Name: Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T16:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Erfahren Sie Zweiphotonen-Imaging neuronaler Vorläuferzellen in der Maus Rückenmark. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbeobachtung zellulärer Interaktionen mit Axonen zur Untersuchung regenerativer Prozesse.

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Diese Arbeit wurde teilweise unterstützt durch die National Institutes of Health (NIH) Grants R01 GM-41514 (an M.D.C.), R39 GM-048071 (an I.P.) und R01 NS-074987 (an T.E.L.) und den National Multiple Sclerosis Society (NMSS) Collaborative Center Research Award CA1058-A-8 (an C.M.W., T.E.L. und M.D.C.), NMSS Grant RG4925, NIH Training Grant T32-AI-060573 (an M.L.G.), NMSS Postdoctoral Fellowship FG 1960-A-1 (an J.G.W.) und Finanzierung durch die George E. Hewitt Foundation for Medical Research (M.P.M.).

HINWEIS: Ethics Statement: Das Protokoll für die Behandlung der Tiere wurde von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee (IACUC) von der University of California, Irvine, Protokoll # 2010-2943 genehmigt. 1. Entfernen des Rückenmarks <ol><li> Zeigen Papierhandtücher mit ~ 100% Flüssigkeit Isofluran USP benetzt in euthanizing Kammer und legen trockenen Papierhandtücher auf. Zeigen Maus in Kammer auf der Oberseite des trockenen Papiertüchern so Maus die Isofluran nicht berühren, und sicherstellen, dass die Kammer bedeckt. Frühestens nach einer Minute nach dem Atemstillstand zu gewährleisten, dass die Maus euthanasiert. </li><li> Führen Sie einen Rückendurchtrennung des Halses, um sicherzustellen, wird die Maus getötet. Haben einen Genickbruch nicht durchführen, da dies das Rückenmark beschädigt werden. </li><li> Sprühen Sie die Maus mit 70% Ethanol, um das nasse Haar. </li><li> Scharfe Feine Schere, um die Haut und Haar von der Rückseite der Maus zu entfernen, um die Wirbelsäule von etwa Gebärmutterhalskrebs Lamina 1 aussetzen (C1) Zu sakralen Lamina 4 (S4). </li><li> Mit einem Skalpell mit einer # 10 Klinge, stellen Schnitte auf der linken und rechten Seite der Wirbelsäule, um es von Muskeln und Fett zu trennen. Dadurch wird die Entfernung von dem Rückenmark erleichtert. </li><li> optional: eine gekrümmte Luer Rongeure kann zur Schaufel entfernt zusätzliche Fleisch werden. </li><li> Halten Sie die Spitze der Wirbelsäule mit Wellen Graefe Pinzette, legen Titan gebogenen Vannas Schere mit der gewölbten Seite nach oben in das freiliegende Wirbelsäule an C1, man aufpassen, das Rückenmark nicht zu berühren. </li><li> Schieben Sie den Titan gebogenen Vannas Schere ganz nach rechts und machen einen kleinen Schnitt. Eine kleine Crunch-Sound zu hören sein und fühlte, wie die Schere die Wirbel. Wiederholen Sie diesen Schnitt auf der äußersten linken Seite des Kabels. Achten Sie darauf, nicht zu schnell zu gehen oder zu groß, von einem Schnitt, da dies das Risiko eine Beschädigung der Schnur mit der Schere. </li><li> Die einzelnen Plättchens sollte mit der Pinzette angehoben, nachdem die Seiten der Wirbelsäule geschnitten zu werden. REPEAT Sie diesen Schritt für jede Schicht bis S4, weiterhin zu halten und ziehen Sie die Rückenmarkswirbel. Hinweis: die Wirbel oberhalb der Transplantatstelle wahrscheinlich ab, wenn man ihn auf die Transplantatstelle geschnitten kommen. Fahren Sie den Vorgang ab knapp unter der Transplantation Website. </li><li> optional: legen Sie den Wirbel nach unten um zu sehen, wo die Transplantation Website hat und zu messen und schneiden ~ 20 mm rostral und kaudal der Transplantation Website. HINWEIS: Bei der Transplantation von NPCs mehr nicht als