Herstellung von Einzelzellsuspensionen für Cytofluorimetric Analyse von verschiedenen Mäusehaut Regionen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Einzelzellsuspension aus der Haut der Maus herzustellen, um die verschiedenen Populationen der residenten Immunzellen mittels zytofluorimetrischer Analyse zu identifizieren und die verschiedenen Populationen der in der Haut ansässigen Immunzellen zu identifizieren und zu isolieren. Mit dieser Technik können die Forscher die Proben aus verschiedenen Regionen der Maushaut leicht verdauen, ohne die Immunzellen, Oberflächenmacher von Interesse, zu beschädigen.

Um Hautproben aus dem Mausohr zu gewinnen, schneiden Sie die haarlosen Teile der Ohren ab und ziehen Sie mit einer Pinzette die dorsale und ventrale Seite der Organe auseinander. Kratzen Sie dann vorsichtig das Innenohr ab, um den verbleibenden Knorpel zu entfernen. Um Stückhautproben zu erhalten, rasieren Sie alle Haare des Tieres mit einer Haarschneidemaschine und tragen Sie anschließend eine Enthaarungslotion auf.

Reinigen Sie nach ein paar Minuten die Lotion und machen Sie einen vertikalen Schnitt in der Mitte des Rückens der Maus, wobei Sie den Schnitt entlang der Ränder der rasierten Bereiche um den Mauskörper herum fortsetzen. Halten Sie die Haut mit einer Pinzette an Ort und Stelle, während Sie die Probe mit den geschlossenen, abgerundeten Spitzen einer chirurgischen Schere oder eines Skalpells trennen, und trennen Sie die Haut vorsichtig von der Bauchfell- und Rückenmuskulatur. Tauchen Sie dann die Haut in eine 100-mm-Zellkulturplatte mit 10 ml eiskaltem PBS und kratzen Sie das Unterhautfett mit einer Pinzette ab.

Um eine Schwanzhautprobe zu erhalten, schneiden Sie den Schwanz ab und machen Sie mit einer chirurgischen Schere einen vertikalen Schnitt, der von der Basis des Schwanzes bis zur Spitze beginnt. Fassen Sie mit einer Pinzette den Rand des Einschnitts an der Basis des Schwanzes, fassen Sie dann den Schwanzkörper mit einer anderen Pinzette und ziehen Sie die Haut vorsichtig zur Spitze. Entfernen Sie überschüssiges Fett, indem Sie die Hautprobe vorsichtig abkratzen.

Der Fuß der Maus wird geschnitten, und um eine Hautprobe aus dem Fußballen zu gewinnen, schneiden Sie die Haut des Fußes mit einer chirurgischen Schere in Längsrichtung vom Knöchel bis zum Anfang der Finger ab, wobei darauf zu achten ist, dass keine Haare geschnitten werden. Fassen Sie dann mit einer Pinzette die Knöchelknochen, während Sie mit der anderen die Haut greifen, und ziehen Sie die Haut in Richtung der Finger, wie beim Entfernen eines Handschuhs. Um die Hautzellen zu markieren, wird das Gewebe für jede Probe in eine 35 Millimeter große Petrischale mit 2 Millilitern frisch zubereitetem Verdauungscocktail gegeben.

Zerkleinern Sie die Probe mit einer Schere in kleine Stücke und inkubieren Sie die Gewebefragmente während der Inkubationszeit 90 Minuten lang bei 37 Grad Celsius mit ein bis zwei sanften Schütteln. Gießen Sie anschließend das verdaute Hautgewebe auf ein 70-Mikron-Zellsieb in einer 66-Millimeter-Petrischale, die 1 Milliliter RPMI 1640 enthält, ergänzt mit FBS pro Schale. Waschen Sie das Sieb mit fünf Millilitern frischem Medium und drücken Sie die Proben dann mit einem Spritzenkolben durch das Netz des Siebs.

Spülen Sie den Kolben, die Schüssel und das Sieb mit 20 Millilitern frischem Medium aus und geben Sie die Gewebeaufschlämmung in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen. Nachdem alle Proben verarbeitet wurden, zentrifugieren Sie die Zellen und suspendieren Sie die Pellets in 100 Mikrolitern pro Probe von zwei Mikrogramm pro Milliliter Anti-CD16-CD32-blockierenden Antikörper in PBS plus 1 % FBS. Nach 15 Minuten bei vier Grad Celsius werden 100 Mikroliter Antikörper, wie in der Tabelle angegeben, 30 Minuten lang bei vier Grad Celsius lichtgeschützt in die entsprechenden Proben gegeben.

Am Ende der Inkubation waschen Sie die Zellen in einem Milliliter PBS plus FBS und suspendieren die Pellets wieder in 300 Mikrolitern FBS PBS. Anschließend markieren Sie die Zellen mit 2 Mikrogramm pro Milliliter DAPI für 10 Minuten bei vier Grad Celsius lichtgeschützt. Um die Leukozyten zu isolieren, schleusen Sie zuerst die DAPI-positive Population, um die abgestorbenen Zellen zu eliminieren.

Wählen Sie dann die Einzelzellen in einem Forward-Scatter-Bereich durch Forward-Scatter-Width-Diagramm aus und gaten Sie die Zellen basierend auf der Größe und Granularität der interessierenden Leukozyten. Wählen Sie als Nächstes die CD45-positiven Zellen aus und identifizieren Sie dann für jede Probe die dendritischen Hautzellpopulationen anhand ihrer CD11C- und MHC-Klasse 2-Expression. Identifizieren Sie die Makrophagen anhand ihrer CD64- und F480-Expression, die B-Zellen anhand ihrer CD19- und MHC-Klasse-2-Expression und die T-Zellen anhand der CD4- oder CD8-Expression.

Die Isolierung von Immunzellen der Haut, wie gerade gezeigt, ergibt eine Population von mehr als 50 % lebensfähigen Zellen aus allen Regionen der Haut, von denen zwischen 5.000 und 15.000 pro Quadratzentimeter CD45-positiv sind. Eine ausreichende Anzahl von dendritischen Zellen, Makrophagen, B-Zellen und T-Zellen ist auch für die nachgelagerte Analyse aus einem Quadratzentimeter Maushaut erhältlich, wie angegeben. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein nicht entzündetes Hautgewebe verdaut und die Leukozyten für die Faxanalyse isoliert