Name: Die Biokonjugation und Radiosynthese 89 Zr-DFO-markiertem Antikörper (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
Description: Lernen Sie die Biokonjugation und Radiosynthese von Zirkonium-89-DFO-markierten Antikörpern für PET-Bildgebung. Diese Methode ermöglicht präklinische Tumorvisualisierung in Mausmodellen.

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Die Autoren danken Prof. Thomas Reiner, Dr. Jacob Houghton, und Dr. Serge Lyaschenko für hilfreiche Gespräche.

Alle beschriebenen In-vivo-Tierversuchen wurden nach einer genehmigten Protokoll und unter den ethischen Richtlinien des Memorial Sloan Kettering Cancer Center Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) durchgeführt. 1. Konjugation von DFO-NCS bis J591 <ol><li> In einem 1,7 ml-Mikrozentrifugenröhrchen, bereiten eine 2-5 mg / ml-Lösung von J591 in 1 ml von entweder 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4) oder 0,5 M HEPES-Puffer (pH 7,4). </li><li> Löse DFO-NCS in trockenem DMSO in einer Konzentration zwischen 5-10 mM (3,8 bis 7,6 mg / ml). Mit Ultraschall oder Wirbel die Lösung sorgfältig durch, um eine vollständige Auflösung zu erleichtern. </li><li> Den pH-Wert der Lösung auf 8,8-9,0 J591 durch Zugabe kleiner Aliquots (&lt;10 &amp; mgr; l) von 0,1 M Na 2 CO 3. </li><li> Nachdem die Antikörperlösung in der richtigen pH, einen Volumen des DFO-NCS-Lösung entsprechend einem 3-4-fachen molaren Überschuß des bifunktionellen Chelators. <ol><li> Zur Prüfungweise hinzuzufügen 4-5 ul einer 10 mM (7,6 mg / ml) DFO-NCS-Lösung (40,4 nmol DFO-NCS) zu 1 ml einer 2 mg / ml J591 Körperlösung (13,3 nmol J591). Die Menge an DMSO im fertigen wäßrigen Reaktionsmischung sollte 2% v / v nicht übersteigen. </li></ol></li><li> Inkubieren der Reaktion für 30 Minuten bei 37 ° C auf einem Heizblock Rühren bei 350 Upm. </li><li> Nach 1 h bei 37 ° C, Reinigen des resultierenden Immunkonjugat mit einem vorverpackten Einweg Grßenausschluß Entsalzungssäule mit einer 50.000 Molekulargewicht-Cut-off unter Verwendung von 0,5 M HEPES-Puffer (pH 7,4) als Elutionsmittel. Mit diesem Schritt wird eine 2 ml Lösung des fertigen J591-DFO Konstrukt ergeben. </li><li> Messung der Konzentration des J591-DFO Konstrukt auf einem UV-Vis-Spektrophotometers. </li><li> Wenn eine höhere Konzentration des Konstrukts gewünscht wird, konzentrieren die J591-DFO Lösung unter Verwendung einer Zentrifugalfiltereinheit mit einer 50.000 Molekulargewicht-Cut-off. </li><li> Bewahren Sie die Lösung des fertigen J591-DFO Immunkonjugat bei -20 ° C im Dunkeln. </ol> 2. Radiomarkierung J591-DFO mit 89 Zr VORSICHT: Dieser Schritt des Protokolls umfaßt die Handhabung und Manipulation von Radioaktivität. Vor der Durchführung dieser Schritte oder bei anderen Arbeiten mit Radioaktivität Forscher sollten mit Strahlenschutzabteilung ihrer Heimateinrichtung konsultieren. Alle möglichen Schritte unternommen werden sollten, um die Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zu minimieren. HINWEIS: Im Interesse einer ordnungsgemäßen radiochemische Hinweis Haltung, sollte die Menge an Radioaktivität in der Probe unter Verwendung einer Dosiskalibrator gemessen und aufgezeichnet werden vor und nach den Schritten von 