Name: Ein Farbtest, die speziell Maßnahmen Granzyme B Proteolytische Aktivität: Hydrolyse von Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 20 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die proteolytische Aktivität von Granzym B mit einem kolorimetrischen Assay quantitativ messen. Diese Methode nutzt spezifische Substrathydrolyse und ist auf humane, murine oder rattenbasierte Proben anwendbar.

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Diese Arbeit wurde durch das Stipendium HA 6136/1-1 der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) an MH unterstützt. JAT wird durch Programm- und Projektzuschüsse des National Health and Medical Research Council of Australia unterstützt.

HINWEIS: Die Milz wurde aus Mäusen (6-10 Wochen alt) und alle Tierversuche wurden nach den Tierethik Richtlinien der Peter MacCallum Cancer Center (E486) durchgeführt. 1. Vorbereitung der Proben. <ol><li> Herstellung von aktivierten Maus-NK-Zellen. <ol><li> Isolieren Primär naive NK-Zellen von Einzelzellsuspensionen von den Milzen von C57BL / 6 oder B6.GrzmB - / - (GzmB Gen null) Mäusen durch negative Selektion unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Kits. </li><li> Folgen Protokoll der Hersteller. Kurz gesagt, magnetisch zu markieren &quot;nicht-NK&quot; Zellen, wie T- und B-Zellen, dendritischen Zellen, Granulozyten, Makrophagen und Erythrozyten unter Verwendung von Biotin-konjugiertem Antikörper gegen ihre spezifischen Oberflächenmarkern. Verwenden magnetischer Trennung mit Anti-Biotin-Perlen zu &quot;nicht-NK&quot; Zellen abzureichern. </li><li> Kultur isoliert NK-Zellen für 5-7 Tage in Medium, das IL-2 (1.000 U / ml) bei 700000 Zellen / ml in 24-Well-Plattenbei 37 &#160; ° C. </li><li> Alternativ aktiviert Verwendung T-Zellen 19, primäre Antigen-restringierte CTL aus OT1 T-Zell-Rezeptor-transgenen Mäusen 20 erzeugte CTL in gemischten Lymphozyten-Kulturen 21 oder Überständen von aktivierten NK-Zellen, um die Aktivität der sekretierten GzmB 19 bestimmen. </li></ol></li><li> Wartung der menschlichen NK-Zelllinie und Isolierung von primären NK-Zellen. <ol><li> Pflege der menschlichen NK Leukämie (YT-Zellen) in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium mit 10% fötalem Kälberserum ergänzt. Alternativ reinigen primären NK-Zellen aus dem peripheren Blut von gesunden Probanden und für 2-3 Tage in einem Medium anzuregen, das IL-2 bei 100 U / ml, wie zuvor beschrieben 22. </li></ol></li><li> Erzeugung von Zelllysaten. <ol><li> Wash-Zellen dreimal in PBS (pH 7,4), dann in Nonidet P-40 Lysepuffer auszusetzen (0,1% NP-40, 250 mM NaCl, 25 mM Hepes, 2,5 mM EDTA). Idealerweise Lyse von mindestens 5 x 10 6 </sbis&gt; NK-Zellen oder 1 · 10 7 T-Zellen in 100 ul Puffer. Nicht hinzufügen Proteaseinhibitoren, wie viele sind irreversible Inhibitoren von Serinproteasen, insbesondere Tryptasen wie GZMA. Inkubieren auf Eis für 20 min, und dann die Kerne zu pelletieren in einer Mikrozentrifuge bei 15.000 × g für 10 min. Entsorgen Sie die Kernpellet und den Überstand in ein frisches Röhrchen. </li></ol></li><li> Bestimmung der Proteinkonzentration der Lysate. <ol><li> Verwenden Sie ein handelsübliches Protokoll der Wahl, wie Bradford oder Bicinchoninsäure (BCA) und bestimmen Sie die Proteinkonzentration. Sicherzustellen, dass die Konzentration von ~ 2 mg / ml Minimum. Speicher Lysate bei -20 ° C bis zur Verwendung (Granzym-Aktivität ist