Neben einem HD-Fourier-Transformations-Infrarot (FT-IR) Spektroskopische Bildgebung der menschlichen Gewebeschnitte in Richtung Verbesserung der Pathologie

Fourier-Transformations-Infrarot (FT-IR) spektroskopische Bildgebung ist ein schneller und markierungsfreier Ansatz zur Gewinnung biochemischer Datensätze von Zellen und Geweben. Hier zeigen wir, wie hochauflösende FT-IR-Bilder von Gewebeschnitten erhalten werden können, um die Krankheitsdiagnose zu verbessern.

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, hochauflösende Infrarotbilder von Gewebeproben zu erhalten. Dies wird erreicht, indem zunächst Gewebeproben auf infrarotkompatible Objektträger geschnitten werden. Der zweite Schritt besteht darin, ein hochauflösendes Bildgebungsgerät einzurichten, indem die entsprechenden Objektive installiert werden.

Als nächstes wird der Hintergrund des Substrats entnommen und die Gewebeprobe gescannt. Der letzte Schritt besteht darin, eine entsprechende Software für die Datenverarbeitung und -visualisierung zu verwenden. Letztendlich wird hochauflösende Infrarotbildgebung verwendet, um biochemische Informationen aus biologischem Gewebe auf störungsfreie Weise zu visualisieren und zu erhalten.

Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der Lichtmikroskopie besteht darin, dass die inhärente Biochemie des Gewebes ohne den Einsatz von Farbstoffen oder Sonden untersucht werden kann. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen der Pathologie zu beantworten, wie z. B. die Vorhersage des Wiederauftretens der diabetischen Nephropathie und die Klassifizierung des Fortschreitens der Lebererkrankung durch HEPA-Car-Osteogenese. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose und Prognose von Krankheiten, da sie große Mengen an biochemischen Informationen liefert, die in der traditionellen Histopathologie nicht verfügbar sind.

Diese Methode kann jedoch zur Diagnose verwendet werden. Es kann auch verwendet werden, um die Veränderungen im Prozess der Wundheilung zu verfolgen und wichtige Gewebemerkmale wie Stammzellen im Magen-Darm-Trakt und im Gehirn zu identifizieren. Erster Schnitt eines formalen und fixierten, in Paraffin eingebetteten Gewebes mit einer Dicke von vier Mikrometern auf einen IR-kompatiblen Objektträger mit einem Mikrotom aufblasen.

Im Anschluss daran. Spülen Sie das FTIR-Mikroskop und das Spektrometer mit trockener Luft, um atmosphärisches Wasser aus dem System zu entfernen. Kühlen Sie dann sowohl den Focal-Plane-Array-Detektor als auch den internen Quecksilber-Cadmium-Tellurid-Detektor im Mikroskop mit flüssigem Stickstoff ab. Montieren Sie den Objektträger für die FTIR-Bildgebung auf dem Mikroskoptisch, nachdem Sie sichergestellt haben, dass das sichtbare Licht eingeschaltet ist, und fokussieren Sie die Probe mit dem Probenerfassungsprogramm.

Öffnen Sie als Nächstes das Bundle-Softwarepaket und klicken Sie auf Sammeln. Klicken Sie auf Diagnose und wählen Sie ein Linienspektrometer aus. Klicken Sie dann auf Imaging Setup, um das System zu kalibrieren.

Wählen Sie auf der Registerkarte Optik links den Detektor als Bodenmikroskop-Detektor aus, und wählen Sie dann unter Optikmodus die Option Durchlässigkeit aus. Klicken Sie auf Setup, um das Lancer-Steuerungsfenster für den Übertragungsmodus in Lancer Control zu öffnen. Klicken Sie mit dem Joystick auf Raw und beobachten Sie, wie sich die Live-Ansicht des FTIR-Interferogramm-Bildes in einen sauberen Bereich der Folie bewegt.

