Name: Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 59 s
Description: Erfahren Sie die funktionelle Rekonstitution von CFTR-Protein in Proteoliposomen zur Messung der Kanalaktivität und Modulatorwirkung bei Mukoviszidose. Diese Methode ermöglicht Echtzeit-Monitoring.

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Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

<ol><li>Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+the+mechanisms+underlying+CFTR+channel+activity%2C+the+molecular+basis+for+cystic+fibrosis+and+strategies+for+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+Biochem%22%5BJournal%5D)">Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy.</a> Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).</li>
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<li>Rabeh, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+of+both+NBD1+energetics+and+domain+interface+is+required+to+restore+DeltaF508+CFTR+folding+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function.</a> Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).</li>
<li>Aleksandrov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allosteric+modulation+balances+thermodynamic+stability+and+restores+function+of+DeltaF508%5BTitle%5D)+AND+%22CFTR.+J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508.</a> CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).</li>
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<li>Riordan, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+recombinant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+from+Chinese+hamster+ovary+and+insect+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells.</a> J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).</li>
<li>Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE%22%5BJournal%5D)">Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> JoVE. (61), (2012).</li>
<li>Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).</li>
<li>Peng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+affinity+isolation+of+recombinant+protein+using+the+baculovirus%2Finsect+cell+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr+Purif%22%5BJournal%5D)">One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system.</a> Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+procedure+for+the+efficient+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).</li>
<li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).</li>
<li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+reconstitution+of+epithelial+chloride+channel+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).</li>
<li>Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+recombinant+protein+derived+from+the+baculovirus+expression+system+using+glutathione+affinity+agarose%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose.</a> Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).</li>
<li>Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+%28CFTR%29+potentiator+VX-770+%28ivacaftor%29+opens+the+defective+channel+gate+of+mutant+CFTR+in+a+phosphorylation-dependent+but+ATP-independent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner.</a> J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).</li>
<li>Alkhouri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+properties+of+molecular+probes+for+the+rescue+site+on+mutant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).</li>
<li>Eckford, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VX-809+and+Related+Corrector+Compounds+Exhibit+Secondary+Activity+Stabilizing+Active+F508del-CFTR+after+Its+Partial+Rescue+to+the+Cell+Surface%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface.</a> Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).</li>
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</ol>

Die Autoren danken den Rat von Dr. Mohabir Ramjeesingh während der Entwicklung der hier beschriebenen Reinigungsverfahren. Diese Studien wurden durch Betriebskostenzuschüsse zur CEB von der kanadischen Institutes of Health Research (CIHR) und Cystic Fibrosis Canada (CFC) unterstützt. PDWE wurde teilweise durch Fellowship Awards durch den CIHR und CFC unterstützt. Die Autoren danken der Bereitstellung von Korrektor Potentiator und Inhibitor-Verbindungen von Dr. R. Bridges (Rosalind Universität für Medizin und Wissenschaft) sowie den Vertrieb durch die Cystic Fibrosis Foundation Therapeutics (CFFT). Die Autoren hervorragenden Service zu bestätigen auch von der Baylor Cell Culture Facility (NIH P30 CA125123) auszudrücken Wt und mutierten CFTR-Proteins unter Verwendung des Baculovirus-System. Die inaktive VX-770 analog, V-09 bis 1188, war ein Geschenk von Vertex Pharmaceuticals.

Es gab eine beschränkte Anzahl von Reinigungsprotokolle für Volllängen-funktionelle CFTR Isolierung war, aus einer Vielzahl von Zellexpression Systemen. Das hier beschriebene Verfahren ist vorteilhaft, da sie ermöglicht eine schnelle Reinigung von Wt-CFTR oder hohe Anreicherung von F508del- und G551D-CFTR in moderaten Mengen, die hochfunktionell in Assays einschließlich ATPase und direkte Messungen der Kanalfunktion, einschließlich Einzelkanalmessungen in planaren Doppelschicht Systeme und zeigte Maßnahmen CFTR Populati...