2,2 bis 2,13 in der folgenden Protokoll. Dies wird mit der genauen Bestimmung der radiochemischen Ausbeuten und spezifischen Aktivitäten zu helfen. <ol><li> Es wird eine Lösung von 0,5-2,0 mg J591-DFO in 200 ul 0,5 M HEPES-Puffer, pH 7,5. </li><li> Pipettieren Volumen des &lt;sup&gt; 89 Zr 4+ Stammlösung (in der Regel in 1,0 M Oxalsäure im Lieferumfang enthalten), entsprechend 1,0 bis 6,0 mCi (37-222 MBq) in ein 2-ml-Plastik Schraubverschluss Reaktionsgefäß. Stellen Sie die Lautstärke dieser Lösung auf insgesamt 300 ul mit 1,0 M Oxalsäure. </li><li> Den pH-Wert des 89 Zr 4+ Lösung auf 6,8-7,5 unter Verwendung von 1,0 M Na 2 CO 3. Beginnen durch Zugabe von 250 ul 1,0 M Na 2 CO 3 zu dem 89 Zr 4+ Lösung und anschließend Hinzufügen kleiner (&lt;10 ul) Aliquots von Base, um den gewünschten pH zu erreichen. </li><li> Fügen Sie die gewünschte Menge des pH-eingestellten 89 Zr 4+ Lösung der J591-DFO-Lösung in Schritt 2.1 vorbereitet. </li><li> Der pH-Wert des Radiomarkierungsreaktionsgemisch zu gewährleisten, dass sie innerhalb des gewünschten Bereichs von 6,8-7,5 fällt. </li><li> Inkubieren der Radiomarkierungsreaktion 60 Minuten lang bei RT auf einer Rührwerkskugelmühle Heizblock bei 350 Umdrehungen pro Minute. </li><li> Nach 60 min Inkubation, messen Sie den radiolabeling Ausbeute der Reaktion mit radio TLC. <ol><li> Hierzu Spot 1 uCi Radiomarkierungsreaktionsmischung auf einem Kieselsäure-TLC imprägnierten Streifen. Lassen Sie den aliquoten trocknen, führen Sie den TLC unter Verwendung eines Elutionsmittels von 50 mM DTPA (pH 5,5) und analysieren die TLC Streifen mit Hilfe eines Radio-TLC-Scanner. 89 Zr 4+ mit dem J591-DFO Konstrukt gebunden wird am Ursprung angezeigt (R f &lt;0.1), während die freien 89 Zr 4+ Kationen werden von DTPA Chelat werden und wird mit der Lösungsmittelfront (Rf eluieren&gt; 0,9). </li><li> Berechnen der Radiomarkierungsausbeute der Reaktion durch Integrieren des Radiochromatogramm, indem die Fläche unter der Kurve von R f 0,0-0,1 durch die gesamte Fläche unter der Kurve, multipliziert mit 100. </li></ol></li><li> Wenn die Radiomarkierungsausbeute ausreicht (typischerweise eine theoretische spezifische Aktivität von&gt; 2 mCi / mg) Die Reaktion wird mit 5 ul 50 mM DTPA, pH 5,5. </li><li> Man reinige den resultierenden Immunkonjugat using eine vorverpackte Einweg Grßenausschluß Entsalzungssäule mit einer 50.000 Molekulargewicht-Cut-off unter Verwendung eines Elutionsmittels von entweder 0,9% sterile Kochsalzlösung mit 5 mg / ml Gentisinsäure oder 0,25 M Natriumacetat (pH 5,5) mit 5 mg / ml Gentisinsäure . Mit diesem Schritt wird eine 2 ml Lösung des fertigen 89 Zr-DFO-J591 Radioimmunkonjugats ergeben. </li><li> Nach der Reinigung, überprüfen Sie die radiochemische Reinheit der 89 Zr-DFO-J591 mit Radio-TLC wie in Schritt 2.7 beschrieben. </li><li> Berechnen der Gesamtradiomarkierungsausbeute der Reaktion durch Dividieren der Menge an Aktivität zu Beginn auf die Antikörperlösung durch die Menge an Radioaktivität mit dem gereinigten 89 Zr-DFO-J591 Radioimmunkonjugat getrennt zugegeben. </li><li> Berechnen Sie die endgültige spezifische Aktivität durch Dividieren der Menge an Aktivität mit dem gereinigten 89 Zr-DFO-J591 Radioimmunkonjugat