Ein Farbtest, die speziell Maßnahmen Granzyme B Proteolytische Aktivität: Hydrolyse von Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
28. November 2014
Wir beschreiben einen einfachen, quantitativen kolorimetrischen Assay, der speziell die proteolytische Aktivität von Granzym B (GzmB) bei Mensch, Maus oder Ratte misst. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um die Proteaseaktivität anderer granulierter Serinproteasen durch die Hydrolyse anderer synthetischer Peptidsubstrate mit einer geeigneten Erkennungssequenz zu bestimmen.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, die proteolytische Aktivität der Inprotease Granzym B zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Lysat der interessierenden Zellen hergestellt und dann schnell Substrat zu den Proben hinzugefügt wird. Die Granzym-B-Aktivität wird dann durch eine farbmetrische Reaktion gemessen. Letztendlich kann die hochspezifische Spaltung von alla alla as s benzo durch granzyme B anhand seiner einzigartigen Substratspezifität für a part Säurereste beurteilt werden.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z. B. dem Nachweis der Expression der großen Zone B mittels PCR oder Western Blot, besteht darin, dass die Hydrolyse von Benzyl spezifisch für die große Zone B ist und auch anzeigt, dass die Protease aktiv ist. Um die Zelle vorzubereiten, isolieren Lysate zunächst primäre NK-Zellen aus den Einzelzellsuspensionen der Milz von Wildtyp C 57 Black Six oder kontrollieren Granzym-B-Gen-Null-Mäuse durch Negativselektion unter Verwendung kommerziell erhältlicher Kits gemäß den Anweisungen des Herstellers, nachdem die Zellen aktiviert wurden. Waschen Sie die Kultur dreimal zwei bis drei Sekunden lang bei maximaler Geschwindigkeit in PBS und resuspendieren Sie dann das Pellet mit mindestens 5 Millionen NK-Zellen in 100 Mikrolitern Nont P 40-Lysepuffer für 20 Minuten auf Eis.
Dann wird das Lysat in einer Mikrozentrifuge 10 Minuten lang bei 15.000 g heruntergeschleudert und das Mittel in Rückenlage in ein frisches Röhrchen überführt. Nach der Bestimmung der Proteinkonzentration gemäß dem entsprechenden kommerziell erhältlichen Protokoll wird das Sat bei einer Konzentration von mindestens etwa zwei Milligramm pro Milliliter bei minus 20 Grad Celsius gelagert, um einen Grand-Zyme-B-Aktivitätsassay durchzuführen. Anschließend werden mindestens 100 Mikrogramm Proteinlysat pro Probe in frisch vorbereitetem Haufenpuffer auf ein Endvolumen von 160 Mikrolitern verdünnt.
Laden Sie dann mit einer Mehrkanalpipette 50 Mikroliter Probe pro Vertiefung in dreifacher Ausfertigung in eine 96-Well-Vinyl-U-Bodenplatte. Achten Sie darauf, dass drei Kontrollvertiefungen nur mit Puffer vorhanden sind, und fügen Sie jeweils 100 Mikroliter verdünntes DTNB hinzu. Nun, dann fügen Sie schnell 50 Mikroliter frisch verdünntes Alala-Benzoyl-Substrat zu jedem der Haufen-Puffer-Allein-Vertiefungen hinzu, gefolgt von allen Negativkontrollen und zum Schluss mit den erwarteten positiven Proben.
Messen Sie die AASE-Aktivität durch die Hydrolyse der Alala als Benzyl in einem Mikroplatten-Reader bei einer optischen Dichte von 405 Nanometern unter Verwendung eines kinetischen Assay-Protokolls, das alle 15 Sekunden 25 Messungen durchführt. Verwenden Sie abschließend die Plattenlesersoftware, um die maximale Rate der Substratspaltung für jede Vertiefung zu berechnen, und übertragen Sie dann die Rohdaten an die entsprechende statistische Analysesoftware mit Granzym-Gen-Knockout-Mäusen. Es wurde entdeckt, dass das synthetische Peptidsubstrat Alala als Benzyl spezifisch durch Granzym B hydrolysiert wird. Eine weitere robuste Spaltung des synthetischen Substrats kann in Zelllysaten aus primären NK-Zellen des Wildtyps gemessen werden, nicht jedoch in NK-Zellen von Granzym-B-Knockout-Tieren als Kontrolle.
