Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Funktion einer Population von CFTR-Kanälen in einem rekonstituierten System zu messen und die Reaktion der Kanäle auf das Vorhandensein von Modulatormolekülen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Wildtyp- oder mutierte CFTR-Protein aus SF-Neun-Zellen mit einem Schnellreinigungsverfahren gereinigt wird, wodurch ein funktionelles CFTR-Protein in einer Detergenzienlösung erhalten wird. Der zweite Schritt besteht darin, das gereinigte Protein in Protea-Liposomen mit definiertem Lipid zu rekonstituieren, die vom Experimentator ausgewählt werden.

Als nächstes wird ein chemischer Gradient von Iodid über die Membran entwickelt, indem das zusätzliche liposomale Iodid entfernt wird, um eine treibende Kraft für die Ionenbewegung durch den CFTR-Kanal zu erzeugen. Der letzte Schritt besteht darin, den Kanal zu aktivieren und die Jodidfreisetzung aus den Protea-Liposomen in Gegenwart des interessierenden Modulatormoleküls zu initiieren. Letztendlich wird eine iodidselektive Elektrode verwendet, um die Funktion des CFTR-Kanals in Echtzeit in diesem rekonstituierten System zu überwachen.

Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Chloridkanalaktivität einer gereinigten Population von CFTR-Molekülen nach der Rekonstitution in Phospholipid-Liposomen. Obwohl diese Methode ausgewählt wurde, um Einblicke in die Funktion von C-F-D-R-N-Neunkanal und die Wirkung von niedermolekularen Modulatoren zu geben, kann diese Methode auch auf andere Systeme angewendet werden, wie z.B. die funktionelle Charakterisierung anderer Membranproteine. Um erfolgreich zu sein, müssen Personen, die neu in dieser Methode sind, sicherstellen, dass sie das Verhältnis von Protein zu Lipid für ihr System optimiert haben, dass sie nicht mit schlecht funktionierendem oder nicht-funktionellem Protein arbeiten und dass sie einen ausreichenden Jodidgradienten über gut abgedichtete Vesikel erzeugt haben.

Um das Lipid herzustellen, trocknen Sie zunächst fünf Milligramm Ei, Phosphatidylcholin oder Ei PC in einem Nicht-Bor-Silikatglasröhrchen unter einem Argongasstrahl für 20 Minuten bei Raumtemperatur. Berechnen Sie als nächstes das benötigte Volumen von Puffer sechs, wie im Textprotokoll angegeben, und fügen Sie dann Puffer sechs direkt zum Lipid hinzu. Verschließen Sie das Glasröhrchen mit Perfil und wirbeln Sie das Röhrchen dann zwei Minuten lang bei Raumtemperatur, um das Lipid im Puffer zu suspendieren.

Suspendieren Sie anschließend das Lipid bei Raumtemperatur mit einer 25-Gauge-Nadel, die an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist, bis kein sichtbarer Lipidfilm an der Seite des Röhrchens zu sehen ist. Der Puffer wird aufgrund des suspendierten Lipids trüb sein. Beschallen Sie das Lipid in der Röhre für einen 22. Stoß in einem Bad, beschallen Sie das eishaltige Röhrchen und legen Sie dann die Röhre auf Eis, um eine Minute lang zu ruhen.

Führen Sie diesen Zyklus dreimal durch. Fügen Sie als Nächstes das CFTR-Protein zum Lipid hinzu, um ein Endvolumen von einem Milliliter zu erhalten. Mischen Sie das Protein 10 Mal mit einer 25-Gauge-Nadel mit einer Lipidsuspension.

Legen Sie die Probe 30 Minuten lang auf Eis und schwenken Sie das Röhrchen fünfmal alle fünf Minuten, um es zu mischen, während Sie die Probe inkubieren. Brechen Sie die untere Lasche einer Schleudersäule für Einwegwaschmittel und zentrifugieren Sie die Säule zwei Minuten lang bei 2000 Mal, G.To entfernen Sie den Aufbewahrungspuffer, waschen Sie die Säule mit fünf Millilitern Puffer sieben und zentrifugieren Sie die Säule vier Minuten lang bei 2000 Mal. G, um den Waschpuffer zu eluieren.

Waschen Sie die Säule dreimal, übertragen Sie die gesamte Ein-Milliliter-Proteinlipidprobe auf die Oberseite des Säulenharzes und inkubieren Sie die Säule dann zwei Minuten lang bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Säule vier Minuten lang bei Raumtemperatur bei 2000 mal G. Übertragen Sie dann die trübe Protea-Liposomenprobe in ein sauberes Mikrosicherungsröhrchen und stellen Sie das Röhrchen auf Eis. Weichen Sie fünf Gramm Cidex G 50 Kügelchen in 50 Millilitern Puffer neun für mindestens zwei Stunden bei Raumtemperatur ein.

Dann bestücken Sie vier kleine Siebsäulen mit den gesättigten Kügelchen, bis sie mindestens zu drei Vierteln gefüllt sind. Zentrifugieren Sie die Säulen vier Minuten lang bei 2000 mal G, um überschüssigen Puffer aus dem Harz zu entfernen. Nach der Zentrifugation sollten sich etwa 2,25 Milliliter des gepackten Harzes in der Säule befinden.

