Name: Eine vergleichende Analyse der Expression rekombinanter Proteine in verschiedenen Biofabrik: Bakterien, Insektenzellen und Pflanzensysteme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Lernen Sie die vergleichende Analyse rekombinanter Proteinexpression in Bakterien, Insektenzellen und Pflanzensystemen. Diese Methode zeigt Vor- und Nachteile verschiedener Produktionsplattformen auf.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch die COST-Aktion 'Molekulares Pharming: Pflanzen als Produktionsplattform für hochwertige Proteine' FA0804. Die Autoren danken Dr. Anatoli Giritch und Prof. Yuri Gleba für die Bereitstellung der MagnICON-Vektoren für Forschungszwecke.

<ol><li>Hampe, C. S., Hammerle, L. P., Falorni, A., Robertson, J., Lernmark, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+of+K396R+of+the+65+kDa+glutamic+acid+decarboxylase+active+site+obliterates+enzyme+activity+but+not+antibody+binding%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis of K396R of the 65 kDa glutamic acid decarboxylase active site obliterates enzyme activity but not antibody binding.</a> FEBS Lett. 488 (3), 185-189 (2001).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+human+GAD65+accumulates+to+high+levels+in+transgenic+tobacco+plants+when+expressed+as+an+enzymatically+inactive+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Recombinant human GAD65 accumulates to high levels in transgenic tobacco plants when expressed as an enzymatically inactive mutant.</a> Plant Biotechnol. J. 9 (8), 862-872 (2010).</li>
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<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+different+biofactories+for+the+production+of+a+major+diabetes+autoantigen%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of different biofactories for the production of a major diabetes autoantigen.</a> Transgenic Res. 23, 281-291 (2014).</li>
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<li>Hunt, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+gene+to+protein%3A+a+review+of+new+and+enabling+technologies+for+multi-parallel+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expr.+Purif%22%5BJournal%5D)">From gene to protein: a review of new and enabling technologies for multi-parallel protein expression.</a> Protein Expr. Purif. 40 (1), 1-22 (2005).</li>
<li>Arzola, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transient+co-expression+of+post-transcriptional+silencing+suppressor+for+increased+in+planta+expression+of+a+recombinant+anthrax+receptor+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Sci%22%5BJournal%5D)">Transient co-expression of post-transcriptional silencing suppressor for increased in planta expression of a recombinant anthrax receptor fusion protein.</a> Int. J. Mol. Sci. 12 (8), 4975-4990 (2011).</li>
<li>Merlin, M., Gecchele, E., Capaldi, S., Pezzotti, M., Avesani, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+evaluation+of+recombinant+protein+production+in+different+biofactories%3A+the+green+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Comparative evaluation of recombinant protein production in different biofactories: the green perspective.</a> Biomed. Res. Int. 2014, 136419(2014).</li>
<li>Avesani, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+in+planta+expression+of+the+human+islet+autoantigen+glutamic+acid+decarboxylase+%28GAD65%29%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Improved in planta expression of the human islet autoantigen glutamic acid decarboxylase (GAD65).</a> Transgenic Res. 12 (2), 203-212 (2003).</li>
<li>Leuzinger, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+agroinfiltration+of+Plants+for+high-level+transient+expression+of+recombinant+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient agroinfiltration of Plants for high-level transient expression of recombinant proteins.</a> J Vis Exp. (77), (2013).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass bei der Veröffentlichung dieser Arbeit kein Interessenkonflikt besteht.

Bakterienzellen, Baculovirus / Insektenzellen und Pflanzen: In dieser Studie wurden drei verschiedene Plattformen für die Expression eines rekombinanten humanen Proteins verglichen. (- MagnICON und pK7WG2 basiert - und stabile dh transient) Die Anlage-basierte Plattform wurde durch die Nutzung von drei weit verbreitete Ausdruck Technologien erforscht. Der für dieses Experiment, hGAD65mut, ausgewählten Zielproteins wurde zuvor in verschiedenen Systemen 13 zum Ausdruck gebracht, und seine Herstellung u...