Stellen Sie an dieser Stelle die Integrationszeit auf ca. 8.000 Zählungen und das untere Kondensatorobjektiv ein. Um die Anzahl der Zählungen auf das Maximum zu erhöhen, beobachten Sie die Form des Bildes unten rechts in der Lancer-Steuerung, um sicherzustellen, dass es Gauß aussieht und relativ einheitlich ist. Nachdem Sie die Integrationszeit angepasst haben, bewegen Sie den Tisch erneut, um ein Stück Gewebe mit Struktur zu finden, vorzugsweise den Rand eines Gewebes.

Perfektionieren Sie dann den Fokus des Bildes. Bewegen Sie sich mit dem Joystick der Bühnensteuerung zu einem sauberen Bereich der Rutsche. Drücken Sie nach der Auswahl die Kalibrierungstaste.

Okay, zweimal Wählen Sie auf der Registerkarte Optik Detektor gleich MCT und Mikroskopdetektor gleich rechts. Klicken Sie dann auf Setup. Sobald das FTIR-Interferogramm auf dem Bildschirm visualisiert ist, klicken Sie auf find center burst und okay.

Auf der Registerkarte Optik ist Detektor neu auswählen gleich Bodenmikroskopdetektor gleich links. Wählen Sie dann Setup aus. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass sich das Bild noch auf einem sauberen Bereich in der Lancer-Steuerung befindet, klicken Sie erneut auf Kalibrieren und dann auf OK.

Um ein FTIR-Hintergrundbild zu erfassen, gehen Sie zur Registerkarte Elektronik und wählen Sie eine geeignete spektrale Auflösung aus, die in der Regel vier oder acht inverse Zentimeter beträgt. Gehen Sie für Gewebe auf die Registerkarte Hintergrund und geben Sie 128 in scans ein, um zu coad. Wählen Sie die Schaltfläche Neue Datei und legen Sie die Hintergrunddatei im entsprechenden Ordner ab.

Nachdem Sie auf den Hintergrund geklickt und auf den Abschluss des Scans gewartet haben, bestätigen Sie, wo die Datei gespeichert werden soll. Klicken Sie auf einen Bereich im Hintergrund, auf das FTIR-Bild und überprüfen Sie das Spektrum. Klicken Sie an dieser Stelle auf Setup, und verwenden Sie in Lancer Control die Live-IR-Ansicht.

Um den gewünschten Bereich zu finden, gehen Sie zur Registerkarte Elektronik und geben Sie die Anzahl der Scans ein, die kopiert werden sollen. Klicken Sie dann auf Scan Um das FTIR-Mikroskop für die hochauflösende Analyse vorzubereiten, schrauben Sie das Objektiv mit hoher Vergrößerung anstelle des 15-fach-Objektivs ein. Öffnen Sie an dieser Stelle die Bildverarbeitungs- und Analysesoftware und laden Sie die IR-Datendatei.

Wenden Sie einen Basislinienkorrekturalgorithmus auf die IR-Daten an, indem Sie Spektralwerkzeuge auswählen, nach unten scrollen und auf Absorptionsspektren klicken. Wenn das Einblendmenü angezeigt wird, wählen Sie "Grundlinienkorrektur" aus. Führen Sie eine spektrale Normalisierung durch, indem Sie normalisierte Spektren unter den Menüoptionen für absorbierende Spektren auswählen.

Beobachten Sie anschließend eine Liste aller IR-Frequenzen, die im Bild erfasst wurden. Klicken Sie auf die Frequenzen, die bestimmten Biomolekülen entsprechen, um ein Bild des Gewebes bei der ausgewählten Frequenz zu betrachten und Bilder zu erstellen, die die Visualisierung verschiedener biomolekularer Komponenten ermöglichen. Klicken Sie auf Spektralwerkzeuge und wählen Sie dann Peak-Höhenverhältnisse aus.