In diesem Experiment war die proteolytische Aktivität von Granzym A, das eine tripsinähnliche Substratspezifität aufweist und in Lysaten beider Zelltypen vorhanden ist, gleich, gemessen durch die Hydrolyse von BLT-Benzyl, I-E-P-D-P-N-A wurde generisch verwendet, um die Granzym-B-Aktivität zwischen Spezies zu testen. In diesem repräsentativen Experiment zeigte die Analyse der Tetra-Peptid-Sequenzen, dass menschliches, aber nicht Maus-Granzym B nach der Sequenz IEPD, die sowohl bei Mensch als auch bei Maus mit der Erkennungssequenz übereinstimmt, effizient spalten kann. Im Gegensatz dazu führt eine Verringerung der Menge an humanem NK-Leukämiezelllysat von 30 Mikrogramm auf 10 Mikrogramm immer noch zu einer ausreichenden Gramm-Enzym-B-Menge, um das I-E-P-D-P-N-A-Substrat zu hydrolysieren.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das geeignete Substrat und die experimentellen Kontrollen für die In-vitro-Analyse von rotem Enzym B von Mensch und Maus auswählen.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt einen quantitativen, farbmetrischen Assay zur Messung der proteolytischen Aktivität von Granzym B (GzmB) in menschlichen, maus- oder rattenspezifischen Proben vor. Die Methode kann durch Verwendung unterschiedlicher synthetischer Peptidsubstrate für andere Granula-Serinproteasen angepasst werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Protease-Aktivität
- Zellbiologie
Hintergrund
- Granzym B ist eine Serinprotease, die an Immunantworten beteiligt ist.
- Die Messung ihrer Aktivität ist entscheidend, um ihre Rolle bei der zellvermittelten Zytotoxizität zu verstehen.
- Bisherige Methoden wie PCR oder Western Blot messen die Proteaseaktivität nicht direkt.
- Dieser Assay ermöglicht eine spezifische und direkte Bestimmung der GzmB-Aktivität.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines einfachen Assays zur Quantifizierung der GzmB-Aktivität.
- Bereitstellung einer Methode, die für andere Proteasen angepasst werden kann.
- Verbesserung bestehender Techniken durch Spezifität für die GzmB-Aktivität.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Zelllysaten aus primären NK-Zellen.
- Verwendung einer farbmetrischen Reaktion zur Messung der GzmB-Aktivität.
- Isolierung von NK-Zellen aus Milzen von Wildtyp- und Granzym-B-Gen-Null-Mäusen.
- Hydrolyse von Substraten zur Beurteilung der Proteaseaktivität.
Hauptergebnisse
- Der Assay misst erfolgreich die GzmB-Aktivität durch spezifische Spaltung des Substrats.
- Er weist im Vergleich zu anderen Methoden eine hohe Spezifität für GzmB auf.
- Die Ergebnisse zeigen, dass die Protease aufgrund der Substrathydrolyse aktiv ist.
- Die Methode lässt sich für andere granuläre Serinproteasen anpassen.
Schlussfolgerungen
- Der entwickelte Test ist ein zuverlässiges Werkzeug zur Messung der GzmB-Aktivität.
- Er bietet Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden, da er die Proteasefunktion direkt bewertet.
- Dieser Ansatz kann die Forschung zu Immunantworten und der Proteasebiologie verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die genaue Messung der proteolytischen Aktivität von Granzym B ist entscheidend zur Validierung der Funktion zytotoxischer Lymphozyten bei der Entwicklung von Immuntherapien. Dieser farbmetrische Assay liefert einen direkten, spezifischen Nachweis der Proteaseaktivität und ermöglicht die mechanistische Absicherung der Zielstrukturnbindung und des pro-apoptotischen Potenzials in präklinischen Modellen. Die Querspeziesverträglichkeit unterstützt die translationale Kontinuität von Studien an Nagetieren bis hin zu Anwendungen beim Menschen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Granzym-B-abhängigen Apoptosewegen in zytotoxischen Lymphozyten.
