Name: Eine injizierbare and Drug belasteten supramolekulares Hydrogel für Lokale Catheter Injection in die Pig Herz (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Erfahren Sie die minimal-invasive Injektion eines arzneibehandelten supramolekularen Hydrogels in ein infarktiertes Schweineherz mittels Katheter. Diese Methode ermöglicht kontrollierte lokale Wirkstofffreisetzung und neue Therapieansätze für Myokardinfarkte.

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Diese Arbeit wurde durch das Ministerium für Bildung, Kultur und Wissenschaft (Gravity Programm 024.001.035) finanziert, der niederländischen Organisation für wissenschaftliche Forschung (NWO), dem European Research Council (FP7 / 2007-2013) ERC Grant Agreement 308.045 und in der durchgeführt, LSH TKI Rahmen. Diese Forschung ist Teil des Projekt P1.03 PENT des Forschungsprogramms des Instituts Biomedizinische Materialien, mitfinanziert vom niederländischen Wirtschaftsministerium. Niederlande Heart Institute (- Dieses Projekt wurde von ICIN unterstützt <a href="www.icin.nl">www.icin.nl</a> ) und die &quot;Wijnand M. Pom Stichting&quot;. Die Autoren bedanken sich bei Henk Janssen und Joris Peters für die Synthese des UPY-Hydrogelbildner und Remco Arts für die Bereitstellung der mRuby2 danken. Wir bedanken uns bei Bert Meijer, Tonny Bosman, Roxanne Kieltyka, Stijn Kramer, Joost Sluijter, Imo Hoefer und Frebus van Slochteren für die viele nützliche Diskussionen und Marlijn Jansen, Joyce Visser, Anmut Croft und Martijn van Nieuwburg für technische Unterstützung.

