Ein Farbtest, die speziell Maßnahmen Granzyme B Proteolytische Aktivität: Hydrolyse von Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl
28. November 2014
Wir beschreiben einen einfachen, quantitativen kolorimetrischen Assay, der speziell die proteolytische Aktivität von Granzym B (GzmB) bei Mensch, Maus oder Ratte misst. Dieses Protokoll kann leicht angepasst werden, um die Proteaseaktivität anderer granulierter Serinproteasen durch die Hydrolyse anderer synthetischer Peptidsubstrate mit einer geeigneten Erkennungssequenz zu bestimmen.
Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die proteolytische Aktivität der Granzyman-B-Protease zu messen. Dies wird erreicht, indem zunächst ein Lysat der Zellen von Interesse hergestellt und anschließend schnell Substrat zu den Proben hinzugefügt wird. Die Granzyman-B-Aktivität wird dann mittels einer farbmetrischen Reaktion gemessen. Letztendlich kann der hochspezifische Schnitt von alla alla as s benzo durch Granzyman B aufgrund seiner einzigartigen Substratspezifität für Asparat-Säurereste bewertet werden.
Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie beispielsweise dem Nachweis der Grand-Zone-B-Expression mittels PCR oder Western Blot, besteht darin, dass die Hydrolyse von Benzyl spezifisch für Grand Zone B ist und außerdem anzeigt, dass die Protease aktiv ist. Um die Zelle vorzubereiten, werden zunächst mittels negativer Selektion primäre NK-Zellen aus Einzelzell-Suspensionen von Milzen von Wildtyp C57 Black Six oder Kontroll-Mäusen mit Grand-Zyme-B-Gen-Deletion mit kommerziell erhältlichen Kits gemäß den Herstelleranweisungen nach Aktivierung der Zellen isoliert. Waschen Sie die Kultur dreimal in PBS bei maximaler Geschwindigkeit für zwei bis drei Sekunden und resuspendieren Sie dann das Pellet, das mindestens 5 Millionen NK-Zellen enthält, in 100 Mikrolitern Nonidet-P-40-Lysepuffer auf Eis für 20 Minuten.
Danach das Lysat 10 Minuten bei 15.000 G in einer Mikrozentrifuge zentrifugieren und den überstehenden Überstand in ein frisches Röhrchen überführen. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration gemäß der entsprechenden, handelsüblichen Anleitung das Lysat mindestens in einer Konzentration von etwa zwei Milligramm pro Milliliter bei minus 20 Grad Celsius lagern, um einen Caspase-3-Aktivitätsassay durchzuführen. Anschließend pro Probe mindestens 100 Mikrogramm Proteinglysat in frisch zubereitetem HEPES-Puffer auf ein Endvolumen von 160 Mikrolitern verdünnen.
Dann mit einer Mehrkanalpipette je 50 Mikroliter Probe pro Vertiefung in dreifacher Ausführung in eine 96-Loch-Vinyl-Platte mit U-förmigem Boden geben. Unter Berücksichtigung von drei Kontrollvertiefungen, die nur Puffer enthalten, je 100 Mikroliter verdünntes DTNB zu jeder Vertiefung hinzufügen. Anschließend schnell je 50 Mikroliter frisch verdünntes AlaLa-p-Nitrobenzoyl-Substrat zu den Puffer-allein-Vertiefungen geben, gefolgt von den negativen Kontrollen und abschließend den erwarteten positiven Proben.
Messen Sie die Aase-Aktivität durch die Hydrolyse von Alala als Benzyl in einem Mikroplattenreader bei einer optischen Dichte von 405 Nanometern unter Verwendung eines kinetischen Assay-Protokolls mit 25 Messungen alle 15 Sekunden. Verwenden Sie abschließend die Software des Plattenreaders, um die maximale Substratspaltungsrate für jede Vertiefung zu berechnen, und übertragen Sie die Rohdaten anschließend in die geeignete Software für die statistische Analyse unter Verwendung von Granzym-Gen-Knockout-Mäusen. Es wurde festgestellt, dass das synthetische Peptidsubstrat Alala als Benzyl spezifisch durch Granzym B hydrolysiert wird. Eine weitere robuste Spaltung des synthetischen Substrats kann in Zelllysaten von primären NK-Zellen des Wildtyps nachgewiesen werden, nicht jedoch in NK-Zellen aus Granzym-B-Knockout-Tieren als Kontrolle.
