Name: Die Selbstorganisation von Complex zweidimensionale Formen von Einzelstrang-DNA-Fliesen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Erfahren Sie die Selbstassemblierung komplexer DNA-Nanostrukturen mit Einzelstrang-DNA-Fliesen. Diese Methode nutzt Gelelektrophorese und Rasterkraftmikroskopie zur Verifikation und hilft Forschern bei der reproduzierbaren Herstellung.

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Diese Arbeit wurde durch das Office of Naval Research Young Investigator Programm Auszeichnung N000141110914, Office of Naval Research Grant N000141010827, NSF Career Award CCF1054898, NIH Direktor Neue Innovator Award 1DP2OD007292 und Wyss Institut für biologisch inspirierte Wesen Fakultät Gründerfonds (bis PY) finanziert und Tsinghua-Peking Center for Life Sciences Gründerfonds (BW).

1. DNA Reihenfolgen-Entwurf <ol><li> Verwenden UNIQUIMER Software 27 einen SST-finite Struktur durch die Angabe der Anzahl der Doppelhelix, Längen von oben und unten Helix für jede Doppelhelix und die Crossover-Muster, um ein 24H × 28T Leinwand erstellen zu entwerfen. Nach der Definition dieser Parameter wird die Gesamtarchitektur (Strang-Zusammensetzung und die Komplementarität Anordnung) graphisch im Programm veranschaulicht. </li><li> Erzeugen eine Folge für die Stränge der angegebenen Struktur, um die Komplementarität Anordnung und zusätzliche Anforderungen (falls vorhanden) zu erfüllen. Design-DNA-Sequenzen durch die Minimierung der Sequenzsymmetrie 28 (für die meisten Strukturen). <ol><li> Erzeugen Nukleotide (A, C, G und T) nach dem Zufallsprinzip einer nach dem anderen. </li><li> Spiel Nukleotide komplementär zu denen erzeugt nach dem Basenpaarungsregel: von A bis T und umgekehrt; C bis G und umgekehrt. </li><li> Verwenden Sie keine sich wiederholenden Segmenten über acht oder neun Nukleotiden. Wenn solche repEssen Segmente bei der Konstruktion entstehen, mutieren die zuletzt erzeugten Nukleotide, bis der sich wiederholenden Segmenten Anforderung erfüllt ist. </li><li> Verwenden Sie keine vier aufeinander folgenden A, C, G oder T-Basen. </li><li> Verwenden vorgegebenen Nukleotide an den einzelsträngigen Anlenkpunkte (zum Beispiel T und G wie die einundzwanzigsten und zweiundzwanzigsten Nukleotiden, jeweils für die meisten der Stränge), um zu vermeiden Gleitunterlagen um die Anlenkpunkte (beispielsweise, wenn sowohl einundzwanzigste und zweiundzwanzigste Nukleotide T, es möglich war, das einundzwanzigste Nucleotid an das Nukleotid bindet, dass der zweiundzwanzigsten Nukleotid soll, zu binden). </li></ol></li><li> DNA-Sequenzen zu modifizieren manuell Streptavidin Kennzeichnung, die Transformation von Rechtecken in Röhrchen, die Bildung von verschiedenen Rechtecken und Röhren in verschiedenen Maßstäben und die Aggregation durch freiliegende Bereiche auf SST verhindern. <ol><li> Ersetzen Sie die freiliegenden Bereiche auf der Grenze des Molekular Leinwand mit Poly-T-tracts. </li><li> Für Streptavidin Kennzeichnung, entwerfen die Griffsegmente (das zusätzliche Segment mit dem Bauteil-Strang, der mit einem komplementären Gegenstück wie einem Anti-handle Stranges binden können angehängt), so dass sie eine Anti-handle Strang mit 3&#39;-Biotin-Modifikation unterzubringen. </li><li> Für die Umwandlung von einem Rechteck in ein Rohr, entfernen Sie die oberen und unteren Zeilen aus dem Rechteck und setzen Sie eine neue Zeile, deren SSTs haben spezifische Ergänzung zu den entsprechenden Fliesen auf der zweiten bis oberen Reihe und der zweiten Reihe nach unten. </li><li> Für eine freiliegende Einzelstrang-Domäne von verschiedenen Formen, ersetzen mit Poly-T-Segmente von 10-11 Nukleotiden Länge, oder Abdeckung mit Kantenschutz, die komplementär zu der freiliegenden Domäne sind und mit 10-11 Nukleotide lange Poly-T-Segmente zu kündigen. </li></ol></li></ol> 2. Herstellung der Molecular Canvas <ol><li> DNA-Komponente erhalten Stränge in RNase-freiem Wasser von einem oligonucleoti gelöst angegebenen Sequenzende-Hersteller in V Boden 96-Well-Platten mit Oligonukleotiden bei einer 10 nmol Maßstab mit Standard Entsalzung synthetisiert. Zentrifugation der 96-Well-Platten mit der DNA-Stränge zu etwa 10 s lang bei 600 x g. <ol><li> Pipette 1 ul von jeder der 362 Vertiefungen, die mit DNA-Strängen zur 24H × 28T Rechteck (3A) bei 100 &amp; mgr; M pro Strang (Herstellerangabe) in eine 2-ml-Röhrchen. Add 138 ul destilliertem entionisiertem H 2 O, um das 2-ml-Röhrchen, um eine Stammlösung des Stranges Mischung bei einer Konzentration von 200 nM pro Strang bilden. </li></ol></li><li> Dann werden 50 ul der 200 nM Stammlösung von Strang Mischung wurden 10 ul 10x Annealing-Puffer A (50 mM Tris, pH 7,9, 10 mM EDTA, 250 mM MgCl 2), 40 ul destilliertes entionisiertes H 2 O, um eine 0,2 ml