Name: Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Lernen Sie die Echtzeit-Quantifizierung von Zelladhäsion und De-Haftung in Endothelzellen mittels Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung dynamischer Veränderungen durch Matrix-Modifikationen.

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Diese Arbeit wurde durch einen Project Grant 568721 (SRT) des National Health and Medical Research Council (NHMRC) und teilweise durch einen Faculty Research Grant (MDR) der UNSW Faculty of Medicine finanziert.

1. Allgemeine Endothelial Cell Culture <ol><li> Kultur Endothelzellen der Rinderaorta (Gänge 4-9) auf Gelatine-beschichteten Gewebekulturflaschen (coat-Zellkulturoberfläche mit 0,1% w / v Gelatine in PBS bei RT für 15 min) in EGM-2-Medien (mit dem EGM-2 kugel Kit, enthaltend 5% fötales Rinderserum, Wachstumsfaktoren und alle Ergänzungen durch den Hersteller zur Verfügung gestellt, mit Ausnahme von Hydrocortison). </li><li> Wenn die Zellen nahezu konfluent (ca. 3 Tage nach der Aussaat nach einer 1: 4-split), Ernten der Zellen durch Behandlung mit 0,05% w / v Trypsin / 0,02% w / v EDTA in PBS bei 37 ° C. Nachdem der Großteil der Zellen gelöst, fügen komplette EGM-2-Medien, um das Trypsin und dann Zentrifuge (100 · g, 5 min) zu löschen. </li><li> Vorbereitung der Zellen für Untersuchungen über die de novo Adhäsion von endothelialen Zellen an Fibronektin (Experiment 1: Teil 2) und der anschließenden de-Adhäsion von Endothelzellen mit etablierten Haftung auf diesem Substrat (Experiment 2: Abschnitt 3). <ol><li> Waschen geerntetZellen wurden einmal mit serumfreiem Medium 199, das 1% w / v Rinderserumalbumin (BSA) und Re-Zentrifuge (100 × g, 5 min). </li><li> Resuspendieren Zellen in serumfreiem Medium 199, das 1% w / v BSA auf 2,5 x 10 5 Zellen / ml (Zell-Substrat-Impedanzmessungen) oder 5 × 10 5 Zellen / ml (Abbildung lebender Zellen analysiert) und Aufrechterhaltung bei 37 ° C vor der Verwendung. HINWEIS: Die Haft Antworten von Zellen sehr empfindlich auf Temperaturunterschiede (beispielsweise aufgrund von Konvektion Effekte), so dass alle Geräte und Lösungen verwendet werden, um während der folgenden Protokolle verarbeiten und zu behandeln Zellen sollten bei einer konstanten Temperatur von 37 ° C gehalten werden. </li></ol></li></ol> 2. Experiment 1: Quantifizierung De Novo Endothelzelladhäsion auf Einheimische und MPO-oxidiert Fibronectin (Zell-Substrat-Impedanz) HINWEIS: Experiment 1 untersucht, in welchem ​​Maße MPO-vermittelten Oxidation von Fibronektin beeinträchtigt ihre Fähigkeit zur Unterstützung de novo </em&gt; Haftung ausgesetzt Endothelzellen. <ol><li> Coat Fibronektin auf 96-Loch-Gold Zell-Substrat-Impedanz Mikroelektroden-Arrays. In 80 ul / Vertiefung gereinigtes Rinder Fibronektin bei 5 ug / ml in PBS, Inkubation für 2 Stunden bei 37 ° C, und entfernen Sie die Lösung. </li><li> Inkubieren Fibronektin-beschichteten Oberflächen mit MPO die Bindung von MPO an die Oberfläche gebundenen Fibronectin ermöglichen. Werden 80 ul / Vertiefung von gereinigtem humanen neutrophilen MPO bei 20 nM in Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) und Inkubation für 0,5 h bei 37 ° C. </li><li> Wash Oberflächen zweimal mit HBSS um ungebundenes MPO entfernen. </li><li> Hinzufügen H 2 O 2 (0-10 uM Endkonzentration) zu den Vertiefungen der Mikroelektroden-Array-Platte, die 80 &amp; mgr; l / Vertiefung HBSS einzuleiten MPO-katalysierte, HOCl-abhängigen Fibronektin Oxidation und Inkubation für weitere 0,5 h bei 37 ° C. </li><li> Um die Wirkung der entsprechenden Inhibitoren oder Modulatoren der MPO-katalysierten Reaktionen (zB alternative MPO-Enzym zu untersuchenSubstrate, Enzyminhibitoren oder Antioxidationsmitteln; siehe 9 für Details), fügen Sie diese dem HBSS unmittelbar vor der H 2 O 2 hinaus. </li><li> Nach 0,5 Stunden, behandeln Oberflächen mit Methionin an Restoberflächengebundenen oxidierenden Spezies auslöschen, dh reaktives Protein-gebundenen Chloramine, die verwirrende Zellaktivitäten ausüben kann. Zugabe von 10 mM Methionin in 80 ul HBSS pro Vertiefung und Inkubation für 10 min bei 37 ° C. </li><li> Block-Oberflächen mit BSA. In 80 ul / Vertiefung BSA bei 0,2% w / v in PBS, Inkubation für 2 Stunden bei 37 ° C, und entfernen Sie die Lösung. HINWEIS: Residual unbeschichteten Oberfläche Regionen Zelladhäsion unterstützen und die Blockierung dieser mit einem