Chlorid-Transports durch die apikale Membran von Epithelzellen in Geweben wie der Lunge, des Darms, der Bauchspeicheldrüse und Schweißdrüsen wird primär von der Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR), einem ATP- und Phosphorylierung reguliert Mitglied der ABC (ATP-vermittelten Binding Cassette) C-Unterfamilie von Membranproteinen (in 1 überprüft). Wie andere Mitglieder der ABCC Familie ist CFTR eine große, mehr Spanning integrales Membranprotein, das an zwei ATP-Nukleotid-Bindungsstellen an der Schnittstelle ihrer Nukleotid-(NBDs), wo es geringe ATPase-Aktivität besitzt, in einer einzigen gebildet bindet Website. Im Gegensatz zu anderen ABCC Familie Mitglieder CFTR wurde als einzigartiges geregelten Cl Kanal anstatt als aktiven gelösten Transporter entwickelt. Mutationen im CFTR Ursache Mukoviszidose, einer Krankheit, die mehrere Organe wie die Lunge, Magen, Darm, Pankreas-und Fortpflanzungsorgane, was zu morbidity und Mortalität bei jungen Erwachsenen. Lungenerkrankungen nimmt normalerweise Frühletalität bei zystischer Fibrose und in den meisten Fällen wird durch den Verlust der CFTR-Funktion auf dem Oberflächenepithel der leitenden Atemwegen verursacht wird. Der Mangel an CFTR Chlorid-Kanal-Aktivität führt zu einer Verringerung sowohl der Cl - und Wasserbewegung über die Oberfläche Epithel, um die Fluidschicht auf der apikalen Oberfläche der Wimper Respirationsepithels modifizieren. Dies führt zu einem viskosen Atemwegsoberflächenflüssigkeit, die die Fähigkeit von Wimper respiratorischen Epithelzellen beeinträchtigt effektiv klare Pathogenen aus den Atemwegen. Als Folge sind die meisten CF-Patienten leiden unter wiederkehrenden Anfällen von Lungenentzündung und Lungenschäden aufgrund einer Entzündung. Wie erwartet, Studien über den Wirkungsmechanismus des normalen CFTR-Protein konzentrierte sich hauptsächlich auf detaillierten elektrophysiologische Untersuchungen der Kanalöffnung Aktivität. Einkanal-Studien haben direkt, dass CFTR fungiert als PKA-abhängige Cl gezeigt- Kanal, der ein ATP-regulierten Tor 2 besitzt. Detaillierte elektrophysiologische Studien bieten eine Vielzahl von Informationen über einzelne CFTR-Kanäle 1,3, es kann jedoch Sorge, ob die Eigenschaften eines bestimmten einzelnen Kanal, der untersucht wurde, ist repräsentativ für die gesamte Bevölkerung von CFTR-Kanäle und damit die einzelnen Kanal Testergebnisse sollten stets zusammen mit Methoden, um die makroskopischen Bevölkerung studieren berücksichtigt werden. Direkter Assay der Bevölkerung Kanalaktivität von gereinigtem CFTR hat das Potential, um einen Einblick in die molekularen Defekts mit krankheitsverursachenden Mutation assoziiert ist und Entdeckung chemischer Modulatoren, die Reparatur mutierten CFTR-Proteine ​​zu treiben. Bis heute gibt es mehr als 1.900 verschiedene Mutationen im CFTR gedacht, um Mukoviszidose 4 verursachen. Der Haupt Mutation F508del-CFTR, auf mindestens einem Allel in etwa 90% der Patienten in Nordamerika und Europa führt zu Proteinfehlfaltung and Retention im endoplasmatischen Retikulum 5. F508del-CFTR hat auch andere Folgen, einschließlich defekte Kanalaktivität 6-9. Die sich ergebende Fehlen von CFTR von der Zelloberfläche ist mit einer schweren Erkrankung. G551D-CFTR, eine weniger häufige Mutation, wird angenommen, dass noch richtig gefaltet dysfunktional als Chlorid-Kanal an der Zelloberfläche 6 ist. Die Entwicklung niedermolekularer Korrektoren und Potentiatoren hat das Ziel, Korrektur Faltung und / oder Menschen von Mutanten, wie F508del-CFTR an der Zelloberfläche und potenzierende oder Erhöhung der Kanalaktivität von Mutationen wie G551D, wenn sie auf der Zelloberfläche vorhanden sind, jeweils . Während die Korrektoren VX-809 und VX-661 (noch nicht zur Anwendung bei Patienten zugelassen, die Potentiator Kalydeco (Ivacaftor, VX-770) wird auf 150 mg alle 12 h bei CF-Patienten&gt; 6 Jahre mit mindestens einem G551D verwendet -CFTR Mutation, und in jüngerer