für viele Monate bei -20 ° C stabil). </li></ol></li></ol> 2. Granzyme B-Aktivitätstest <ol><li> Herstellung der Reagenzien <ol><li> Bereiten Sie eine 10 mM Stamm der Substrate (Boc-AAD-S-Bzl oder Ac-IEPD-pNA) in DMSO (~ 5 mg / ml) und lagern bei -20 &amp; #176; C. Bereiten Sie eine Arbeitsverdünnung frisch und entsorgen Sie nach jedem Tag, als Boc-AAD-S-Bzl teilweise bei der Lagerung in DMSO hydrolysiert. </li><li> Bereiten Sie eine 250 mM Stamm der farbmetrischen Reagenz (5,5&#39;-Dithio-bis (2-nitrobenzoesäure), DTNB) in DMSO (0,09 g / ml) und bei -20 ° C. Bereiten Sie jeden Tag eine neue Arbeitsverdünnung. Dieses Reagenz ist nur für Substrate mit SBzl Indikatorgruppen nicht pNA erforderlich. </li><li> Make-up frischen Puffer (0,1 M HEPES, 0,05 M MgCl 2, pH 7,3), alle 2-3 Wochen. </li></ol></li><li> Bringen DTNB und synthetische Substrate auf Raumtemperatur. Verdünnen Substrate (01.16, zB 100 ul in 1,6 ml Puffer) und DTNB (1: 250, beispielsweise 10 &amp; mgr; l in 2,5 ml Puffer) und gut mischen. </li><li> Verdünne ein Minimum von 100 &amp; mgr; g Protein-Lysat von jeder Probe in einem Puffer, um ein Endvolumen von 160 ul. Mit einer Mehrkanal-Pipette werden 50 ul pro Vertiefung in dreifacher Ausfertigung (~ 33,3 ug / Vertiefung) in einer &#39;&#39; U &#39;&#39; bottom Vinyl Platte mit 96 Vertiefungen.Fügen Sie eine &quot;Puffer-only&quot; Kontrolle (auch in dreifacher Ausfertigung). </li><li> 100 l verdünnt DTNB zu der Proben / Pufferkontrolle (bei der Arbeit mit Ac-IEPD-pNA lassen Sie diesen Schritt. HINWEIS: Die Spaltung von Ac-IEPD-pNA durch GzmB direkt frei fluorogenen pNA (4B). </li><li> Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette um 50 ul verdünnt Substrate auf jeden Satz von dreifach schnell hinzufügen, beginnend mit dem Puffer dann negative Kontrollen und endend mit erwarteten positiven Proben. </li><li> Die Platte wird in der Plattenlesegerät. Messen Asp-ase-Aktivität durch Hydrolyse von Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl / Ac-IEPD-pNA in einem Mikroplatten-Lesegerät bei OD 405 nm. Verwenden Sie eine kinetische Assay-Protokoll, nehmen 25 Lesungen, alle 15 Sekunden (ca. 6 min Gesamtlesezeit). </li><li> Verwenden Sie die Absorptionswerte zu jedem Zeitpunkt erzeugt werden, um manuell berechnen die Geschwindigkeit der Spaltung des Substrats, wenn die Software des Plattenlesegerät kann kein Wert für Vmax zu generieren. </li></ol> 3. Analyse Data Hinweis: die erzeugt wird, wenn die maximale Geschwindigkeit präsentierten Daten, definiert als Veränderung der OD über die Zeit (mOD / min). <ol><li> Um die Daten zu analysieren, zu bestimmen, die maximale Geschwindigkeit der Spaltung des Substrats, die von der Änderungsrate der Extinktion berechnet wird. Tun Sie dies automatisch mit dem Plattenlesegerät-Software, die in der Regel hat diese Option. </li><li> Alternativ nach der Anzeige der kinetischen Grundabsorptionsänderung, die während der kinetischen Assay auf dem Plattenlesegerät erzeugt werden, manuell auswählen, die Datenpunkte, die den steilsten gerade Linie zu geben. Für die meisten Tests wird innerhalb der ersten 2 min des Tests die maximale Rate erreicht. </li><li> Subtrahieren Sie die Anfangs-OD Lesung aus dem höchsten OD-Wert auf dieser geraden Linie und Gefälle durch das Zeitintervall. Übertragen Sie Rohdaten an Microsoft Excel / Graph-Pad für die statistische Analyse und grafische Darstellung. </li></ol>

