Die Selbstorganisation von Complex zweidimensionale Formen von Einzelstrang-DNA-Fliesen

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, komplexe DNA-Nanostrukturen mit einzelsträngigen Kacheln zu bilden. Dies wird erreicht, indem sorgfältig gestaltete synthetische DNA-Stränge in der gewünschten Pufferlösung gemischt werden, um in einem zweiten Schritt die gewünschte DNA-Nanostruktur zu bilden. Bei der Probe handelt es sich um ein Knie, bei dem die Selbstorganisation der Struktur stattfindet.

Anschließend werden eine native Agros-Gelelektrophorese und Rasterkraftmikroskopie durchgeführt, um die erfolgreiche Bildung der Nanostrukturen zu überprüfen. Die Ergebnisse zeigen, dass DNA-Nanostrukturen auf der Grundlage von nativem Agros, Gelelektrophorese und Rasterkraftmikroskopie selbstorganisiert sind. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da die Probenvorbereitung einer solchen Selbstorganisation kompliziert zu sein scheint: Vor Beginn dieses Verfahrens erhielten sie DNA-Komponentenstränge bestimmter Sequenzen, die in RNAs gelöst waren, freies Wasser von einem Oligonukleotidhersteller in Vbo, 96-Well-Platten, pipetierten einen Mikroliter aus jeder der 362 Vertiefungen für die 24 Helices um 28 Umdrehungen.

Rechteck 100 Mikromolar pro Strang in ein zwei Milliliter Reagenzglas geben. Geben Sie dann 138 Mikroliter destilliertes deionisiertes Wasser in das Reagenzglas, um eine Stammlösung herzustellen. Bei einer Konzentration von 200 Nanomolaren pro Strang.

Sie 50 Mikroliter der 200 anomolaren Stammlösung, 10 Mikroliter 10 x Glühpuffer A und 40 Mikroliter destilliertes deionisiertes Wasser in ein 0,2 Milliliter PCR-Röhrchen. Anschließend wird die Probe 17 Stunden lang in einem Thermocycler von 90 auf 25 Grad Celsius abgekühlt.

Nachdem Sie ein natives 2%iges Agros-Gel hergestellt haben, das mit SYBR safe vorgefärbt ist, lassen Sie es zwei Stunden lang bei 100 Volt in einem Eiswasserbad laufen. Wenn das Gel mit einem Gelscanner mit einem geeigneten Filter für den SYBR-sicheren Fleck auf einem blauen Licht abgebildet ist, schneidet der Transluminator die dominante Bande mit ähnlicher Beweglichkeit wie die Bande von 1.500 Basenpaaren der einen Kilobase-DNA-Leiter mit einer scharfen, sauberen Rasierklinge heraus. Legen Sie die gewünschten Gelstücke in eine Spin-Säule und zerkleinern Sie das Gel dann mit einem Mikroröhrchen in feine Stücke, und zentrifugieren Sie dann bei 438 G für drei Minuten bei vier Grad Celsius.

Nach der Zentrifugation. Messen Sie die Konzentration der DNA mit einem Ultraviolett-Spektralphotometer bei 260 Nanometern. Ziehen Sie an dieser Stelle die MICA, die an einer Metallscheibe befestigt ist, mit Klebeband ab, um eine ebene Oberfläche zu erhalten, und legen Sie eine Probenscheibe auf den Bildgebungstisch des Mikroskops.

Geben Sie 40 Mikroliter von einem x und einem knienden Puffer A, gefolgt von fünf Mikrolitern der gereinigten Probe der 24 HELOCs durch 28 Umdrehungen Rechteck auf die frisch gespaltene Micah-Oberfläche. Lassen Sie die Mischung etwa zwei Minuten lang absetzen. Installieren Sie einen A FM-Siliziumnitrit-Cantilever-Chip auf einem Cantilever-Halter, bilden Sie die Probe im Flüssigkeitsabstichmodus mit einer Scangröße von zwei Mikrometern und 1024 Zeilen für die Auflösung ab.

Und eine Abtastrate von 0,5 bis 1 Hertz für die interne Markierung, die an drei Primzahl-17-Nukleotidsegmente an acht interne Kacheln und sechs Grenzkacheln des Rechtecks angehängt ist. Mischen Sie die 28 Stränge mit Griffen mit den restlichen Komponentensträngen der 24 HELOCs durch ein Rechteck von 28 Umdrehungen, um eine 200 NANOMOLAR Stammlösung für die Grenzmarkierung herzustellen. Mischen Sie die 14 Stränge mit Griffen mit den restlichen Strängen der Komponenten der 24 Fersenmeere um 28 Umdrehungen Rechteck, um eine 200 Nanomolar Stammlösung für die interne Etikettierung zu erhalten.

Für die Grenzmarkierung geben Sie 50 Mikroliter der 200 Nanomolaren Stammlösung, 60 Mikroliter der 100 Mikromolaren Biotin-modifizierten Anti-Handle-Stränge. 10 Mikroliter 10 x Annealing-Puffer A und 34 Mikroliter destilliertes deionisiertes Wasser in das PCR-Reagenzglas A.