Zeit für Patienten mit einem G178R, S549N, S549R, G551S, G1244E, S1251N, S1255Pund G1349D. Kalydeco sowohl sicher und führt zu einer Verbesserung der klinischen Maßnahmen CF Krankheit 10 ist jedoch der Mechanismus der Wirkung des kleinen Moleküls war schlecht bei der FDA-Zulassung für die Anwendung bei Patienten verstanden. Eine Handvoll von CFTR Reinigungsverfahren wurden zuvor 2,11-18, von denen viele erfordern eine beträchtliche Zeitdauer in Anspruch beschrieben. In einer kürzlich erschienenen Publikation 19 wurde eine einzigartige schnelle Reinigung und Rekonstitution Verfahren zur CFTR in Sf 9-Zellen-Expressionssystem überexprimiert beschrieben, und das gereinigte Protein in definierten Lipidsystem wurde verwendet, um ein CFTR Halogenid Kanalaktivitätstest für eine Population von CFTR entwickeln Molekülen. Der Assay fasst die bekannten Wirkungen der Phosphorylierung, Nukleotide und Inhibitoren auf die CFTR-Funktion. Das System wurde verwendet, um die Wirkungen der Potentiator abzufragen VX-770 / Kalydeco auf Wt (Wildtyp), F508del- und G551D-CFTR und es wurde zum ersten Mal gezeigtZeit, die das Arzneimittel interagiert direkt mit dem CFTR-Protein, seine Kanalaktivität in einem ATP-unabhängigen Weise zu verstärken, was die Nützlichkeit und Anwendbarkeit dieser Verfahren auf die Untersuchung der Wechselwirkung von CFTR und Mutanten mit Nukleotiden und kleinen Molekülen aus einer Population Perspektive beantworten klinisch relevante Fragen zum Protein. Die Verfahren sind auch verwendet worden, um andere Potentiator Moleküle und deren Derivate 20, als auch die Auswirkungen eines kleinen Moleküls Korrektor auf die Aktivität des Proteins 21 zu studieren. Efflux-Assays wurden in vielen Studien verwendet worden, die zuvor um die Aktivität des CFTR-Mutanten und die Wirkungen von CFTR-modulatorische Verbindungen auf ihre Aktivität, einschließlich der Gesamtzelltests unter Verwendung von Elektroden, radioaktiven Tracer und Fluorophore 22,23, Membranvesikel mit ionenselektiven Elektroden 24 zu untersuchen und gereinigt wieder hergestellt CFTR mit radioaktiver Tracer 25. Allerdings the Verwendung von ionenselektiven Elektroden zu reinig wiederhergestellt CFTR Studie wurde vor kurzem 19 ausgewiesen. Eine Anpassung der aktuellen Methode ist für die Rekonstitution und funktionelle Charakterisierung der beiden Membranproteine ​​von Pseudomonas aeruginosa, einem gemeinsamen CF Pathogen verwendet. Rekonstitution von gereinigten Alge Protein der äußeren Membran gekuppelt mit Jodid Efflux-Messungen wurden verwendet, um ein Modell für die anionische Alginat Sekretion durch diese Transporter 26 zu unterstützen. Rekonstitution und Iodid Auslauf Messungen wurden mit dem gereinigten WZX Protein, das ein Modell vorgeschlagen werden, die ein H + -abhängigen Antiport-Mechanismus für die Lipid-verknüpftes Oligosaccharid Translokation über die bakteriellen Innenmembran schlägt dieses Protein 27 dürfen angewandt. In beiden Fällen wurde Jodid als Surrogat für die anionische Substrat bei geringeren Durchsatz verwendet, wenn auch, als man für eine native Substrat erwarten. Das Verfahren kann für die Anpassung an andere Proteine, die mit c istationic Transport oder Leitungsbahnen für die anionische Substrate. Hier wird eine schnelle Reinigungsverfahren ist für den CFTR-Proteins und seiner Rekonstitution in Proteoliposomen von definierten Lipid beschrieben. Die rasche Rekonstitution kann leicht zur Verwendung mit CFTR durch andere Verfahren gereinigt zugeschnitten werden, dass die Art des Detergens in der Reinigung verwendet zugänglich ist, um die Entfernung von den hier verwendeten Methoden oder nach einem geeigneten Detergens vor der Rekonstitution ausgetauscht werden. Das Iodid Efflux Verfahren zur Messung der Kanalaktivität der gereinigten und rekonstituierten CFTR-Protein ist im Detail beschrieben, und einige typische Ergebnisse, die durch dieses Verfahren erhalten werden können, sind dargestellt.