isoliert von der Ausgangsmasse der DFO-J591 in der Radiomarkierungsreaktion. </li><li> Wenn eine höhere Konzentration gewünscht wird, konzentrieren the 89 Zr-DFO-J591 Lösung unter Verwendung einer Zentrifugalfiltereinheit mit einer 50.000 Molekulargewicht-Cut-off. HINWEIS: Die Gentisinsäure im letzten Reinigungsschritt verwendet wird, ein radioSchutz verwendet, um den Abbau des Antikörpers durch Radiolyse minimieren 46 Während die Speicherung des 89 Zr-DFO-J591 Radioimmunkonjugat für bis zu 48 Stunden bei 4 ° C. möglich ist, ist es nicht empfehlenswert. Wenn das Radioimmunkonjugat gespeichert werden soll, zu verwenden 0,25 M Natriumacetat (pH 5,5) mit 5 mg / ml Gentisinsäure als Pufferspeicher, um das Risiko von Hypochlorit-vermittelte Radiolyse minimieren. 47 </li></ol> 3. In-vivo-PET-Bildgebung mit 89 Zr-DFO-J591 ACHTUNG: Wie in Protocol Abschnitt 2 dieser Schritt des Protokolls umfaßt die Handhabung und Manipulation von Radioaktivität. Vor der Durchführung dieser Schritte Forscher sollten mit Strahlenschutzabteilung ihrer Heimateinrichtung konsultieren. Alle possible Schritte sollten unternommen werden, um die Exposition gegenüber ionisierender Strahlung zu minimieren. <ol><li> Bei männlichen athymischen Nacktmäusen subkutan Implantat 5 x 10 6 LNCaP-Prostatakrebszellen und lassen diese zu einem 100-150 mm 3 Xenograft (3-4 Wochen nach der Beimpfung) wachsen. 44 </li><li> Verdünne das 89 Zr-DFO-J591 Radioimmunkonjugat auf eine Konzentration von 1,0 mCi / ml in 0,9% steriler Kochsalzlösung. </li><li> Injizieren 200 ul des 89 Zr-DFO-J591-Lösung (200 &amp; mgr; Ci; 7.4 MBq). In die laterale Schwanzvene der Xenotransplantat-tragenden Mäusen 48 </li><li> Bei der gewünschten Abbildungs ​​Zeitpunkt (zB 12, 24, 48, 72, 96 oder 120 h post-Injektion), betäuben die Maus mit einer 2% Isofluran: Sauerstoff-Gasgemisch. </li><li> Platzieren Sie die Maus auf dem Bett des Kleintier-PET-Scanner, und Aufrechterhaltung einer Narkose bei der Untersuchung mit einem 1% Isofluran: Sauerstoff-Gasgemisch. Vor Inbetriebnahme des Tieres auf das Scanner-Bett, überprüfen Anästhesie mit dem Zehe-Pinch-Methode und apply Augensalbe für die Augen der Maus, um das Trocknen während einer Narkose zu verhindern. 49 </li><li> Erwerben die PET-Daten für die Maus über einen statischen Abtastung mit einem Minimum von 40 Millionen koinzident Ereignisse unter Verwendung eines Energiefensters 350-700 keV und eine Koinzidenzzeitfenster von 6 nsec. 50 </li><li> Nach Abschluss der Akquisition des Bildes, darf die Maus nicht unbeaufsichtigt zu lassen, und stellen Sie sie nicht in einem Käfig mit anderen Mäusen, bis sie wieder zu sich kam. </li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Während die Konstruktion, radioaktive Markierung, und Abbildung 89 Zr-DFO-beschriftet Radioimmunkonjugate ist in der Regel ein ziemlich einfaches Verfahren, ist es wichtig, ein paar wichtige Überlegungen bei jedem Schritt des Prozesses zu halten. Beispielsweise, wenn die wahrscheinlichste Ursache für Bedenken während der Konjugation Schritt der Prozedur ist die Aggregation des Antikörpers während der Konjugationsreaktion. Dieses Problem ist häufig ein Produkt von schlechter Vermischung der Konjugationsreaktio...

