Benutzen Sie die Cell-Substrat-Impedanz und Live Cell Imaging, um Echtzeit-Änderungen in der Zelladhäsion und De-Haftung durch Matrix Änderung Induzierte Messen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, schnelle Veränderungen der Zellmatrixadhäsion in Endothelzellen, die Matrixmodifizierern ausgesetzt sind, in Echtzeit unter Verwendung der Zellsubstratimpedanz und der Bildgebung lebender Zellen zu quantifizieren. In diesem Experiment wird das Häm-Enzym Myeloperoxidase als pathophysiologisch relevanter Matrixmodifizierer eingesetzt. Dies wird erreicht, indem zunächst Oberflächen mit Fibronektin beschichtet werden, um ein adhäsives Matrixsubstrat bereitzustellen.

Myoperoxidase oder MPO wird dann an das Fibronektin binden gelassen. Als nächstes werden suspendierte Endothelzellen auf die Oberflächen gesetzt und inkubiert, um eine maximale Zelladhäsion und Ausbreitung auf das Fibronektin zu erreichen. Dann werden die Zellen Wasserstoffperoxid ausgesetzt, um die NPO-vermittelte Fibronektinoxidation einzuleiten.

Die anschließenden schnellen Änderungen der Zellmatrixadhäsion werden dann in Echtzeit mit Hilfe der Impedanz von Zellsubstraten und der Analyse von Live-Cell-Imaging quantifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass schnelle Verluste in der Adhäsion der Endothelzellmatrix, die durch NPO-vermittelte Fibronektinoxidation ausgelöst werden, in Echtzeit mit hoher zeitlicher Auflösung und auf markierungsfreie Weise durch Zellsubstratimpedanz und Lebendzellbildgebung quantifiziert werden können. Nun, der Vorteil dieser Techniken besteht darin, dass sie Veränderungen der Zellmatrixadhäsion kontinuierlich mit hoher zeitlicher Auflösung quantifizieren können, und das bedeutet, dass sie wichtige neue Erkenntnisse darüber liefern können, wie Matrixmodifikationen nachgelagerte Veränderungen in der Zellmorphologie und adhäsionsabhängigen Signalprozessen vorantreiben.

Die Protokolle sind insofern von breiterer Bedeutung, als sie leicht angepasst werden können, indem MPO durch andere matrixmodifizierende Wirkstoffe, wie Matrix-to-Gating, Proteasen, oder durch die Verwendung von adhärenten Zelltypen, die keine Endothelzellen sind, wie z. B. Epithelzellen, verwendet wird. Fügen Sie zunächst 80 Mikroliter Fibronektin pro Vertiefung hinzu, um 96-Well-Gold-Mikroelektrodenarrays für die Messung der Impedanz von Zellsubstraten zu beschichten, oder fügen Sie zwei Milliliter Fibronektin zu Zellkulturschalen mit Glasboden für die Analyse von Lebendzellbildgebung hinzu. Inkubieren Sie die Arrays und/oder die Kulturschalen zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius.

Um die Oberflächen zu blockieren, fügen Sie dann 0,2 % BSA hinzu und inkubieren Sie weitere zwei Stunden bei 37 Grad Celsius. Als nächstes fügen Sie gereinigte humane Peroxidase in HBSS hinzu und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang. Waschen Sie die Oberflächen dann mit HBSS zweimal, um ungebundenes MPO zu entfernen.

Als nächstes sehen Sie 250.000 Zellen pro Milliliter suspendierter Endothelzellen, die gemäß dem Textprotokoll auf 96-Well-Zellen Substratimpedanz-Mikroelektrodenarrays mit einer nativen oder MPO-tragenden Fibronektin-beschichteten Oberfläche hergestellt wurden. Für die 35-Millimeter-Zellkulturschalen mit Glasboden fügen Sie zwei Milliliter mit 500.000 Zellen pro Milliliter hinzu. Unmittelbar nach der Aussaat montieren die Zellen die Mikroelektroden-Array-Platten auf den Impedanz-Inkubatoranschluss des Zellsubstrats bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.

Und nehmen Sie leere Messwerte vor, um die kontinuierliche Erfassung von Zellindexdaten zu initiieren. Bringen Sie die 35-Millimeter-Zellkulturschalen mit Glasboden in einen 35 Grad Celsius heißen Inkubator mit 5 % Kohlendioxid. Zwei Stunden lang inkubieren, um eine maximale Zellanhaftung und -ausbreitung zu ermöglichen.

Nach der Inkubation unterbrechen Sie die Zellindexmesswerte und entfernen Sie kurz die Mikroelektrodenarray-Platte oder nehmen Sie die Glasbodenschale aus dem Inkubator, aspirieren Sie die Snat und fügen Sie erwärmtes HBSS hinzu, um die Wirkung von Inhibitoren, MPO-Modulatoren, katalysierten Reaktionen oder Zellsignalinhibitoren zu untersuchen. Fügen Sie sie den Kulturen hinzu. Setzen Sie zu diesem Zeitpunkt die Array-Platte sofort wieder in die Inkubatoröffnung oder die Glasbodenschale in den Inkubator ein und lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang äquilibrieren.