PCR-Röhrchen. Dies ermöglicht eine 100 ul-Probe des molekularen Leinwand in 1X Glühen Puffer A (5 mM Tris, pH 7,9, 1 mM EDTA, 25 mM MgCl 2). </li><li> Glühen die sample für 17 h in einem Thermocycler Abkühlen von 90 ° C bis 25 ° C. Den Thermocycler wie folgt: Lauframpe von 90 ° C bis 61 ° C bei einer konstanten Geschwindigkeit von 5 min pro ° C; Lauframpe von 60 ° C bis 25 ° C bei einer konstanten Geschwindigkeit von 20 min pro ° C; und Inkubieren bei 4 ° C, bis die Probe aus dem Thermocycler genommen werden. </li><li> Bereiten Sie eine native 2% Agarose-Gel. <ol><li> Messen von 2,4 g Agarose in einen 600 ml Becher. Zugabe von 120 ml 0,5 × TBE-Puffer (44,5 mM Tris-Borat, pH 8,3, 1 mM EDTA) und 30 ml destilliertem entionisiertem Wasser in den Becher. </li><li> Mikrowelle für 3 Minuten (oder 40 - 60 sec mehr nach dem Kochen). Füllt die Wasser während der Verdampfung durch Zugabe von 30 ml Wasser, die zu der Konzentration von Agarose in dem Gel bei 2% zu halten hilft, verloren. </li><li> Schwenken Sie den Inhalt des Becherglases für 1 min in ein kaltes Wasserbad. 1 ml 1,2 M MgCl 2 (um eine 10 mM MgCl 2 -Konzentration in dem Gel zu machen) und Pre-Fleck das Gel with 6 ul Farbstoff SYBR Tresor (1: 20.000). </li><li> Gießen Sie das Gel-Lösung in ein trockenes Gel Box und legen Sie eine 1,5 mm dick und 12 Gelelektrophorese Kamm. Die Lösung erstarren lassen für 15 - 30 min auf einer ebenen Plattform. </li><li> Pour Gel-Laufpuffer (44,5 mM Tris-Borat, pH 8,3, 1 mM EDTA und 10 mM MgCl 2) in das Gel ein. Last 2-3 ul 1 kb DNA-Leiter in eine Vertiefung des Agarosegels. Mischungs 4 ul 6X Bromphenolblau-Farbstoff (0,25% Bromphenolblau, 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl 2 und 30% Glycerin) mit 20 ul der Probe des molekularen Leinwand und laden die Lösung in einen anderen Napf der Agarose-Gel. </li></ol></li><li> Führen Sie den nativen 2% igen für 2 Stunden bei 100 V in einem Eiswasserbad (Bromphenolblau blau dargestellt, läuft schneller als Komponentenstränge, damit es als Indikator dienen kann, dass, wenn 2 Stunden Laufzeit angemessen ist). </li><li> Bild des Gels mit einem Gel-Scanner mit einem geeigneten Filter für die SYBR Safe Fleck (2B </strong&gt;). </li><li> Auf einem blauen Licht Transilluminator, Verbrauchs die dominante Bande mit ähnlichen Mobilität der Band von 1500 Basenpaare des 1 kb DNA-Leiter mit einer scharfen Rasierklinge. Legen Sie die gewünschte Gel Einheit (en) in einer Spin-Säule und dann quetschen Sie das Gel in feine Stücke mit Hilfe eines Mikroröhrchen Stößel. Zentrifuge bei 438 × g für 3 min bei 4 ° C. </li><li> Messen der Konzentration der DNA unter Verwendung eines Ultraviolett-Spektrophotometer bei 260 nm. <ol><li> Verwenden Sie 2 ul ultrareinem DNase / RNase-Free destilliertem Wasser als leer, um die Maschine zu kalibrieren. </li><li> Verwenden ein äquivalentes Volumen der gesammelten Probe von der Spinsäule, um eine Schätzung der DNA-Konzentration zu erhalten. Die Konzentrationsmesswert (&quot;a&quot; = ng / &amp; mgr; l) bei einer UV-Absorption von 260 nm erhalten wird helfen, den Verdünnungsfaktor für AFM und TEM-Bildgebung. </li><li> Wandeln die gemessene Konzentration von &quot;a&quot; (ng / &amp; mgr; l), um &quot;b&quot; (nM) nach b = a × 10 6 / (330 &amp;# 215; Anzahl der Nukleotide). ANMERKUNG: Das Molekulargewicht eines Nukleotid 330 g / mol. Die berechnete molare Konzentration Wert des Verdünnungsfaktors für AFM und TEM-Aufnahmen zu bestimmen. Wie für den Fall eines 24H × 28T Rechtecks ​​die gemeinsame Messung für die gereinigte Probe liegt bei etwa 10 bis 60 ng / &amp; mgr; l. Da die Anzahl der Nukleotide, die für eine solche Struktur ist 14616 Da, die molare Konzentration etwa 2-12 nM. Die Endkonzentration wird durch die Sammelausbeute bestimmt (~ 20 bis 50%) aus der Zentrifugation und dem Volumen des Gels Bande ausgeschnitten aus (je höher das Volumen, je verdünnter die gereinigte Probe). </li></ol></li></ol> 3. Atomic Force Microscopy Imaging <ol><li> Schälen Glimmer auf eine Probe Metallscheibe mit Klebeband, um eine ebene Fläche zu erhalten und setzen Sie den Probenteller auf die Abbildungsstufe befestigt. </li><li> Dann werden 40 &amp; mgr; l 1X Anelierungspuffer A, gefolgt von 5 ul (2-5 nM) der gereinigten Probe der 24H × 28TRechteck, um die frisch gespaltenen Glimmeroberfläche. Lassen Sie die Mischung für ca. 2 min zu begleichen. </li><li> Installieren Siliziumnitrid AFM Cantilever-Chips auf einem freitragenden Halterung. Benutzen Sie einen C Dreiecksspitze (Resonanzfrequenz f 0 = 40 bis 75 kHz; Federkonstante, k = 0,24 Nm -1) für die Bildgebung. </li><li> Ein Musterbild in dem Fluid-Tapping-Modus. Verwenden Sie die folgenden Abbildungsparameter für das Scannen: Scannen Größe von 2 &amp; mgr; m, 1024 Zeilen für die Auflösung und