HINWEIS: Alle in vivo-Experimente wurden in Übereinstimmung mit dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren durch das Institut für Labortier Ressourcen durchgeführt. Die Experimente wurden von der Tierversuchsausschuss der Medizinische Fakultät der Universität Utrecht, den Niederlanden. 1. Formulierung des Hydrogel <ol><li> Um 1 ml der 10 Gew% -igen Gel, werden 100 mg des UPY-Hydrogelbildner in einem Fläschchen in 900 ul PBS pH 11,7 unter Rühren bei 70 ° C für 1 Stunde unter Verwendung eines Magnetrührers. Danach kühlen die viskose Lösung auf Raumtemperatur. Die Lösung soll jetzt einen pH von ungefähr 9,0. Diese Lösung kann für einige Tage gelagert werden. </li><li> Pipettieren die entsprechende Menge an Arzneistoff oder Molekül, das in neutralen PBS in die viskose Lösung gelöst wird und unter Rühren für 10 min, um eine gleichmäßige Verteilung zu erreichen. Wenn die Lösung zu viskos, kurz warm es mit heißem Wasser. </li><li> Legen Sie die Lösung für 1 Stunde unter einer UV-Lampe zu sterilisieren. </li></ol> 2. Analyse der Hydrogel <ol><li> Rheologische Beurteilung der Lösung <ol><li> Vor dem Beladen des Gels, montieren Sie die 25 mm Platte-Platte-Geometrie in dem Rheometer, die Temperatur auf 20 ° C und laden Sie die Platte mit Wasser, um die Verdampfung des Gels während der Messung zu vermeiden. </li><li> Pipette 300 ul der Lösung auf eine 25 mm Platte-Platte-Geometrie auf einem Rheometer bei 20 ° C gehalten und senken Sie die Platten, um eine 0,5 mm Spaltabstand zu erhalten. </li><li> Record Scherviskosität als Funktion der Scherspannung von 0,1 bis 500 Pa mit 10 Punkten pro Dekade. </li></ol></li><li> Rheologische Beurteilung des Gels <ol><li> Pipette 300 ul der Lösung auf die Platte und Pipette insgesamt 4,2 ul 1 M HCl an verschiedenen Orten auf der Lösung, um die Gelbildung zu induzieren. </li><li> Senken Sie die Platten mit einem Spaltabstand von 0,5 mm und lassen Sie das Gel Heilmittel für etwa 30 min. Während dieses Aushärtungsprozesses messen den Speicher- und Verlustmodul bei niedriger Frequenz und Belastung beispielsweise jeweils 1 rad / s und 0,5%. </li><li> Nachdem das Gel (nach ca. 30 min), Platten Speicher- und Verlustmodul als Funktion der Frequenz (0,1-100 rad / sec) und anschließend als Funktion der Dehnung (0,1-1000%) gehärtet. </li></ol></li></ol> 3. Erosion und Freisetzungsversuche <ol><li> Dann 100 ul der viskosen Lösung, die das Medikament oder Biomolekül in eine Poly (ethylenterephthalat) hängen Zellkultureinsatz 24-Mulden-Platte mit 8,0 &amp; mgr; m Porengrße. Um ein Auslaufen der Polymerlösung zu verhindern, während in der flüssigen Phase, decken sie die Unterseite der Einsätze mit Parafilm (2A). </li><li> Unmittelbar danach Pipette 1,4 ul 1 M HCl auf der viskosen Lösung, um den pH auf etwa 7,0-7,2 zu verringern und ließ das Gel Heilung innerhalb des Einsatzes für etwa 30 min. </li><li> Entfernen Sie die Parafilm frobin der Einsätze, legen Sie den Einsatz in einer 24-Well-Platte und füllen Sie die gut mit 800 ul PBS pH-Wert 7,4. Inkubieren Sie die Platte bei 37 ° C mit langsamen Schaukel oder Schüttelbewegung. Um die Verdampfung des Lösungsmittels zu verhindern, füllen verbleibenden leeren Vertiefungen mit PBS und Abdichtung der 24-Well-Platte mit Parafilm (2B). </li><li> In regelmäßigen Abständen aktualisieren Sie die PBS und analysieren die entfernt PBS freigesetzt UPY Erosion Produkt oder Arzneimittel / Biomolekül. <ol><li> Quantifizieren UPY Erosion Produkte oder Pirfenidon durch Messung der UV-Absorption bei 265 nm oder 320 nm. Für fluoreszierende Protein mRuby2 Maßnahme Fluoreszenzemission bei 587 nm nach Anregung bei 559 nm. </li><li> Übersetzen gemessenen Absorption / Emissionswerte auf Konzentrationen über vorgegebene Kalibrierungskurven. <ol><li> Vorbereitung Kalibrierkurven Lösen einer Reihe von bekannten Konzentrationen des Analyten in Puffer und Messung der UV-Absorption oder Fluoreszenzemission dieser Proben. Interpoliert die Daten unter Verwendung einer linearen Funktion, um detHermelin die Konzentration der unbekannten Proben. Für nicht-fluoreszierende Proteine ​​verwenden ELISA Detektion 6. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Lokale Injektion über einen Katheter <ol><li> Induktion von Myokardinfarkt <ol><li> Nach 12 Stunden des Fastens, ohne Wasser, sedieren das Schwein in ihrer stabilen durch Injektion von Midazolam 0,4 mg / kg, Ketamin 10 mg / kg und Atropin 0,014 mg / kg intramuskulär. </li><li> Verwalten Sie Natriumthiopental 5 mg / kg intravenös Narkoseeinleitung und Intubation das Schwein mit einem Endotrachealtubus. Führen Sie Ballon-Belüftung mit einer Rate von 12 / min, wenn erforderlich, während dem Transport des Tieres in den Operationssaal. </li><li> Bei der Ankunft im OP mechanischen Überdruckbeatmung sofort mit FiO2 0.50, 10 ml / kg Atemvolumen und einer Frequenz von 12 / min im Dauer Kapnographie. Verwenden vet Salbe auf die Augen bis zur Trockenheit zu verhindern. </li><li> Starten ausgewogene Anästhesie durch kontinuierliche intravenous Infusion von Midazolam 0,5 mg / kg / h, Sufentanil 2,5 ug / kg / h und Pancuroniumbromid 0,1 mg / kg / h. Um eine ordnungsgemäße Betäubung kontinuierlich EKG, arteriellen Blutdruck, Temperatur und Kapnographie überwachen. </li><li> Intravenös infundiert 4,3 mg / kg Amiodaron und legen Sie die intra Defibrillation Katheter in die rechte Herzkammer mit dem venösen sheeth 18. </li><li> Verschließen die linke vordere absteigende Arterie (LAD) distal zu der zweiten Diagonalzweig durch intrakoronare Ballonokklusion für 90 min, gemessen nach den zuvor beschriebenen Protokoll 18. </li></ol></li><li> Elektromechanische Zuordnung <ol><li> Nach vier Wochen nach Myokardinfarkt, planen die Mapping-Prozedur. Vorbereitung des Systems (4) im Katheterlabor für 3D elektro Mapping (EMM) des linken Ventrikels. Mit diesem System lebensfähig, Winterschlaf und Myokard ohne Durchleuchtungskontrolle identifiziert werden. Um eine solche EM-Karte zu konstruieren erwerben series Punkte an mehreren Stellen auf der LV endokardialen Oberfläche durch die Verwendung eines ultraMagnetfeldEnergieQuelle und einen Sensor Katheters 19,20. </li><li> Betäuben das Schwein, folgenden Protokollschritte 4.1.1-4.1.4. </li><li> Setzen Sie den externen Referenz Patch auf dem Rücken des Schweins. </li><li> Sichere Gefäßzugang (Oberschenkelarterie) gemäß Protokoll 18. </li><li> Nach Erhalt eines Doppeldecker linksventrikuläre angiogram im 25 ° rechten vorderen Schräg (RAO) und 40 ° linke vordere schräge (LA) im Hinblick auf die linke Herzkammer Schätzung Größe, geben 75 U / kg Heparin. </li><li> Voran eine 8 