Name: Herstellung von Einzelzellsuspensionen für Cytofluorimetric Analyse von verschiedenen Mäusehaut Regionen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus Mäusehaut für die zytofluorimetrische Analyse. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von Immunzellpopulationen ohne Beschädigung der Oberflächenmarker.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, IG14593, MFAG13235), der Fondazione Cariplo (Grant 2010-0678 und NANOVAC) und der Fondazione Regionale per la Ricerca Biomedica unterstützt.

Studienzulassung: Die experimentellen Protokolle wurden vom italienischen Ministerium für Gesundheit genehmigt (Rom, Italien) nach dem Decreto legislativo 27 novembre 1992, n. 116 &quot;attuazione della Direttiva n. 86/609 / EWG in materia di Protezione degli animali utilizzati a fini sperimentali o ad altri fini scientifici.&quot; 1. Gewinnung Hautproben <ol><li> Euthanize die Maus durch Genickbruch. </li><li> Ohr: <ol><li> Schneiden Sie den unbehaarten Teil der Ohren der Maus aus. </li><li> Separate dorsalen und ventralen Seite durch sie auseinander mit einer Pinzette herausziehen. Entfernen Sie alle verbleibenden Knorpeln durch sanft den inneren Teil der Ohren mit einer Pinzette Schaben. </li></ol></li><li> Trunk Haut: <ol><li> Rasieren Sie die ganze Haut des Tieres sowohl mit einem elektrischen Rasierer und mit zarten Enthaarungslotion. </li><li> Schneiden Sie die gewünschte Hautprobe (von 2 cm 2 bis zur gesamten Tierhaut) aus. <ol><li> Wenn die gesamte Rücken abschneidet und ventrale Mäusehaut, einen vertikalen Schnitt in der Mitte der Maus entlang der Grenzen der rasierten Bereichen rund um die Maus Körper zurück geschnitten und dann machen. </li><li> Vorsichtig trennen die Haut aus dem Peritoneum und Rückenmuskulatur, immer noch mit der Pinzette die Hautprobe zu halten, während die Hautprobe mit geschlossenen runden kantigen Spitzen einer chirurgischen Schere oder einem Skalpell trennt. </li></ol></li><li> Bereiten Sie eine 100 mm Zellkulturplatte mit 10 ml eiskaltem PBS enthält. </li><li> Beseitigen von subkutanem Fett durch Eintauchen der Hautprobe in PBS in der Platte, hergestellt in Schritt 1.3.3 und Abkratzen der Hautprobe mit einer Pinzette. </li></ol></li><li> Schwanz: <ol><li> Schneiden Sie den Schwanz der Maus ab. </li><li> Machen Sie einen vertikalen Schnitt auf den Schwanz mit einer chirurgischen Schere oder chirurgische Skalpell aus der Schwanzbasis beginnt und an der Spitze des Schwanzes zu erreichen. </li><li> Verwenden einer Pinzette, um die Haut vom Schwanz zu lösen. Besorgen Sie sich die Kante des Schnitts an der Basis des Schwanzes und ziehen Sie vorsichtig die Spitze zu, während die HalteKörper des Schwanzes mit einer Pinzette. </li><li> Entfernen Sie überschüssiges Fett durch die Hautprobe sanft kratzen. </li></ol></li><li> Wegelagerer <ol><li> Schneiden Sie die gesamte Maus Fuß mit chirurgischen Schere. Vermeiden jede behaarter Haut zu schneiden. </li><li> Schneiden Sie die Haut des Fußes in Längsrichtung vom Knöchel bis zum Beginn der Ziffern. </li><li> Halten Sie die Knöchel mit einer Pinzette oder mit der Hand, während die Haut mit einer Pinzette greifen und ziehen Sie die Haut in Richtung auf die Ziffern, als ob, die ein Handschuh aus. </li></ol></li></ol> 2. Verdauung <ol><li> Bereiten Sie die Verdauung Cocktail aus der Stammlösung (hergestellt wie in der Materialliste) mit folgendem Rezept: Enzymmischung (siehe Materialliste für Spezifikationen) 300 ug / ml, DNAse1 50 U / ml. Man verdünnt in RPMI 5% FBS. </li><li> Hacken Hautproben mit einer Schere in kleine Stücke in eine 35 mm Petrischale mit 2 ml Digestion Cocktail (Für Stamm Haut: 2 ml Verdauung Cocktail alle 2 cm 2 der Haut, bis zu 3 ml insgesamt). </li><li>für 90 min bei 37 ° C inkubieren. Schütteln Sie die Petrischale 1-2 mal während der Inkubation. </li><li> Gießen verdaute Hautproben auf einem 70 &amp; mgr; m Zellsieb in 66 mm Petrischale mit 1 ml RPMI1640 5% FBS. </li><li> Waschen Sie das Sieb mit 5 ml RPMI 1640 5% FBS. </li><li> Drücken Sie die Probe durch die Zelle Sieb mit einem Spritzenkolben. </li><li> Flush Kolben, Petrischale und Sieb mit 20 ml RPMI1640 5% FBS, Transfer in 50-ml-Tube. </li></ol> 3. Antikörper und Labeling <ol><li> Waschen der erhaltenen Suspension zweimal mit 5 ml PBS, das 1% FBS (oder BSA). </li><li> Beschriften Sie die erhaltene Zellsuspension mit den gewünschten Antikörper. <ol><li> Resuspendieren der Proben in 100 ul / Probe einer Mischung enthaltend 2 &amp; mgr; g / ml aCD16 / CD32 (Klon 2.4G2), verdünnt in PBS 1% FBS. </li><li> 15 min Inkubieren bei 4 ° C, um nicht-spezifische Bindung der gewünschten Antikörper via Fc-Rezeptoren zu blockieren. </li><li> Fügen Sie die angegebenen Antikörper in der Tabelle1. <ol><li> Bereiten einer Mischung die gewünschten Antikörper in 100 &amp; mgr; l / Probe von PBS 1% FBS in einer Konzentration von 4 ug / ml verdünnt. </li><li> Füge 100 &amp; mgr; l des in Schritt hergestellten Mischung 3.2.3.1 zu jeder Probe, so dass in dem Rohr, wird es in einer Endkonzentration von 2 &amp; mgr; g / ml mit einem Volumen von 200 &amp; mgr; l der Antikörpermischung sein. </li></ol></li><li> Inkubieren für 30 min bei 4 ° C und die Abdeckung von Licht. </li></ol></li><li> Waschen mit 1 ml PBS, das 1% FBS, Zentrifuge für 5 Minuten bei 400 · g, den Überstand verwerfen und resuspendieren in 300 ul PBS, das 1% FBS. </li><li> Hinzufügen DAPI in einer Endkonzentration von 2 &amp; mgr; g / ml und Inkubation bei 4 ° C, geschützt vor Licht für 10 min. </li><li> Analysieren Sie die Proben durch FACS erhalten. <ol><li> Um Leukozyten zu isolieren, verwenden Sie die folgende Gating-Strategie: <ol><li> Zuerst beseitigen alle toten Zellen durch auf der DAPI- Bevölkerung Gating. </li><li> Wählen Sie Singuletts im FSC-A gegen FSC W Plot , wie in Abbildung 1 angegeben </strong&gt;. </li><li> Tor die darauf basierenden Zellen nach Größe und Granularität typisch für die Leukozyten von Interesse. </li><li> Wählen Sie CD45 + Zellen in der FSC-A CD45 Plot wie in Abbildung 1 dargestellt. </li></ol></li><li> Unterscheiden die verschiedenen Populationen von Leukozyten durch die Expression von Oberflächenmarkern, wie folgt: <ol><li> Identifizieren DCs als CD11c + MHC II + Zellen. Diese können später für die Expression von CD207 analysiert werden, um zu unterscheiden, Langerhans&#39;schen Zellen und CD207 + Dermal DCs von CD207- Dermal DCs. </li><li> Identifizieren Makrophagen als CD64 + F4 / 80 + Zellen. </li><li> Identifizieren B-Zellen als CD19 + MHCII + Zellen. </li><li> Identifizieren T-Zellen als CD8 + oder CD4 + Zellen. </li></ol></li></ol></li></ol>