einer Abtastrate von 0,5 bis 1 Hz (2C). </li><li> Falls erforderlich, werden 10 &amp; mgr; l oder mehr der 10 mM NiCl 2 -Lösung, die Stärke der DNA-Bindung Glimmer 29 zu erhöhen. </li></ol> 4. Probenvorbereitung für Streptavidin Labeling <ol><li> Manuell Design der 24H × 28T Rechtecks, so dass Griff Stränge an spezifischen Stellen eingebaut sind, die komplementär zu der anti-Griff-Stränge mit Biotin Modifikation, die ihrerseits in der Lage sind zu binden streptavid seinin speziell. <ol><li> Modifizieren des Molekular Leinwand durch Anbringen eines 3 &#39;17-Nucleotid-Segment, das aus einem zwei Nukleotidsequenz (TT) als Abstandshalter besteht und eine 15-Nucleotid-Griff (GGAAGGGATGGAGGA) an die Fliesen 14 in der oberen Reihe und 14 Fliesen auf dem Boden Reihe des Rechtecks ​​(3A), um die Grenze zu beschriften. Diese Sequenz ist komplementär zu einem 3&#39;-Biotin-modifizierten Antigriff Strang (TCCTCCATCCCTTCC-Biotin). </li></ol></li><li> Für die interne Kennzeichnung, bringen Sie die 3 &#39;17 Nukleotid-Segment zu 8 interne Fliesen und 6 Randfliesen des Rechtecks ​​(4A). <ol><li> Mischen Sie die 28 Stränge mit Griffen (Grenzkennzeichnung) mit dem Rest der Komponenten-Stränge des 24H × 28T Rechteck (334 Fäden), eine 200 nM Stammlösung zu machen. Mischen Sie die 14 Stränge mit Griffen (interne Markierung) mit dem Rest der Komponenten-Stränge des 24H × 28T Rechteck (348 Fäden), eine 200 nM Stammlösung zu erhalten. </li></ol></li><li> Für boundary Kennzeichnung, werden 50 ul der 200 nM Stammlösung der Stränge, 6 &amp; mgr; l der 100 &amp; mgr; M Biotin-modifizierten Antigriff Stränge 10 ul der 10X Anelierungspuffer A und 34 ul destilliertem deionisiertem Wasser auf eine 0,1 bis 0,2 ml PCR Reagenzglas. Die Endkonzentration der Komponente Strang 100 nM und die Endkonzentration des Antigriff Biotin modifizierten Strang 6.000 nM. Man beachte, dass 28 Moleküle des Antihand Biotin modifiziert Strang bindet an eine 24H × 28T Rechteck so die Anti-Biotin-modifizierten Griff Strangs von mehr als 100% der Bindung günstig zu gestalten. </li><li> Für interne Kennzeichnung, werden 50 ul der 200 nM Stammlösung der Stränge, 3 ul der internen Antihand Biotin modifizierten Strang bei 100 &amp; mgr; M, 10 &amp; mgr; l des 10X-Annealing-Puffer A, 37 ul destilliertem entionisiertem Wasser auf eine 0,1 - 0,2 ml PCR-Röhrchen. Die Endkonzentration der Komponente Strang 100 nM und die Endkonzentration des Antigriff Biotin modifi<html> ed Strang 3.000 nM. Man beachte, dass 14 Moleküle des Antigriff Biotin modifiziert Strang bindet an eine 24H × 28T Rechteck so anti-Griff Biotin modifizierten Strangs von mehr als 100% der Bindung günstig zu gestalten. </li><li> Glühen beide Proben in einem Thermocycler für 17 Stunden unter Verwendung der in 2.3 beschriebenen Schritte. </li><li> Bereiten Sie eine native 2% Agarose-Gel, wie in Schritt 2.4 beschrieben. </li><li> Reinigen Sie beide Proben wie in den Schritten 2.5 beschrieben. </li><li> Messung der Konzentration der gewünschten DNA-Strukturen, wie in Schritt 2.6 beschrieben. </li></ol> 5. Rasterkraftmikroskopie für Streptavidin Labeling <ol><li> Bild jede Probe unter Verwendung eines AFM, wie in Schritt 3 (3B und 4B) beschrieben. </li><li> Nach der ersten Runde der Bildgebung, 40 &amp; mgr; l 1X Annealing-Puffer A, gefolgt von 1 &amp; mgr; l Streptavidin bei 10 mg / ml zu der Probe. Lassen Sie die Mischung für ca. 2 min vor der Reimaging (3C und 4C) zu begleichen. </li></ol>_title &quot;&gt; 6. Konvertieren Sie ein Rechteck in ein Rohr <ol><li> Um ein Rohr auf der Basis des Rechtecks ​​zu gestalten, halten alle Komponenten SSTs an Ort und Stelle mit Ausnahme der oberen und unteren Reihe. Einführung einer neuen Zeile, deren SSTs werden durch Verknüpfung der oberen und unteren Halb Fliesen der jeweiligen Spalten, um das ursprüngliche Rechteck in ein Rohr Konformation (5A) cyclisieren konzipiert. </li><li> Mischen Sie die neue Reihe der Litzen (14 Stränge) mit den Komponentenstränge des 24H × 28T Rechteck mit Ausnahme der oberen und unteren Reihe (336 Fäden), eine 200 nM Stammlösung zu erhalten. </li><li> Folgen Sie der Gelreinigung Schritte 2,2-2,7 (5B). </li></ol> 7. Die Transmission Electron Microscope Imaging <ol><li> Wiegen 0,06 g Uranyl Formiat in 3 ml destilliertem Wasser zu einer 2% igen wässrigen Uranyl Formiat Färbemittellösung herzustellen. Filtern der 2% igen wässrigen Uranyl Formiat Färbelösung wird mittels eines 0,2 um-Filter in eine Spritze befestigt. <ol><li> In 5 ul5 N NaOH auf die 1 ml des gefilterten Farblösung. Vortexen Sie die Lösung und Zentrifuge bei 20.000 x g. </li></ol></li><li> Glimmentladungs ​​die kohlenstoffbeschichteten Gitter (beschichtete Seite nach oben) mit den folgenden Einstellungen: 25 mA, 45 s, 0,1 mbar und negativen