transplantierten NPC benötigt in der Regel nicht weiter migrieren als 15 mm sein. Die Höhe der Wirbelsäule benötigt wird abhängig vom Experiment und Migrationseigenschaften der Zelltyp verpflanzt. Machen rostralen und kaudalen Schnitte, die zur Transplantation Website gleich weit sind die Transplantation Website, um während der Bildgebung leichter entfernt werden können. </li><li> Mit einem Skalpell mit einer # 11 Klinge sorgfältig geschnitten Ganglien auf der rechten und linken Seite der Bauchseite der Wirbelsäule ausgehend von der rostralen Ende. Dies wkrank ermöglichen das Rückenmark aus dem ventralen Wirbel leichter entfernt werden. HINWEIS: Fertig schnell (Schritte von 1,7 bis 1,11), wird das Rückenmark nicht austrocknen. Allerdings kann 1x PBS auf die Schnur verabreicht werden, um sie feucht zu halten. </li><li> Drehen Sie die Maus und halten Sie die Maus nach oben, damit das Rückenmark nach unten zeigt. Schieben Sie vorsichtig das Rückenmark mit geschlossenen gezackten Graefe Pinzette. Ohne nicking das Rückenmark, sorgfältig geschnitten verbleibende Ganglien, damit das Rückenmark in einem einzigen intakten Stück angehoben werden. </li><li> Stellen Sie sicher, das Rückenmark in RPMI-1640 und auf Eis für den Transport zum 2P Mikroskop. </li></ol> 2. Herstellung von Spinal Cord for Imaging <ol><li> Einbetten des Rückenmarks in Agarose <ol><li> Halten Sie die isolierten Rückenmark in gekühlt RPMI-1640 auf Eis vor der Bildgebung. </li><li> Abwiegen Agarose (niedrige Geliertemperatur) und euch eine 5% ige Lösung in 5 ml 1x PBS. Mikrowelle den 5% igen Lösung für 15 Sekunden, um den ag lösenmachte sich auf und lassen Sie die Lösung abkühlen auf 37 ° C. </li><li> Bereiten Sie das Rückenmark, indem Sie sie auf ein Blatt Parafilm mit der Bauchseite nach oben ein. </li><li> Pipette ca. 5 ml 5% Agarose-Lösung über die Bauchseite der Wirbelsäule. Lassen die Agarose verfestigt durch Abkühlen auf Raumtemperatur. Voll Erstarrung dauert ca. 5 min. </li><li> Eine dünne Schicht von Gewebekleber auf eine 22 mm Quadratdeckglas. </li><li> Kehren Sie die eingebettete Rückenmark, indem die Bauchseite auf Parafilm. Die Rückenseite wird nun nach oben zeigen. Halten Sie das Deckglas auf der Rückenseite, und tauchen Sie die Agarose eingebettet Rückenmark / Deckglas Vorbereitung in RMPI, den Klebstoff zu verfestigen. Entfernen Sie das überschüssige erstarrte Agarose mit einer Rasierklinge. </li></ol></li><li> Montage des Rückenmarks auf dem Mikroskoptisch <ol><li> Vaseline auf die Unterseite des Deckglases. Dies stabilisiert die Vorbereitung während der Perfusion. </li><li> Stellen Sie das Rückenmark Zubereitung in eineAbbilden und auf dem Mikroskoptisch mit der ventralen Seite nach oben in Richtung des 25X Tauchobjektivseite. Die speziell angefertigten Bild auch ca. 20 mm tief, 50 mm lang und 50 mm breit. </li><li> Bild während Superfusion der Vorbereitung mit wärmten (37 ° C), mit Sauerstoff angereichert (95: 5 Sauerstoff: Kohlendioxid-Carbogen) RPMI-1640-Medium ohne Serum. <ol><li> Vorwärmen Medien bis 37 ° C im Wasserbad und an der Schlauchpumpe, indem Sie den Schlauch in die Medienflasche. </li><li> Behalten die Flüssigkeitstemperatur bei 37 ° C eine Heizvorrichtung an der Verbindung der Rohrleitung mit der Kammer. Superfuse Medium durch gut bei 3 ml / min unter Verwendung von Schläuchen auf die Schlauchpumpe (1B) verbunden ist. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. 