Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Funktion einer Population von CFTR-Kanälen in einem rekonstituierten System zu messen und die Reaktion der Kanäle auf das Vorhandensein von Modulatormolekülen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Wildtyp- oder mutierte CFTR-Protein aus SF9-Zellen mithilfe eines schnellen Reinigungsverfahrens gereinigt wird, wodurch funktionelles CFTR-Protein in Detergenslösung erhalten wird. Der zweite Schritt besteht darin, das gereinigte Protein in Proteoliposomen mit definierten, vom Experimentator ausgewählten Lipiden zu rekonstituieren.

Anschließend wird ein chemischer Iodid-Gradient über die Membran erzeugt, indem das überschüssige liposomale Iodid entfernt wird, um eine treibende Kraft für die Ionenbewegung durch den CFTR-Kanal zu schaffen. Im letzten Schritt wird der Kanal aktiviert und die Freisetzung von Iodid aus den Protea-Liposomen in Gegenwart des interessierenden Modulator-Moleküls eingeleitet. Letztendlich wird die Funktion des CFTR-Kanals in diesem rekonstituierten System mittels einer iodidselektiven Elektrode in Echtzeit überwacht.

Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Chloridkanalaktivität einer gereinigten Population von CFTR-Molekülen nach deren Rekonstitution in Phospholipid-Liposomen. Obwohl diese Methode ursprünglich entwickelt wurde, um Einblicke in die Funktion des C-F-D-R-N-neun-Kanals und die Wirkung kleiner Molekülmodulatoren zu erhalten, kann sie ebenfalls auf andere Systeme angewandt werden, beispielsweise zur funktionalen Charakterisierung weiterer Membranproteine. Um erfolgreich zu sein, müssen Personen, die neu in dieser Methode sind, sicherstellen, dass sie die Verhältnisse von Protein zu Lipid für ihr jeweiliges System optimiert haben, dass sie nicht mit funktionsgeschwächtem oder nicht funktionsfähigem Protein arbeiten und dass ein ausreichender Iodid-Gradient über gut abgedichtete Vesikel erzeugt wurde.

Zur Vorbereitung des Lipids trocknen Sie zunächst fünf Milligramm Ei-Phosphatidylcholin oder Ei-PC in einem nicht borosilikatglasartigen Glasröhrchen unter einem Argonstrom 20 Minuten lang bei Raumtemperatur ein. Berechnen Sie anschließend das Volumen von Puffer sechs gemäß den Angaben im textlichen Protokoll und geben Sie Puffer sechs dann direkt zum Lipid hinzu. Verschließen Sie das Glasröhrchen mit Perfil und wirbeln Sie es zwei Minuten lang bei Raumtemperatur im Vortex, um das Lipid im Puffer zu suspendieren.

Als Nächstes das Lipid bei Raumtemperatur mit einer 25-Gauge-Nadel, die an einer Ein-Milliliter-Spritze befestigt ist, suspendieren, bis kein sichtbarer Lipidfilm mehr an der Röhrenwand vorhanden ist. Der Puffer wird aufgrund des suspendierten Lipids trüb sein. Das Lipid in der Röhre im Wasserbad für eine 22. Impulssequenz beschallen, wobei die Sonifikation unter Zugabe von Eis erfolgt, und anschließend die Röhre eine Minute lang zur Ruhe auf Eis stellen.

Wiederholen Sie diesen Zyklus dreimal. Geben Sie anschließend das CFTR-Protein zu dem Lipid hinzu, sodass sich ein Endvolumen von einem Milliliter ergibt. Mischen Sie das Protein zehnmal mit einer 25-Gauge-Nadel in einer Lipid-Suspension.

Stellen Sie die Probe 30 Minuten lang auf Eis und wirbeln Sie das Gefäß alle fünf Minuten fünfmal um, um die Probe während der Inkubation zu mischen. Brechen Sie die untere Lasche einer Einweg-Detergens-Bindungs-Spin-Säule ab und zentrifugieren Sie die Säule zwei Minuten lang bei 2000 × g. Um den Lagerpuffer zu entfernen, waschen Sie die Säule mit fünf Millilitern Puffer 7 und zentrifugieren Sie die Säule vier Minuten lang bei 2000 × g, um den Waschpuffer zu eluieren.

Spülen Sie die Säule dreimal, übertragen Sie die gesamte Protein-Lipid-Probe von einem Milliliter auf das Säulenharz und inkubieren Sie die Säule anschließend zwei Minuten bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie die Säule vier Minuten lang bei Raumtemperatur mit 2000 × g. Übertragen Sie die trübe Proteo-Liposomen-Probe dann in ein sauberes Mikrozentrifugenröhrchen und stellen Sie das Röhrchen auf Eis. Schlüren Sie fünf Gramm Cidex G-50-Kügelchen mindestens zwei Stunden lang bei Raumtemperatur in 50 Milliliter Puffer neun ein.

Danach vier kleine Säulen für die Durchmusterung mit den gesättigten Kügelchen befüllen, bis diese mindestens zu drei Vierteln gefüllt sind. Die Säulen vier Minuten lang bei 2000 × g zentrifugieren, um überschüssiges Puffermedium aus dem Harz zu entfernen. Nach der Zentrifugation sollten sich etwa 2,25 Milliliter gepacktes Harz in der Säule befinden.