Hochspannungspolarität. </li><li> Verwenden Sie selbstschließenden Pinzette, um einen Schein-Entlader behandelt Gitter von der Kante greifen. </li><li> Pipette 3,5 ul Probe auf das Gitter für 4 min. Mit einem Stück Filterpapier Docht von der Probe, indem das Filterpapier in Kontakt mit dem Gitter von der Seite. </li><li> 3,5 &amp; mgr; l der Färbelösung sofort hinzufügen auf das Gitter für 1 min. </li><li> Wick Sie den Fleck wie in 7.4 und halten das Filterpapier gegen den Netz für 1-2 min. </li><li> Übertragen Sie das Gitter auf eine TEM Probenhalter und Bild unter Verwendung eines JEOL JEM-1400 bei 80 kV mit einer Vergrößerung von 10 K bis 80 K (5C) betrieben. </li></ol> 8. Konstruieren beliebiger Form Mit dem Molecular Leinwand <ol><li> Identifizieren Sie eine Form, und wählen Sie die Stränge, die an die Form auf der molekularen Leinwand entsprechen. Für eine Dreiecksform zum Beispiel, wählen Sie 206 aus 362 Stränge für die molekulare Leinwand. </li><li> Ersetzen Sie die freiliegenden Domain (dh entlang der Hypotenuse des Dreiecks) mit einem Poly-T-Segment 10 - 11 Nukleotide lang (Design 1 in 6A), oder fügen Sie einen Kantenschutz, die komplementär zu der freiliegenden Domäne ist und beenden Sie es mit ein 10 - 11 Nukleotide lange poly-T-Segment (Design 2 in 6A), um die Aggregation zu verhindern. HINWEIS: Einfach Tempern der SSTs die an die Pixel des Dreiecks entsprechen (ohne Verwendung von Schutz Stränge) werden, um die Aggregation und keine gesonderten Produktbandbildung auf einem Gel führt. Verwenden Sie den Kantenschutz-Design für verschiedene Formen, wie es ist, ressourceneffizientere; nur vier zusätzliche Sätze von Strängen (6C) im Vergleich zu 14 zusätzliche Sätze in Einbauentwurf erfordert (Figure 6B). </li><li> Erstellen Sie eine Strang-Bibliothek für die 310-Pixel-Molekular Leinwand, die den Kernsatz (der 362 SST Leinwand), Set 1 * (Kantenschutz, die Domäne 1 binden eines SST), Set 2 * (Kantenschutz, die Domäne 2 binden beinhaltet einer SST), Set 3 * (Kantenschutz, die Domäne 3 eines SST binden) und Set 4 * (Kantenschutz, die Domäne 4 eines SST) zu binden, um insgesamt 1344 Kantenschutz zu geben. </li><li> Zentrifugieren Sie die Platten mit 96 Vertiefungen für die verschiedenen Sets für etwa 10 s. Pipettieren Sie die gewünschte Stränge von den Platten, um eine Stammlösung für eine bestimmte Form zu machen. <ol><li> Für die Form eines Dreiecks mit Kantenschutz, Pipette 1 ul 206 Stränge aus der Kernsatz, 0 von Satz 1 *, 0 aus der Serie 2 *, 0 von Satz 3 * und 24 Stränge von Satz 4 * in ein 2-ml-Zentrifugen Rohr. Mit 20 ul destilliertes entionisiertes Wasser zu dem Rohr, um eine 400 nM Stammlösung der DNA-Stränge bilden. </li></ol></li><li> In 50 ul der 400 nM Stammlösung von DNA stra<html> NDS, 10 ul der 10X Glühen Puffer B (50 mM Tris, pH 7,9, 10 mM EDTA, 125 mM MgCl 2) Stammlösung und 40 ul destilliertes entionisiertes H 2 O, um eine 0,2 ml PCR-Röhrchen. Dies ermöglicht eine 100 ul-Probe des Dreiecks in 1X Glühen Puffer B (5 mM Tris, pH 7,9, 1 mM EDTA, 12,5 mM MgCl 2) mit Fäden in einer Konzentration von etwa 200 nM pro Strang. </li><li> Tempern des Gemisches in einem Thermozykler für 17 Stunden, wie in Schritt 2.3 beschrieben. </li><li> Bereiten Sie eine native 2% Agarose-Gel, wie in Schritt 2.4 beschrieben. </li><li> Reinigen die Probe wie in Schritt 2.5 beschrieben. </li><li> Messen der Konzentration der DNA, wie in Schritt 2.6 beschrieben. </li><li> Bild die Probe unter AFM wie in Schritt 3 (7C und 7D) beschrieben. </li><li> Pick and mix Stränge für verschiedene Formen unter Verwendung des gleichen Strang Bibliothek. Glühen die verschiedenen Lösungen und kombinieren gereinigten Proben von verschiedenen Formen zu Zeit während AFM zu speichern. </li></ol>jove_title &quot;&gt; 9 Optional:. Robot Automation Of Shape Design und Liquid Mixing <ol><li> Verwenden Sie eine benutzerdefinierte MATLAB-Programm, um das Design von komplexen Formen zu unterstützen. </li><li> Verwenden Sie die Software, um Anweisungen in Form eines Pipettierungssequenz an einen Roboter Liquid Handler liefern. Verwenden Sie den Roboter Liquid Handler auswählen und mischen Sie die Stränge, die die Zielform darstellen. HINWEIS: Shape Design und Strangmischung wurde automatisiert, um menschliche Fehler zu reduzieren und die Konstruktion weniger arbeitsintensiv. </li></ol> 10. Rechtecke und Tubes in verschiedenen Skalen <ol><li> Konstrukt unterschiedlich große Rechtecke (10), indem einfach die Anzahl der parallelen Helices (H) und die Anzahl der schraubenförmigen Windungen (T). </li><li> Folgen Sie Schritt 3 für eine bestimmte Größe Rechteck. </li><li> Folgen Sie Schritt 6 für eine bestimmte Größe Rohr. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren erklären konkurrierende finanzielle Interessen.