2P Imaging des ventralen Rückenmark <ol><li> Mikroskop-Setup <ol><li> Erwerben Sie Bilder von Thy1-eYFP Rückenmark mit einem Chameleon Ultra-Ti: Saphir-Laser bis 900 nm eingestellt. Dämpfen Laserleistung auf dieProbe auf &lt;5%, um minimale Phototoxizität 16 zu gewährleisten. Haltetemperatur durch Perfusion sauerstoff perfundiert RPMI-1640 mit einer konstanten 37 ° C unter Verwendung einer einzelnen Inline-Lösung Heizvorrichtung stabile Bildgebung zu gewährleisten und um Gewebe Drift und Zellschäden zu verhindern. </li><li> Um eGFP und eYFP Fluoreszenzsignal zu trennen, setzen Sie ein 520 nm Single-Rand dichroitischen und eine 560 nm Single-Rand dichroitischer Strahlteiler in Reihe 2P Emission in drei Kanäle zu trennen, absichtlich Spaltung der grüne Emission, um die Sichtbarkeit zu verbessern. HINWEIS: Diese Kanal werden als blau-grün (Mission &lt;520 nm), grün-gelb (520-560 nm) und rot (Emissions&gt; 560 nm) bezeichnet. Photomultiplierröhren detect emittierte Licht in jedem Kanal. </li></ol></li><li> Lokalisierung Bildgebung Bereiche von Interesse <ol><li> Mit dem Okular und eine Hellfeld-Lichtquelle, konzentrieren sich die Tauchziel am ventralen Rand des Rückenmarks, ein Referenzpunkt gesetzt. </li><li> Stellen Sie sicher, Umgebungslichtquelle ausgeschaltet ist und swJuckreiz an 2P Anregung durch Öffnen der Laserverschluß. </li><li> Falls verfügbar, bei der Suche Gewebe für Bereiche von Interesse, verwenden Sie eine niedrigere Auflösung, höhere Lautstärke ohne Digitalzoom und eine höhere Abtastrate als beim Erwerb von endgültigen Bilder. Typische Einstellungen mit diesem System bei der Suche Gewebe für eine Region von Interesse sind: Auflösung: 256 Pixel; Volumen: x = 600 &amp; mgr; m, y = 600 um, z = 0 bis 300 &amp; mgr; m. </li><li> Beachten Sie die eYFP Axone in der Nähe des ventralen Rand des Rückenmarks. Signal der zweiten Harmonischen aus Kollagen (blau) am hellsten in der Rückenmarksgewebe Rand. Suchen Sie die eYFP Axone nur auf die zweite harmonische Signal dorsal aus dem Kollagen und eYFP Signal wird in der grün-gelb Kanal visualisiert. </li><li> Finde die Transplantatstelle in der Längsmitte des Rückenmarks Präparation 14. Bei Mäusen 1 Tag nach eGFP-NPC-Transplantation, suchen Sie die Transplantation Website durch die Fokussierung des Strahlengangs in der z-Ebene tief in das Gewebe. Die Transplantation Website will unterscheiden sich leicht zwischen den Tieren, sondern ist in der Regel ~ 200 &amp; mgr; m von der ventralen Rand entfernt. Beachten Sie die Cluster von eGFP-NPCs in der weißen Substanz Wege, näher an der ventralen und Seitenränder in Mäusen nach Tag 1 nach der Transplantation. </li></ol></li><li> Der Erwerb endgültigen Bilder <ol><li> Erwerben Bildauflösung von 512 Bildpunkten; Volumen: x = 270 &amp; mgr; m, y = 212 &amp; mgr; m und z = 100 &amp; mgr; m mit 6 Slidebook Software. Kompilieren z-Stacks durch den Erwerb von sequenziellen Fokusebenen in Schritten von 2,5 um. </li><li> Führen Sie eine bidirektionale Abtastung mit der richtigen Zeilensprung-Offset, um eine schnelle Quantifizierung eventueller Migrieren von Objekten im Rückenmark zu gewährleisten. Sicherzustellen, dass die ideale Erfassungsbildrate zellulären Geschwindigkeit zu bestimmen, innerhalb des Rückenmarks ist ungefähr 1 Rahmen / sec. HINWEIS: Imaging-Einstellungen können auf individuelle Benutzereinstellungen, wie beispielsweise Erfassungsbildrate, Bildauflösung und Bildmengen geändert werden. Größere Bildmengen werden in der Regel länger, um in einem giv erwerbenen Auflösung. </li><li> Analysieren, Ernte, glatt und Pseudoslidebook-Bilddateien mit Bildanalyse-Software wie Bitplane Imaris 7.7. Produzieren letzte Zeitraffer-Videos durch Kämmen aufeinanderfolgenden Bildgebungsvolumen mittels eines automatisierten Verfahrens in Slidebook und Imaris. </li></ol></li></ol>