Französisch-mapping (D oder F-Kurve) Katheter unter fluoroskopischer Führung zur absteigenden Aorta, Aortenbogen und über die Aortenklappe in den linken Ventrikel (LV). </li><li> Orientierung der Spitze des Katheters an der Spitze des LV, um die ersten Daten zu erfassen, gefolgt von Ausflusstrakt, seitlichen und hinteren Punkte, um ein 3D-Silhouette zu bilden, definieren die Grenzen des ventricle. </li><li> Erhalten Sie nachfolgende Punkte, bis alle endokardialen Segmente, indem Sie den Mapping-Katheter über das Endokard und der Reihe nach Erwerb der Ort der Spitze, während in Kontakt mit dem Endokard 21,22 abgetastet worden. </li><li> Definieren Sie das Zielgebiet, das ist, wo die elektrische Aktivität ist (fast) normal und mechanische Bewegung beeinträchtigt, so genannte Winterschlaf Myokard (Abbildung 6). </li></ol></li><li> Intramyokardialen Injektion <ol><li> Ersetzen Sie die Mapping-Katheter durch die intramyokardialen Injektionskatheter, der aus einer 27-Gauge-Nadel und ein Kern Lumen innerhalb eines 8 Französisch Katheter (5A und B) zusammengesetzt ist. Auf bestimmte Mengen zu liefern, laden ein Volumen abgestufte Spritze mit etwa 2 ml des Hydrogels Lösung und legen Sie sie in eine Spritzenpumpe. </li><li> Stellen Sie die Nadelverlängerung bei 0 ° und 90 ° biegen und legen Sie 0,1 ml des Hydrogels Lösung, um die Nadel toten Raum zu füllen. Legen Sie dann dieInjektionskatheterspitze über die Aortenklappe und in das Zielgebiet. </li><li> Treffen Sie die folgenden Kriterien für eine Injektionsposition innerhalb des Zielbereichs in 4.2.9 festgelegt: (1) senkrechten Position des Katheters zu der LV Wand; (2) hervorragende Regelschleifenstabilität (&lt;4 mm), wie durch die EMM-System berechnet wird; und (3) zugrunde liegende Spannung&gt; 6,9 mV 21. <ol><li> Die Kanüle in das Myokard, (4) durch eine vorzeitige ventrikuläre Kontraktion des LV bestätigt und injizieren 0,1-0,3 ml des Hydrogels in einem Bolus mit einer konstanten Rate von etwa 0,4-0,5 ml / min unter Verwendung der Spritzenpumpe. Wiederholen Sie diesen Vorgang in 6-10 verschiedene Positionen als diffuse wie möglich. Der natürliche pH-Wert des Gewebes wird die Lösung nach der Injektion auf dem das Hydrogel gebildet neutralisieren. </li></ol></li></ol></li><li> Opfer <ol><li> Post-Verfahren, mit Menschlichkeit zu opfern das Tier durch Ausbluten. Schneiden Sie die Vena cava inferior und entfernen Blut mit einer Saugvorrichtung. Induzieren ventrikuläre fiDefibrillation, indem Sie eine 9 V Batterie an der Spitze. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Eine zentrale Herausforderung ist es, eine Lösung, die injizierbare durch einen langen Katheter während die Lösung mit den bioaktiven Verbindungen einholen. Obwohl der pH-Wert erhöht die Injizierbarkeit zu erhöhen, bioaktive Substanzen wie Wachstumsfaktoren sind empfindliche Moleküle, die vorsichtig gehandhabt werden müssen. Wir überwachen den pH-Wert der Lösung eng mit einem pH-Meter nach dem Hinzufügen des Hydrogelbildner zu, bevor Sie irgendwelche bioaktiven Komponenten zu bestätigen ist es pH 9,0. Anfänglich wurden mehrere Runden des Einstellens der Ausgangs-pH der PBS erforderlich sind, um den richtigen pH beenden. Ferner, weil wir relativ viskosen Lösungen und einen langen dünnen Katheter ist ein großer Druckabfall vorhanden ist (in der Größenordnung von 0,5 MPa in Abhängigkeit von der Geschwindigkeit der Injektion). Deshalb sollte besondere Sorgfalt bei der Auswahl der richtigen Verbindungen zwischen der Spritze und dem Katheter entnommen werden. Eine Spritzenpumpe Träger gesteuerte Einspritzung, wie die Anwendung solcher Kräfte von Hand ist eine Herausforderung. Für in vitro Experimenten wurde die Lösung durch Neutralisieren der Lösung mit HCl geliert, während in vivo Dieses wird durch den natürlichen pH-Wert des Gewebes erfolgt. Daher ist es wichtig, die richtige Menge von HCl in den ein Überschwingen im pH zu verhindern. Die Diffusion dieser Säure ist wahrscheinlich der begrenzende Faktor bei der Geliertemperatur des Hydrogels in in vitro-Experimenten; jedoch in vivo würde die Flüssigkeit eine hohe Kontaktfläche mit neutralisierenden Gewebe besitzen, die höchstwahrscheinlich zu einem schneller und gleichmäßiger gegenüber Gelierung Zugabe von konzentrierter Säure tropft. Außerdem ist das Gel Schalt viel schneller mit dieser milden Verfahrens im Vergleich zu bisher verwendeten Methoden (0,5 h gegenüber 2 Stunden) 25. Mit natürlichen pH-Wert des Körpers zum Umschalten der Materialeigenschaften ist sehr ansprechend, da der Übergang ist schnell, reversibel, kann nicht innerhalb des Katheters auftreten und ist in vivo vollautomatisch. Diese Eigenschaften geben, Vorteile gegenüber zB thermische switchable geliert 26, denen das Risiko einer Gelbildung in einem Katheter aufgrund von Temperaturänderungen vorhanden ist, die Gele, die photoinduzierte Polymerisation, die aufgrund der begrenzten Lichteinfall und die Radikalbildung 27 oder Gele, die Co-Injektion eines Polymerisationsinitiators erforderlich herausfordernd ist erforderlich oder accellerator 28. Erfolgreiche Freisetzung eines Arzneimittels aus dem Hydrogel hängt weitgehend von der Größe des Arzneimittels. Wie gezeigt, wird das kleine Molekül Medikament sofort freigelassen, während die allmähliche Freisetzung des Modellproteins ab 1 Woche zeigt die Versprechen dieser Hydrogele als Abgabesysteme für Wachstumsfaktoren. Im Allgemeinen sind die Hydrogele versprechender als Abgabewerkzeug für größere Objekte, wie Proteine, Exosomen und Zellen 29,30. Die 3-D-Mapping und elektromechanische Einspritzverfahren bietet eine klinisch validierten katheterbasierte Liefer Ansatz für verschiedene Herzmuskel regenerative Therapien, wie Hydrogele. Die added-Wert dieser Technologie im Vergleich zu anderen nicht-chirurgische Abgabetechniken ist die Planung der Behandlung, so dass es möglich ist, normal ist, und infarzierten Myokard hibernating unterscheiden und Therapien in dem interessierenden Bereich zu führen. Nachteile dieses Ansatzes betreffen die erforderlichen technischen Fähigkeiten und die zeitraubende und kostspieliges Verfahren 20. In der vorliegenden Schweinemodell von Myokardinfarkt elektromechanische Mapping wurde von geführten intramyokardialen Injektionen mit dem bioaktiven supramolekularen UPY-Hydrogel gefolgt. Andere Kombinationen mit regenerativer Therapien wurden in vitro getestet und in vivo zu mehr Erfolg in diesem neuen Gebiet zu erlangen. Außerdem Optimierung Injizierbarkeit und Sterilisationsverfahren haben, um durchgeführt werden, um erfolgreich zu einer klinischen Umgebung zu übersetzen diese Methode.

