten und alle notwendigen Reagenzien und Laborverschleiß im Roboter.Die ersten RNA-Konzentrationen werden normalisiert. Dann wird das Deck für die nächsten Schritte von der Amplifikation über die Markierung bis hin zur Reinigung und Fragmentierung gewechselt. Als nächstes wird die Hybridisierungsmischung zu 33 Mikrolitern der fragmentierten und markierten A-RNA gegeben, die Proben denaturieren und das Array mit 200 Mikrolitern Vorhybridisierung vorbenetzt.Mischen Sie aus dem Hybridisierungswasch- und Fleckenset. Legen Sie dann den Chip für 10 Minuten in den Hybridisierungsofen, der auf 45 Grad Celsius und 60 U/min eingestellt ist. Entfernen Sie den Vorhybridisierungspuffer und laden Sie 200 Mikroliter der Probe.Inkubieren Sie das Array 16 Stunden lang bei 45 Grad Celsius und 60 U/min im Ofen. Saugen Sie den Cocktail aus dem Chip an und füllen Sie den Microarray mit 250 Mikrolitern Wash Buffer a. Öffnen Sie die Software und führen Sie Fluidics über die Menüleiste der Software aus.Wählen Sie für jedes Modul das gewünschte Modul und das Prime Four 50-Programm aus. Weisen Sie jedem Modul den richtigen Chip zu, indem Sie den Barcode des Chips scannen und die Chips im Fluidiksystem platzieren. Stellen Sie abschließend sicher, dass der Scanner warm ist.Laden Sie dann den Chip in den Autoloader des Scanners und scannen Sie den Microarray. Die CELIA-Schlagfrequenz oder CBF des Nasengewebes wurde vor und nach der Exposition gegenüber Luft oder Zigarettenrauch oder cs gemessen. Die CBF und das Nasengewebe waren nach der Exposition gegenüber cs langsamer.Eine geringere Schlagfrequenz des CLIA verringert die Effizienz bei der Entfernung von Schleim und Infektionserregern. Microarray-Analysen wurden durchgeführt, um die Auswirkungen der CS-Exposition in organotypischen, bronchialen und nasalen Gewebemodellen zu untersuchen. 48 Stunden nach der Exposition.Dieser CS-Einfluss in vitro wurde mit den Auswirkungen des Rauchens auf menschliches Bronchialepithelgewebe verglichen, das durch Bronchoskopie bzw. Nasenepithelbürsten gewonnen wurde. Die netzwerkbasierte Systembiologie zeigt eine positive Korrelation zwischen den Rückgratknoten von in vivo und in vitro Datensätzen. Bei diesem Verfahren ist zu bedenken, dass es sich um ein sich neu entwickelndes Forschungsgebiet handelt.Auf der einen Seite gibt es zwei Schlüsselkomponenten, eine gut charakterisierte Toll-Aerosol-Expositionsplattform, und auf der anderen Seite ein relevantes experimentelles System, das aus einem dreidimensionalen Gewebekulturmodell bestehen kann, das die spezifische Architektur, die biochemischen und mechanischen Signale sowie die Zellzellinteraktion der Mikroumgebung, die für das Gewebe oder das Zielorgan relevant ist, am besten nachahmt. Wird untersucht.

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Isolierung von Maus respiratorischen Epithelzellen und der Exposition gegenüber Experimental Zigarettenrauch bei Air Liquid-Interface

Nasen Epithelzellen, durch oberflächliche Schürf Biopsie der menschlichen Freiwilligen erhalten, werden erweitert und auf Gewebekultureinsätze übertragen. Nach Erreichen der Konfluenz werden die Zellen an der Luft Flüssigkeit-Grenzfläche angebaut, was Kulturen der Wimper und nicht-Geißelzellen. Differenzierte Nasen epithelialen Zellkulturen bieten tragfähige experimentelle Modelle für die Untersuchung der Schleimhaut der Atemwege.

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Folgenabschätzung Wiederholte Exposition von organotypischen 3D bronchiale und nasale Zellkulturmodelle zu Whole Zigarettenrauch (Video) | JoVE Journal

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