nicht-klebenden Proteins (dh BSA) wird sichergestellt, dass die zelluläre Adhäsion Antworten strikt abhängig von der gereinigten Zellklebenden Matrix verwendet, in diesem Fall Fibronektin. </li><li> Wash Oberflächen zweimal mit HBSS. HINWEIS: Keine der vorstehenden Oberflächenbehandlungen spürbar beeinträchtigt Zell-Substrat-readings. </li><li> Seed ausgesetzt Endothelzellen (mit 200 ul / Vertiefung bei ca. 2,5 x 10 5 Zellen / ml in serumfreiem Medium 199, das 1% BSA, siehe 1.3) auf die native oder MPO-oxidiert Fibronektin beschichteten Oberflächen. </li><li> Unmittelbar nach der Aussaat Zellen (dh vor jeder Zellhaftung und Verbreitung), montieren Sie die Mikroelektroden-Array Platte auf den Inkubator-Anschluss (in einem 37 ° C Inkubator in Gegenwart von 5% CO 2 untergebracht). <ol><li> Mit dem Geräte-Software sofort ein &#39;blank&#39; lesen, um nachfolgende Zell-Substrat-Impedanz (&quot;Zell Index&quot;) zu den ursprünglichen Hintergrundwerte in der Abwesenheit von Zell-Adhäsion erhalten normalisieren Werte. </li><li> Initiieren Erwerb von kontinuierlichen Zellindexdaten (mindestens eine Zelle Index Lesen / min). </li></ol></li><li> Zellen bei 37 ° C und 5% CO 2 inkubieren 2 Stunden, eine Zeit, während der maximale Zellhaftung und Ausbreitung erzielt wird; dies wird durch reflektierteseine Plateaubildung der Zellenindex-Werte (siehe Figur 3A). HINWEIS: Die vorhergehenden Versuch (Versuch 1) untersucht, wie anfängliche MPO-vermittelten Oxidation von Fibronektin schränkt die Fähigkeit von Endothelzellen an der Zelladhäsion auf diesem Substrat herzustellen. Das folgende Experiment (Experiment 2) untersucht, wie MPO-vermittelte Oxidation Fibronektin fördert Abnahmen Zellmatrixadhäsion (dh Enthaftung) in Endothelzellen mit etablierten Haftung auf diesem Substrat. Die Behandlungen in diesen beiden Versuchen sind im wesentlichen identisch, mit Ausnahme des Zeitpunkts der MPO-vermittelte Fibronektin Oxidation (dh vor der Zelladhäsion - Experiment 1; nach Zelladhäsion - Experiment 2). </li></ol> 3. Versuch 2: Quantifizierung Endothelzellen De-Adhäsion von Fibronektin in Reaktion auf MPO-vermittelte Oxidation Fibronektin (Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging) <ol><li> Coat Fibronektin auf 96-Loch-Goldmikroelektrode einrrays für Zell-Substrat-Impedanzmessungen (Add 80 ul / Vertiefung von Fibronektin an 5 ug / ml in PBS und Inkubation für 2 Stunden bei 37 ° C) oder 35 mm Glasboden-Zellkulturschalen für Live Cell Imaging Analysen (2 ml / Schale von Fibronektin bei 5 ug / ml in PBS und Inkubation für 2 h bei 37 ° C). </li><li> Block-Oberflächen mit BSA. Fügen BSA bei 0,2% w / v in PBS an den in 3.1 angegebenen Mengen und Inkubation für 2 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Inkubieren Oberflächen mit MPO die Bindung von MPO an Fibronektin zu ermöglichen. In 20 nM gereinigtem menschlichen MPO in HBSS auf die in 3.1 angegebenen Mengen und Inkubation für 0,5 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Wash Oberflächen zweimal mit HBSS um ungebundenes MPO entfernen. </li><li> Seed ausgesetzt Endothelzellen (in Serum-freiem Medium 199, das 1% w / v BSA; siehe 1.3) auf die native oder MPO tragenden Fibronektin beschichteten Oberflächen. <ol><li> Nach Zugabe von 200 ul / Vertiefung 2,5 x 10 5 Zellen / ml auf 96 Loch-Zellsubstrat Impedanz Mikroelektrodenarrays. </li> &lt;li&gt; 2 ml / Schale bei 5 x 10 5 Zellen / ml bis 35 mm Glasboden-Zellkulturschalen. </li></ol></li><li> Unmittelbar nach der Saat Zellen (dh vor jeder Zellhaftung und Ausbreitung): <ol><li> Berg 96-Loch-Mikroelektroden-Array-Platten auf die Zell-Substrat-Impedanz-Inkubator-Anschluss (in einem 37 ° C Inkubator in Gegenwart von 5% CO 2 untergebracht) und nehmen &#39;blank&#39; Lesungen die kontinuierliche Erfassung von Zellindexdaten (siehe Abschnitt 2.10 zu starten ). </li><li> Übertragungs 35 mm Glasboden-Zellkulturschalen zu einem 37 ° C Inkubator in Gegenwart von 5% CO 2. </li></ol></li><li> Zellen bei 37 ° C für 2 Stunden, um eine maximale Zellhaftung und die Verbreitung (siehe Abschnitt 2.11) zu ermöglichen. </li><li> Kurz Entfernen Sie die 96-Loch-Mikroelektroden-Array Platte (Pause Zell Index Lesungen an dieser Stelle) oder 35 mm Glasbodenzellkulturschale aus dem 37 ° C-Inkubator, Zellüberstand zu entfernen und fügen wärmten (37 ° C) HBSS (Volumina per Schritt 3.1). HINWEIS: HBSS verwendet