Obwohl die Behandlung des akuten Myokardinfarkts hat sich deutlich verbessert Überlebensraten, ist die chronische ischämische Herzversagen eine wichtige Problem der öffentlichen Gesundheit, die mit einer alternden Bevölkerung fortschreitet. Es gibt rund 6 Millionen Patienten mit Herzinsuffizienz in den USA mit einem geschätzten 25% ige Erhöhung der Prävalenz im Jahr 2030 1,2. Initial Verlust von Herzmuskelgewebe führt zu kardialen Remodeling und verursacht chronischer Herzinsuffizienz schließlich. Außer für eine Herztransplantation, gibt es keine wirkliche Behandlung für diese Gruppe von Patienten. Der zunehmende Mangel an Spenderherzen unterstreicht die Notwendigkeit, neue Therapien zur Verfügung, um diesen Prozess der Umgestaltung rückgängig zu entwickeln. Daher ist ein Ziel für zukünftige Therapien ist die Regenerierung verloren Myokard. Hydrogele sind interessante Materialien auf dem Gebiet der regenerativen Medizin aufgrund ihrer Biokompatibilität und ihrer Empfindlichkeit gegenüber externen Trigger 3. Injizierbare Hydrogele bieten adVorteile gegenüber nicht-injizierbaren Hydrogele in deren Einsatz in der minimal invasiven Chirurgie 4. Diese injizierbaren Hydrogele können durch eine Spritze aufgrund ihrer Schaltbarkeit im physiologischen Bedingungen 5 aufgebracht werden und im Prinzip erlauben katheterbasierten Injektions nähert 6. Verschiedene Strategien sind für injizierbare Materialien verwendet worden sind, von der chemischen Vernetzung nach der Injektion, um eine physikalische Vernetzung entweder durch Temperatur, pH und scherentzähende Verhalten 4,7,8. Obwohl mehrere Systeme einfach Injizierbarkeit über eine Spritze 9,10 gezeigt, hat die volle Katheter-Kompatibilität nicht oft 6 gezeigt. Hydrogele, die aus supramolekulare Polymere hergestellt werden durch nicht-kovalente Wechselwirkungen, die bequem von einem Gel zu einem Lösungszustand geschaltet werden können und umgekehrt unter Verwendung von Umwelt-Trigger 11 ausgebildet. Darüber hinaus ermöglichen die Gewichts Vorläufer mit niedrigem Molekular für leichte Verarbeitbarkeit 12,13 </sup&gt;. Die milden Bedingungen zum Umschalten kann der Zusatz von verschiedenen biologisch aktiven Komponenten, wie oft schwierig, Wachstumsfaktoren zu behandeln erforderlich. Supramolekulare transienten Netzwerke in Wasser, bezogen auf Poly (ethylenglycol) (PEG), End-modifizierten mit Ureido-pyrimidinon (UPY) -Einheiten 14 haben die Vorteile der nicht-kovalente Wechselwirkungen in Kombination mit biomedizinischen Anwendungen gezeigt und sind als Arzneimittel-Abgabesystem verwendet im Herzen 6 und unter der Nierenkapsel 15. Diese Netze werden durch Dimerisierung der UPY-Gruppen aus der wässrigen Umgebung durch Alkylspacer Bildung einer hydrophoben Tasche abgeschirmt gebildet. Harnstoffwasserstoffbrückenbindung erleichtert anschließende Stapelung dieser Dimere in Nanofasern. Aufgrund der reversiblen Wechselwirkung des UPY-UPY Dimer löst, wie pH und Temperatur können verwendet werden, um aus Lösungen, Gele zu schalten. Die Verwendung eines Kunstmotiv ermöglicht Gestaltung der Molekül und Geleigenschaften von PrüfungsB. tuning Länge der PEG-Ketten und Alkylspacer 14,16. Darüber hinaus können mehrere bioaktive Komponenten durch einfaches Mischen des supra Hydrogelbildner Lösung vor der Injektion mit Medikamenten oder bioaktive Spezies, wie zum Beispiel Wachstumsfaktoren oder Exosomen bzw. eingebracht werden. Exosomen sind kleine Membranbläschen, die Cytosol-Derivate enthalten. Sie werden von vielen Zellen sezerniert und in die interzelluläre Kommunikation beteiligt. Exosomen von Kardiomyozyten-Vorläuferzellen abgeleitet werden vorgeschlagen, um eine Rolle bei Herz-Schutz 17 zu spielen. Hier beschreiben wir das Protokoll der Formulierung und in vivo myokardialen Injektion eines derartigen bioaktiven supra Hydrogel ist. In-vitro-Versuche beschrieben, die auf der Vorhand ein Indiz für Gelstabilität und Wirkstofffreisetzung, die für die Abstimmung des Gels ermöglicht geben und vor dem Trenneigenschaften Anwendung in vivo.