In der Strukturbildung Schritt ist es wichtig, eine geeignete Konzentration an Magnesiumkationen zu halten (z. B. 15 mM) in dem DNA-Strang-Mischung zur Selbstorganisation DNA-Nanostrukturen. Ähnlich wird in dem Agarosegel Charakterisierung / Reinigungsschritt ist es wichtig, eine geeignete Magnesium-Kationen-Konzentration zu halten (z. B. 10 mM) in dem Gel und dem Gel-Laufpuffer, um die DNA-Nanostrukturen während der Elektrophorese zu erhalten. Zur 24H × 28T Rechteck Struktur testeten wir Glühen in ver...

5,8,10 - - vorherige Nukleinsäureselbstmontagearbeiten 1-25 hat zur erfolgreichen Aufbau einer Vielzahl von komplexen Strukturen, einschließlich DNA 2 geführt 13,17,23 oder RNA 7,22 periodischen 3,4,7, 22 und algorithmische 5 zweidimensionalen Gittern, Bänder 10,12 und Röhren 4,12,13, 3D-Kristalle 17, 11 Polyeder und endlich, 2D-Formen 7,8. Ein besonders wirksames Verfahren ist eingerüstet DNA-Origami, wobei eine einzelne Gerüststrang wird durch viele kleine Hilfsklammer Stränge gefaltet, um eine komplexe Form zu bilden 9,14 - 16,18 - 21,25. Vor kurzem berichteten wir ein Verfahren zum Konstruieren diskrete Nanostrukturen mit vorgegebenen 2D-Formen unter Verwendung von Einzelstrang-Fliesen (SST), und zeigte Strukturen Komplexität vergleichbar Origami 26. Diese article ist eine Anpassung unserer früheren Arbeit 26 und enthält detaillierte Protokolle für die Anordnung einzeln adressierbaren SSTs in anspruchsvolle Finite 2D-Formen mit genau vorgeschriebenen Abmessungen (Breite und Länge) und Morphologien. Ein entscheidender Vorteil des SST-Methode ist seine Modularität. Jede Komponente SST einer Struktur dient als modulares Bauteil in der Baugruppe, und unterschiedliche Untergruppen von diesen SSTs produzieren unterschiedliche Formen. Daher haben wir eine allgemeine Plattform, um Nanostrukturen mit vorgegebenen Größen und Formen von kurzen, synthetischen DNA-Stränge zu konstruieren. SSTs enthält vier Domänen, die jeweils 10 oder 11 Nukleotide lang ist (Figur 1A). Die SSTs binden, so dass ihre parallelen Helices schaffen eine DNA Gitter von Crossover-Bindungen zusammengehalten werden. Jede Überkreuzung der Phosphat zwischen den Domänen 2 und 3. Das Phosphat wird künstlich in den Diagrammen für klare gestreckt. Die Frequenzweichen sind beabstandet zwei Helixwindungen (21 Basen) auseinander (&lt;strong&gt; 1B). Die Verbundrechtecke werden durch ihre Abmessungen der Anzahl der Helices und Wendelgänge bezeichnet. Zum Beispiel, die ein Rechteck sechs Helices breit und acht Schrauben dreht lange als 6H × 8T Rechteck verwiesen. SSTs kann weggelassen werden, hinzugefügt, oder auf andere Weise neu angeordnet, um Strukturen von beliebigen Formen und Größen (1C) zu erstellen. Beispielsweise kann eine rechteckige Gestaltung zu einem Rohr mit gewünschter Länge und Radius (1D) gerollt werden. Alternativ dazu kann die rechteckige Gitter SST als Molekular Leinwand aus SST Pixeln, jeweils 3 nm von 7 nm betrachtet werden. In dieser Studie verwenden wir ein Molekular Leinwand von 310 in voller Länge internen SSTs, 24 voller Länge SSTs, aus denen die linken und rechten Grenzen, und 28 halbe Länge SSTs Bildung der oberen und unteren Grenzen. Die Leinwand hat 24 Doppelhelix durch Frequenzweichen verbunden und jede Helix enthält 28 Helixwindungen (294 Basen) und wird daher bezeichnet alsa 24H × 28T rechteckigen Leinwand. Die 24H × 28T Leinwand hat ein Molekulargewicht ähnlich der von einer DNA-Origami-Struktur aus einem M13-Phagen Gerüst erstellt.