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Die Autoren haben keine konkurrierenden Interessen.

Echtzeit-2P Bildgebung von intaktem Gewebe ist erforderlich, um NPC Kinetik und Interaktionen nach der Transplantation in die demyelinisierten Maus Rückenmark zu untersuchen. Intravital Imaging-2P wird häufig verwendet, um zelluläre Dynamik auf der Rückenseite des Rückenmarks in lebenden Mäusen zu bestimmen und wurde genutzt, um Rücken Demyelinisierung in demyelinisierende Erkrankung 17-19 studieren. Da transplantierte NPCs wandern zur ventralen weißen Substanz, die zu tief, um Bild in situ mit 2P-Mikroskopie...

Mausmodelle der Demyelinisierung, einschließlich experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) und intrakranielle Infektion mit neuroadapted Maus-Hepatitis-Virus (MHV), sind ausgezeichnete Werkzeuge zur molekularen Signalwege und zellulären Interaktionen mit der Krankheit zu studieren. Sie haben dazu geführt, und unterstützt die Wirksamkeit der FDA zugelassenen pharmazeutischen Therapien, die sich vornehmlich an Einstellung der Autoimmun- und Entzündungs ​​1. Sobald jedoch endogenen Remyelinisierung ausgefallen ist, die gegenwärtig zugelassenen Therapien nicht wirksam beheben demyelinisierten Läsionen im zentralen Nervensystem. Daher sind die Reparaturorientierten Therapien in diesem Stadium der Erkrankung kritisch für die Linderung von chronischen Symptomen und Verbesserung der Lebensqualität. In letzter Zeit wurden neurale Vorläuferzellen (NPCs) in den Vordergrund als eine mögliche regenerative Therapieform gekommen, um Bereiche der Entzündung und Demyelinisierung Ziel. Mehrere Studien haben die Fähigkeit der NPCs zu endogeno induzieren hervorgehobenRemyelinisierung uns und machen Sie direkt in die Remyelinisierung 2-8. Da NPCs in direktem Remyelinisierung beteiligt sind, ist es unerlässlich, die Kinetik und Wechselwirkungen mit körpereigenen Zellen nach der Transplantation zu verstehen. Nach der Transplantation, wandern NPCs ventral Bereichen der weißen Substanz Schaden, dann rostral und kaudal in Bezug auf die Transplantatstelle 5,9. Die Kinetik der Migration unterschiedlich in Reaktion auf Umweltreize; NSC in einen nicht beschädigten Rückenmark transplantiert größere Geschwindigkeiten als NSC in einen beschädigten Bandkabel 6 transplantiert. Nach einer Wanderungsperiode übertragen NSC proliferieren umfassend, mit einer höheren Geschwindigkeit in einer beschädigten Wirbelsäule relativ zu intaktem Rückenmark 6. Schließlich sind die meisten NPCs differenzieren sich in Oligodendrozyten und initiieren direkten Remyelinisierung 4,6,9. Die demyelinisierten Läsion ist komplex und kann eine vielfältige Population von Zellen in verschiedenen Stadien einer umfassenctivation. Zum Beispiel kann ein aktiver Multipler Sklerose (MS) Läsion eine signifikante Population von aktivierten T-Zellen, M1 Mikroglia und M1 Makrophagen, aber eine chronische Stumm MS Läsion kann hauptsächlich aus reaktiven Astrozyten mit wenig Entzündungszellen 10-13 umfaßt, umfassen. Aufgrund der Vielfalt von Effektorzellen, Zwei-Photonen (2P) Bildgebung in Mausmodellen der Demyelinisierung ist ein äußerst nützliches Werkzeug zur besseren Verständlichkeit lokalen zellulären Interaktionen innerhalb der Läsion. MS und vielen intensiv genutzt MS Forschungsmodellen wird die Mehrzahl von Läsionen an der Bauchseite des Rückenmarks, einer Region unzugänglich intravitalen 2P Abbildungs ​​aufgrund Läsionstiefe und dem hohen Lipidgehalt des Rückenmarks. Um diese Probleme und Untersuchung der Zell-Zell-Wechselwirkungen innerhalb Läsionen entlang der ventralen Rückenmark umgehen haben wir ein einfaches ex vivo 2P Abbildungs ​​Zubereitung 6 entwickelt. Diese Studie folgt auf eine frühere Veröffentlichung Methoden, die zeigten,die Prozedur zur Verpflanzung enhanced green fluorescent protein (eGFP) exprimierenden NSC in das Rückenmark von Mäusen nach JHMV Stamm von MHV-induzierten Demyelinisierung 14. Fünf Wochen alten Mäusen mit JHMV infiziert und mit eGFP-NPCs transplantiert bei thorakalen Ebene 9 am Tag 14 nach der Infektion. Die hier vorgestellte Protokoll enthält detaillierte Anweisungen zum Extrahieren des Rückenmarks, geben Sie ein Ex-vivo-Agarose Vorbereitung und Bild transplantiert eGFP-NPC-Interaktionen mit verbesserten gelb fluoreszierendes Protein (eYFP) exprimierenden Axone. Mäuse, eYFP unter der neuronalen spezifischen Thy1 Promotor In diesem Verfahren wurden 15 verwendet. Nur ein Teil der Axone zum Ausdruck eYFP, so dass es nützlich für die Abbildung einzelner Axone. Hier zeigen wir, Rückenmark nach 7 Tagen nach der Transplantation entfernt; jedoch kann das Rückenmark zu jedem Zeitpunkt nach der Transplantation gewonnen werden. Während wir zeigen, Wechselwirkungen von NPCs mit beschädigten Axone können unsere Protokoll in Kombination mit genetischen Fluoreszenzmarker eingesetzt werdenvon anderen Zelltypen in einer Vielzahl von zellulären Interaktionen ganzen Rückenmark der Maus vorkommen untersuchen.