<table><tbody><tr><td>1 M HCl</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M NaOH</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol 24-Well-Platte</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>Amiodaron</td><td>Cordaron I.V. (Sanofini)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anton Paar Physica MCR501</td><td>Anton Paar GmbH</td><td></td><td>Ausgestattet mit einer parallelen Plattengeometrie (25 mm)</td></tr><tr><td>Atropin</td><td>PCH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ballonbeatmungsgerät</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cary 50 Scan UV-Sichtbares Spektralphotometer</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cary Eclipse Fluoreszenz-Spektralphotometer</td><td>Varian</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Defibrillationspflaster</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Biosolve</td><td>44705</td><td></td></tr><tr><td>Endotrachealtubus</td><td>Covidien</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, Ketamin,</td><td>Narketan 10 V&eacute; toquinol</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mapping Katheter 115&nbsp; cm</td><td>Biosense Webster</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midazolam</td><td>Actavis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MilliQ</td><td>MD Milipore MilliQ Integriertes Wasseraufbereitungssystem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>mRuby2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl 0,9% 500&nbsp; cc</td><td>Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOGA geführter Myostar Injektionskatheter</td><td>Biosense Webster</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NOGA-RefStar EFO-Pflaster</td><td>Biosense Webster</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pancuroniumbromid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>VWR</td><td>IKAA3801100</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>PET Millicel</td><td>Millipore</td><td>PIEP12R48</td><td></td></tr><tr><td>Pirfenidon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2116</td><td>Gebraucht ab 100&nbsp; mM Lager in DMSO</td></tr><tr><td>Natriumthiopental</td><td>Inresa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sufentanil</td><td>Sufentanil-Hameln</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tegaderm</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UPy-PEG10k</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV-Lampe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tierarztsalbe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Visipaque Kontrastflüssigkeit 100&nbsp; cc</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

eine injizierbare and drug belasteten supramolekulares hydrogel für lokale catheter injection in die pig herz