<table><tbody><tr><td>fos-Cholin 14 Waschmittel</td><td>Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com)</td><td>F312</td><td>Affymetrix: Anatrace Produkte; CAS#&nbsp; :77733-28-9</td></tr><tr><td>cOmplete EDTA-freie Proteasehemmer-Cocktailtabletten</td><td>Roche (www.roche-applied-science.com)</td><td>04 693 132 001</td><td>EDTA-freie Proteasehemmer-Cocktailtabletten (1 von 50 ml oder mini: 1 von 10 ml) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001)</td></tr><tr><td>cOmplete ULTRA Tabletten, Mini, EDTA-frei, EASYpack&nbsp;</td><td>Roche (www.roche-applied-science.com)</td><td>05 892 791 001</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agarose</td><td>Qaigen GmbH</td><td>1018240</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Screening-Säulen</td><td>Fisher Healthcare</td><td>11-387-50</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra Zentrifugalfilter, Ultracel-100K</td><td>Millipore (www.millipore.com)</td><td>UFC910008</td><td></td></tr><tr><td>cAMP-abhängige Proteinkinase A (PKA), katalytische Untereinheit</td><td>New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit)</td><td></td><td>Peirce PKA ist auch geeignet</td></tr><tr><td>PC, Chicken Egg</td><td>Avanti Polare Lipide (www.avantilipids.com)</td><td>840051C</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td>, <td>Avanti Polare Lipide (www.avantilipids.com)</td><td>850457C</td><td></td></tr><tr><td>PS, Schweinehirn</td><td>Avanti Polare Lipide (www.avantilipids.com)</td><td>840032C</td><td>CFTR wurde erfolgreich rekonstituiert zu Ei PC, POPC, 2:1 (w/w) Ei PC:POPC oder einer Mischung aus PE:PS:PC:Ergosterol, 5:2:2:1 (w/w)</td></tr><tr><td>PE, Chicken Egg</td><td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td><td>841118C</td><td></td></tr><tr><td>Ergosterol</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>45480</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Schleudersäule zur Entfernung von Reinigungsmitteln</td><td>Thermo Scientific</td><td>87779</td><td>Säulen mit 1 ml Kapazität</td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>V-0627</td><td></td></tr><tr><td>VX-770 (ivacaftor)</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1144</td><td></td></tr><tr><td>iodidselektive Mikroelektrode</td><td>Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam)</td><td>LIS-146ICM</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Clampex 8.1 Software</td><td>Axon Instruments (www.axon.com)</td><td></td><td>wir verwenden Komponenten des ClampX-Systems mit einem hausgemachten Filter, um die Reaktion auf unsere Elektrode zu überwachen und aufzuzeichnen</td></tr><tr><td>Alternative Software: ArrowLabb System&nbsp;</td><td>Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam)</td><td>LIS-146LICM-XS</td><td>Lazar Research verkauft ein Messgerät, das mit einem Computer und einer Software verbunden werden kann, um die Sondenreaktion aufzuzeichnen. Diese Software sollte eine ähnliche Funktion wie unser Setup erfüllen.</td></tr><tr><td>kleine Rührstäbchen</td><td>Big Science Inc (www.stirbars.com)</td><td>SBM-0502-CMB</td><td>Wählen Sie einen Rührstab, der klein genug ist, um problemlos in eine Vertiefung einer 96-Well-Platte zu passen</td></tr><tr><td>Sephadex G50, fein</td><td>GE Health Care (www.gelifesciences.com)</td><td>17-0042-01</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Laboratory Supplies Co, Inc.</td><td>G112SP1G</td><td>Auch Bad-Ultraschallgeräte anderer Hersteller sollten geeignet sein</td></tr></tbody></table>