<table><tbody><tr><td>Isofluran, USP</td><td>Piramal Critical Care, Inc</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Feine Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td>scharfe</td></tr><tr><td>Skalpellklinge #10</td><td>Fine Science Tools</td><td>10010-00</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellgriff</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Luer rongeurs</td><td>Fine Science Tools</td><td>16001-15</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Pinzette</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15615-08</td><td></td></tr><tr><td>Skalpellklinge #11</td><td>Fine Science Tools</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco</td><td>12-115F</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, niedrige Geliertemperatur</td><td>Sigma</td><td>A9414-25G</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Vetbond (Tissue-Klebstoff)</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>22 mm quadratischer Deckschirm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-547</td><td></td></tr><tr><td>25X Tauchobjektiv, 1,1 NA</td><td>Nikon</td><td>CFI Apo LWD 25XW</td><td></td></tr><tr><td>Single Inline Solution Heater</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0102</td><td></td></tr><tr><td>520 nm einschneidiger dichroitischer Strahlteiler</td><td></td><td>Semrock FF520-Di02-25x36</td><td>Brightline</td></tr><tr><td>560 nm dichroitischer Strahlteiler mit einer Kante</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25x36</td><td>Brightline</td></tr><tr><td>Photomultiplier-Röhren</td><td>Hamamatsu</td><td>R928</td><td></td></tr><tr><td>C/L Schlauchpumpe mit variabler Drehzahl</td><td>Masterflex</td><td>77122-22</td><td></td></tr><tr><td>digitales Thermometer</td><td>Comar Instruments</td><td>3501</td><td></td></tr><tr><td>Chameleon Ultra Ti:Saphir Laser</td><td>Coherent</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Slidebook 6 Software</td><td>3i</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Imaris 7.7 Software</td><td>Bitplane</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

zwei-photonen-imaging von zelluläre dynamik in der maus spinal cord

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Zwei-Photonen-Mikroskopie (2P) wird verwendet, um zelluläre Dynamiken und Wechselwirkungen tief im lebenden, intakten Gewebe aufzudecken. Hier stellen wir eine Methode zur Bildgebung lebender Zellen im murinen Rückenmark vor. Diese Technik eignet sich hervorragend zur Analyse der Dynamik von neuralen Vorläuferzellen (NPC) nach der Transplantation in Rückenmark bei neuroinflammatorischen demyelinisierenden Erkrankungen. NPCs wandern zu Stellen axonaler Schädigung, vermehren sich, differenzieren sich zu Oligodendrozyten und nehmen an der direkten Remyelinisierung teil. NPCs sind damit eine vielversprechende therapeutische Behandlung zur Linderung chronischer demyelinisierender Erkrankungen. Da transplantierte NPCs in die geschädigten Bereiche auf der ventralen Seite des Rückenmarks wandern, ist eine traditionelle intravitale 2P-Bildgebung unmöglich, und bisher waren mit histochemischen Färbeansätzen nur Informationen über statische Wechselwirkungen verfügbar. Obwohl diese Methode entwickelt wurde, um transplantierte NPCs im ventralen Rückenmark abzubilden, kann sie auf zahlreiche Studien an transplantierten und endogenen Zellen im gesamten Rückenmark angewendet werden. In diesem Artikel demonstrieren wir die Präparation und Bildgebung eines Rückenmarks mit verstärkten gelb fluoreszierenden Protein-exprimierenden Axonen und verstärkten grün fluoreszierenden Protein-exprimierenden transplantierten NPCs.

<html> Während die explantiert Rückenmark Bildgebungsprotokoll kann verwendet werden, um jede Fluoreszenz innerhalb des Rückenmarks zu visualisieren, unser Vertreter Ergebnisse zeigen eGFP-NPC-Interaktionen mit eYFP-Axone. Zunächst zeigen wir die eingebetteten ventralen Rückenmark Zubereitung in 1A. Als nächstes zeigen wir die 2P Mikroskopaufbau und Schlüsselkomponenten in der 1B, Fig. 2 zeigt eGFP und eYFP Fluoreszenz in einem Z-Stapel innerhalb des ventralen Rückenmark. Erwerb von aufe...

Eine neue ex vivo Herstellung zum Abbilden der Rückenmark der Maus. Dieses Protokoll ermöglicht die Zwei-Photonen-Bildgebung von lebenden zellulären Interaktionen ganzen Rückenmark.