An Injectable and Drug-loaded Supramolecular Hydrogel for Local Catheter Injection into the Pig Heart

Regeneration der verlorenen Myokard ist ein wichtiges Ziel für zukünftige Therapien wegen der zunehmenden Auftreten von chronischen ischämischen Herzversagen und dem begrenzten Zugang zu Spenderherzen. Ein Beispiel für eine Behandlung, um die Funktion des Herzens zu gewinnen aus der lokalen Abgabe von Arzneistoffen und bioaktiven Substanzen, aus einem Hydrogel. In dieser Arbeit wird ein Verfahren eingeführt, zu formulieren und zu injizieren, eine wirkstoffbeladene Hydrogel nicht-invasiv und Seitenspezifische in das Schweineherz mit einem langen, flexiblen Katheter. Die Verwendung von 3-D elektro Kartierung und Injektion über einen Katheter ermöglicht seitenspezifischen Behandlung des Herzmuskels. Um ein Hydrogel mit diesem Katheter kompatibel ist, wird ein supramolekulares Hydrogel wegen der günstigen Schalt von einem Gel zu einem Lösungszustand mit Umwelt-Trigger verwendet. Bei einem basischen pH-Wert dieser Ureido-pyrimidinon modifizierten Poly (ethylenglycol) als eine Newtonsche Flüssigkeit, die leicht injiziert werden kann, aber bei einem physiologischen pH-Wert der Lösung schnell schaltet inein Gel. Diese milden Schaltbedingungen erlauben für den Einbau von biologisch aktiven Arzneimitteln und bioaktiven Spezies, wie zum Beispiel Wachstumsfaktoren und Exosomen, wie wir hier sowohl in vitro als auch in vivo gegenwärtig. Die in-vitro-Experimente geben ein auf Vorhand Angabe der Gelstabilität und Wirkstofffreisetzung, die für die Abstimmung des Gels erlaubt und vor der späteren Anwendung in vivo Freisetzungseigenschaften. Diese Kombination ermöglicht die optimale Abstimmung des Gels auf die verwendeten bioaktiven Verbindungen und Spezies und das Einspritzsystem.