<table><tbody><tr><td>DNA-Stränge&nbsp;</td><td>Integrierte DNA-Technologie</td><td></td><td>Abschnitt 3.1</td></tr><tr><td>SYBR Sichere DNA-Gelfärbung</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td>Abschnitt 3.4.2</td></tr><tr><td>Freeze'N Squeeze DNA-Gel-Extraktions-Spin-Säulen</td><td>BIO-RAD</td><td>731-6166</td><td>Abschnitt 3.6</td></tr><tr><td>Bruker's Sharp Nitrid Hebelsonden</td><td>Bruker AFM-Sonden</td><td>SNL10</td><td>Abschnitt 4.3</td></tr><tr><td>Safe Imager 2.0 Blaulicht-Transilluminator</td><td>Invitrogen</td><td>G6600</td><td>Sektion 3.6</td></tr><tr><td>Zentrifuge 5430R</td><td>Eppendorf</td><td>5428 000.414</td><td>Sektion 3.6</td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop&nbsp;</td><td>Jeol</td><td>Jem 1400</td><td>Abschnitt 7.4</td></tr><tr><td>Multimode 8</td><td>Veeco</td><td></td><td>Abschnitt 4</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 9000 Laser Scanner</td><td>GE Heathcare Life Sciences</td><td>28-9558-08</td><td>Abschnitt 3.5</td></tr><tr><td>Reinstes destilliertes Wasser</td><td>Invitrogen</td><td>10977-023</td><td>Abschnitt 3.7.1</td></tr><tr><td>Glimmerscheibe</td><td>SPI Supplies</td><td>12001-26-2</td><td>Abschnitt 4.1</td></tr><tr><td>Montagescheibe aus Stahl</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>16218</td><td>Abschnitt 4.1</td></tr><tr><td>kohlenstoffbeschichtetes Kupfergitter für die</td><td>TEM-Elektronenmikroskopie</td><td>FCF400-Cu</td><td>Abschnitt 7.2</td></tr><tr><td>Pinzetten</td><td>Dumont</td><td>0203-N5AC-PO</td><td>Abschnitt 7.31</td></tr><tr><td>Glimmentladungssystem</td><td>Quorum Technologies</td><td>K100X</td><td>Abschnitt 7.2</td></tr><tr><td>DNA-Motor Tetrad 2 Peltier-Thermocycler</td><td>BIO-RAD</td><td>PTC 0240G</td><td>Abschnitt 3.3</td></tr><tr><td>Owl Easycast B2 Mini-Gelelektrophorese-Systeme</td><td>ThermoScientific</td><td>B2</td><td>Abschnitt 3.4.3</td></tr><tr><td>Seekam LE Agarose 500G</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td>Abschnitt 3.4.1</td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb plus DNA-Leiter, gebrauchsfertig 75-20000bp</td><td>ThermoScientific</td><td>SM1333</td><td>Abschnitt 3.4.4</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000c UV-vis-Spektralphotometer</td><td>ThermoScientific</td><td></td><td>Abschnitt 3.7</td></tr><tr><td>0,2 μm Filter</td><td>Corning Inc.</td><td>431219</td><td>Abschnitt 7.1.2</td></tr></tbody></table>