Rekombinante Proteine werden kommerziell in heterologen Expressionssystemen mit Hilfe neuer biotechnologischer Werkzeuge in Massenproduktion hergestellt. Zu den Schlüsselfaktoren, die bei der Auswahl des heterologen Expressionssystems berücksichtigt werden müssen, gehören: Proteinqualität, Funktionalität, Prozessgeschwindigkeit, Ausbeute und Kosten.
Im Bereich der rekombinanten Proteine expandiert der Markt für Pharmazeutika schnell und folglich sind die meisten heute hergestellten Biopharmazeutika rekombinant. Proteine können in Zellkulturen von Bakterien, Hefen, Schimmelpilzen, Säugetieren, Pflanzen und Insekten sowie in pflanzlichen Systemen (entweder über stabile oder transiente Transformation) und transgenen Tieren exprimiert werden; Jedes Expressionssystem hat seine inhärenten Vorteile und Grenzen, und für jedes rekombinante Zielprotein muss das optimale Produktionssystem sorgfältig evaluiert werden.
Pflanzliche Plattformen entstehen als wichtige Alternative zu herkömmlichen fermenterbasierten Systemen für eine sichere und kostengünstige rekombinante Proteinproduktion. Obwohl die Kosten für die nachgelagerte Verarbeitung mit denen von mikrobiellen Zellen und Säugetierzellen vergleichbar sind, sind die geringeren Vorabinvestitionen, die für die kommerzielle Produktion in Pflanzen erforderlich sind, und die potenziellen Skaleneffekte, die durch den großflächigen Anbau erzielt werden, entscheidende Vorteile.
Wir untersuchten Pflanzen als Bioreaktoren für die Expression der 65 kDa-Isoform der humanen Glutaminsäure-Decarboxylase (hGAD65), eines der wichtigsten Autoantigene bei Typ-1-Autoimmundiabetes (T1D). hGAD65 wird weitgehend als Marker verwendet, sowohl zur Klassifizierung als auch zur Überwachung des Fortschreitens der Krankheit, und seine Rolle bei der T1D-Prävention wird derzeit in klinischen Studien untersucht. Wenn diese Versuche erfolgreich verlaufen, wird die weltweite Nachfrage nach rekombinantem hGAD65 drastisch steigen.
Hier konzentrieren wir uns auf die Expression des enzymatisch inaktiven Gegenstücks von hGAD65, hGAD65mut, einer Mutante, die durch Substitution des Lysinrests, der den Cofaktor PLP (Pyridoxal-5'-phosphat) bindet, mit einem Argininrest (K396R)1 erzeugt wird.
hGAD65mut behält seine Immunogenität bei und reichert sich in Pflanzen- und Insektenzellen bis zu zehnmal höher an als hGAD65, sein Wildtyp-Gegenstück. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die enzymatische Aktivität von hGAD65 in den Stoffwechsel der Pflanzenzellen so stark eingreift, dass es seine eigene Synthese unterdrückt, während hGAD65mut, die enzymatisch inaktive Form, in Pflanzenzellen auf einem höheren Niveau akkumuliert werden kann.
Für die Expression von hGAD65mut wurde hier der Einsatz verschiedener Technologien, die in der Pflanzenbiotechnologie weit verbreitet sind, untersucht und mit traditionellen Expressionsplattformen (Escherichia coli und Baculovirus/Insektenzell-basiert) verglichen.
In dieser Arbeit wurden die rekombinanten Plattformen, die für die Expression von hGAD65mut entwickelt wurden und traditionelle und pflanzliche Systeme umfassen, auf der Grundlage von Prozessgeschwindigkeit und -ausbeute sowie der Qualität und Funktionalität des Endprodukts überprüft und verglichen.

<table><tbody><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Sigma</td><td>Y1333</td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>Formedium</td><td>TRP03</td><td></td></tr><tr><td>Agar Bakteriologische Qualität</td><td>Applichem</td><td>A0949</td><td></td></tr><tr><td>Sf-900 II SFM Medium</td><td>Gibco</td><td>10902-088</td><td></td></tr><tr><td>Grace' s Insektenmedium, unergänzt</td><td>Gibco</td><td>11595-030</td><td></td></tr><tr><td>Cellfectin II Reagenz</td><td>Invitrogen</td><td>10362-100</td><td></td></tr><tr><td>MS Medium mit Vitaminen</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0222</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>Pflanzenagar</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>P1001</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin-Natrium</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>A0104</td><td>Toxisches</td></tr><tr><td>Gentamycinsulfat</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G0124</td><td>Toxisches</td></tr><tr><td>Ganciclovir</td><td>Invitrogen</td><td>I2562-023</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin-Dinatrium</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C0109</td><td>Toxisches</td></tr><tr><td>Kanamycinsulfat</td><td>Sigma</td><td>K4000</td><td>Toxisches</td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>R0146</td><td>Giftig & ndash; 25 mg/ml Bestand an DMSO</td></tr><tr><td>Streptomycinsulfat</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0148</td><td></td></tr><tr><td>Toxisches Spectinomycin-Dihydrochlorid</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0188</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (Isopropil-&beta;-D-1-Tiogalattopiranosid)</td><td>Sigma</td><td>I5502</td><td>Toxisches</td></tr><tr><td>MES-Hydrat</td><td>Sigma</td><td>M8250</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Biochemisch</td><td>436994U</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringon</td><td>Sigma</td><td>D134406</td><td>Toxisch &ndash; 0,1 M Vorrat in DMSO-Spritze</td></tr><tr><td>(1 ml)</td><td>Terumo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Fluka</td><td>63136</td><td></td></tr><tr><td>BAP (6-Benzylaminopurin)</td><td>Sigma</td><td>B3408</td><td>Toxisch</td></tr><tr><td>NAA (Naphtalinessigsäure)</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>N0903</td><td>Reizstoff</td></tr><tr><td>Cefotaxim</td><td>Mylan Generika</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Passen Sie den pH-Wert mit 1 N HCl an, um Tris-HCl Puffer</td></tr><tr><td>HCl</td><td>herzustellen Sigma</td><td>H1758</td><td>Corrosive</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>1 M Lager</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S7907</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid)</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td>Ätzender,</td></tr><tr><td>giftiger Harnstoff</td><td>Sigma</td><td>U5378</td><td></td></tr>&<tr><td>beta;-mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>giftiges</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P5927</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Dithiothreitol)</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td>Giftig &ndash; 1 M Lagerbestand, lagern bei -20 &de; C</td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>C1374</td><td>Toxischer</td></tr><tr><td>pflanzlicher Proteasehemmer-Cocktail</td><td>Sigma</td><td>P9599</td><td>Nicht zu oft einfrieren/auftauen</td></tr><tr><td>SDS (Natriumdodecylsulfat)</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td>Entzündlich, giftig, ätzend &ndash; 10% Lagerbestand</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Brillantblau R-250</td><td>Sigma</td><td>B7920</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Sigma</td><td>24137</td><td>Entzündliche</td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Sigma</td><td>27221</td><td>Ätzende</td></tr><tr><td>Anti-Glutaminsäure-Decarboxylase 65/67</td><td>Sigma</td><td>G5163</td><td>Nicht zu oft einfrieren/auftauen</td></tr><tr><td>Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierter Anti-Kaninchen-Antikörper</td><td>Sigma</td><td>A6154</td><td>Nicht zu oft einfrieren/auftauen</td></tr><tr><td>Sf9-Zellen</td><td>Leben Technologien</td><td>11496</td><td></td></tr><tr><td>BL21 Kompetent E. coli</td><td>New England Biolabs</td><td>C2530H</td><td></td></tr><tr><td>Protein A Sepharose</td><td>Sigma</td><td>P2545</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturplatten</td><td>Sigma</td><td>CLS3516</td><td></td></tr><tr><td>Radio Immuno Assay Kit</td><td>Techno Genetics</td><td>12650805</td><td>Radioaktives Material</td></tr></tbody></table>