funktionelle rekonstitution und kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem wildtyp und mutierten cftr-protein

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

Die Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) ist eine eindeutige Kanal-Bildungselement von der ATP-Bindungskassette (ABC) -Superfamilie von Transportern. Die Phosphorylierung und Nucleotid-abhängigen Chlorid-Kanal-Aktivität von CFTR wurde häufig in Ganzzellsystemen und als einzelne Kanäle in abgetrennten Membranflecken untersucht. Viele Mukoviszidose verursachenden Mutationen wurde gezeigt, dass diese Aktivität ändern. Obwohl eine kleine Anzahl von Reinigungsprotokolle sind veröffentlicht worden, haben eine schnelle Rekonstitution Methode Kanalaktivität beibehält und ein geeignetes Verfahren zur Untersuchung Population Kanalaktivität in einem gereinigten System fehlte. Hier schnelle Methoden zur Reinigung und funktionelle Rekonstitution des Volllängen-CFTR-Protein in Proteoliposomen von definierten Lipid-Zusammensetzung, die eine Aktivität als geregelter Halogenid Kanal beibehält beschrieben. Diese Rekonstiutionsmethode zusammen mit einem neuen Fluß basierenden Assay Kanalaktivität ist ein geeignetes System zurStudium der Bevölkerung Kanaleigenschaften von Wildtyp-CFTR und die krankheitserregenden Mutanten F508del- und G551D-CFTR. Insbesondere weist das Verfahren die Anwendung in der Untersuchung der direkten Effekte der Phosphorylierung, Nukleotide und kleine Moleküle wie Potentiatoren und Inhibitoren auf die CFTR-Kanalaktivität. Die Verfahren sind sich auch zur Untersuchung anderer Membrankanäle / Transporter für anionische Substrate.

In dieser Publikation geschrieben werden Verfahren zur Reinigung, zu rekonstruieren und zu messen geregelten Kanalaktivität des CFTR-Proteins. 1a zeigt den Arbeitsablauf für die Reinigung, Wiederherstellung und Iodid Auslaufverfahren. Verfahren zur Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen durch Jodid Fluss auch in weiteren Einzelheiten in der zugeordneten Video gezeigt. Reinigung und Wiederherstellung der CFTR in Proteo CFTR funktionell in hoh...

Beschrieben wird hier ein schnelles und wirksames Verfahren für die funktionelle Rekonstitution von gereinigten Wildtyp- und mutierten CFTR-Proteins, die die Aktivität für dieses Chloridkanal, der bei zystischer Fibrose fehlerhaft ist bewahrt. Iodid-Efflux aus rekonstituierter Proteo von CFTR vermittelten ermöglicht Untersuchungen der Kanalaktivität und die Auswirkungen von kleinen Molekülen.

Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Funktion einer Population von CFTR-Kanälen in einem rekonstituierten System zu messen und die Reaktion der Kanäle auf das Vorhandensein von Modulatormolekülen zu untersuchen. Dies wird erreicht, indem zunächst das Wildtyp- oder mutierte CFTR-Protein aus SF9-Zellen mithilfe eines schnellen Reinigungsverfahrens gereinigt wird, wodurch funktionelles CFTR-Protein in Detergenslösung erhalten wird. Der zweite Schritt besteht darin, das gereinigte Protein in Proteoliposomen mit definierten, vom Experimentator ausgewählten Lipiden zu rekonstituieren.Anschließend wird ein chemischer Iodid-Gradient über die Membran erzeugt, indem das überschüssige liposomale Iodid entfernt wird, um eine treibende Kraft für die Ionenbewegung durch den CFTR-Kanal zu schaffen. Im letzten Schritt wird der Kanal aktiviert und die Freisetzung von Iodid aus den Protea-Liposomen in Gegenwart des interessierenden Modulator-Moleküls eingeleitet. Letztendlich wird die Funktion des CFTR-Kanals in diesem rekonstituierten System mittels einer iodidselektiven Elektrode in Echtzeit überwacht.Diese Methode ermöglicht die Untersuchung der Chloridkanalaktivität einer

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Biology

Biologie

Wir werden zeigen, wie man die Wirkung einer einzelnen Punktmutation auf die Funktion eines Ionenkanals zu studieren.

Mutagenese und funktionale Analyse von Ionenkanälen heterolog in Säugerzellen exprimierten

Versuche, die zystische Fibrose Transmembran Regulator (CFTR) in...