wird, wenn das Studium MPO-katalysierte oxidative Reaktionen statt komplette Kulturmedien wie letztere enthält oxidierbare Spezies, die mit den Oxidationsreaktionen stören. </li><li> Um die Wirkung von Inhibitoren zu untersuchen / Modulatoren der MPO-katalysierte Reaktionen (alternative Enzymsubstrate, Enzyminhibitoren oder Antioxidantien) oder Zell-Signal-Hemmer (zB 40 uM blebbistatin zu Actomyosin Kontraktilität hemmen), hängen Sie diese jetzt. </li><li> Sofort legen Sie die Mikroelektroden-Array Platte zurück in die 37 ° C-Inkubator-Port (neu beginnen Zelle Index Lesungen zu diesem Zeitpunkt) oder das 35-mm-Glasbodenzellkulturschale zurück in die 37 ° C-Inkubator, und damit die Zellen in das Gleichgewicht HBSS 0,5 Stunden. HINWEIS: Nach 0,5 Stunden Äquilibrierung in HBSS, stabilisieren Zellindexwerte bei etwas niedrigeren Werten; wenn Vorinkubieren Zellen mit Enzymsubstraten, und Zell-Signalschutzmittel oder Antioxidantien, zunächst sicherstellen, dass die tiese keine signifikanten Auswirkungen auf die nach der Gleichgewichtseinstellung erhaltenen Werte. </li><li> Initiieren MPO-katalysierte, HOCl abhängige Fibronektin Oxidation und De-Haftung. <ol><li> Für Zellimpedanz-Studien mit 96-Loch-Mikroelektroden-Array-Platten: <ol><li> Entfernen Sie die Mikroelektroden-Array Platte aus dem Inkubator und Pause Zellindex-Messungen. </li><li> Hinzufügen H 2 O 2 (Endkonzentration von 0-10 &amp; mgr; M) zu der HBSS und vorsichtig durch wiederholtes Pipettieren. </li><li> Sofort wieder montieren Mikroelektroden-Array zurück auf die 37 ° C-Inkubator-Port und neu beginnen die Übernahme von Zellindexwerte. </li></ol></li><li> Für Live Cell Imaging-Studien mit 35 mm Glasbodenzellkulturschale: <ol><li> Entfernen Sie die Kulturschale aus dem Inkubator und montieren auf eine 37 ° C erhitzt Bühne eines invertierten konfokalen Mikroskop mit 63X Wasser Objektiv mit geeigneten DIC-Optik für die Aufzeichnung von Live Cell Filme. </li><li> Konzentrieren Sie sich auf Zellen undOptimierung der DIC-Optik (Köhler-Beleuchtung, Bias Retardierung und Kamera Versatz / Verstärkung; Details siehe 13). </li><li> Initiieren DIC Film und notieren Ausgangswerte von unbehandelten Zellen für 1 min. </li><li> Hinzufügen H 2 O 2 (Endkonzentration von 0-10 uM) und vorsichtig durch wiederholtes Pipettieren. Re-Fokussierung des Mikroskops (falls erforderlich) und die Aufnahme fortzusetzen DIC Filme der behandelten Zellen für den erforderlichen Zeitraum. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Datenanalyse und Präsentation <ol><li> Zell-Substrat-Impedanzdaten <ol><li> Export Rohdaten (Zellenindex als Funktion der Zeit) in eine Tabellenkalkulation. </li><li> Für Zell Enthaftung Studien (Experiment 2: Abschnitt 3) normalisieren Daten durch Setzen auf die Einleitung des MPO-vermittelte Fibronektin Oxidations aufgezeichnet unmittelbar vor Werte auf einen Wert von 1 (dh, unmittelbar vor der Zugabe von H 2 O 2 in 3,11 .1.1). ANMERKUNG: Dies stellt sicher, dass die relativenVeränderungen in der Zellindexwerte von MPO-vermittelte Fibronektin Oxidation hervorgerufen werden durch kleine anfängliche Unterschiede in absoluten Zellindexwerte zwischen Brunnen maskiert. <ol><li> Vorliegenden Daten als Grund normierte Zellenzahl (y-Achse) gegen die Zeit (x-Achse). </li></ol></li></ol></li><li> Live Cell Imaging-Daten (Zelle de-Haft Studien in Versuch 2: Abschnitt 3) <ol><li> Öffnen DIC Live Cell Imaging Filme unmittelbar vor und nach dem Beginn der MPO-vermittelte Fibronektin Oxidation in einem Standard-Bildanalyseprogramm (zB ImageJ Software) aufgezeichnet. </li><li> In mindestens zwei getrennten DIC Filme auswählen zufällig mehrere Zellen und messen ihre projizierte Fläche in aufeinanderfolgenden Rahmen (zB bei 1-Minuten-Intervallen) durch ihre Membranrand manuell Verfolgung und indem die Anzahl der eingeschlossenen Bildpunkten. </li><li> Export Rohdaten (projizierte Zellfläche als Funktion der Zeit), um eine Excel-Tabelle und normalisieren Zellenbereich Daten, indem Sie Werte aufgezeichnet unmittelbar vordie Initiierung der MPO-vermittelte Fibronektin Oxidation auf einem Wert von 1 (dh, unmittelbar vor der Zugabe von H 2 O 2 in 3.11.2.3). </li><li> Vorliegenden Daten als eine graphische Darstellung der normalisierten Zellenbereich (y-Achse) gegen die Zeit (x-Achse). </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Angaben zu machen.