eine vergleichende analyse der expression rekombinanter proteine ​​in verschiedenen biofabrik: bakterien, insektenzellen und pflanzensysteme

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Pflanzliche Systeme sind als wertvolle Plattform für die Produktion rekombinanter Proteine ​​als Ergebnis ihrer gut dokumentierten Potential für die flexible und kostengünstige Herstellung von qualitativ hochwertigen, bioaktive Produkte. In dieser Studie verglichen wir die Expression eines Ziel humanen rekombinanten Protein in herkömmlichen Fermenter basierenden Zellkulturen (Bakterien und Insekten) mit pflanzlichen Expressionssysteme, sowohl transient und stabil. Für jede Plattform beschrieben wir den Aufbau, die Optimierung und die Länge der Herstellungsverfahren, der Endproduktqualität und der Ausbeute und wir geprüft vorläufigen Herstellungskosten, die spezifisch für das ausgewählte rekombinante Zielprotein fusionieren. Insgesamt zeigen unsere Ergebnisse, dass die Bakterien zur Produktion des Zielproteins ungeeignet aufgrund ihrer Akkumulation in unlöslichen Einschlusskörpern. Andererseits sind Pflanzenbasierte Systeme flexiblen Plattformen tKappe ermöglichen die Produktion des ausgewählten Proteins zu niedrigeren Kosten als die Baculovirus / Insektenzellsystem. Insbesondere angezeigten stabilen transgenen Linien die höchste Ausbeute des Endproduktes und vorübergehend exprimierenden Pflanzen der schnellste Prozessentwicklung. Allerdings können nicht alle rekombinanten Proteinen aus pflanzlichen Systemen profitieren, aber die beste Produktionsplattform sollte empirisch mit einer Fall-zu-Fall-Ansatz bestimmt werden kann, wie hier beschrieben.

Eine Versuchsanordnung für die heterologe Expression eines rekombinanten Zielproteins in verschiedenen Produktionssystemen wird hier beschrieben. Der erste Schwerpunkt war der Aufbau der verschiedenen Plattformen durch Festlegung der optimalen Bedingungen für die Expression des Zielproteins in jedem System. Die Expression des Target-Proteins, hGAD65mut, wurde dreifach induzierten E. coli-Kulturen. Nach 3 h der Expression bei 37 ° C wurden die Bakterienzellen durch Zentrifugation ges...

In dieser Studie wurde die Expression eines humanen rekombinanten Zielproteins in verschiedenen Produktionsplattformen verglichen. Wir konzentrierten uns auf traditionelle fermenterbasierte Kulturen und auf Pflanzen, beschrieben den Aufbau jedes Systems und hoben auf der Grundlage der berichteten Ergebnisse die inhärenten Grenzen und Vorteile für jede Plattform hervor.

Eine vergleichende Analyse der Expression rekombinanter Proteine ​​in verschiedenen Biofabrik: Bakterien, Insektenzellen und Pflanzensysteme

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

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