- Operationaler Wert: Unterscheidet aktive Protease von bloßer Expression und reduziert so falsch-positive Ergebnisse bei der Zielvalidierung.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die funktionelle Bestätigung von Granzym B als mechanistischem Treiber bei der immunvermittelten Tumorbeseitigung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Verwendet das Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl-Substrat, das ausschließlich von Granzym B in humanen, murinen und rattenspezifischen Systemen hydrolysiert wird.
- Quantitative Ausgabe: Misst die anfänglichen Hydrolyseraten mittels DTNB-gekoppelter farbmessender Reaktion bei 405 nm für die kinetische Analyse.
- Spezifitätskontrolle: Schließt Interferenzen durch Caspasen und andere Granzyme aufgrund der einzigartigen Präferenz für Aspartat aus.
- Reproduzierbarkeit: Kompatibel mit unfraktionierten Lysaten und rekombinanten Proteasen, sofern geeignete Kontrollen einbezogen werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Anwendbar auf Modelle der Tumorimmunüberwachung, Virusinfektionen und autoimmune Erkrankungen, bei denen Granzym B die Zielzell-Apoptose vermittelt.
- Translationale Kontinuität: Ermöglicht die konsistente Messung der Aktivität über verschiedene Arten hinweg und unterstützt die Übertragung von Daten von der Maus auf den Menschen.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Liefert einen aktivitätsbasierten Biomarker, um Kandidaten mit nachgewiesenem zytotoxischem Potenzial zu priorisieren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Optimierung ein, wobei die funktionelle Proteaseaktivität Aufschluss über die biologische Wirksamkeit und den Wirkmechanismus gibt.
- Entdeckungsbiologie: Bestätigt die Hypothese, dass Granzym B die Apoptose in Effektorlymphozyten über substratspezifische Spaltung auslöst.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Aktivitätsmessungen zum Vergleich verschiedener Bedingungen oder genetischer Störungen.
- Analytik: Erzeugt kinetische Daten (Vmax), die einen Vergleich zwischen Proben und eine statistische Bewertung der proteolytischen Kapazität ermöglichen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die präklinische Validierung, indem sie die erhaltene Aktivität von Granzym B beim Menschen, bei Maus und Ratte nachweist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Plattform ist durch Substitution des Substrats an andere Granulaproteasen anpassbar und erhöht so die langfristige Nützlichkeit.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Die direkte Messung der proteolytischen Funktion verringert die Abhängigkeit von Surrogatmarkern wie mRNA- oder Proteinspiegeln.
- Operativer Wert: Einfaches, plattenbasiertes Format mit minimalem manuellem Aufwand und Kompatibilität mit gängigen Mikroplatten-Readern.
- Strategischer Wert: Ermöglicht Go/No-Go-Entscheidungen basierend auf funktioneller Aktivität statt allein auf Expression und verbessert so die Vorhersagesicherheit.
- Portfolio-Implikation: Erleichtert die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Immuntherapien, indem die mechanistische Wirksamkeit früh im Entwicklungsprozess bestätigt wird.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Isolierung primärer Immunzellen und deren Lyse unter kontrollierten Bedingungen, um die Proteaseaktivität zu erhalten.
- Setzt den Zugang zu einem Mikroplattenreader voraus, der kinetische Messungen der OD405 ermöglicht, sowie kompatible Analysesoftware.
- Benötigt die Einbeziehung von Granzym-B-Knockout-Kontrollen, um die Spezifität des Assays zu bestätigen, wie in der Quelle gezeigt.
- Die Anpassung auf andere Proteasen erfordert die Validierung alternativer Substrate, um eine vergleichbare Spezifität und Signalbreite beizubehalten.
- Praktische Einschränkung: Der Assay misst die gesamte Aktivität des Lysats und kann für Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation eine Fraktionierung erfordern.