Zell-Matrix-Adhäsion und de-Klebeprozesse genau und in Echtzeit mit hoher zeitlicher Auflösung unter Verwendung von Zell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging-Analysen quantifiziert werden. Diese Echtzeit-Ansätze bieten einen großen Vorteil gegenüber Endpunktanalysen der Zelladhäsion, die schlechte zeitliche Auflösung zur Verfügung. Durch die präzise Quantifizierung schnellen de-Haft Reaktionen mit hoher zeitlicher Auflösung kann diese Analysen kritische Einblicke in geben, wie morphologische Reaktionen auf Matrix Änd...

Für die Wartung der Gewebshomöostase sind stabile Klebe Kontakte zwischen Zellen und ihrer Umgebung extrazellulären Matrix erforderlich. Sie spielt beispielsweise endothelialen Zelladhäsion an der subendothelialen Matrix, in die Blutgefäße eine kritische Rolle bei der Aufrechterhaltung der Integrität der endothelialen Schicht und ihre homöostatischen Funktion als Regelungs semipermeable Gefäßschranke 1. Aktinzytoskeletts mechanisch gekoppelt Matrixmoleküle an Stellen von Zell-Matrix-Haftung und eine Kontakten an der Zellmatrix-Grenzflächenkleber spielen eine wichtige Rolle bei der Bestimmung der Position der Zellmembran durch Widerstand zentral gerichteten Actomyosin Zugkräfte. Extrazelluläre Stimuli Zellmatrixadhäsion verändern das Gleichgewicht der Kräfte an der Zell-Matrix-Schnittstelle, ein Ereignis, das schnell ist notwendigerweise verändern &#39;&#39; erfaßt durch mechanosensitive Signalproteine, was bei der Übertragung von &quot;außen nach innen Signalisieren&quot;. Das Übersprechen Wetteween Zellen und ihre umgebenden extrazellulären Matrix spielt eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle der Zellform, Motilität, Funktion, Proliferation und Überleben 2. Diverse pathophysiologischen Prozessen (embryonalen Entwicklung, Entzündung, Wundheilung und Krebsmetastasen) durch dynamische Umgestaltung der Klebermatrix Substraten durch Matrix-abbauenden Oxidationsmittel und / oder Enzyme 3,4 gekennzeichnet. Zum Beispiel, Klebe subendothelialen Matrix Proteine ​​in den Blutgefäßen (zB Fibronektin) werden als Hauptziele für eine Änderung oder Abbau im menschlichen entzündlichen Erkrankungen aufgrund der lokalisierten Produktion von reaktiven Oxidantien beteiligt (zB Hypochlorsäure, HOCl) durch die Leukozyten stammende Enzym Myeloperoxidase (MPO), das innerhalb des Subendothel bei entzündlichen Gefäßerkrankungen (Abbildung 1) 5-9 ansammelt. Veränderungen Zellmatrixadhäsion von MPO abgeleiteten Oxidationsmitteln und anderen Matrix modifizierende Stimuli induziert werden likEly wichtige Rollen in Ändern vaskulären Homöostase bei einer Vielzahl von pathologischen Prozessen spielen, zB durch Verändern endothelialen Zellsignalisierung, Morphologie und Lebensfähigkeit, was wiederum stört Endothelfunktion und Barrierenintegrität. Jedoch werden die morphologischen und Zellsignalantworten der adhärenten Zellen an extrazelluläre Matrix-Änderungen erst beginnt zu verstehen. Um zu verstehen wie Matrix Änderungen treiben Veränderungen in Zelladhäsion Dynamik und Haftung abhängigen Zelle Signalwege, sind Techniken erforderlich, dass Veränderungen in der Zell-Matrix-Adhäsion in Echtzeit genau zu quantifizieren, mit hoher zeitlicher Auflösung. Hier beschreiben wir komplementären Zell-Substrat-Impedanz und lebenden Zellen Techniken, die diese Kriterien erfüllen, und eine Plattform, um die Zellhaftung und de-Adhäsionsvorgänge in einer nicht-invasiven Weise zu quantifizieren. Wir zeigen, wie diese Zell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging approSchmerzen können leicht zu (i) verwendet werden, die Dynamik der Zellhaftung zu überwachen und zu verbreiten (dh De-novo-Zell-Adhäsion) auf native und modifizierte Matrix Substraten und (ii), die Dynamik der Zell-Matrix-Ablösung zu messen (dh de-Haftung ) von anhaftenden Zellen zu Matrix-modifizierende Reizen ausgesetzt. Das xCELLigence Zell-Substrat-Impedanz-Biosensor-System bietet eine kontinuierliche Messung der Bereich der Zell-Matrix-Kontakt durch die Quantifizierung der elektrischen Impedanz an der Oberfläche des 96-Loch-Gold-Mikroelektroden-Arrays und drückt diese elektrischen Impedanzmessungen als &quot;Zell Index&quot;, ein dimensionsloser Wert, ist weitgehend proportional zu der Fläche der Zell-Substrat-Kontakt 10 (Figur 2), aber doch in der empfindlich gegenüber Änderungen in der durchschnittlichen Entfernung zwischen dem (isolierend) Zellmembran und der Elektrodenoberfläche 11. Ein weiterer Anstieg der Zellenindexwerte ist auch bei der Bildung des engen Zell-Zell-Kontakte erreicht That beschränken para Strom fließt, 11 Bedingungen, die nicht im Rahmen der in dieser Studie beschriebenen Experimente durchsetzen müssen. Messung der projizierten Fläche der einzelnen Zellen über die Zeit durch Bildanalyse von Zeitraffer Differential-Interferenz-Kontrast (DIC) Filme eine komplementäre Messung der Veränderungen im Bereich der Zell-Substrat-Kontakt und stellt zusätzliche Informationen über die genaue Art und Dynamik der morphologische Veränderungen durch die Zell-Substrat-Impedanz Ansatz quantifiziert. Genauer gesagt, die Anwendung dieser Methoden zu überwachen, wie MPO-vermittelten Oxidation von Klebstoff subendothelialen Matrix Proteine ​​(zB Fibronektin) (i) reduziert die de novo Adhäsion der suspendierten Endothelzellen auf gereinigtes Fibronectin und (ii) auslöst Zell-Matrix de beschreiben wir -adhesion in Endothelzellen mit etablierten Haftung auf Fibronektin. Durch die Ausführung parallel Zellsignalanalysen im Laufe der Zeit mit relevanten biochemchemischen Assays (zB Western-Blotting), der zeitlichen und kausalen Beziehungen zwischen Adhäsion / Enthaftung Verfahren und damit verbundenen Änderungen der Adhäsion abhängigen Zellsignalisierungsereignisse bestimmt werden. Diese Ansätze wurden kürzlich verwendet, um zu zeigen, dass die extrazelluläre Matrix, die Oxidation durch subendotheliale Ablagerungen von MPO katalysierten löst einen schnellen Verlust in Zell-Matrix-Adhäsion von Endothelzellen, die von bereits existierenden Actomyosin Kontraktionskräfte 9 angetrieben wird. Wichtig ist, indem die zeitliche Beziehung zwischen den Veränderungen in beiden Zell-Adhäsion und Haftung abhängige Zell-Signal ermittelt werden, diese Ansätze identifiziert, die MPO-induzierte Matrixmodifikation und zellulären de-Haftung löst Veränderungen in wichtigen Haftung abhängigen Zelle Signalwege einschließlich Src-Kinase -abhängigen Paxillin-Phosphorylierung und Myosin Light Chain II-Phosphorylierung (Abbildung 1) 9. Diese Art der redox-abhängige Signal, involving die Aktivierung intrazellulärer Signalwege durch extrazelluläre oxidative Reaktionen, die Zell-Matrix-Adhäsion zu stören, stellt eine neue Art der Zellsignalisierung &quot;outside-in Redox-Signalisierung&quot; (Abbildung 1) bezeichnet 9. In der Regel sollten diese komplementären Zell-Substrat-Impedanz-Biosensor-und Live Cell Imaging Ansätze wertvoll bei der Aufdeckung, wie verschiedene Matrix-modifizierende Reize oder Agenten fahren Veränderungen der Zelladhäsion Dynamik, Morphologie und Signal innerhalb verschiedener adhärenten Zelltypen unterliegen einer Vielzahl von sein Versuchsanordnungen. Das folgende Protokoll beschreibt, wie die Auswirkungen der MPO-vermittelte Matrix Oxidation auf De-novo-Endothelzelladhäsion (Experiment 1) und Endothelzellen de-Haftung (Experiment 2) Prozesse zu quantifizieren. MPO bindet sich begierig an Fibronektin und andere Klebe subendothelialen extrazellulären Matrixproteinen und unses Wasserstoffperoxid (H 2 O 2), um Chloridionen (Cl -) umzuwandeln, um das hochreaktive chlorierenden Oxidationsmittel Hypochlorsäure (HOCl), welche lokal mit diesen Matrixproteinen reagiert und stört deren Zellhaftfähigkeit (1) 8,9, 12.