In diesem Experiment war die proteolytische Aktivität von Granzym A, das eine tripsinähnliche Substratspezifität aufweist und in Lysaten aus beiden Zelltypen vorhanden ist, gleich, gemessen durch die Hydrolyse von BLT-Benzyl. I-E-P-D-P-N-A wurde generisch verwendet, um die Granzym-B-Aktivität über verschiedene Arten hinweg zu testen. Bei dieser repräsentativen Versuchsanalyse zeigte sich, dass menschliches, aber nicht murines Granzym B die Sequenz IEPD effizient nachspalten kann, was der Erkennungssequenz sowohl im menschlichen als auch im murinen Bid entspricht. Im Gegensatz dazu führt die Verringerung der Menge an menschlichem NK-Leukämiezell-Lysat von 30 Mikrogramm auf 10 Mikrogramm weiterhin zu ausreichend Granzym B, um das I-E-P-D-P-N-A-Substrat zu hydrolysieren.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man das geeignete Substrat und die richtigen experimentellen Kontrollen für die In-vitro-Analyse des roten menschlichen und des roten murinen Enzyms B auswählt.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt einen quantitativen, farbmetrischen Assay zur Messung der proteolytischen Aktivität von Granzym B (GzmB) in menschlichen, maus- oder rattenspezifischen Proben vor. Die Methode kann durch Verwendung unterschiedlicher synthetischer Peptidsubstrate für andere Granula-Serinproteasen angepasst werden.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Protease-Aktivität
- Zellbiologie
Hintergrund
- Granzym B ist eine Serinprotease, die an Immunantworten beteiligt ist.
- Die Messung ihrer Aktivität ist entscheidend, um ihre Rolle bei der zellvermittelten Zytotoxizität zu verstehen.
- Bisherige Methoden wie PCR oder Western Blot messen die Proteaseaktivität nicht direkt.
- Dieser Assay ermöglicht eine spezifische und direkte Bestimmung der GzmB-Aktivität.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines einfachen Assays zur Quantifizierung der GzmB-Aktivität.
- Bereitstellung einer Methode, die für andere Proteasen angepasst werden kann.
- Verbesserung bestehender Techniken durch Spezifität für die GzmB-Aktivität.
Verwendete Methoden
- Herstellung von Zelllysaten aus primären NK-Zellen.
- Verwendung einer farbmetrischen Reaktion zur Messung der GzmB-Aktivität.
- Isolierung von NK-Zellen aus Milzen von Wildtyp- und Granzym-B-Gen-Null-Mäusen.
- Hydrolyse von Substraten zur Beurteilung der Proteaseaktivität.
Hauptergebnisse
- Der Assay misst erfolgreich die GzmB-Aktivität durch spezifische Spaltung des Substrats.
- Er weist im Vergleich zu anderen Methoden eine hohe Spezifität für GzmB auf.
- Die Ergebnisse zeigen, dass die Protease aufgrund der Substrathydrolyse aktiv ist.
- Die Methode lässt sich für andere granuläre Serinproteasen anpassen.
Schlussfolgerungen
- Der entwickelte Test ist ein zuverlässiges Werkzeug zur Messung der GzmB-Aktivität.
- Er bietet Vorteile gegenüber herkömmlichen Methoden, da er die Proteasefunktion direkt bewertet.
- Dieser Ansatz kann die Forschung zu Immunantworten und der Proteasebiologie verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die genaue Messung der proteolytischen Aktivität von Granzym B ist entscheidend zur Validierung der Funktion zytotoxischer Lymphozyten bei der Entwicklung von Immuntherapien. Dieser farbmetrische Assay liefert einen direkten, spezifischen Nachweis der Proteaseaktivität und ermöglicht die mechanistische Absicherung der Zielstrukturnbindung und des pro-apoptotischen Potenzials in präklinischen Modellen. Die Querspeziesverträglichkeit unterstützt die translationale Kontinuität von Studien an Nagetieren bis hin zu Anwendungen beim Menschen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung von Granzym-B-abhängigen Apoptosewegen in zytotoxischen Lymphozyten.