Aufgrund ihrer bemerkenswerten Empfindlichkeit, Affinität und Selektivität wurden Antikörper langem als vielversprechende Vektoren für die Abgabe von Radioisotopen an Tumorzellen. Jedoch wurde ihre Anwendung in der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) durch das Fehlen eines geeigneten Positronen emittierende Radioisotope für die Etikettierung behindert. 1-3 Einer der kritischsten Aspekte bei der Konzeption der Radioimmunkonjugate wird passend zum physikalischen Zerfall Halb Zeit des Radioisotops für die in vivo Pharmakokinetik des Antikörpers. Genauer gesagt wurden Antikörper oft relativ lang, mehrtägigen biologischen Halbwertszeit und müssen daher mit Radioisotopen mit vergleichbaren physikalischen Halbwertszeit gekennzeichnet sein. Für PET-Imaging-Anwendungen, haben Antikörper traditionell mit radioaktiv markiertem 64 Cu (t 1/2 = 12,7 h), 86 Y (t 1/2 = 14,7 Stunden) oder 124 I (t 1/2 = 4,18 d). 4, 5 jedoch jedediese Radioisotope besitzt erhebliche Einschränkungen, die ihre Eignung für die klinische Bildgebung behindern. Während Radioimmunkonjugate mit 86 Y und 64 Cu beschriftet sind vielversprechend in präklinischen Untersuchungen nachgewiesen, beide Isotope besitzen physikalische Halbwertszeiten, die zu kurz, um effektiv für die Bildgebung beim Menschen sind. 124 I hingegen hat eine nahezu ideale physikalische Halbwertszeit für Bildgebung mit Antikörpern, aber es ist teuer und hat suboptimal Abklingeigenschaften, die relativ geringe Auflösung klinischen Bildern führen. Ferner können 124 I-markiertem Radioimmunkonjugaten Subjekt in vivo Dehalogenierung, ein Verfahren, das Tumor-zu-Hintergrund-Aktivitätsverhältnisse senken kann. 6,7 Der Antrieb, ein Positronen emittierende Radioisotop zu 64 Cu, 86 Y ersetzen zu finden, und 124 I in Radioimmunkonjugate hat den jüngsten Anstieg der Forschung über 89 Zr-markierten Antikörpern angeheizt. 8-12 Ter Grund für die Einführung der 89 Zr ist einfach: das Radiometall besitzt nahezu idealen chemischen und physikalischen Eigenschaften für den Einsatz in diagnostischen PET Radioimmunkonjugate 13 89 Zr wird über die 89 Y (p, n) 89 Zr Reaktion auf ein Zyklotron mit einer produziert. im Handel erhältlich und 100% natürlich reichlich 89 Y Ziel. 14,15 Die Radiometall hat eine Positronen-Ausbeute von 23%, zerfällt mit einer Halbwertszeit von 78,4 Stunden und Positronen emittiert mit der relativ geringen Energie von 395,5 keV (Abbildung 1). 13,16,17 Es ist wichtig zu beachten, dass 89 Zr emittiert ebenfalls eine hohe Energie 909 keV γ-Strahl mit 99% Effizienz. Während dieser Emission nicht energetisch nicht mit den emittierten 511 keV Photonen, erfordert es zusätzliche Überlegung im Hinblick auf Transport, Handling und Dosimetrie. Trotz dieser Einschränkung, diese Zerfallseigenschaften letztlich bedeuten, dass 89 Zr hat nicht nur eine günstigere hAlf-Lebensdauer für die Bildgebung mit Antikörpern als 86 Y und 64 Cu kann aber auch erzeugen Bilder mit höherer Auflösung als 124 I, welche mit Positronen höheren Energien von 687 bis 975 keV und einer Anzahl von Photonen mit Energien innerhalb 100-150 keV emittiert die 511 keV Positronen erzeugt Photonen. 