Scannen Sie den entsprechenden angrenzenden gefärbten Gewebeschnitt mit einem separaten Imager-System, das neben dem IR-Bild auch Hellfeldbilder aufnimmt. Rufen Sie das digitale Bild des gefärbten Gewebes mit dem Programm für sichtbare Bilder auf. Klicken Sie anschließend mit der rechten Maustaste auf das Bild in einem Bereich von Interesse und wählen Sie Z-Profil, um die spektralen Informationen am ausgewählten Pixel anzuzeigen.

Um bestimmte Pixel auf dem Bild zu markieren, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild und wählen Sie ROI-Tool. Erstellen Sie die Klassen, die beschriftet werden sollen, z. B. Meum- und Bowman-Kapselklassen. Wählen Sie dann anschließend den ROI-Typ Punkt aus, wählen Sie die Klasse aus, für die Pixel ausgewählt werden sollen, und zeichnen Sie auf die entsprechenden Pixel im IR-Bild.

Leiten Sie die durchschnittlichen Spektren für jede der Klassen mit dem Tool "Durchschnittlicher ROI" ab. Vergleichen Sie abschließend abgeleitete Spektren durch Plotten. In der Grafiksoftware ermöglicht die FT-IR-Bildgebung die Ableitung von IR-Bildern von Gewebe, die je nach IR-Frequenz unterschiedliche Kontraste ergeben können.

Jedes Pixel setzt sich aus dem gesamten Spektrum zusammen, mit unterschiedlichen Peaks, die verschiedenen Biomolekülen entsprechen und Aufschluss über die biochemischen Eigenschaften von Zelltypen oder Krankheitszuständen geben können. Die FTIR-Instrumentierung hat sich von der Messung im Einzelpunkt-Mapping-Modus mit undurchsichtigen Blenden zum Bildgebungsmodus mit CASA-Kornobjektiven entwickelt, bei denen entweder ein Beleuchtungsobjektiv verwendet wird, das mit einem Sammelobjektiv im Transmissionsmodus gekoppelt ist, oder ein einzelnes Objektiv, das im Reflexionsmodus sowohl beleuchtet als auch sammelt. Die Fortschritte in der räumlichen Auflösung für die Gewebebildgebung waren von entscheidender Bedeutung, da nun Zelltypen und Gewebestrukturen identifiziert werden können.

In diesem Fall wurden die Funktionseinheiten der Nierenglomeruli in einem Lebergewebekern beobachtet. Es ist möglich, Hepatozyten und Regionen der infiltrierenden Fibrose sichtbar zu machen, die zwei unterschiedliche Bereiche der Dysplasie und der nicht-dysplastischen Zirrhose trennt. Die erhöhte räumliche Auflösung ermöglicht die Isolierung spezifischer struktureller Merkmale, die durch die Krankheit chemisch verändert werden können, bevor histologische Veränderungen sichtbar werden.

Biochemische Veränderungen in glomerulären Strukturen der Niere wie der Bowman-Kapsel, dem Meum, der glomerulären Basalmembran und der tubulären Basalmembran können durch FTIR-Bildgebung identifiziert werden. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Objektträger vor dem Scannen vollständig zu analysieren. Befolgen Sie dieses Verfahren. Andere Methoden, wie die traditionelle immunchemische Analyse, können am selben Gewebeschnitt durchgeführt werden, um die biochemischen Signaturen und die Gewebemorphologie zu korrelieren.

Unsere erste Entwicklung, diese Technik, ebnete Forschern auf dem Gebiet der Gewebebildgebung den Weg, um den biomolekularen Status kleiner Zelltypen und Strukturen innerhalb von Geweben zu erforschen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein grundlegendes Verständnis dafür haben, wie Sie hochauflösende FTR-Bilder von Gewebeproben erhalten und grundlegende Spektralanalysen durchführen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit flüssigem Stickstoff äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Sicherheitsvorkehrungen getroffen werden sollten, wie z. B. kryosichere Handschuhe und Schutzbrille.