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<li>Hagn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+mouse+B+cells+lack+expression+of+granzyme%5BTitle%5D)+AND+%22B.+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Activated mouse B cells lack expression of granzyme.</a> B. J Immunol. 188 (2), 3886-3892 (2012).</li>
<li>Konjar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+and+mouse+perforin+are+processed+in+part+through+cleavage+by+the+lysosomal+cysteine+proteinase+cathepsin+L%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human and mouse perforin are processed in part through cleavage by the lysosomal cysteine proteinase cathepsin L.</a> Immunology. 131 (2), 257-267 (2010).</li>
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<li>Bird, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+regulation+of+apoptosis%3A+the+cytotoxic+lymphocyte+serpin+proteinase+inhibitor+9+protects+against+granzyme+B-mediated+apoptosis+without+perturbing+the+Fas+cell+death+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Selective regulation of apoptosis: the cytotoxic lymphocyte serpin proteinase inhibitor 9 protects against granzyme B-mediated apoptosis without perturbing the Fas cell death pathway.</a> Mol Cell Biol. 18 (11), 6387-6398 (1998).</li>
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<li>Sun, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+family+of+10+murine+ovalbumin+serpins+includes+two+homologs+of+proteinase+inhibitor+8+and+two+homologs+of+the+granzyme+B+inhibitor+%28proteinase+inhibitor+9%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A new family of 10 murine ovalbumin serpins includes two homologs of proteinase inhibitor 8 and two homologs of the granzyme B inhibitor (proteinase inhibitor 9).</a> J Biol Chem. 272 (24), 15434-15441 (1997).</li>
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<li>Jenkins, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+CTL+activity+for+different+CD8%2B+effector+T+cells+supports+the+idea+that+lower+TCR%2Fepitope+avidity+may+be+advantageous+for+target+cell+killing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Visualizing CTL activity for different CD8+ effector T cells supports the idea that lower TCR/epitope avidity may be advantageous for target cell killing.</a> Cell Death Differ. 16 (4), 537-542 (2009).</li>
<li>Edwards, K. M., Kam, C. M., Powers, J. C., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+cytotoxic+T+cell+granule+serine+protease+granzyme+H+has+chymotrypsin-like+%28chymase%29+activity+and+is+taken+up+into+cytoplasmic+vesicles+reminiscent+of+granzyme+B-containing+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The human cytotoxic T cell granule serine protease granzyme H has chymotrypsin-like (chymase) activity and is taken up into cytoplasmic vesicles reminiscent of granzyme B-containing endosomes.</a> J Biol Chem. 274 (43), 30468-30473 (1999).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Historisch die Granzyme wurden als Schlüssel Effektormoleküle zytotoxischer Lymphozyten (CTL und NK-Zellen), die zur Induktion einer schnellen apoptotischen Tod in Zielzellen identifiziert. Dies war vor allem auf die Wirkung von GzmB, das Zielsubstrat Moleküle an Aspartat (D) Reste gespalten und somit konnte die Caspase-Kaskade von beiden spalten pro-Caspasen zu aktivieren, sowie mehrere ihrer nachgelagerten Ziele. Es ist jedoch nun ersichtlich, dass GzmB Expression ist nicht auf lymphoide zytotoxischen Zellen beschränk...