Expression und Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulatorprotein in Saccharomyces cerevisiae

Zystische Fibrose-Transmembran-Regulator (CFTR), eine epitheliale Chlorid-Kanal, wurde berichtet, dass mit verschiedenen Proteinen zu interagieren und zu regulieren wichtige zelluläre Prozesse, darunter die CFTR PDZ-Motiv-vermittelte Wechselwirkungen sind gut dokumentiert. Dieses Protokoll beschreibt Methoden, die wir entwickelt, um eine PDZ-abhängigen CFTR makromolekularen Signalkomplexes...

In-vitro-Analyse der PDZ-abhängigen CFTR Makromolekulare Signalkomplexe

Verfahren zur vollständigen Auflösung des Prototyps spannungsabhängigen Kaliumkanal in Lipid-Membranen beschrieben. Die rekonstituierten Kanäle sind für biochemische Assays, elektrische Aufnahmen, Liganden-Screening und Elektronen kristallographische Untersuchungen geeignet. Diese Methoden können allgemeine Anwendungen auf die strukturelle und funktionelle Studien anderer Membranproteine.

Rekonstitution eines Kv-Kanal in Lipidmembranen für Strukturelle und Funktionelle Studien

Die heterologe Expression und Reinigung des Mukoviszidose Transmembran Regulator (CFTR) sind bedeutende Herausforderungen und limitierende Faktoren bei der Entwicklung von Arzneimitteltherapien für Mukoviszidose. Dieses Protokoll beschreibt zwei Verfahren zur Isolierung von Milligramm-Mengen von CFTR für funktionelle und strukturelle Untersuchungen.

Die Reinigung des Cystic Fibrosis Transmembran Regulator-Protein in Ausgedrückt<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Ererbten Arrhythmien werden häufig durch Mutationen verursacht, die die Oberfläche Lieferung eines oder mehrerer Ionenkanäle verändern. Hier passen wir die Durchflusszytometrie-Assays eine Quantifizierung der relativen Gesamt und Zelloberflächenproteinexpression von rekombinanten Ionenkanäle in tsa-201-Zellen exprimiert zu liefern.

Bestimmung der relativen Zelloberfläche und Total Expression rekombinanter Ionenkanäle Mit Flow Cytometry

Dieser Artikel beschreibt bestimmte Methoden um biochemische Menge Waschmittel solubilisiert TRPV1 für spektroskopische Analyse zu erhalten. Die kombinierte Protokolle bieten Biochemische und biophysikalische Werkzeuge, die angepasst werden können, um die strukturelle und funktionelle Studien für Säugetier-Ionenkanäle in einer Membran-kontrollierten Umgebung zu erleichtern.

Reinigung und Wiederherstellung der TRPV1 für spektroskopische Analyse

Dieses Protokoll stellt eine Methode zur Messung der Adenin-Nukleotid-Bindung an Rezeptoren in Echtzeit in einer zellulären Umgebung vor. Die Bindung wird als Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) zwischen Trinitrophenylnukleotidderivaten und Proteinen, die mit einer nicht-kanonischen, fluoreszierenden Aminosäure markiert sind, gemessen.

Messung der Nukleotidbindung an intakte, funktionelle Membranproteine in Echtzeit

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Untersuchung von elektrogenen Membranproteinen durch Messung von Änderungen des Membranpotentials. Dieser Assay bietet eine Plattform für die funktionelle Auslesung mehrerer Ionenkanäle, die endogen in Epithelzelllinien exprimiert werden.

Ein fluoreszenzbasierter Assay des Membranpotentials zur Hochdurchsatz-Funktionsuntersuchung zweier endogener Ionenkanäle in zwei Epithelzelllinien

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Funktionelle ortsgerichtete Fluorometrie in nativen Zellen zur Untersuchung der Erregbarkeit der Skelettmuskulatur

Die Elektrophysiologie ist der Goldstandard für die Untersuchung der Aktivität von Ionenkanälen. Es gibt jedoch viele alternative Ansätze, einschließlich optischer Methoden. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Überwachung der Aktivität des leucinreichen Repeats mit 8 Kanälen (LRRC8)-gebildeten Anionenkanälen unter Verwendung einer auf Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) basierenden Methode zwischen den Untereinheiten.

Überwachung der Leucin-reichen Repeat-haltigen 8-Kanal-Aktivität (LRRC8/VRAC) mittels sensibilisiertem Emissions-Förster-Resonanz-Energietransfer (SE-FRET)

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Funktionelle Rekonstitution und Kanalaktivitätsmessungen von gereinigtem Wildtyp und mutierten CFTR-Protein

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