Für die interne Markierung fügen Sie 50 Mikroliter der 200 nanomolaren Stammlösung hinzu. Drei Mikroliter des internen Anti-Handle-Biotin-modifizierten Strangs bei 100 Mikromolaren. 10 Mikroliter 10 x Glühpuffer A und 37 Mikroliter destilliertes deionisiertes Wasser in ein PCR-Reagenzglas geben.

Wiegen Sie anschließend 0,06 Gramm Urinalformiat in drei Millilitern destilliertem Wasser. Zur Herstellung einer 2%igen wässrigen Urinalformiat-Fleckenlösung filtrieren Sie die Fleckenlösung mit einem 0,2-Mikroliter-Filter, der an der Spritze befestigt ist. Geben Sie fünf Mikroliter von fünf normalem Natriumhydroxid zu einem Milliliter der gefilterten Fleckenlösung.

Nach kurzem Vortexen die Lösung bei 20.000 G Glühen zentrifugieren. Entleeren Sie die kohlenstoffbeschichteten Gitter mit der beschichteten Seite nach oben mit den folgenden Einstellungen: Wenn Sie fertig sind, pipettieren Sie 3,5 Mikroliter Probe auf das mit Glimmentladung behandelte Gitter. Nach vier Minuten wird die Probe mit einem Stück Filterpapier abgesaugt, indem man das Filterpapier von der Seite mit dem Gitter in Kontakt bringt.

Anschließend sofort 3,5 Mikroliter der Fleckenlösung auf den Rost geben. Nach einer Minute den Fleck abwischen und das Filterpapier ein bis zwei Minuten lang gegen das Gitter halten. Übertragen Sie das Gitter in einen TEM-Probenhalter.

Ein Bild mit A-J-E-O-L GM 1400, betrieben bei 80 Kilovolt mit einer Vergrößerung von 10 K bis 80 K.Sobald die Form identifiziert wurde, wählen Sie die Stränge aus, die der Form auf der molekularen Leinwand entsprechen. Ersetzen Sie die exponierte Domäne durch ein Poly-T-Segment mit einer Länge von 10 bis 11 Nukleotiden oder fügen Sie einen Kantenschutz hinzu, der komplementär zur exponierten Domäne ist, und beenden Sie es mit einem 10 bis 11 Nukleotiden langen Poly-T-Segment. Um eine Aggregation zu verhindern, erstellen Sie eine Strangbibliothek für die molekulare Leinwand mit 310 Pixeln, die das Korsett enthält.

Set mit einem Stern, Set mit zwei Sternen, Set mit drei Sternen und Set mit vier Sternen, was insgesamt 1.344 Kantenschutz ergibt. Nachdem Sie die 96-Well-Platten für die verschiedenen Sets zentrifugiert haben, pipettieren Sie einen Mikroliter von 206 Strängen aus dem Core-Set, Null aus dem Set, einen Stern Null aus dem Set, zwei Stern Null aus dem Set, drei Sterne und 24 Stränge aus Set vier Stern in ein Zentrifugenröhrchen mit zwei Millilitern. Geben Sie 20 Mikroliter destilliertes deionisiertes Wasser in das Röhrchen, um eine 400 nanomolare Stammlösung der DNA-Stränge herzustellen.

Als nächstes geben Sie 50 Mikroliter der 400 nanomolaren Stammlösung, 10 Mikroliter 10 x Glühpuffer B und 40 Mikroliter destilliertes deionisiertes Wasser in ein 0,2 Milliliter PCR-Röhrchen und halten das Gemisch 17 Stunden lang im Thermocycler, wie zuvor beschrieben. Nach der Reinigung der Probe und der Messung des DNA-Konzentrationsbildes konstruiert die Probe mit einem FM auf die gleiche Weise wie zuvor vier schließlich unterschiedlich große Rechtecke, indem einfach die Anzahl der parallelen Heoc und die Anzahl der spiralförmigen Windungen geändert wird.

Die Selbstorganisation von einzelsträngigen Kacheln ergibt 24 HELOCs mal 28 Windungen Rechteck-DNA-Sequenzen für die verschiedenen einzelsträngigen Kacheln können modifiziert und optimiert werden, um die Streptokokkenteilung und -markierung der Umwandlung eines Rechtecks in eine Röhre zu ermöglichen. Die programmierbare Selbstorganisation von einzelsträngigen Kacheln zur Bildung von Rohren und Rechtecken unterschiedlicher Größe und die Konstruktion zweidimensionaler beliebiger Formen unter Verwendung des molekularen Canvas-Domänensubstitutionsdesigns und des Kantenschutzdesigns wurden als Lösungen für die Aggregation entlang exponierter Domänen beliebiger Formen getestet. Beide Designs haben eine vergleichbare Gelausbeute und strukturelle Integrität, aber das Kantenschutzdesign ist kostengünstiger, da weniger Hilfsstoffe benötigt werden.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man komplexe DNA-Nanostrukturen auf der Basis von Einzelstrangkacheln herstellt.