Granzyme sind eine Familie von Serin-Proteasen, die in den sekretorischen Lysosomen von natürlichen Killerzellen (NK) und zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) 1 gefunden. Fünf verschiedene Granzyme im Menschen vorhanden (A, B, H, K und M), und zehn Mäuse (A - G, K, M und N) 2,3. Granzyme A und Granzyme B (GZMA, GzmB) sind die häufigsten und wurden umfangreich im menschlichen und Nagetier-Einstellung untersucht. Die klassische Funktion GzmB ist die Induktion von Apoptose in Zielzellen in Verbindung mit der porenbildende Protein von Perforin, Granzym, die die an die Zielzelle Cytosol 4 Zugriff ermöglicht ausgeführt. Obwohl GzmB Expression unzweideutig in zytotoxischen Lymphozyten haben neuere Studien wurden zu einer Vielzahl anderer GzmB exprimierenden Zelltypen, einschließlich, aber nicht beschränkt Keratinozyten 5, 6 Basophilen, Mastzellen 7, plasmacytoid dendritischen Zellen 8, 9 und B-Zellen, 10.In diesem Zusammenhang wurden nicht-apoptotischen GzmB Funktionen ergeben, die von der Teilnahme an entzündlichen Prozessen, Gewebeumbau und anderen immunregulatorischen Eigenschaften 14.11. Da eine breitere biologische Rolle für GzmB als bisher vermutet vorgeschlagen, Forschern erfordern zuverlässige und spezifische Werkzeuge für die Erkennung. Von Vorteil ist, GzmB die ausdrückliche Verpflichtung, in der Carboxylseite von Asparaginsäurereste, eine Eigenschaft, einzigartig unter den eukaryotischen Serinproteasen 15 zu spalten. Maus, Ratte und Mensch sind GzmB strukturell sehr ähnlich, aber die erweiterten Substratspezifität der Maus GzmB unterscheidet dezent von der Ratte und Mensch 16, was bedeutet, dass bestimmte allgemeine Substraten mit Asp an der Klemme (P1) effizient durch GzmB gespalten von allen drei Spezies, während andere Substrate mit komplizierteren Sequenzen stromaufwärts von P1 kann stark unterschiedliche Ergebnisse ergeben. In der Vergangenheit und neuere literature hat diese Tatsache erhebliche Verwirrung und Fehlinterpretation der biologische Bedeutung einiger experimenteller Befunde verursacht, obwohl sorgfältig kontrolliert wurden kinetische Untersuchungen versucht, die Lage 17 zu korrigieren. In dieser Arbeit haben wir versucht, diese Punkte unter Verwendung von zwei im Handel erhältliche Substrate, nämlich Boc-Ala-Ala-Asp-SBzl und N-acetyl-Ile-Glu-Pro-Asp-p-Nitroanilid zu illustrieren. Die beiden Reagenzien zu tun erzeugen unterschiedliche reaktive Gruppen nach der Spaltung (eine freie Sulfhydryl gegenüber einer Leuchtstoff kostenlos Paranitroanilid), aber dies berührt in keiner Weise auf die proteolytische Spaltung. Das beschriebene Protokoll ist eine moderne Adaption eines sehr alten Protokoll 18, sollte aber helfen Forschern, die verschiedenen GzmB Substrate angemessen zu nutzen, sondern schafft auch einen methodischen Rahmen zur Erfassung der Aktivität von anderen Granzyme wie GZMA und GzmH.

<table><tbody><tr><td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SMSB05</td><td>Granzyme B-Substrat (Maus und Mensch)</td></tr><tr><td>Ac-IEPD-pNA&nbsp;</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SMPNA009</td><td>Granzyme B Substrat (nur human)</td></tr><tr><td>N-&#945;-CBZ-L-Lysin-S-Bzl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3647</td><td>Granzyme A Substrat</td></tr><tr><td>Suc-Phe-Leu-Phe-S-Bzl</td><td>SM Biochemicals LLC, CA</td><td>SB025</td><td>Granzyme H Substrat</td></tr><tr><td>5,5'-dithio-bis(2-nitrobenzoesäure)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8130</td><td>DTNB, Ellman' s Reagenz</td></tr><tr><td>NK Zellisolationskit II Maus</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-096-892</td><td>Negativ-Selektionskit</td></tr><tr><td>NK-Zellisolationskit human</td><td>Miltenyi Biotec GmbH</td><td>130-092-657</td><td>Negativ-Selektionskit</td></tr><tr><td>Plattenleser</td><td>Biorad iMark</td><td></td><td>Biorad Microplate Manager Softwareversion MPM6.3</td></tr><tr><td>Serocluster U-Boden Vinyl 96-Well-Platte</td><td>Corning, MA, USA</td><td>2797</td><td></td></tr></tbody></table>

ein farbtest, die speziell maßnahmen granzyme b proteolytische aktivität: hydrolyse von boc-ala-ala-asp-s-bzl