Um die NPO-katalysierte hypochlorige säureabhängige Fibronektinoxidation und Deadhäsion für Zellimpedanzstudien zu initiieren, nehmen Sie die Mikroelektrodenarray-Platte aus dem Inkubator und unterbrechen Sie die Zellindexmessungen. Geben Sie Wasserstoffperoxid in das HBSS und mischen Sie es vorsichtig durch wiederholtes Pipettieren, setzen Sie es sofort wieder in das Mikroelektrodenarray wieder in den Inkubatoranschluss ein und starten Sie die Zellindexmesswerte für Lebendzellbildgebungsstudien mit 35-Millimeter-Schalen mit Glasboden neu. Nachdem Sie die Schale aus dem Inkubator genommen haben, montieren Sie sie auf einen 37 Grad Celsius beheizten Tisch eines inversen konfokalen Mikroskops, das mit einer 63-fach-Wasserobjektivlinse ausgestattet ist.

Und DIC-Optiken Für die Aufnahme von Live-Zellfilmen können Sie sich auf die Zellen fokussieren und die DIC-Optik gemäß den hier genannten Richtlinien optimieren. Starten Sie einen DIC-Film und zeichnen Sie eine Minute lang die Ausgangswerte unbehandelter Zellen auf, fügen Sie dann Wasserstoffperoxid hinzu und mischen Sie vorsichtig durch wiederholtes Pipettieren, fokussieren Sie das Mikroskop neu und fahren Sie mit der Aufnahme von DIC-Filmen der behandelten Zellen für den erforderlichen Zeitraum fort. Um die Impedanzdaten des Zellsubstrats zu analysieren, exportieren Sie die Daten zunächst in eine Tabelle für die Adhäsion von Zelle d.

Studien normalisieren die Daten, indem Werte, die unmittelbar vor Beginn der NPO-vermittelten Fibronektinoxidation aufgezeichnet wurden, auf einen der vorliegenden Daten als Diagramme des normalisierten Zellindex über die Zeit gesetzt werden, um die Bildgebungsdaten lebender Zellen zu analysieren. Offene DIC-Live-Zell-Bildgebungsfilme, die unmittelbar vor und nach der Initiierung der MPO-vermittelten Fibronektinoxidation in einem Bildanalyseprogramm wie Image J in mindestens zwei separaten DIC-Filmen aufgenommen wurden, wählen nach dem Zufallsprinzip mehrere Zellen aus und messen ihre projizierte Fläche in sequenziellen Frames, indem sie ihren Membranrand manuell verfolgen und die Anzahl der eingeschlossenen Pixel quantifizieren. Präsentieren Sie schließlich die Daten als Diagramm der normalisierten Zellfläche über die Zeit, in der das Platzieren von Endothelzellsuspensionen auf Fibronektin oder MPO-haltigem Fibronektin zu einer maximalen Zelladhäsion und -ausbreitung innerhalb von zwei Stunden führt, beurteilt durch ein Plateau der Zellindexwerte im Zellsubstrat.

Impedanzmessungen, sobald die maximale Zelladhäsion auf nativem oder NPO-haltigem Fibronektin etabliert ist, bewirkt eine gezielte Fibronektinoxidation, die durch NPO-katalysierte hypochlorige Säure vermittelt und durch die Zugabe von NPOs als Substrat Wasserstoffperoxid initiiert wird, eine rasche Abnahme der Oberfläche des Zellmatrixkontakts, gemessen an der Impedanz des Zellsubstrats und durch Lebendzellbildgebung, wie hier gezeigt, Die schnelle zelluläre Deadhäsion, die in den Endothelzellen sichtbar ist, die als Reaktion auf eine Wasserstoffperoxidbehandlung an NPO-haltiges Fibronektin gebunden sind, fehlt in Zellen, die nur mit Wasserstoffperoxid behandelt wurden. Die Hemmung der myosin-zwei-motorischen Funktion mit BLEs-Statin hemmt die Adhäsionsrate der Endothelzellen, gemessen an der Impedanz des Zellsubstrats, und durch die Bildgebung von lebenden Zellen, die zeigt, dass die zelluläre Deadhäsion und Kontraktion als Reaktion auf MPO die subzelluläre Matrixoxidation katalysiert, wird durch ACTO-Myosin-Zugkräfte angetrieben. Da diese Methoden sehr schnelle Veränderungen der Zelladhäsion genau messen können, können sie einen kritischen Einblick in die kausalen Zusammenhänge zwischen Adhäsionsänderungen und nachgelagerten Änderungen in adhäsionsabhängigen Signalprozessen wie der SARK-Phosphorylierung oder der fokalen Adhäsionssignalgebung geben, die in parallelen Experimenten über die Zeit mit Western-Blotting leicht gemessen werden können.