13. Darüber hinaus ist 89 Zr auch sicherer in der Handhabung und weniger teuer herzustellen und residualizes in Tumoren wirksamer als sein Gegenstück Radiojod. 18,19 Eine mögliche Einschränkung von 89 Zr ist, dass es keinen ein therapeutisches Isotopolog zB 86 Y (PET) vs. 90 Y (Therapie). Dies schließt die Konstruktion von chemisch identischen, Surrogat-Bildgebungsmittel, die als dosimetrische scouts für ihre therapeutischen Gegen eingesetzt werden können. Das heißt, Untersuchungen legen nahe, dass 89 Zr-markierten Antikörpern zu tun haben Potenzial als Bild Surrogate für 90 Y und 177 Lu-markierten Immunkonjugate.20,21 Vom chemischen Standpunkt aus als ein Metall der Gruppe IV, besteht 89 Zr als vier Kationen in wässriger Lösung. Die Zr 4+ Ion hoch geladenen, relativ groß (effektive Ionenradius = 0,84 Å), und kann als eine &quot;harte&quot; Kation klassifiziert werden. Als solches weist es eine Präferenz für die Liganden mit bis zu acht Fest anionische Sauerstoffdonatoren. Einfach die häufigste Chelator in 89 Zr-markierten Radioimmunkonjugate verwendete Desferrioxamin (DFO), ein Siderophor-abgeleitete, azyklische Chelator, die drei Hydroxamatgruppen. Der Ligand stabil koordiniert den Zr 4+ Kationen schnell und sauber bei RT bei biologisch relevanten pH-Werten, und das erhaltene Zr-DFO-Komplex bleibt stabil im Laufe mehrerer Tage in Kochsalzlösung, Blutserum und Vollblut. 22 Computational Studien stark darauf hin, dass DFO bildet einen sechsfach koordinierten Komplex mit Zr 4+ in dem das Metallzentrum an die Drei Neut koordiniertral und drei anionische Sauerstoffdonoren des Liganden sowie zwei exogene Wasserliganden (Abbildung 2). 23,24 Die in vivo Verhalten Radioimmunkonjugate Einsatz der 89 Zr-DFO Konjugation Gerüst war im Allgemeinen sehr gut. Jedoch in einigen Fällen, Bildgebung und Biodistribution akuten Studien erhöhten Aktivität in den Knochen von Mäusen mit 89 Zr-markierte Antikörper injiziert wird, Daten, die zeigt, dass die osteophiles 89 Zr 4+ Kation aus der Chelator in vivo freigesetzt und anschließend mineralisiert ergab in den Knochen. 25 Kürzlich, insbesondere Liganden eine Reihe von Untersuchungen über die Entwicklung von neuartigen 89 Zr 4+ Chelatoren mit acht Sauerstoffspender sind in der Literatur erschienen. 24,26,27 Dennoch derzeit DFO ist die am weitesten verbreiteten Chelator mit großem Abstand in 89 Zr-markierten Radioimmunkonjugate. Eine Vielzahl von unterschiedlichenBiokonjugation Strategien wurden angewendet, um den DFO Antikörper binden, einschließlich bioorthogonalen Click-Chemie, die Reaktion von thiolreaktiven DFO Konstrukte mit Cysteine ​​im Antikörper, und die Reaktion des aktivierten Esters tragenden DFO Konstrukte mit Lysinen in den Antikörper. 