A Colorimetric Assay that Specifically Measures Granzyme B Proteolytic Activity: Hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Die Serinprotease Granzyme B (GzmB) vermittelt die Apoptose der Zielzelle, wenn sie von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) oder natürlichen Killerzellen (NK) freigesetzt wird. GzmB ist das am besten untersuchte Granzym bei Menschen und Mäusen, und daher benötigen Forscher spezifische und zuverlässige Werkzeuge, um seine Funktion und Rolle in der Pathophysiologie zu untersuchen. Dies erfordert insbesondere Assays, die Proteasen wie Caspasen oder andere Granzyme, die strukturell oder funktionell verwandt sind, nicht erkennen. Hier wenden wir die GzmB-Präferenz für die Spaltung nach Asparaginsäureresten in einem kolorimetrischen Assay mit dem Peptidthioester Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl an. GzmB ist die einzige Serinprotease aus Säugetieren, die in der Lage ist, dieses Substrat zu spalten. Das Substrat wird mit ähnlicher Effizienz von Mensch, Maus und Ratte GzmB gespalten, eine Eigenschaft, die von anderen kommerziell erhältlichen Peptidsubstraten nicht geteilt wird, selbst wenn einige als für diesen Zweck geeignet beworben werden. Dieses Protokoll wird unter Verwendung von unfraktionierten Lysaten aus aktivierten NK-Zellen oder CTL demonstriert und eignet sich auch für rekombinante Proteasen, die in einer Vielzahl von prokaryotischen und eukaryotischen Systemen erzeugt werden, vorausgesetzt, die richtigen Kontrollen werden verwendet. Dieser Assay ist eine hochspezifische Methode zur Bestimmung der potentiellen pro-apoptotischen Aktivität zytotoxischer Moleküle in Säugetier-Lymphozyten und ihrer rekombinanten Gegenstücke, die durch eine Vielzahl von Methoden exprimiert werden.

Die Boc-AAD-S-Bzl Substrat spezifisch für GzmB Die Serinprotease GzmB ist ein Hauptbestandteil von zytotoxischen Lymphozyten (CTL und NK-Zellen) und vorwiegend zur Induzierung schnelle apoptotischen Tod in Zielzellen, wie virusinfizierte oder transformierten Zellen verantwortlich. Dies ist vor allem aufgrund der Substratpräferenz für die Spaltung nach bestimmten Aspartatreste in ausgewählten Proteinen geteilt ein Attribut mit den Caspasen, die auch nach der Aspartatreste spa...

Wir beschreiben einen einfachen, quantitativen kolorimetrischen Assay, der speziell die proteolytische Aktivität von Granzym B (GzmB) bei Mensch, Maus oder Ratte misst. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um die Proteaseaktivität anderer granulierter Serinproteasen durch die Hydrolyse anderer synthetischer Peptidsubstrate mit einer geeigneten Erkennungssequenz zu bestimmen.

Ein Farbtest, die speziell Maßnahmen Granzyme B Proteolytische Aktivität: Hydrolyse von Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