die selbstorganisation von complex zweidimensionale formen von einzelstrang-dna-fliesen

Self-assembly of Complex Two-dimensional Shapes from Single-stranded DNA Tiles

Aktuelle Methoden in der DNA-Nanoarchitektur haben erfolgreich eine Vielzahl von 2D- und 3D-Strukturen unter Verwendung von Prinzipien der Selbstorganisation entwickelt. In diesem Artikel beschreiben wir detaillierte Protokolle zur Herstellung anspruchsvoller 2D-Formen durch die Selbstorganisation von einzigartig adressierbaren einzelsträngigen DNA-Kacheln, die als molekulare Pixel auf einer molekularen Leinwand wirken. Jedes einzelsträngige Tile (SST) ist ein 42-Nukleotid-DNA-Strang, der aus vier verketteten modularen Domänen besteht, die während der Selbstorganisation an vier Nachbarn binden. Die molekulare Leinwand ist eine rechteckige Struktur, die sich selbst aus SSTs zusammensetzt. Eine vorgegebene komplexe 2D-Form wird gebildet, indem die konstituierenden molekularen Pixel (SSTs) aus einer 310-Pixel-Molekülleinwand ausgewählt und dann die entsprechenden Stränge einem Eintopf-Glühen unterzogen werden. Aufgrund des modularen Charakters des SST-Ansatzes demonstrieren wir die Skalierbarkeit, Vielseitigkeit und Robustheit dieser Methode. Im Vergleich zu alternativen Methoden ermöglicht die SST-Methode eine größere Auswahl an Informationspolymeren und -sequenzen durch die Verwendung von de novo gestalteten und synthetisierten kurzen DNA-Strängen.