<table><tbody><tr><td>96-Well-Gold-Zellsubstrat-Impedanz-Mikroelektroden-Array</td><td>ACEA Biosciences / Roche</td><td>E-Plate 96</td><td>Einwegplatte zur Durchführung zellbasierter Assays auf dem xCELLigence-System</td></tr><tr><td>blebbistatin</td><td>Sigma</td><td>B0560</td><td>selektiver Inhibitor von nicht-Muskelmyosin-II-Rinder-Aorten-Endothelzellen</td></tr><tr><td>, kryokonserviert&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BW-6001</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma</td><td>05470</td><td></td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Endothelzellwachstums-Medienkit</td></tr><tr><td>Fibronektin, lyophilisiertes</td><td>Pulver Sigma</td><td>F-4759</td><td>aus Rinderplasma</td></tr><tr><td>Fluorodish 35 mm Zellkulturschale mit Glasboden</td><td>World Precision Instruments</td><td>FD35-100</td><td>Zellkulturschale mit Glasboden in optischer Qualität für die Bildgebung</td></tr><tr><td>Gelatine aus Rinderhaut</td><td>Sigma</td><td>G9391</td><td>Zellkultursubstrat</td></tr><tr><td>Hank's Balanced Salt Solution</td><td>Life Technologies</td><td>14025076</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Merck</td><td>107298</td><td></td></tr><tr><td>Medium-199</td><td>Life Technologies</td><td>11150-059</td><td>serumfreie Zellmedien</td></tr><tr><td>Methionin</td><td>Sigma</td><td>M9500</td><td>löscht chlorierende Oxidantien, die durch Myeloperoxidase erzeugt</td></tr> werden<tr><td>, Myeloperoxidase, humane polymorphkernige Leukozyten</td><td>Millipore</td><td>475911</td><td></td></tr><tr><td>RTCA MP Instrument / xCELLigence Zellsubstrat-Impedanzsystem</td><td>ACEA Biosciences / Roche</td><td></td><td>Bestehend aus RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station und RTCA Control</td></tr><tr><td>Unit Trypsin-EDTA (0,5%)</td><td>Gibco</td><td>15400-054&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

benutzen sie die cell-substrat-impedanz und live cell imaging, um echtzeit-Änderungen in der zelladhäsion und de-haftung durch matrix Änderung induzierte messen