The serine protease Granzyme B (GzmB) mediates target cell apoptosis when released by cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells. GzmB is ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die proteolytische Aktivität der Granzyman-B-Protease zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Lysat der Zellen von Interesse hergestellt und anschließend schnell Substrat zu den Proben hinzugefügt wird. Die Granzyman-B-Aktivität wird dann mittels einer farbmetrischen Reaktion gemessen. Letztendlich kann der hochspezifische Schnitt von alla alla as s benzo durch Granzyman B aufgrund seiner einzigartigen Substratspezifität für Asparat-Säurereste bewertet werden.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise dem Nachweis der Grand-Zone-B-Expression mittels PCR oder Western Blot, besteht darin, dass die Hydrolyse von Benzyl spezifisch für Grand Zone B ist und außerdem anzeigt, dass die Protease aktiv ist. Um die Zelle vorzubereiten, werden zunächst mittels negativer Selektion primäre NK-Zellen aus Einzelzell-Suspensionen von Milzen von Wildtyp C57 Black Six oder Kontroll-Mäusen mit Grand-Zyme-B-Gen-Deletion mit kommerziell erhältlichen Kits gemäß den Herstelleranweisungen nach Aktivierung der Zellen isoliert. Waschen Sie die Kultur dreimal in PBS bei maximaler Geschwindigkeit für zwei bis drei Sekunden und resuspendieren Sie dann das Pellet, das mindestens 5 Millionen NK-Zellen enthält, in 100 Mikrolitern Nonidet-P-40-Lysepuffer auf Eis für 20 Minuten. Danach das Lysat 10 Minuten bei 15.000 G in einer Mikrozentrifuge zentrifugieren und den überstehenden Überstand in ein frisches Röhrchen überführen. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration gemäß der entsprechenden, handelsüblichen Anleitung das Lysat mindestens in einer Konzentration von etwa zwei Milligramm pro Milliliter bei minus 20 Grad Celsius lagern, um einen Caspase-3-Aktivitätsassay durchzuführen. Anschließend pro Probe mindestens 100 Mikrogramm Proteinglysat in frisch zubereitetem HEPES-Puffer auf ein Endvolumen von 160 Mikrolitern verdünnen.Dann mit einer Mehrkanalpipette je 50 Mikroliter Probe pro Vertiefung in dreifacher Ausführung in eine 96-Loch-Vinyl-Platte mit U-förmigem Boden geben. Unter Berücksichtigung von drei Kontrollvertiefungen, die nur Puffer enthalten, je 100 Mikroliter verdünntes DTNB zu jeder Vertiefung hinzufügen. Anschließend schnell je 50 Mikroliter frisch verdünntes AlaLa-p-Nitrobenzoyl-Substrat zu den Puffer-allein-Vertiefungen geben, gefolgt von den negativen Kontrollen und abschließend den erwarteten positiven Proben.Messen Sie die Aase-Aktivität durch die Hydrolyse von Alala als Benzyl in einem Mikroplattenreader bei einer optischen Dichte von 405 Nanometern unter Verwendung eines kinetischen Assay-Protokolls mit 25 Messungen alle 15 Sekunden. Verwenden Sie abschließend die Software des Plattenreaders, um die maximale Substratspaltungsrate für jede Vertiefung zu berechnen, und übertragen Sie die Rohdaten anschließend in die geeignete Software für die statistische Analyse unter Verwendung von Granzym-Gen-Knockout-Mäusen. Es wurde festgestellt, dass das synthetische Peptidsubstrat Alala als Benzyl spezifisch durch Granzym B hydrolysiert wird. Eine weitere robuste Spaltung des synthetischen Substrats kann in Zelllysaten von primären NK-Zellen des Wildtyps nachgewiesen werden, nicht jedoch in NK-Zellen aus Granzym-B-Knockout-Tieren als Kontrolle.In diesem Experiment war die proteolytische Aktivität von Granzym A, das eine tripsinähnliche Substratspezifität aufweist und in Lysaten aus beiden Zelltypen vorhanden ist, gleich, gemessen durch die Hydrolyse von BLT-Benzyl. I-E-P-D-P-N-A wurde generisch verwendet, um die Granzym-B-Aktivität über verschiedene Arten hinweg zu testen. Bei dieser repräsentativen Versuchsanalyse zeigte sich, dass menschliches, aber nicht murines Granzym B die Sequenz IEPD effizient nachspalten kann, was der Erkennungssequenz sowohl im menschlichen als auch im murinen Bid entspricht. Im Gegensatz dazu führt die Verringerung der Menge an menschlichem NK-Leukämiezell-Lysat von 30 Mikrogramm auf 10 Mikrogramm weiterhin zu ausreichend Granzym B, um das I-E-P-D-P-N-A-Substrat zu hydrolysieren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das geeignete Substrat und die richtigen experimentellen Kontrollen für die In-vitro-Analyse des roten menschlichen und des roten murinen Enzyms B auswählt.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

In diesem Video führen wir Zymographie durch, eine elektrophoretische Technik, um die proteolytische Aktivität in biologischen Proben zu analysieren.

Fluoreszierende Peptid-Zymographie: Eine modifizierte Technik zum Nachweis der Proteaseaktivität unter Verwendung fluorogener Substrate in Zymogramm-Gelen

Dieses Video beschreibt einen in vitro Caspase-3/7 Lumineszenz-Assay zur Quantifizierung von Zelltod oder Apoptose. Der Assay misst die Lumineszenz, die nach der Caspase-3/7-Spaltung eines prolumineszierenden DEVID-Substrats erzeugt wird. Die erzeugte Lumineszenz ist proportional zur Caspase-3/7-Aktivität.

Caspase-3/7-Assay: Ein lumineszenzbasierter Assay zur Quantifizierung der Apoptose durch Messung der Caspase-3/7-Aktivitäten in Froschhaut-Explantaten

Dieses Video zeigt einen Assay zum Screening der proteolytischen Aktivität von Proteasen mit fluorogenen Peptiden. Die Protease erkennt ihre Spaltstelle auf dem Peptid, spaltet es und trennt den Quencher vom Fluorophor, wodurch seine Fluoreszenzemission ermöglicht wird. Das Fluoreszenzsignal wird detektiert und analysiert, um die Spaltungseffizienz verschiedener Peptidvarianten zu überprüfen.