4,28- 30 leicht die häufigste Strategie jedoch ist die Verwendung von einem Isothiocyanat tragende Derivat von DFO, DFO-NCS (Abbildung 2). 22 Diese kommerziell verfügbaren bifunktionellen Chelator robust und zuverlässig stabile, kovalente Bindungen mit Thioharnstoff Lysine der Formen Antikörper (Abbildung 3). In den vergangenen Jahren wurde eine Vielzahl von 89 Zr-DFO-markierten Radioimmunkonjugaten in der Literatur berichtet worden. Präklinische Untersuchungen haben besonders reichlich gewesen, mit Antikörpern, die von der bekannteren Cetuximab, Bevacizumab und Trastuzumab mehr esoterischen Antikörper wie die CD105-Targeting-TRC105 und fPSA-Targeting 5A10. 30-36 In jüngerer Zeit sind eine geringe Anzahl von frühen Phase der klinischen Studien mit 89 Zr-DFO-markierte Antikörper in der Literatur aufgetaucht. Insbesondere Gruppen in den Niederlanden veröffentlichten Studien beschäftigt 89 Zr-DFO-CMAB U36, 89 Zr-DFO-Ibritumomab-Tiuxetan, und 89 Zr-DFO-Trastuzumab. 21,32,37 Darüber hinaus eine Reihe von weiteren klinischen Studien mit 89 Zr-markierten Radioimmunkonjugate sind derzeit im Gange, einschließlich Untersuchungen hier am Memorial Sloan Kettering Cancer Center mit dem PSMA-Targeting 89 Zr-DFO-J591 für Prostata-Krebs-Bildgebung und die HER2-Targeting 89 Zr-DFO-Trastuzumab bei Brustkrebs Bildgebung. 23, 30 Darüber hinaus, während radiomarkierten Antikörpern bleiben die häufigsten 89 Zr-markierte Radiopharmaka, die Radio auch zunehmend mit anderen Vektoren, einschließlich Peptide, Proteine ​​und Nanomaterialien eingesetzt. 38-43 </sup&gt; Die Modularität dieser 89 Zr-DFO Kennzeichnungsmethode ist eine enorme Bereicherung. Das Repertoire der Biomarker-Targeting-Antikörper ist immer größer, und das Interesse an der Durchführung in vivo PET-Bildgebung mit diesen Konstrukten legt kräftig zu. Als Ergebnis, glauben wir, dass die Entwicklung standardisierter Verfahren und Protokolle können Sie das Feld profitieren. Eine ausgezeichnete schriftliche Versuchsprotokoll für DFO-NCS Konjugation und 89 Zr Radiomarkierung wurde bereits von Vosjan veröffentlicht, et al. 22 Wir sind der Meinung, dass die visuelle Demonstration von dieser Arbeit bereitgestellt könnte weiter helfen Ermittler neue zu diesen Techniken. In dem Protokoll bei Seits wird die Prostata-spezifischen Membran-Antigen-Targeting-Antikörper J591 als Modellsystem verwendet, um zu veranschaulichen (1) die Biokonjugation des bifunktionellen Chelators DFO-Isothiocyanat an einen Antikörper, (2) die Radiosynthese und Reinigung des 89 Zr-DFO-mAb Radioimmunkonjugats,und (3) in vivo PET mit 89 Zr-DFO-mAb Radioimmunkonjugat in einem Mausmodell von Krebs. 23,44,45