Es ist entscheidend, dass das Harz für die Elution mit den Protea-Liposomen angemessen hydratisiert ist. Überführen Sie anschließend 125 Mikroliter der Protea-Liposomenprobe auf das Ende jeder Säule und zentrifugieren Sie vier Minuten bei 2000 ×g. Sammeln Sie die EITs für die Verwendung in den Iodid-FLX-Experimenten.

Geben Sie einen kleinen F-Lanolin-Rührstab in eine Vertiefung einer 96er-Platte und fügen Sie anschließend 150 µL VX seven 70 in einer Konzentration von 20 µM in Puffer neun hinzu. Entfernen Sie eventuelle Blasen mit einer Pipettenspitze. Geben Sie dann 150 µL der Protea-Liposomenprobe zur Vertiefung, sodass sich ein Gesamtvolumen von 300 µL ergibt.

Stellen Sie die 96-Well-Platte auf einen Rührer mit 130 Umdrehungen pro Minute. Führen Sie die Spitze der iodidempfindlichen Elektrode in die Lösung ein, ohne den Rührstab oder den Boden des Wells zu berühren. Um die Aufzeichnungen des Elektrodensignals zu erfassen, filtern Sie das Signal über einen Tiefpassfilter mit einer Abtastrate von zwei Hertz und nehmen Sie die Signale der Probe fünf Minuten lang auf, um die Probe zur Gleichgewichtseinstellung zu bringen.

Es sollte eine stabile, nahezu flache Grundlinie erzeugen. Dann drei Mikroliter einer 100 Millimolar-Stammlösung von Magnesium-A TP bei pH sieben hinzufügen. Um die CFTR-Kanäle zu aktivieren, die Probe weitere fünf Minuten lang anlaufen lassen, um eine neue Grundlinie zu erreichen.

Fügen Sie anschließend drei µL einer zwei µM Stammlösung von Valinomycin hinzu, um den durch die CFTR-Aktivität erzeugten elektrochemischen Gradienten zu eliminieren. Registrieren Sie den Spannungsabfall aufgrund der CFTR-vermittelten Iodid-FLX-Aktivität mindestens fünf Minuten lang.

Anschließend drei Mikroliter einer 10 %igen Triton X-100-Lösung zur Probe hinzufügen, um Iodid aus dem Protealiposomenlumen als Kontrolle freizusetzen. Eine signifikante Freisetzung von Iodid zeigt an, dass das eingefangene Iodid in den Vesikeln nicht die CFTR-Aktivität begrenzte. Nach der Messung der Probe eine Verdünnungsreihe von Kaliumiodid von Mikromolar- bis Nanomolar-Konzentrationen in Puffer neun herstellen.

Ausgehend von der am stärksten verdünnten Lösung die Reaktion der Elektrode in Millivolt bei jeder Iodidkonzentration erfassen, um eine Standardkurve zu erstellen. Der Wildtyp-CFTR wurde auf Iodid getestet. Die F-Flussaktivität wurde in Anomol pro Sekunde nach der Rekonstitution gemessen.

Der Iodid-Fluss wird signifikant in Gegenwart von CFTR und ATP gegenüber der Kontrolle ohne CFTR und durch Zugabe von ATP stimuliert. Wenn CFTR durch die cAMP-abhängige Proteinkinase A, deren katalytische Untereinheit als PKA bekannt ist, phosphoryliert wird, reduziert eine Vorbehandlung mit dem starken Inhibitor CFTR-Inhibitor 172 hingegen die Iodid-Flussrate. Die Fähigkeit von VX-770, den Iodid-Fluss des wildtypischen CFTR zu verstärken, wurde in Abwesenheit und in Gegenwart der Phosphorylierung durch PKA getestet. VX-770 erhöhte den relativen Iodid-Fluss nur in Gegenwart von phosphoryliertem CFTR. Die Wirksamkeit von VX-770 wurde unter Verwendung einer CFTR-Variante namens Delta-F508-CFTR untersucht, und das inaktive Analogon V091188 verstärkte die Aktivität des phosphorylierten Delta-F508-CFTR nicht, während VX-770 den relativen Iodid-Fluss erhöhte. Ist die Methode einmal beherrscht, kann sie von der Reinigung bis hin zur Messung der CFTR-Aktivität innerhalb eines typischen achtstündigen Arbeitstags abgeschlossen werden; die Reinigung von CFTR dauert etwa vier Stunden, und die Rekonstitution benötigt eine weitere Stunde, bevor der eFlex-Assay gestartet wird.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden, einschließlich eines TPS-Assays und der Einzelkanalmessung in para-lipidem S, mit derselben Aufbereitung des CFDR-Proteins durchgeführt werden, um die Wechselwirkung mit kleinen Molekülen weiter zu charakterisieren. Mithilfe dieser Methoden kann ein Forscher zur zystischen Fibrose zentrale Fragen im Bereich der CFTR-Modulatoren beantworten, insbesondere, ob ein Modulator direkt mit dem CFTR-Protein interagiert und welcher Wirkmechanismus diesem Modulator zugrunde liegt.