Aus den oszillierenden rheologischen Messungen sowohl von der Lösung und dem Gel erhalten Typische Ergebnisse sind in Abbildung 1 dargestellt. Für die Injektion durch einen langen Katheter ist eine Newtonsche Flüssigkeit mit niedriger Viskosität erwünscht. Viskosität wurde als Funktion der Schergeschwindigkeit gemessen wird, zeigt, dass bei pH 8,5 wird die Lösung Scherentzähung aber bei pH 9,0 und 9,5 die Lösungen verhalten sich wie newtonsche Flüssigkeiten, wie durch den konstanten Viskosität von 0,54 und 0,36 Pa · sec belegt, bzw. (1A) . Nach Neutralisation der Proben, die Proben zeigen eine feststoffartige Reaktion von einem Speichermodul G &lt;1 (1B) &#39;, der größer als der Verlustmodul G &quot;und somit einen tan &amp; delta; = G&quot; / G&#39; beobachtet. Das Gel erhält seine Endfestigkeit innerhalb von 30 Minuten. Oszillierenden rheologischen Messungen zeigen eine typische feststoffartige Reaktion mit G &#39;nahezu unabhängig von der Winkelfrequenzuency und G &#39;&gt; G &quot;für alle Frequenzen gemessen (Abbildung 1c). Wesentlich für die Verwendung als Arzneimittelabgabesystem ist die Erosion des Hydrogels über die Zeit. Die supramolekulare Wechselwirkungen sind inhärent dynamisch und ermöglichen eine langsame Erosion des Gels in vitro. Erosion und Freigabe-Experimente werden bei 37 ° C unter Verwendung von porösen und Einlagen (2A und B) durchgeführt. Durch Abstimmung der Länge der hydrophoben und hydrophilen Block 14, ein Gel, das über einen Zeitraum von mehreren Wochen erhalten werden kann (3A) erodiert. Das Gel erodiert 25% in 2 Wochen mit einer anfänglichen Erosion von 10% in den ersten Tag, vermutlich aufgrund anfänglicher Quellung des Hydrogels. Als Beispiel wurde sowohl die Veröffentlichung eines kleines Molekül als Wirkstoff (Pirfenidon), und die Freisetzung von einem Modell fluoreszierende Protein (mRuby2) untersucht. Ein fluoreszierendes Protein Modell ermöglicht eine einfache Anzeige; jedoch in vitro </em&gt; Freisetzungsexperimente können auch auf andere Proteine, unter Verwendung eines ELISA zur Quantifizierung 6 durchgeführt werden. Die Kleinmolekül-Arzneimittel wird in einem Tag freigesetzt, während größere Moleküle wie Proteine ​​allmählich über 1 Woche (3B) freigesetzt. Montage des Freisetzungsprofil mRuby2 bis zu 60% Freisetzung mit dem semi-empirischen Korsmeyer-Peppas Modell zeigt Freisetzung durch Diffusion (n = 0,44) 23. Das Fehlen von ein Versatz in der (angepasst) Korsmeyer-Peppas Modell zeigt, dass es keinen Burst Geschenk für mRuby2 24 Release. Wegen der begrenzten Menge von Datenpunkten mit einem Release niedriger als 60% für Pirfenidon wurde kein passendes zu diesem Freisetzungsprofil durchgeführt. Der Katheter-Navigationssystem besteht aus einer Kommunikationseinheit Konsole eine Arbeitsstation (4), einer dreieckigen Anordnungskissen (Erzeugen eines Nieder Magnetfeld) mit einer externen Referenzzone und zwei Katheter, der sensorbestückten Kartierung identifiziert und die injection Katheter (Abbildung 5). Nach der Post-Processing-Analyse hat instabilen Punkte gefiltert der endokardialen 3D-Rekonstruktion des LV wird in Echtzeit mit dem Erwerb von jedem neuen Datenpunkt aktualisiert und kontinuierlich als unipolare und bipolare Spannungspotentiale auf einem abgestuften Farbskala (6A) angezeigt. Die Funktion lokale lineare Verkürzung (LLS) quantifiziert regionalen Wandbewegung durch Erhalten der durchschnittlichen Änderung des Abstands zwischen Probenstelle und benachbarte Punkte per Ende der Systole und Enddiastole. Die mittlere Spannung und LLS-Werte werden für jedes Segment berechnet und in der Polarkarte. (6B) dargestellt. Das Vorhandensein eines abnormalen oder niedrigen unipolar Potential (≤6 mV) und verschlechterten mechanischen Aktivität (LLS ≤4%) charakterisiert Infarktbereiche 22. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52450/52450fig1highres.jpg"width = &quot;700&quot; /&gt; Figur 1 :. Rheologische Beurteilung der Lösungen und Gelen. (A) Viskosität als Funktion der Schergeschwindigkeit für die Lösungen bei verschiedenen pH. Für die Probe bei pH 8,5 Scherentzähung wird beobachtet, aber bei den Proben bei pH 9,0 und 9,5 konstant Viskositäten erhalten werden, zeigt die Newtonsche Verhalten dieser Lösungen. (B) Härten Gel gefolgt von Auftragen tan δ als Funktion der Zeit. (C) Frequenz-Sweep für eine neutralisierte Probe nach 2 h Aushärtung. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen von 3 unabhängigen Messungen, was auf eine typische Versuchsfehler. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52450/52450fig2highres.jpg" width="600" /> Abb. 2: Einstellung für Abbau und Release-Experimenten (A) Poly (ethylenterephthalat) und mit Parafilm abgedeckt Einsatz, um ein Auslaufen zu verhindern during Vorbereitung. (B) 24-Mulden-Platte mit Einlagen, mit Parafilm eingewickelt, um die Verdampfung des Lösungsmittels zu verhindern. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52450/52450fig3highres.jpg" width="700" /> Abb. 3: Erosion und lassen (A) Erosion des Hydrogels im Laufe der Zeit. Allmähliche Erosion des Gels für mindestens 2 Wochen beobachtet. (B) Veröffentlichung einer kleines Molekül als Wirkstoff und Modellprotein. Während das kleine Molekül in einem Tag freigesetzt wird, das Modellprotein allmählich über eine Woche ohne wesentliche artige Freisetzung freigesetzt. Die Linie zeigt die Passform des Korsmeyer-Peppas Modell auf die Anfangsphase der Freisetzung. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52450/52450fig4highres.jpg" width="600" /> Abbildung 4: Der Katheter-Navigationssystem. </strong&gt; Kommunikationseinheit Konsole mit NOGA XP Cardiac Navigation System. <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52450/52450fig5highres.jpg" width="700" /> Abbildung 5: (A) Das intramyokardialen Injektionskatheter mit Spritze befestigt. (B) Detail der Injektionsnadel. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52450/52450fig6highres.jpg" width="700" /> Abbildung 6: Unipolar Spannung und LLS Karte. (A) Unipolare Karte, LAO Ansicht (oben) und Stierauge (unten). Rote Farbe zeigt niedrigen unipolaren Spannungswerte an Herzmuskelbasis (normal) mit dem Verlust der elektrischen Aktivität posterolateral. Blau zeigt normalem Myokard, während grüne und gelbe Farben zeigen eine verringerte Lebensfähigkeit. (B) LLS Karte, LAO Ansicht (oben) und Stierauge (unten). Rote Farbe indicates Akinese im dorsolateralen Wand, grün und gelb deuten verringerte Wandbewegung. Die Abbildungspunkte sind durch weiße Punkte dargestellt. Der gezogene weiße Linie zeigt den Bereich von Interesse, gekennzeichnet durch verringerte unipolare Spannungen und beeinträchtigt Wandbewegungen. Brown Punkte stellen die Injektionsstellen.

Supramolekulare Hydrogelbildner basierend auf Ureido-Pyrimidinone ermöglicht volle Kontrolle über die makroskopischen Eigenschaften Gel und Sol-Gel-Schaltverhalten mit pH. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Formulierung und Einspritzen eines solchen supramolekularen Hydrogelbildner über ein Kathetersystem für die lokale Zustellung direkt in den relevanten Bereichen in der Schweineherz.