Using Cell-substrate Impedance and Live Cell Imaging to Measure Real-time Changes in Cellular Adhesion and De-adhesion Induced by Matrix Modification

Zell-Matrix-Adhäsion spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Zellmorphologie und Signalisierung. Reize, Zellmatrixadhäsion (zB Myeloperoxidase und anderen Matrix modifizierende Oxidantien / Enzyme während der Entzündung freigesetzt) ​​stören an der Auslösung pathologischen Veränderungen der zellulären Funktion, Phänotyp und Lebensfähigkeit in einer Reihe von Krankheiten in Verbindung gebracht. Hier beschreiben wir, wie Zell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging Ansätze kann leicht verwendet werden, um Echtzeit-Änderungen der Zelladhäsion und de-Haftung durch Matrixmodifikation induzierte genau zu quantifizieren (unter Verwendung von Endothelzellen und Myeloperoxidase als pathophysiologische Matrix-modifizierende Stimulus) mit hoher zeitlicher Auflösung und in einer nicht-invasiven Weise. Die xCELLigence Zell-Substrat-Impedanzsystem kontinuierlich quantifiziert den Bereich der Zell-Matrix-Adhäsion durch die Messung der elektrischen Impedanz bei der Zell-Substrat-Grenzfläche in den Zellen auf Goldmikroelektrodenarrays gezüchtet. Bildanalyse von Zeitraffer-differenTiAl-Interferenzkontrastfilme quantifiziert Veränderungen der projizierten Fläche der einzelnen Zellen über die Zeit, die Änderungen im Bereich der Zellenmatrix-Kontakt. Beide Techniken genau zu quantifizieren schnelle Änderungen an der Zelladhäsion und de-Klebeverfahren. Zell-Substrat-Impedanz auf Mikroelektroden-Biosensor-Arrays liefert eine robuste Plattform für Hochdurchsatz-Messungen. Live Cell Imaging Analysen liefern zusätzliche Details über die Art und Dynamik der morphologischen Veränderungen von Zell-Substrat-Impedanzmessungen quantifiziert. Diese komplementäre Ansätze liefern wertvolle neue Einblicke in die Myeloperoxidase oxidative Veränderung der subzellulären extrazelluläre Matrixkomponenten löst schnellen Veränderungen bei der Zelladhäsion, Morphologie und Signalübertragung in Endothelzellen. Diese Ansätze sind auch anwendbar für die Untersuchung der zellulären Adhäsion Dynamik in Abhängigkeit von einer anderen Matrix-modifizierenden Stimuli und den damit verbundenen anhaftenden Zellen (beispielsweise Epithelzellen).

Echtzeit-Quantifizierung von Endothelzellen de-Adhäsion von Fibronektin als Reaktion auf MPO-vermittelte Oxidation Fibronektin (Experiment 2). Die Aussaat der endothelialen Zellsuspensionen auf nativen (MPO kostenlos) Fibronektin oder MPO-Lager Fibronektin ergibt maximale Zellhaftung und die Verbreitung innerhalb von 2 h, wie durch eine Plateaubildung der Zellindexwerte in dem Zellensubstrat Impedanzmessungen (3A) beurteilt. Diese Anfangsphase der Zellhaftung und Ausbreitung deutlich re...

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um kontinuierlich zu quantifizieren Zelladhäsion und de-Klebeprozesse mit hoher zeitlicher Auflösung in eine nicht-invasive Weise durch Zell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging analysiert. Diese Ansätze zeigen die Dynamik der Zelladhäsion / de-Klebeverfahren durch Matrixmodifikation und ihre zeitliche Beziehung, um die Haftung abhängige Signalereignisse ausgelöst.

Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen

Cell-matrix adhesion plays a key role in controlling cell morphology and signaling. Stimuli that disrupt cell-matrix adhesion (e.g., myeloperoxidase and ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, schnelle Veränderungen der Zell-Matrix-Adhäsion in Endothelzellen, die matrixmodifizierenden Substanzen in Echtzeit ausgesetzt sind, mittels Zell-Substrat-Impedanz und Live-Cell-Imaging zu quantifizieren. In diesem Experiment wird das Häm-Enzym Myeloperoxidase als pathophysiologisch relevanter matrixmodifizierender Wirkstoff eingesetzt. Dies wird erreicht, indem Oberflächen zunächst mit Fibronectin beschichtet werden, um ein adhäsives Matrixsubstrat bereitzustellen.Myo-Peroxidase oder MPO wird anschließend an das Fibronectin binden gelassen. Danach werden suspendierte endotheliale Zellen auf die Oberflächen aufgebracht und inkubiert, um eine maximale Zelladhäsion und Ausbreitung auf dem Fibronectin zu erreichen. Anschließend werden die Zellen Wasserstoffperoxid ausgesetzt, um die MPO-vermittelte Oxidation des Fibronectins einzuleiten.Die anschließenden schnellen Veränderungen der Zell-Matrix-Adhäsion werden dann in Echtzeit mithilfe der Impedanzanalyse zwischen Zelle und Substrat sowie der Live-Cell-Bildgebung quantifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass schnelle Verluste der endothelialen Zell-Matrix-Adhäsion, die durch NPO-vermittelte Oxidation von Fibronectin ausgelöst werden, in Echtzeit mit hoher zeitlicher Auflösung und ohne Markierung durch Impedanzmessungen an der Zell-Substrat-Interaktion und Live-Cell-Bildgebung quantifiziert werden können. Der Vorteil dieser Methoden liegt darin, dass sie kontinuierlich und mit hoher zeitlicher Auflösung Veränderungen der Zell-Matrix-Adhäsion erfassen können, wodurch wichtige neue Erkenntnisse darüber gewonnen werden, wie Modifikationen der Matrix downstream ablaufende Veränderungen der Zellmorphologie und adhäsionsabhängige Signalprozesse beeinflussen.Die Protokolle sind von größerer Bedeutung, da sie leicht angepasst werden können, indem MPO durch andere Matrix-modifizierende Substanzen wie Matrix-gating-Proteasen ersetzt wird, oder indem anheftende Zelltypen verwendet werden, die von Endothelzellen abweichen, beispielsweise Epithelzellen. Geben Sie zunächst 80 Mikroliter Fibronectin pro Vertiefung in 96-Loch-Gold-Mikroelektrodenarrays, um diese für Impedanzmessungen der Zellsubstrate zu beschichten, oder geben Sie zwei Milliliter Fibronectin in Zellkulturschalen mit Glasboden für die Live-Cell-Bildgebungsanalyse. Inkubieren Sie die Arrays und/oder die Kulturschalen bei 37 Grad Celsius für zwei Stunden.Dann zur Blockierung der Oberflächen 0,2 % BSA hinzufügen und weitere zwei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren. Anschließend gereinigtes humanes Myeloperoxidase in HBSS hinzufügen und 30 Minuten inkubieren. Danach die Oberflächen zweimal mit HBSS waschen, um nicht gebundenes MPO zu entfernen.Anschließend werden 250.000 Zellen pro Milliliter suspendierter endothelialer Zellen, die gemäß dem Textprotokoll vorbereitet wurden, auf 96-Well-Zellsubstrat-Impedanz-Mikroelektrodenanordnungen mit nativen oder MPO-haltigen, fibronectinbeschichteten Oberflächen ausgesät. Für die 35-Millimeter-Zellkulturschalen mit Glasboden werden zwei Milliliter einer Zellsuspension mit 500.000 Zellen pro Milliliter hinzugefügt. Unmittelbar nach der Aussaat der Zellen werden die Mikroelektrodenanordnungsplatten am Inkubatoranschluss für Zellsubstrat-Impedanz bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid montiert.Und nehmen Sie eine Blindmessung vor, um die kontinuierliche Erfassung der Zellindex-Daten zu starten. Überführen Sie die 35-Millimeter-Zellkulturschalen mit Glasboden in einen Inkubator mit 35 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid. Inkubieren Sie zwei Stunden lang, um eine maximale Zelladhäsion und -ausbreitung zu ermöglichen.Nach der Inkubation unterbrechen Sie die Messungen des Zellindex und nehmen die Mikroelektrodenanordnungsplatte vorübergehend aus dem Inkubator oder entfernen die Glasbodenkammer, aspirieren Sie das snat und geben Sie erwärmtes HBSS hinzu, um die Wirkungen von Inhibitoren, Modulatoren der MPO, katalysierten Reaktionen oder Inhibitoren der Zellsignalübertragung zu untersuchen. Geben Sie diese Substanzen zu den Kulturen hinzu. Stellen Sie die Anordnungsplatte unmittelbar danach wieder in die Inkubatorbuchse oder die Glasbodenkammer in den Inkubator zurück und lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang equilibrieren.Um die NPO-katalysierte, hypochlorige-Säure-abhängige Oxidation von Fibronectin und die Ablösung für Impedanzstudien an Zellen einzuleiten, nehmen Sie die Mikroelektrodenanordnungsplatte aus dem Inkubator und unterbrechen Sie die Messungen des Zellindex. Geben Sie Wasserstoffperoxid zum HBSS hinzu und mischen Sie vorsichtig durch mehrfaches Pipettieren, setzen Sie die Mikroelektrodenanordnung unmittelbar wieder in die Inkubatoröffnung ein und starten Sie die Zellindexmessungen erneut für Live-Cell-Imaging-Studien unter Verwendung von 35-Millimeter-Dishs mit Glasboden. Nachdem Sie die Schale aus dem Inkubator genommen haben, befestigen Sie sie auf einem auf 37 Grad Celsius beheizten Objekttisch eines invertierten konfokalen Mikroskops, das mit einem 63x-Wasser-Objektiv ausgestattet ist.Und DIC-Optik: Um Filme lebender Zellen aufzuzeichnen, fokussieren Sie die Zellen und optimieren Sie die DIC-Optik gemäß der hier referenzierten Anleitung. Starten Sie die Aufnahme eines DIC-Films und nehmen Sie eine Minute lang Basiswerte unbehandelter Zellen auf, geben Sie dann Wasserstoffperoxid hinzu und mischen Sie vorsichtig durch wiederholtes Pipettieren, fokussieren Sie das Mikroskop neu und setzen Sie die Aufnahme von DIC-Filmen der behandelten Zellen über den erforderlichen Zeitraum fort. Um die Daten zur Zell-Substrat-Impedanz zu analysieren, exportieren Sie zunächst die Daten in eine Tabellenkalkulation zur Analyse der Zelladhäsion.Studien normalisieren die Daten, indem sie die unmittelbar vor der Initiation der NPO-vermittelten Fibronectin-Oxidation aufgezeichneten Werte auf eins setzen, und stellen die vorliegenden Daten als Diagramm des normalisierten Zellindex über die Zeit dar, um Live-Zell-Bildgebungsdaten zu analysieren. Öffnen Sie DIC-Live-Zell-Bildgebungsfilme, die unmittelbar vor und nach der Initiation der MPO-vermittelten Fibronectin-Oxidation aufgezeichnet wurden, in einem Bildanalyseprogramm wie ImageJ anhand von mindestens zwei separaten DIC-Filmen, wählen Sie zufällig mehrere Zellen aus und messen Sie ihre projizierte Fläche in aufeinanderfolgenden Einzelbildern, indem Sie manuell den Membranrand nachzeichnen und die Anzahl der eingeschlossenen Pixel quantifizieren. Stellen Sie die Daten abschließend als Diagramm der normalisierten Zellfläche über die Zeit dar. Das Ansetzen von endothelialen Zellsuspensionen auf Fibronectin oder MPO-haltiges Fibronectin führt innerhalb von zwei Stunden zu einer maximalen Zelladhäsion und -ausbreitung, wie durch ein Plateau der Zellindexwerte an der Zell-Substrat-Grenzfläche beurteilt wird.Impedanzmessungen zeigen, sobald eine maximale Zelladhäsion auf native oder NPO-haltige Fibronectin-beschichteten Oberflächen etabliert ist, dass eine gezielte Fibronectin-Oxidation, vermittelt durch NPO-katalysierte Hypochlorige Säure und ausgelöst durch die Zugabe des Cofaktors Wasserstoffperoxid für NPOs, einen schnellen Abfall der Kontaktfläche zwischen Zelle und Matrix bewirkt, gemessen mittels Zell-Substrat-Impedanz und Live-Cell-Imaging. Wie hier gezeigt, fehlt der schnelle, zelluläre De-Adhäsionsvorgang, der in endothelialen Zellen sichtbar ist, die an NPO-haltiges Fibronectin gebunden sind und Wasserstoffperoxid ausgesetzt wurden, in Zellen, die allein mit Wasserstoffperoxid behandelt wurden. Die Hemmung der Myosin-II-Motorfunktion durch Blebbistatin inhibiert die Rate der endothelialen Zell-De-Adhäsion, gemessen mittels Zell-Substrat-Impedanz und Live-Cell-Imaging, und zeigt damit, dass die zelluläre De-Adhäsion und Kontraktion als Antwort auf MPO-katalysierte, subzelluläre Matrixoxidation durch ACTO-Myosin-Zugkräfte angetrieben wird. Da diese Methoden sehr schnelle Veränderungen der Zelladhäsion präzise messen können, ermöglichen sie entscheidende Einblicke in die kausalen Zusammenhänge zwischen Adhäsionsänderungen und nachgeschalteten Veränderungen adhäsionsabhängiger Signalprozesse wie der SARK-Phosphorylierung oder der Fokalkontakt-Signalgebung, die in parallelen zeitabhängigen Experimenten mittels Western Blot einfach gemessen werden können.