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, die Wechselwirkungen zwischen fluoreszenzmarkierten transplantierten neuronalen Vorläuferzellen oder NPCs und fluoreszierenden Axonen im Maus-Rückenmark in Echtzeit abzubilden. Dies wird erreicht, indem das Rückenmark von mit NPCs transplantierten Mäusen vorsichtig entfernt und in 5% Aros eingebettet sowie auf einen Deckgläsern befestigt wird. Die Orientierung des Rückenmarks kann verändert werden, um die Fluoreszenz in beliebigen Bereichen des Rückenmarks betrachten zu können.Im zweiten Schritt wird die Rückenmarkspräparation auf dem Zwei-Photonen-Bildgebungsstand platziert, um lebensfähige NPCs während einer Überströmung mit warmem, mit Sauerstoff angereichertem RPMI-Medium bis zu 10 Stunden lang abzubilden. Ein geeigneter Einzelkanten-DCF-Strahlteiler wird verwendet, um die Emissionen von YFP und GFP zu trennen. Letztendlich ermöglicht die Zwei-Photonen-Bildgebung die Visualisierung der Wechselwirkungen zwischen GFP-exprimierenden NPCs und YFP-exprimierenden Axonen im verletzten Rückenmark in Echtzeit.Mit dieser Methode lassen sich zentrale Fragen im Bereich der Neurogenese beantworten, beispielsweise welche molekularen und zellulären Signalreize für die Remyelinisierung geschädigter Axone durch transplantierte NPCs notwendig sind und wie die Kinetik dieser Remyelinisierungsereignisse aussieht. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden wie der intertidalen Zweiphotonen-Bildgebung, die nur zur Abbildung des dorsalen Rückenmarks geeignet ist, besteht darin, dass mit ihr transplantierte NPCs abgebildet werden können, die tief in den ventralen Bereich des Rückenmarks eingewandert sind. Nach Bestätigung der Tötung durch Rückenmarkdurchtrennung benetzen Sie die Maus mit 70 %igem Ethanol und entfernen anschließend mit scharfen feinen Scheren das Fell und die Haut vom Rücken des Tieres, wodurch die Wirbelsäule von etwa der Halswirbelplatte eins oder C eins bis zur Steißbeinplatte vier oder S vier freigelegt wird.Danach mit einem Skalpell mit Klinge Nummer 10 Schnitte links und rechts der Wirbelsäule vornehmen, um diese vom umgebenden Muskel- und Fettgewebe zu lösen, und zusätzlich überschüssiges Gewebe um die Wirbelsäule herum sowie darauf entfernen. Dies erleichtert das Entfernen der Wirbel. Anschließend, während man mit gezahnten grauen Pinzetten die Spitze der Wirbelsäule festhält, die gekrümmten Titan-Scheren mit der konkaven Seite nach oben in die freigelegte Wirbelsäule am Wirbel C1 einführen und darauf achten, das Rückenmark nicht zu berühren.Schieben Sie die Schere ganz nach rechts und führen Sie einen kleinen Schnitt durch. Ein leises Knirschgeräusch sollte zu hören und zu spüren sein, während die Schere die Wirbel durchtrennt. Wiederholen Sie diesen Schnitt auf der äußersten linken Seite des Rückenmarks, wobei darauf zu achten ist, nicht zu schnell zu arbeiten oder zu große Schnitte anzulegen, da dies das Rückenmark beschädigen könnte.Nachdem die Seiten der Wirbel durchtrennt sind, sollte die einzelne Lamina mit der Pinzette angehoben werden können. Wiederholen Sie die Schnitte links und rechts für jede Lamina, bis S vier erreicht ist. Halten und ziehe weiterhin das Rückenmark und die Wirbel zurück.Die Wirbel oberhalb der Transplantatstelle können abfallen, sobald die Wirbelsäule bis zur Transplantationsstelle abgeschnitten wurde. Sobald die Wirbel bis zum vierten Sakralwirbel (S4) abgetragen sind, legen Sie die Wirbel an, um die Lage der Transplantationsstelle besser visualisieren zu können, und schneiden Sie etwa 20 Millimeter kaudal und rostral zur Transplantationsstelle ein. Verwenden Sie nun ein Skalpell mit einer Klinge der Größe 11, um vorsichtig die Ganglien auf der rechten und linken Seite der ventralen Seite des Rückenmarks zu schneiden, beginnend am rostralen Ende.Danach das Tier umdrehen und so halten, dass das Rückenmark nach unten zeigt, und mit geschlossenen, gezahnten anatomischen Pinzetten vorsichtig das Rückenmark vom Kaudalende her heraustrennen. Anschließend, ohne das Rückenmark zu verletzen, alle verbleibenden Ganglien vorsichtig durchtrennen, damit das Rückenmark als ein einziges, intaktes Stück herausgehoben werden kann, und das Präparat in Medium auf Eis legen, um das Rückenmark für die Bildgebung vorzubereiten. Das Nervengewebe auf ein Blatt Parafilm transferieren, wobei die ventrale Seite nach oben zeigt.Danach etwa fünf Milliliter frisch zubereitete 37 Grad Celsius warme 5 %ige Agar-Lösung über das Rückenmark pipettieren und bei Raumtemperatur erstarren lassen. Nach etwa fünf Minuten eine dünne Schicht Gewebekleber auf einen 22 Millimeter großen quadratischen Deckglaser