Ein fluorogener Peptidspaltungsassay zum Screening der proteolytischen Aktivität von Proteasen

Dieses Video zeigt einen Assay zur Überwachung der Neutrophilenaktivierung und der Granulatexozytose durch einen Degranulationsassay. Bei der Aktivierung durch proinflammatorische Verbindungen verschmelzen zytoplasmatische Granula in den Neutrophilen, die Gelatinase enthalten, mit der Zellmembran und entladen ihre Fracht. Das Vorhandensein von Gelatinase im Überstand wird durch die Hydrolyse eines Fluorophor-konjugierten Gelatinesubstrats beurteilt, wodurch die Aktivierung und Degranulation von...

Ein Degranulationsassay zur Überwachung der Neutrophilenaktivierung und der Gelatinasefreisetzung

Dieses Video zeigt einen Degranulationsassay von azurophilen Granula in Maus-Neutrophilen, bei dem Neutrophile stimuliert werden, um myeloperoxidasehaltige azurophile Granula freizusetzen. Die anschließende enzymatische Reaktion wird verwendet, um den Myeloperoxidase-Spiegel zu quantifizieren und so einen Einblick in die Aktivierung von Neutrophilen zu erhalten.

Ein Assay zur Überwachung der Degranulation von azurophilen Granulaten in Neutrophilen nach der Aktivierung

Wir beschreiben hier ein kosteneffizientes Granzym-Expressionssystem mit HEK293T Zellen, das hohe Ausbeuten an reiner, vollständig glykosylierter und enzymatisch aktiver Protease produziert.

Eine hohe Ausbeute und kosteneffiziente Expression System der Menschen Granzyme in Säugerzellen

Hier präsentieren wir Protokolle zum schnellen Screening und zur Charakterisierung von Enzymen auf antimikrobielle Aktivität. Der Mikroschiebe-Diffusionsassay und der Farbstofffreisetzungsassay verwenden bakterielle Zielsubstrate für die qualitative und quantitative Bewertung der enzymatischen Aktivität.

Qualitative und quantitative Assays zur Detektion und Charakterisierung von Protein Antimikrobielle

Hier präsentieren wir Ihnen ein detailliertes Protokoll für eine modifizierte Zymographic-Technik in der fluoreszierenden Peptide als abbaubare Substrat anstelle von native Proteine verwendet werden. Elektrophorese von biologischen Proben in fluoreszierenden Peptid-Zymogramme ermöglicht die Detektion eines breiteren Spektrums von Proteasen als frühere Zymographic Techniken.

Erkennung von Protease-Aktivität durch fluoreszierende Peptid Zymography

Das vorliegende Protokoll beschreibt zwei Methoden zur Messung der Caspase-Aktivität durch ein fluorogenes Substrat unter Verwendung von Durchflusszytometrie oder einem Spektrofluorometer.

Messung der Caspase-Aktivität mit einem fluorometrischen Assay oder einer Durchflusszytometrie

In dieser Arbeit beschreiben wir Protokolle zur biophysikalischen Charakterisierung der ternären Komplexbildung, die durch Proteolyse-Targeting-Chimären (PROTACS) induziert wird, an denen die Ubiquitin-Ligasen Von-Hippel-Lindau E3-Ligase (VHL) und Cereblon (CRBN) beteiligt sind.  Zu den hier dargestellten biophysikalischen Methoden gehören die Oberflächenplasmonenresonanz (SPR), die Bioschichtinterferometrie (BLI) und die isotherme Titrationskalorimetrie (ITC).

Entwicklung und Anwendung biophysikalischer Assays zur Evaluierung der Bildung ternärer Komplexe, die durch Proteolyse-Targeting-Chimären (PROTACS) induziert werden

Dieses Protokoll beschreibt die Entwicklung eines kolorimetrischen Assay-Verfahrens zur Bestimmung der Fähigkeit von Verbindungen, die Elastaseaktivität zu hemmen oder zu aktivieren.

Quantifizierung der Modulation der Elastase-Enzymaktivität durch kolorimetrische Analyse

Erfahren Sie, wie Sie die proteolytische Aktivität von Granzym B mit einem kolorimetrischen Assay quantitativ messen. Diese Methode nutzt spezifische Substrathydrolyse und ist auf humane, murine oder rattenbasierte Proben anwendbar.

Ein Farbtest, die speziell Maßnahmen Granzyme B Proteolytische Aktivität: Hydrolyse von Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

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