<table><tbody><tr><td>p-SCN-Bn-DFO</td><td>Makrozyklika</td><td>B-705</td><td>Bei -80 > lagern C</td></tr><tr><td>[89Zr]Zr-oxalat</td><td>Verschiedenes, einschließlich Perkin-Elmer</td><td></td><td>Vorsicht: Radioaktives Material</td></tr><tr><td>PD-10 Entsalzungskolonnen</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0851-01&nbsp;</td><td>Bei Raumtemperatur lagern</td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Zentrifugalfiltereinheiten</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC805024</td><td>Bei Raumtemperatur lagern</td></tr><tr><td>Kieselgel Imprägniertes RadioTLC-Papier</td><td>Agilent Technologies</td><td>SGI0001</td><td>In 0,5 cm breite Streifen schneiden</td></tr></tbody></table>

die biokonjugation und radiosynthese<sup&gt; 89</sup&gt; zr-dfo-markiertem antikörper

The Bioconjugation and Radiosynthesis of 89Zr-DFO-labeled Antibodies

Die außergewöhnliche Affinität, Spezifität und Selektivität der Antikörper machen sie außergewöhnlich attraktive Vektoren für den Tumor gerichtet PET-Radiopharmaka. Aufgrund ihrer mehrtägigen biologische Halbwertszeit muss Antikörper mit Positronen emittierende Radionuklide mit relativ langen physischen Verfall Halbwertszeiten zu kennzeichnen. Traditionell sind die Positronen emittierende Isotope 124 I (t 1/2 = 4,18 d), 86 Y (t 1/2 = 14,7 h) und 64 Cu (t 1/2 = 12,7 h) wurden verwendet, um Antikörper zu beschriften PET-Bildgebung. In jüngerer Zeit jedoch hat das Feld eine dramatische Zunahme in der Verwendung der Positronen emittierende Radiometall 89 Zr in Antikörper-basierten PET-Bildgebungsmittel beobachtet. 89 Zr ist ein nahezu ideales Radioisotop für die PET-Bildgebung mit Immunkonjugaten, da sie eine physikalische Halb besitzt -Leben (t 1/2 = 78,4 Stunden), die mit den in-vivo-Pharmakokinetik von Antikörpern kompatibel ist und gibt eine relativ niedrige energy Positronen, die Bilder mit hoher Auflösung produziert. Außerdem Antikörper können unkompliziert mit 89 Zr mit dem Siderophor abgeleitete Chelator Desferrioxamin (DFO) gekennzeichnet werden. Bei diesem Protokoll wird die Prostata-spezifische Membran-Antigen-Targeting-Antikörper J591 als Modellsystem verwendet, um zu veranschaulichen (1) die Biokonjugation des bifunktionellen Chelators DFO-Isothiocyanat an einen Antikörper, (2) die Radiosynthese und Reinigung eines 89 Zr- DFO-mAb Radioimmunkonjugat, und (3) in-vivo-PET mit einem 89 Zr-DFO-mAb Radioimmunkonjugat in einem Mausmodell von Krebs.

Der erste Schritt bei diesem Protokoll die Konjugation DFO-NCS an den Antikörper ist typischerweise ziemlich robust und zuverlässig. Im Allgemeinen kann die gereinigte Chelator modifizierten Immunkonjugat in&gt; 90% Ausbeute erhalten werden, und unter Verwendung von 3 Moläquivalenten DFO-NCS in der Anfangs Konjugationsreaktion wird eine Anpassungsgrad-Markierung der Chelatbildner von etwa 1,0-1,5 DFO zu erhalten / mAb. Die 89 Zr radioaktiven Markierung und Reinigungsschritte des Verfahrens sind ebenfalls einf...

Aufgrund seiner mehrtägigen radioaktiven Halbwertszeit und günstigen Zerfallseigenschaften eignet sich das Positronen-emittierende Radiometall 89Zr hervorragend für den Einsatz in Antikörper-basierten Radiopharmaka für die PET-Bildgebung. In diesem Protokoll werden die Biokonjugation, Radiosynthese und präklinische Anwendung von 89Zr-markierten Antikörpern beschrieben.

Die Biokonjugation und Radiosynthese<sup&gt; 89</sup&gt; Zr-DFO-markiertem Antikörper

The exceptional affinity, specificity, and selectivity of antibodies make them extraordinarily attractive vectors for tumor-targeted PET ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, einen mit Zirkonium-89-DFO markierten radioimmunkonjugierten Wirkstoff herzustellen und dessen Leistungsfähigkeit in vivo zu bewerten. Dies wird erreicht, indem zunächst der Chelator Deferoxamin an den Antikörper angebunden wird. Im zweiten Schritt erfolgt die Radiomarkierung des Antikörper-DFO-Konjugats mit Zirkonium-89.Anschließend wird das radioimmunkonjugat mittels Gelpermeationschromatographie gereinigt. Der letzte Schritt besteht in der Durchführung einer Positronen-Emissions-Tomographie (PET) an einem Mausmodell des Krebses. Letztendlich dient die PET-Bildgebung der Aufnahme von Bildern zur in-vivo-Verteilung des mit Zirkonium-89 markierten radioimmunkonjugats.Im Allgemeinen können Personen, die mit dieser Methode neu sind, Schwierigkeiten haben, da die Einstellung des pH-Werts der Zirkonium-89-Oxalatlösung etwas heikel sein kann. Ich werde dieses Verfahren gemeinsam mit Dalia Abdi, einer Technikerin in unserem Labor, demonstrieren. Bereiten Sie zunächst eine Lösung von zwei bis fünf Milligramm pro Milliliter J 5 91 in einem Milliliter 0,5-molarer HEPES-Pufferlösung in einem 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen vor,

the-bioconjugation-and-radiosynthesis-of-89zr-dfo-labeled-antibodies

Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

Dieses Video beschreibt die Technik der präzielgerichteten Radioimmuntherapie oder PRIT, bei der Immunkonjugate gefolgt von Radioliganden zur Behandlung von Tumoren verabreicht werden. Diese Radioimmuntherapie reduziert die Strahlendosis für gesundes Gewebe und verwendet Radionuklide mit sehr geringen Halbwertszeiten, die mit antikörperbasierten Vektoren inkompatibel sind.