Die Selbstorganisation der SSTs (Figur 1) wird eine 24H × 28T Rechtecks ​​ergeben, wie in Abbildung 2 dargestellt. DNA-Sequenzen für die verschiedenen SSTs modifiziert / werden optimiert, um Streptavidin Kennzeichnung ermöglichen (Figur 3 und 4), die Transformation einer Rechteck in ein Rohr (5), die programmierbare Selbstorganisation von SSTs Rohre und Rechtecke unterschiedlicher Größen (10) bilden, und die Konstruktio...

DNA-Kacheln ist ein effektiver Ansatz, um programmierbare Nanostrukturen herzustellen. Wir beschreiben die Protokolle zur Konstruktion komplexer zweidimensionaler Formen durch die Selbstorganisation von einzelsträngigen DNA-Kacheln.

Die Selbstorganisation von Complex zweidimensionale Formen von Einzelstrang-DNA-Fliesen

Current methods in DNA nano-architecture have successfully engineered a variety of 2D and 3D structures using principles of self-assembly. In this ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, komplexe DNA-Nanostrukturen mit einzelsträngigen Bausteinen herzustellen. Dies wird erreicht, indem sorgfältig entworfene synthetische DNA-Stränge in einer geeigneten Pufferlösung gemischt werden, um im zweiten Schritt die gewünschte DNA-Nanostruktur zu bilden. Die Probe wird währenddessen inkubiert, wobei die Strukturbildung durch Selbstorganisation stattfindet.Anschließend werden native Agarose-Gelelektrophorese und Abbildung mittels Rasterkraftmikroskopie durchgeführt, um die erfolgreiche Bildung der Nanostrukturen zu überprüfen. Die Ergebnisse zeigen, dass sich DNA-Nanostrukturen basierend auf nativer Agarose-Gelelektrophorese und Rasterkraftmikroskopie selbstorganisiert haben. Im Allgemeinen haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten, da die Probenvorbereitung einer solchen Selbstorganisation kompliziert erscheint. Vor Beginn dieses Verfahrens werden DNA-Komponentenstränge spezifischer Sequenzen, gelöst in RNA-freiem Wasser, von einem Oligonukleotid-Hersteller in Vbo-96-Well-Platten bezogen; pipettieren Sie je einen Mikroliter aus jedem der 362 Löcher für die 24 Helices mit 28 Windungen.Rechteck: Geben Sie jeweils 100 Mikromolar pro Strang in ein 2-Milliliter-Reagenzglas. Fügen Sie anschließend 138 Mikroliter destilliertes, deionisiertes Wasser zum Reagenzglas hinzu, um eine Stammlösung mit einer Konzentration von 200 Nanomolar pro Strang herzustellen.Fügen Sie 50 µL der 200 amol/L Stammlösung, 10 µL 10×-Annealingpuffer A und 40 µL destilliertes, deionisiertes Wasser in ein 0,2-mL-PCR-Gefäß hinzu. Anschließend inkubieren Sie die Probe 17 Stunden lang in einem Thermocycler, der von 90 auf 25 °C abkühlt.Nachdem ein natives 2 % Agarosegel mit SYBR safe vorgefärbt wurde, führen Sie es zwei Stunden lang bei 100 Volt in einem Eiswasserbad durch. Bilden Sie das Gel nach Beendigung mit einem Gelscanner unter Verwendung eines geeigneten Filters für die SYBR-safe-Färbung auf einem Blaulicht-Transilluminator ab und schneiden Sie das dominante Band mit einer scharfen, sauberen Rasierklinge aus, das eine ähnliche Mobilität wie das Band von 1.500 Basenpaaren der One-Kilobase-DNA-Leiter aufweist. Geben Sie die gewünschten Gelfraktionen in eine Säulchenfiltereinheit und zerkleinern Sie das Gel mit einem Mikrotuben-Pele in feine Stücke, anschließend zentrifugieren Sie drei Minuten bei 438 × g und 4 °C.Nach der Zentrifugation die DNA-Konzentration mit einem ultravioletten Spektrophotometer bei 260 Nanometern messen. Anschließend die mit einer Probenmetallscheibe verbundene MICA mit Klebeband abziehen, um eine ebene Oberfläche zu erhalten, und die Probenmetallscheibe auf die Bildgebungsstufe des Mikroskops setzen.Fügen Sie 40 µL eines x und knienden Puffers A gefolgt von 5 µL der gereinigten Probe der 24 HELOCs durch 28 Umdrehungen rechteckig auf die frisch gespaltene Micah-Oberfläche hinzu. Lassen Sie das Gemisch etwa zwei Minuten lang ruhen. Installieren Sie eine A FM Siliziumnitrid-Karrezelle auf einem Karrezellhalter und bilden Sie die Probe im Flüssig-Tapping-Modus mit einer Scan-Größe von zwei Mikrometern und 1024 Zeilen Auflösung ab.Und eine Scanrate von 0,5 bis eins Hertz für die interne Markierung, angehängt an ein drei-prime-17-Nukleotid-Segment, an acht interne Kacheln und sechs Randkacheln des Rechtecks. Mischen Sie die 28 Stränge mit Griffen mit den übrigen Komponentensträngen der 24 HELOCs in einem 28-Wendungen-Rechteck, um eine 200 NANOMOLARE Stammlösung für die Randmarkierung herzustellen. Mischen Sie die 14 Stränge mit Griffen mit den übrigen Komponentensträngen der 24 Heel-Seas in einem 28-Wendungen-Rechteck, um eine 200 Nanomolare Stammlösung für die interne Markierung zu erhalten.Für die Markierung der Grenze geben Sie 50 µL der 200 Nanomolar Stammlösung, 60 µL der 100 Mikromolar Biotin-modifizierten Anti-Handle-Stränge, 10 µL 10×-Annealing-Puffer A und 34 µL destilliertes deionisiertes Wasser in ein PCR-Reaktionsgefäß.Fügen Sie für die interne Markierung 50 Mikroliter der 200 Nanomolar-Stammlösung hinzu. Drei Mikroliter der internen biotinmarkierten Anti-Handle-Einzelstrang-DNA in einer Konzentration von 100 Mikromolar, 10 Mikroliter 10×-Annealing-Puffer A und 37 Mikroliter destilliertes, deionisiertes Wasser zu einem PCR-Reaktionsgefäß hinzu.Wiegen Sie anschließend 0,06 Gramm Uranylformiat in drei Milliliter destilliertem Wasser ein. Um eine 2%ige wässrige Uranylformiat-Anfärbungslösung herzustellen, filtrieren Sie die Färbungslösung mithilfe eines 0,2-Mikroliter-Filters, der an die Spritze angebracht ist. Geben Sie fünf Mikroliter fünfnormalen Natriumhydroxid zu einem Milliliter der filtrierten Färbungslösung hinzu.Nach kurzem Vortexen der Lösung bei 20.000 G zentrifugieren. Entladen Sie die mit Kohlenstoff beschichteten Gitter, wobei die beschichtete Seite nach oben zeigt, unter Verwendung der folgenden Einstellungen. Danach pipettieren Sie 3,5 Mikroliter Probe auf das durch Glühentladung behandelte Gitter. Nach vier Minuten verwenden Sie ein Stück Filterpapier, um die Probe seitlich in Kontakt mit dem Gitter bringend abzuziehen.Unmittelbar danach 3,5 Mikroliter der Farblösung auf das Raster geben. Nach einer Minute die Färbung mit Filterpapier abziehen und das Filterpapier ein bis zwei Minuten lang gegen das Raster halten. Das Raster in einen TEM-Präparathalter überführen.Ein Bild mit A-J-E-O-L GM 1400, betrieben bei 80 Kilovolt mit einer Vergrößerung von 10 K bis 80 K. Sobald die Form identifiziert wurde, wählen Sie die Stränge aus, die der Form auf der molekularen Leinwand entsprechen. Ersetzen Sie die exponierte Domäne durch ein Poly-T-Segment, 10 bis 11 Nukleotide lang, oder fügen Sie einen Kantenprotektor hinzu, der komplementär zur exponierten Domäne ist, und terminieren Sie diesen mit einem 10 bis 11 Nukleotide langen Poly-T-Segment. Um Aggregation zu verhindern, erstellen Sie eine Strangbibliothek für die 310-Pixel-molekulare Leinwand, die das Korsett einschließt.Stellen Sie einen Sternsatz, zwei Sternsätze, drei Sternsätze und vier Sternsätze ein, um insgesamt 1.344 Kantenschutzmittel zu erhalten. Nach dem Zentrifugieren der 96-Well-Platten für die verschiedenen Sätze pipettieren Sie ein Mikroliter von 206 Strängen aus dem Basissatz, null aus Satz ein Stern, null aus Satz zwei Sterne, null aus Satz drei Sterne und 24 Stränge aus Satz vier Sterne in ein zwei Milliliter fassendes Zentrifugenröhrchen. Geben Sie 20 Mikroliter destilliertes, deionisiertes Wasser in das Röhrchen, um eine 400 Nanomolar Stammlösung der DNA-Stränge herzustellen.Fügen Sie anschließend 50 µL der 400 Nanomolar-Stammlösung, 10 µL 10x-Annealingpuffer B und 40 µL destilliertes, deionisiertes Wasser in ein 0,2-mL-PCR-Röhrchen hinzu und inkubieren Sie die Mischung 17 Stunden lang im Thermocycler, wie zuvor beschrieben. Nach der Reinigung der Probe und der Bestimmung der DNA-Konzentration, bilden Sie die Probe erneut mittels eines FM auf die gleiche Weise wie zuvor ab, um schließlich durch einfache Variation der Anzahl paralleler Heocs und der Anzahl helikaler Windungen Rechtecke unterschiedlicher Größe zu konstruieren.Die Selbstorganisation einzelsträngiger Bausteine führt zu einem Rechteck aus 24 HELOCs mit 28 Windungen. Die DNA-Sequenzen der verschiedenen einzelsträngigen Bausteine können modifiziert und optimiert werden, um eine Strep-Teilung und Markierung zu ermöglichen sowie die Umwandlung eines Rechtecks in ein Röhrchen. Die programmierbare Selbstorganisation einzelsträngiger Bausteine zur Bildung von Röhrchen und Rechtecken unterschiedlicher Größe sowie die Konstruktion zweidimensionaler beliebiger Formen mithilfe der molekularen Leinwand, der Domänensubstitutionsstrategie und der Kanten-Schutzstrategie wurden als Lösungen für Aggregation an exponierten Domänen beliebiger Formen getestet. Beide Strategien weisen eine vergleichbare Gelelektrophorese-Ausbeute und strukturelle Integrität auf, doch ist die Kanten-Schutzstrategie kosteneffizienter, da sie weniger Hilfsarten benötigt.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie komplexe DNA-Nanostrukturen auf der Grundlage einzelner Strang-Fliesen hergestellt werden können.

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Forschung

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Chemistry

Chemie

Wir beschreiben experimentellen Details der Synthese von gemusterten und rekonfigurierbare Teilchen von zweidimensionalen (2D) Vorstufen. Diese Methodik kann verwendet werden, um Partikel in einer Vielzahl von Formen, einschließlich Polyeder und Greifvorrichtungen auf Längenskalen Bereich von Mikro-bis Zentimeterbereich erzeugen.

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