auftragen und das eingebettete Rückenmark mit der ventralen Seite nach unten auf ein neues Stück Perfil umgedreht aufbringen. Den Deckglaser auf der exponierten dorsalen Seite befestigen und die gesamte Präparation in frischem Medium versenken, um den Kleber aushärten zu lassen.Verwenden Sie dann eine Rasierklinge, um das überschüssige erstarrte Agarosegel zu entfernen. Stecken Sie anschließend den Schlauch, der mit der Schlauchpumpe verbunden ist, in eine Mediumsflasche, die in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius gehalten wird, um das Medium aufzuheizen. Leiten Sie das vorgewärmte Medium mit drei Millilitern pro Minute durch eine speziell angefertigte Imaging-Wanne auf dem Mikroskopständer.Platzieren Sie dann das Rückenmarkpräparat mit der ventralen Seite nach oben in die Kammer, sodass sie der 25x-Tauchobjektivlinse zugewandt ist. Um das ventrale Rückenmark mittels Zweiphotonenmikroskopie abzubilden, verwenden Sie einen Ultratitansaphirlaser, der auf 900 Nanometer eingestellt ist, und dämpfen Sie die Laserleistung am Objekt auf weniger als 5 %, um eine minimale Phototoxizität sicherzustellen. Fokussieren Sie anschließend mithilfe des Okulars und einer Hellfeld-Beleuchtung die Tauchobjektivlinse auf den ventralen Rand des Rückenmarks.Um einen Referenzpunkt festzulegen, stellen Sie sicher, dass die Umgebungslichtquelle ausgeschaltet ist. Öffnen Sie dann den Laserverschluss, um die beiden photonic citation zu schalten, falls verfügbar. Verwenden Sie beim Durchsuchen des Gewebes nach Bereichen von Interesse eine niedrigere Auflösung, ein höheres Volumen ohne digitale Vergrößerung und eine höhere Abtastrate als beim Erfassen der endgültigen Bilder.Um die Zellen zu finden, sollte man zuerst die Probe im Hellfeld unter Beleuchtung am Geweberand, an der Transplantationsstelle, fokussieren und anschließend zur Fluoreszenz wechseln. Ein großes X- und Y-Feld mit niedriger Auflösung kann dann verwendet werden, um eine große Fläche schnell überblicken zu können, während die Fokusebene tiefer in das Gewebe vorgeschoben wird. Beobachten Sie die EYFP-Axone in der Nähe des ventralen Randes des Rückenmarks.Das hier in Blau beobachtete zweite harmonische Signal des Kollagens ist am Rand des Rückenmarkgewebes am stärksten ausgeprägt. Verwenden Sie nun geeignete Bildaufnahmesoftware, um abschließend hochauflösende Bilder in sequenziellen Fokusebenen mit 2,5-Mikrometer-Inkrementen aufzunehmen, um Z-Stapel zusammenzustellen. In dieser Darstellung erscheinen die GFP-NPCs blau, und beschädigte YFP-Axone erscheinen gelb. Pseudofärbungen können später mithilfe von Bearbeitungssoftware durchgeführt werden. Führen Sie anschließend einen bidirektionalen Scan mit dem richtigen Interlay-Offset durch, um eine schnelle Quantifizierung aller wandernden Objekte im Rückenmark zu gewährleisten, wobei sichergestellt werden muss, dass die ideale Bildaufnahmefrequenz zur Bestimmung der zellulären Geschwindigkeit innerhalb des Rückenmarks auf etwa 1,7 Bilder pro Sekunde eingestellt ist.Analysieren Sie abschließend die Bilddateien mit der geeigneten Software hinsichtlich Glättung und Pseudofärbung und verwenden Sie automatisierte Prozesse, um die aufeinanderfolgenden Bildaufnahmen zu durchsuchen, um die endgültigen Zeitraffer-Videos zu erstellen. Obwohl dieses Protokoll zur Bildgebung des ausgeschnittenen Rückenmarks verwendet werden kann, um jegliche Fluoreszenz innerhalb des Rückenmarks sichtbar zu machen, zeigen diese Bilder repräsentative Wechselwirkungen zwischen EGFP-markierten neuronalen Vorläuferzellen und EYFP-markierten Axonen in einem einzelnen Z-Stapel im ventralen Rückenmark. Die Aufnahme aufeinanderfolgender Z-Stapel kann anschließend zusammengeführt werden, um Zeitraffer-Videos zu erzeugen, die zur Analyse der zellulären Dynamik in Echtzeit im intakten Gewebe dienen.Tatsächlich ermöglicht die Verwendung eines Einzelkanten-Dichroikspiegels mit 520 Nanometer und eines Einzelkanten-Dichroikspiegels mit 560 Nanometer die Trennung der EGFP- und EYFP-Signale und erlaubt die Pseudofärbung der einzelnen Kanäle in Grün und Gelb mittels der Bildgebungssoftware, wie hier gezeigt. Bei Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, darauf zu achten, dass das Rückenmark der Maus entfernt wird, ohne das Nervengewebe übermäßig zu dehnen, zu komprimieren oder versehentlich zu durchtrennen. Mit dieser Methode können beliebige Kombinationen fluoreszenzmarkierter Zellen oder Axone in Echtzeit abgebildet werden, um weitere Fragestellungen zu beantworten, beispielsweise welche Kinetik die Migration oder Remyelinisierung unter verschiedenen pharmakologischen Behandlungen oder Bedingungen aufweist.