Pretargeted Radioimmuntherapie: Eine Methode zur gezielten Verabreichung von therapeutischen Radionukliden an Tumore

Dieses Video demonstriert eine Technik, die ein Radioimmunkonjugat für die in vivo Bildgebung eines Tumors in einem Mausmodell beinhaltet. Bei der Injektion des Radioimmunkonjugats binden die Antikörper des Konjugats an ein spezifisches Membranantigen auf den Krebszellen. Der Radiotracer des Konjugats emittiert Positronen, die mit benachbarten Elektronen interagieren, um Energie zu erzeugen, die von einem Positronen-Emissions-Tomographie-Scanner (PET) detektiert wird, um ein Bild des Tumors zu...

Eine in vivo PET-Bildgebungstechnik zum Nachweis von Tumoren in einem Mausmodell mit radioaktiv markierten Antikörpern

Die bioorthogonale inverse Elektronennachfrage Diels-Alder-Cycloaddition wurde genutzt, um eine effektive und modulare prägezielte PET-Bildgebungsstrategie für Krebs zu entwickeln. In diesem Protokoll werden die Schritte dieser Methodik im Kontext eines Modellsystems beschrieben, das den auf Darmkrebs abzielenden Antikörper huA33 und einen 64-Cu-markierten Radioliganden verwendet.

Die Nutzung der Bioorthogonale inversem Elektronenbedarf Diels-Alder-Cycloaddition für Pretargeted PET Imaging

Ein detailliertes Verfahren für die Synthese eines 125 I-markierten Azid und die radioaktiven Markierung von dibenzocyclooctyne (DBCO) -Gruppe-konjugierten, 13 nm große Goldnanopartikel einen kupferfreien Klick - Reaktion beschrieben.

Ein optimiertes Protokoll für die effiziente radioaktive Markierung von Gold-Nanopartikeln durch eine Verwendung von<sup&gt; 125</sup&gt; I-markiertem Azide prosthetische Gruppe

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Radiomarkierung und in vivo Testung von dreizackigen 99mTc(I)-Chelat-Tetrazin-Derivaten für Pre-Targeting und bioorthogonale Chemie.

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In diesem Protokoll wird die Synthese von Hülsen, ein Phenyoxadiazolyl Methyl Sulfon-basierte Reagenz für die Website-selektive Befestigung der Ladungen an die Thiole von Biomolekülen, insbesondere Antikörper beschrieben. Darüber hinaus beschreiben wir die Synthese und Charakterisierung von eine Hülsen tragenden bifunktionelle Chelator und die Konjugation zu einem Modell-Antikörper.

Synthese und Biokonjugaten der Thiol-reaktive Reagenzien für die Erstellung der Website selektiv geändert Immunokonjugate

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Bestimmung der Bindungsaffinität (KD) von radioaktiv markierten Antikörpern gegen immobilisierte Antigene

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Positronen-Emissions-Tomographie-Bildgebung des Zelltransports: Eine Methode der radioaktiven Markierung von Zellen

Diese Arbeit beschreibt die automatisierte Herstellung von bis zu 1,7 GBq [68Ga]Ga-FAPI-46 auf dem iPHASE MultiSyn Synthesizer für die PET-Bildgebung von Fibroblasten-Aktivierungsproteinen.

Eine automatisierte Radiosynthese von [68Ga]Ga-FAPI-46 für den routinemäßigen klinischen Einsatz

Lernen Sie die Biokonjugation und Radiosynthese von Zirkonium-89-DFO-markierten Antikörpern für PET-Bildgebung. Diese Methode ermöglicht präklinische Tumorvisualisierung in Mausmodellen.

Die Biokonjugation und Radiosynthese

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