Es ist entscheidend, dass das Harz für die Elution mit den Protea-Liposomen angemessen hydratisiert wird. Übertragen Sie anschließend 125 Mikroliter der Protea-Liposomenprobe auf die Oberseite jeder Säule und zentrifugieren Sie vier Minuten lang bei 2000 Mal. G Bündeln Sie die EITs für die Verwendung in den Iodid-FLX-Experimenten.

Legen Sie einen kleinen F-Vlies-Rührstab in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte und geben Sie dann 150 Mikroliter VX seven 70 in einer Konzentration von 20 Mikromolaren in Puffer neun in die Vertiefung. Verwenden Sie eine Pipettenspitze, um Blasen zu entfernen. Geben Sie dann 150 Mikroliter der Protea-Liposomenprobe in die Vertiefung, um ein Gesamtvolumen von 300 Mikrolitern zu erhalten.

Stellen Sie die 96-Well-Platte bei 130 Umdrehungen pro Minute auf eine Rührplatte. Führen Sie die Spitze der iodidempfindlichen Elektrode in die Lösung ein, ohne den Rührstab oder den Boden der Vertiefung zu berühren. Um die Abtastungen des Elektrodensignals aufzuzeichnen, filtern Sie das Signal fünf Minuten lang durch einen Tiefpassfilter mit einer Abtastrate von zwei Hertz, um die Abtastung der Probe zu ermöglichen.

Es sollte eine stabile, nahezu flache Basislinie erzeugen. Fügen Sie dann drei Mikroliter einer 100 millimolaren Stammlösung von Magnesium A TP bei einem pH-Wert von sieben hinzu. Um die CFTR-Kanäle zu aktivieren, lassen Sie die Probe weitere fünf Minuten lang äquilibrieren, um eine neue Basislinie zu erreichen.

Fügen Sie als nächstes drei Mikroliter einer zwei mikromolaren Stammlösung hinzu. Ein Valin-Mycin, um den durch die CFTR-Aktivität erzeugten elektrochemischen Gradienten zu eliminieren. Zeichnen Sie den Spannungsabfall aufgrund der CFTR-vermittelten Jodid-FLX-Aktivität mindestens fünf Minuten lang auf.

Geben Sie dann drei Mikroliter einer Lösung von 10 % Triton X 100 zur Probe, um Jodid aus dem Protea-Liposomenlumen als Kontrolle freizusetzen. Eine signifikante Jodidfreisetzung deutet darauf hin, dass das in den Vesikeln eingeschlossene Iodid die CFTR-Aktivität nicht einschränkte. Nach der Messung der Probe wird eine Verdünnungsreihe von Kaliumiodid von mikromolaren zu nanomolaren Konzentrationen in Puffer neun durchgeführt.

Beginnen Sie mit der am stärksten verdünnten Lösung, und notieren Sie die Reaktion der Elektrode in Millivolt bei jeder Jodidkonzentration, um eine Standardkurve zu erstellen. Wildtyp-CFTR wurde auf Iodid untersucht. F-Flussaktivität, gemessen in Anomol pro Sekunde nach der Rekonstitution.

Der Iodid-F-Fluss wird in Gegenwart von CFTR und A TP signifikant stimuliert, verglichen mit der Kontrolle ohne CFTR und durch Zugabe eines TP. Wenn CFTR durch die zyklische A MP-abhängige Proteinkinase phosphoryliert wird. Eine katalytische Untereinheit, die als PKA bekannt ist, reduziert umgekehrt bei der Vorbehandlung mit dem potenten Inhibitor CFTR-Inhibitor 1 72 die Jodid-FLX-Rate, die Fähigkeit von VX seven 70, den Jodid-F-Fluss von Wildtyp-CFTR zu potenzieren, wurde ohne und mit Phosphorylierung durch PKA getestet. VX 70 erhöhte das relative Iodid FLX nur in Gegenwart von phosphoryliertem CFTR. Das effektive VX seven 70 wurde mit einer Variante von CFTR namens Delta 5 0 8 CFTR getestet, und das inaktive Analogon V 0 9 11 88 potenziert die Aktivität von phosphoryliertem Delta 5 0 8 CFTR nicht, während VX seven 70 das relative Iodid flx erhöht. Einmal gemeistert, kann diese Technik von der Reinigung bis zur CFTR-Aktivitätsmessung in einem typischen achtstündigen Arbeitstag abgeschlossen werden. Die Aufreinigung von CFTR dauert etwa vier Stunden und die Rekonstitution dauert eine weitere Stunde, bevor der eFlex-Assay gestartet wird.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, einschließlich eines T-PS-Assays und der Durchführung einer Einkanalmessung, im Para-Lipid S unter Verwendung der gleichen Präparation des CFDR-Proteins durchgeführt werden, um die Wechselwirkung mit den kleinen Molekülen weiter zu charakterisieren. Mit diesen Methoden wird ein Mukoviszidose-Forscher in der Lage sein, Schlüsselfragen auf dem Gebiet des CFTR-Modulators zu beantworten, nämlich ob dieser Modulator direkt mit dem CFTR-Protein interagiert und was der Wirkmechanismus dieses Modulators ist.