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Ein minimal-invasiven Protokoll, um die Maus Wirbelsäule zu stabilisieren und sich...

In-vivo-Imaging von der Maus Spinal Cord mit Zwei-Photonen-Mikroskopie

Quelle: Maruoka, H., et. al. Gleichzeitige Bildgebung der Mikrogliadynamik und der neuronalen Aktivität bei wachen Mäusen. J. vis. exp.,  (2022) Dieses Video zeigt ein Zwei-Photonen-Mikroskopieverfahren zur Abbildung der neuronalen Aktivität und der Mikrogliadynamik bei einer wachen Maus während der visuellen Stimulation, wobei Kalziumtransienten und zelluläre Wechselwirkungen hervorgehoben werden.

Gleichzeitige Bildgebung der Mikrogliadynamik und der neuronalen Aktivität bei einer wachen Maus

Zeitraffer-Bildgebung am lebenden Tier liefert wertvolle Informationen über die strukturelle Reorganisation im intakten Gehirn. Hier stellen wir ein verdünntes Schädelpräparat vor, das die transkranielle Bildgebung von fluoreszenzmarkierten synaptischen Strukturen in der lebenden Mausrinde mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie ermöglicht.

Zwei-Photonen-<em&gt; In vivo</em&gt; Imaging von dendritischen Dornen in der Maus Cortex Mit einem ausgedünnten Schädel Vorbereitung

In diesem Video, beschreiben wir ein Verfahren zum Implantieren einer chronischen optischen Abbildungskammer über der dorsalen Rückenmark von einer Live-Maus. Die Kammer, chirurgischen Eingriff und chronische Bildgebung werden überprüft und demonstriert.

Ein Verfahren für die Implantation eines Spinal Kammer für Längs In-vivo- Imaging der Maus Spinal Cord

Zwei-Photonen-Intravital-Bildgebung kann verwendet werden, um Interaktionen zwischen verschiedenen Zelltypen im Rückenmark in ihrer natürlichen Gewebeumgebung bei einem chimären Knochenmarktier mit einer traumatischen Rückenmarksquetschung der Dorsalsäule zu untersuchen.

Intravital Imaging von Axonal Wechselwirkungen mit Mikroglia und Makrophagen in einem Maus-Rücken Spalte Quetschverletzung

Wir stellen eine in-Vivo imaging-Verfahren unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen, um dynamische Wirbelsäule Gefäßveränderungen nach contusive Rückenmarksverletzungen bei Erwachsenen Sprague-Dawley Ratten zu verfolgen.

Eine In Vivo Duo-Farbe-Methode für Imaging-vaskuläre Dynamik nach Contusive Spinal Cord Injury

Dieses Protokoll beschreibt die Implantation eines Glasfensters auf das Rückenmark einer Maus, um die Visualisierung durch intravitale Mikroskopie zu erleichtern.

Laminektomie und Rückenmarksfenster-Implantation in der Maus

Diese Methode beschreibt eine chronische Zubereitung, die den optischen Zugang zum Hippocampus lebender Mäuse ermöglicht. Dieses Präparat kann verwendet werden, um längsinale optische Bildgebung der neuronalen strukturellen Plastizität und aktivitätsbeschworenen zellulären Plastizität über einen Zeitraum von mehreren Wochen durchzuführen.

Längs-Zwei-Photon-Bildgebung des Dorsal Hippocampal CA1 in lebenden Mäusen

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) -Mikroskopie ermöglicht eine markierungsfreie Bildgebung von Biomolekülen basierend auf ihrer intrinsischen Schwingung spezifischer chemischer Bindungen. In diesem Protokoll wird der instrumentelle Aufbau eines integrierten SRS- und Zwei-Photonen-Fluoreszenzmikroskops beschrieben, um zelluläre Strukturen im Rückenmark lebender Mäuse sichtbar zu machen.

Im lebenden Organismus Bildgebung von biologischem Gewebe mit kombinierter Zwei-Photonen-Fluoreszenz und stimulierter Raman-Streumikroskopie

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, das die Adeno-assoziierte Virusinjektion mit der Implantation eines Schädelfensters kombiniert, um die Dynamik der Mikroglia und die neuronale Aktivität in wachen Mäusen simultan abzubilden.

Simultane Bildgebung von Mikrogliadynamik und neuronaler Aktivität in wachen Mäusen

Erfahren Sie Zweiphotonen-Imaging neuronaler Vorläuferzellen in der Maus Rückenmark. Diese Methode ermöglicht Echtzeitbeobachtung zellulärer Interaktionen mit Axonen zur Untersuchung regenerativer Prozesse.

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

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