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Dieses Papier soll den Leser in den Betrieb eines integrierten atomic force-optische Bildgebung Mikroskop für die mechanische Stimulation von lebenden Zellen in Kultur zu unterrichten. Eine Schritt-für-Schritt-Protokoll vorgestellt. Eine repräsentative Datenmenge, die Live-Zell-Antwort auf mechanische Stimulation zeigt vorgestellt.

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Zellulären Prozessen wie Zellmigration haben sich traditionell auf zweidimensionale, steifen Kunststoff-Oberflächen untersucht. Dieser Bericht beschreibt eine Technik zur direkten Visualisierung von Protein-Lokalisierung und Analyse von Protein-Dynamik in Zellen wandern in eine physiologisch relevante, dreidimensionale Matrix.

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Visualisierung von Adhäsion Bildung in den Zellen durch erweiterte Spinning-Disk-Total Internal Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie

Diese Methode ist nützlich, um die frühe Dynamik der zellulären Adhäsion und die Ausbreitung von verankerungsabhängigen Zellen auf das Fibronectin zu quantifizieren. Darüber hinaus kann dieser Assay verwendet werden, um die Auswirkungen einer veränderten Redoxhomöostase auf die Zellausbreitung und/oder zellspezifische intrazelluläre Signalwege zu untersuchen.

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Krebs ist eine tödliche Krankheit aufgrund seiner Fähigkeit, auf verschiedene Organe metastasieren. Die Bestimmung der Fähigkeit von Krebszellen, unter verschiedenen Behandlungsbedingungen zu wandern und einzudringen, ist entscheidend für die Beurteilung therapeutischer Strategien. Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Beurteilung der metastasierenden Fähigkeiten einer Glioblastom-Krebszelllinie in Echtzeit dar.

Impedanzbasierte Echtzeitmessung der Krebszellmigration und -invasion

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Echtzeit-Detektion und Erfassung invasiver Zellsubpopulationen aus Co-Kulturen

Lernen Sie die Echtzeit-Quantifizierung von Zelladhäsion und De-Haftung in Endothelzellen mittels Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging. Diese Methode ermöglicht die Beobachtung dynamischer Veränderungen durch Matrix-Modifikationen.

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Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen

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