- Operationaler Wert: Unterscheidet aktive Protease von bloßer Expression und reduziert so falsch-positive Ergebnisse bei der Zielvalidierung.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die funktionelle Bestätigung von Granzym B als mechanistischem Treiber bei der immunvermittelten Tumorbeseitigung.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Verwendet das Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl-Substrat, das ausschließlich von Granzym B in humanen, murinen und rattenspezifischen Systemen hydrolysiert wird.
- Quantitative Ausgabe: Misst die anfänglichen Hydrolyseraten mittels DTNB-gekoppelter farbmessender Reaktion bei 405 nm für die kinetische Analyse.
- Spezifitätskontrolle: Schließt Interferenzen durch Caspasen und andere Granzyme aufgrund der einzigartigen Präferenz für Aspartat aus.
- Reproduzierbarkeit: Kompatibel mit unfraktionierten Lysaten und rekombinanten Proteasen, sofern geeignete Kontrollen einbezogen werden.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Anwendbar auf Modelle der Tumorimmunüberwachung, Virusinfektionen und autoimmune Erkrankungen, bei denen Granzym B die Zielzell-Apoptose vermittelt.
- Translationale Kontinuität: Ermöglicht die konsistente Messung der Aktivität über verschiedene Arten hinweg und unterstützt die Übertragung von Daten von der Maus auf den Menschen.
- Risikoadjustierte Entscheidungen: Liefert einen aktivitätsbasierten Biomarker, um Kandidaten mit nachgewiesenem zytotoxischem Potenzial zu priorisieren.
Pipeline- und Workflow-Integration
Der Test fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung bis zur Leitstruktur-Optimierung ein, wobei die funktionelle Proteaseaktivität Aufschluss über die biologische Wirksamkeit und den Wirkmechanismus gibt.
- Entdeckungsbiologie: Bestätigt die Hypothese, dass Granzym B die Apoptose in Effektorlymphozyten über substratspezifische Spaltung auslöst.
- Screening: Liefert standardisierte, quantitative Aktivitätsmessungen zum Vergleich verschiedener Bedingungen oder genetischer Störungen.
- Analytik: Erzeugt kinetische Daten (Vmax), die einen Vergleich zwischen Proben und eine statistische Bewertung der proteolytischen Kapazität ermöglichen.
- Translationale Forschung: Unterstützt die präklinische Validierung, indem sie die erhaltene Aktivität von Granzym B beim Menschen, bei Maus und Ratte nachweist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Plattform ist durch Substitution des Substrats an andere Granulaproteasen anpassbar und erhöht so die langfristige Nützlichkeit.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Die direkte Messung der proteolytischen Funktion verringert die Abhängigkeit von Surrogatmarkern wie mRNA- oder Proteinspiegeln.
- Operativer Wert: Einfaches, plattenbasiertes Format mit minimalem manuellem Aufwand und Kompatibilität mit gängigen Mikroplatten-Readern.
- Strategischer Wert: Ermöglicht Go/No-Go-Entscheidungen basierend auf funktioneller Aktivität statt allein auf Expression und verbessert so die Vorhersagesicherheit.
- Portfolio-Implikation: Erleichtert die risikoadjustierte Weiterentwicklung von Immuntherapien, indem die mechanistische Wirksamkeit früh im Entwicklungsprozess bestätigt wird.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Isolierung primärer Immunzellen und deren Lyse unter kontrollierten Bedingungen, um die Proteaseaktivität zu erhalten.
- Setzt den Zugang zu einem Mikroplattenreader voraus, der kinetische Messungen der OD405 ermöglicht, sowie kompatible Analysesoftware.
- Benötigt die Einbeziehung von Granzym-B-Knockout-Kontrollen, um die Spezifität des Assays zu bestätigen, wie in der Quelle gezeigt.
- Die Anpassung auf andere Proteasen erfordert die Validierung alternativer Substrate, um eine vergleichbare Spezifität und Signalbreite beizubehalten.
- Praktische Einschränkung: Der Assay misst die gesamte Aktivität des Lysats und kann für Untersuchungen zur subzellulären Lokalisation eine Fraktionierung erfordern.