Eine injizierbare and Drug belasteten supramolekulares Hydrogel für Lokale Catheter Injection in die Pig Herz

Regeneration of lost myocardium is an important goal for future therapies because of the increasing occurrence of chronic ischemic heart failure and the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, ein mit einem Wirkstoff beladenes supramolekulares Hydrogel mithilfe eines langen, flexiblen Katheters minimalinvasiv in ein infarziertes Schweineherz zu injizieren. Dies wird erreicht, indem zunächst eine Formulierung aus Hydrogel und dem gewünschten Wirkstoff hergestellt wird. Der zweite Schritt besteht darin, die Eigenschaften des Hydrogels sowie die Freisetzungsrate des Wirkstoffs unter in-vitro-Bedingungen zu untersuchen.Danach wird vier Wochen nach dem Myokardinfarkt mithilfe von Datenpunkten von der endokardialen Oberfläche eine elektromechanische Karte des linken Ventrikels des Schweins erstellt. Anschließend wird das sogenannte hibernierende Myokard für lokale Injektionen mit arzneimittelbeladenem Hydrogel gezielt. Diese praktische Formulierung und Applikationsmethode kann zur Entdeckung neuer Therapien bei Myokardinfarkt und ähnlichen Erkrankungen führen.Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden perkutanen Ansätzen wie der intrakoronaren Effusion liegt erstens in der Katheterapplikation des Hydrogels und zweitens in der Möglichkeit der Behandlungsplanung, die es uns ermöglicht, den Katheter gezielt in den interessierenden Bereich zu führen. Diese Methode kann wesentliche Fragen in der Erforschung und Behandlung des Myokardinfarkts beantworten, beispielsweise potenzielle Vorteile der Injektion eines mechanisch stützenden Materials sowie die Wirksamkeit einer kontinuierlichen lokalen Arzneimittelfreisetzung. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf unsere Therapie des Myokardinfarkts, da die elektromechanische Kartierung die Identifizierung der infarzierten Region ermöglicht und die anschließende gezielte, standortspezifische Injektion des Hydrogels eine lokale Arzneimittelabgabe erlaubt.Im Allgemeinen war bekannt, dass diese Methode Schwierigkeiten bereiten wird, da diese Technik praktische Fähigkeiten mit feinen Bewegungen des Katheters erfordert, während gleichzeitig Stabilitätsparameter überwacht werden. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, sowohl für die Herstellung der Arzneimittel-lastigen IDE-Gele als auch für die anti-injizierende Applikation über einen Katheter, da beides anspruchsvolle Verfahren darstellen, die ohne Erfahrung schwer durchzuführen sind. Zur Vorbereitung wird ein Milliliter eines 10 %igen (Gewicht pro Volumen) Hydrogels formuliert.Lösen Sie zunächst 100 Milligramm Up-Hydrogel in 900 Mikrolitern PBS bei pH 11,7. Falls die Hydrogele zur Injektion in Tiere formuliert sind, sollten alle Schritte unter Handschuhbenutzung durchgeführt werden. Anschließend wird das Hydrogel eine Stunde lang bei 70 Grad Celsius in das PBS eingerührt.Nachdem die Lösung abgekühlt ist, überprüfen Sie den pH-Wert. Er sollte bei etwa neun liegen. Die Lösung ist mehrere Tage lang haltbar.Pipettieren Sie nun die gewünschte Substanz oder das gewünschte Molekül in die Lösung und lassen Sie sie für 10 Minuten rühren, falls das Hydrogel in ein Tier injiziert wird. Schließen Sie die Zubereitung ab, indem Sie die Lösung eine Stunde lang UV-bestrahlen, um sie zu sterilisieren. Der Textprotokollabschnitt beschreibt, wie das Hydrogel analysiert werden kann.Zunächst bereiten Sie einen hängenden Zellkultur-Einsatz aus Kunststoff für eine 24-Loch-Platte vor, indem Sie den Boden mit Parafilm abdecken, um ein Auslaufen zu verhindern. Anschließend geben Sie 100 µL der vorbereiteten viskosen Lösung in den Einsatz und fügen unverzüglich 1,4 µL einmolarer Salzsäure hinzu. Der pH-Wert sinkt auf einen neutralen Wert, und innerhalb von 30 Minuten härtet das Hydrogel aus.Entfernen Sie nun die Parafolie und geben Sie die Inserts in eine Mehrfachbrunnenplatte. Füllen Sie die leeren Brunnen mit 800 µL PBS bei pH 7,4 und versiegeln Sie die Platte mit Parafilm, um die Verdunstung zu reduzieren. Inkubieren Sie die Platten anschließend bei 37 °C unter leichtem Rühren. Ersetzen Sie den PBS regelmäßig und analysieren Sie den entfernten PBS auf freigesetzte Verbindungen infolge der Hydrogelerosion und Arzneimittelfreisetzung.Dr. Ton, der in Zürich als interventioneller Kardiologe tätig ist, wird das Verfahren demonstrieren. Vier Wochen nach der Induktion eines Myokardinfarkts planen Sie die elektromechanische Mapping-Prozedur und richten das System im Katheterlabor ein. Bringen Sie zunächst den externen Referenzpatch auf dem Rücken des anästhesierten Schweins an und sichern Sie anschließend über die Femoralarterie einen vaskulären Zugang gemäß dem Standardprotokoll.Um die elektromechanische Karte der LV-Endokardoberfläche zu erstellen, verwenden Sie eine elektromagnetische Energiequelle mit extrem niedrigem Magnetfeld und einen Katheter mit Sensorspitze. Verwenden Sie anschließend einen Perfusionsinjektor, um ein biplanares linksventrikuläres Angiogramm in der rechtsanterioren schrägen Ansicht mit 25 Grad und der linksanterioren schrägen Ansicht mit 40 Grad anzufertigen. Nutzen Sie diese Ansichten, um die Größe des LV abzuschätzen.Geben Sie dem Tier nun 75 Einheiten pro Kilogramm Heparin. Führen Sie dann unter fluroskopischer Kontrolle einen nummer acht französischen Mapping-Katheter über die Aorta descendens, den Aortenbogen und die Aortenklappe in das linke Ventrikel vor. Der Katheter kann eine D- oder F-Kurve aufweisen.Dann orientieren Sie die Spitze des Katheters an der Spitze des linken Ventrikels aus. Um die ersten Daten zu gewinnen, setzen Sie die Datensammlung am Ausflusstrakt, an lateralen und posterioren Punkten fort, um eine 3D-Silhouette zu erstellen, die die Grenzen des Ventrikels definiert. Ziehen Sie anschließend den Mappingskatheter über das Endokard und nacheinander.Erwerben Sie die Position der Spitze, während sie mit dem Endokard in Kontakt steht. Sammeln Sie schließlich Daten aus allen endokardialen Segmenten. Entfernen Sie anschließend den Mapping-Katheter unter Verwendung der Daten.Definieren Sie den Zielbereich. Dieser Bereich weist eine nahezu normale elektrische Aktivität und eine eingeschränkte mechanische Bewegung auf. Das sogenannte hibernierende Myokard für die intramyokardiale Injektion.Planen Sie die Verwendung eines Injektionskatheters, der aus einer Nadel mit 27 Gauge und einem Kernlumen in einem achtfranzigen Katheter besteht, um definierte Mengen zu applizieren. Verwenden Sie eine Lotus-Spritze mit etwa einem Milliliter der Hydrogellösung und platzieren Sie sie in einer Spritzenpumpe, um sicherzustellen, dass die myokardiale Wand nicht von der Nadel durchstoßen wird. Die Anpassungen erfolgen entsprechend der minimalen Wanddicke des Ventrikels, gemessen in einem aktuellen Echokardiogramm.Stellen Sie die Nadelausdehnung auf null Grad und auf 90 Grad ein. Füllen Sie dann den Totraum im System mit der Hydrogellösung. Bringen Sie anschließend die Injektionskatheterspitze über die Aortenklappe hinweg in den Zielbereich, um die ersten Injektionskriterien zu erfüllen.Das bedeutet die Senkrechtstellung des Katheters zur LV-Wand. Zweitens muss er eine hervorragende Loop-Stabilität aufweisen, wie sie vom EMM-System berechnet wird. Drittens muss der Zielbereich eine zugrundeliegende Spannung von mindestens 6,9 Millivolt aufweisen.Wenn diese Kriterien erfüllt sind, führen Sie die Nadel in den Myokardgewebe vor. Überprüfen Sie nun ein viertes Kriterium. Es muss eine vorzeitige ventrikuläre Kontraktion des linken Ventrikels auftreten.Unter Einhaltung aller Kriterien 0,1 bis 0,3 Milliliter des Hydrogels mit konstanter Geschwindigkeit injizieren. Die Injektion an sechs bis zehn unterschiedlichen, möglichst diffus verteilten Positionen wiederholen, damit das Hydrogel als Arzneimittelabgabesystem fungieren kann. Es muss ein allmählicher Abbau erfolgen, wobei die Freisetzung eines kleinen Wirkstoffs, Pirfenidon, sowie eines fluoreszierenden Proteins und Rubin zwei untersucht wurden.In vitro wurde das kleine Molekül innerhalb eines Tages freigesetzt, während größere Moleküle wie M ruby zwei über eine Woche hinweg freigesetzt wurden. Es zeigte sich keine offensichtliche Burst-Freisetzung großer Moleküle, um die Zielregion für die Arzneimittelinjektion zu lokalisieren. Zur Erstellung einer Rekonstruktion des linken Ventrikels kam eine Echtzeit-3D-Kartierung des Myokards zum Einsatz.Es wird kontinuierlich als Spannungspotentiale auf einer gestuften Farbskala dargestellt, die anschließend an die ausgewählte Schwelle angepasst wird. Die lokale lineare Verk&uuml;rzung oder LLS-Funktion quantifiziert die regionale Wandbewegung, indem die durchschnittliche &Auml;nderung des Abstands zwischen der Messstelle und benachbarten Punkten in der Systole und am Ende der Diastole ermittelt wird. Diese Werte werden dann f&uuml;r jedes Segment berechnet und in der Polarkarte dargestellt.Infarzierte Bereiche zeichnen sich durch eine beeinträchtigte mechanische Empfindlichkeit aus oder weisen einen LLS-Wert unter 4 % auf, und sie sind durch abnormale oder niedrige unipolare Potentiale gekennzeichnet, die weniger als sechs Millivolt betragen. Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in eineinhalb bis zwei Stunden durchgeführt werden. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, es sorgfältig zu planen und ein Team erfahrener Personen zu haben. Nach diesem Verfahren können Variationen in der Behandlung implementiert werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie beispielsweise die optimale Hydrogel-Formulierung, die gewünschte Freisetzungsrate von Wirkstoffen und die Wirksamkeit verschiedener Arten von Medikamenten.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein arzneimittelbeladenes supramolekulares Hydrogel formuliert, und wie man die elektromechanische Kartierung sowie die intramyokardiale Injektionsverfahren sorgfältig plant und durchführt. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Labor­tieren wie Schweinen eine Genehmigung durch den Versuchsausschuss erfordert und gemäß den örtlichen Tierschutz­vorschriften durchgeführt werden sollte.

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Bioengineering

Biotechnik

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Verabreichung kardioaktiver Therapeutika in einem Schweine-Myokardinfarkt-Modell

Dieser Artikel beschreibt ein optimiertes Protokoll für echokardiographiegesteuerte intramyokardiale Injektionen in Rattenmodellen für Myokardinfarkt mit einer 29 G x 88 mm Nadel. Diese Technik gewährleistet eine robuste, präzise und reproduzierbare Verabreichung von Therapeutika direkt in die Periinfarktzone.

Echokardiographie-gesteuerte Injektion zur gezielten und zuverlässigen intramyokardialen Stammzellabgabe in einem Rattenmodell für Myokardinfarkt

Erfahren Sie die minimal-invasive Injektion eines arzneibehandelten supramolekularen Hydrogels in ein infarktiertes Schweineherz mittels Katheter. Diese Methode ermöglicht kontrollierte lokale Wirkstofffreisetzung und neue Therapieansätze für Myokardinfarkte.

Eine injizierbare and Drug belasteten supramolekulares Hydrogel für Lokale Catheter Injection in die Pig Herz

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