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<li>Bernard, M., Samira, T., Sandrine, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origins+and+functions+of+dendritic+cells+and+macrophages+in+the+skin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The origins and functions of dendritic cells and macrophages in the skin.</a> Nature Reviews Immunology. 14 (6), 417-428 (2014).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Wir haben ein Verfahren zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus verschiedenen Maushautregionen beschrieben. Verfahren nach Verdauung wir angenommen haben, verursacht nicht nur hohe Ausbeuten, sondern bewahrt auch die Expression von Oberflächenmarkern, die für die nachfolgende FACS-Analyse von grundlegender Bedeutung ist. Die Verwendung eines Cocktails von Kollagenase I und II und Thermolysin, garantiert minimale Charge zu Charge unterschiedliche Enzymaktivität macht dieses Verfahren s...

Die Haut ist eines der größten Organe des Körpers und ihre große Oberfläche ist ständig der äußeren Umgebung ausgesetzt. Daher muss die Haut den Organismus vor potenziellen Bedrohungen schützen, um die Homöostase aufrechtzuerhalten, sowohl mit physikalischen Mitteln als auch durch aktiven Schutz vor einem möglichen Eindringen von Krankheitserregern. Ähnlich wie die Darm- und Lungenschleimhaut beherbergt die Haut eine Vielzahl von Immunzellen, die kontinuierlich mit dem Epithel interagieren, um die Immunüberwachung aufrechtzuerhalten. Dieses komplexe System, an dem sowohl Immun- als auch Nicht-Immunzellen der Haut beteiligt sind, ist seit den Anfängen der Immunologie anerkannt, als 1978 erstmals der Begriff "Hautassoziiertes lymphatisches Gewebe" (SALT) 1 geprägt wurde, um eine solche Komplexität zu beschreiben. 
Die große Anzahl von Immunzellen, die sich in der Haut befinden, hilft dem Organismus nicht nur, potenzielle Invasionen zu bekämpfen, sondern auch die Wundheilung zu orchestrieren und die Toleranz gegenüber Selbstantigenen und der Hautmikrobiota aufrechtzuerhalten 2,3. 
Unter den hautresidenten Immunzellen spielen dendritische Zellen (DCs) eine entscheidende Rolle bei der Gestaltung von Immunantworten und der Aufrechterhaltung der Homöostase 4. Dermale DCs und Langerhans-Zellen reagieren bereitwillig auf Invasionen von Krankheitserregern und aktivieren bei der Migration zu den Lymphknoten T-Zellen und induzieren die Expression von Haut-Homing-Rezeptoren auf den neu gebildeten Effektor-T-Zellen 5. DCs spielen auch eine grundlegende Rolle bei der Regulierung der Hauthomöostase. DCs, die unter homöostatischen Bedingungen von der Dermis zu den Lymphknoten wandern, transportieren sequestrierte Antigene der Haut mit dem Ziel, die T-Zell-Toleranz zu induzieren, hauptsächlich durch die Differenzierung von regulatorischen T-Zellen (Tregs), die spezifisch für die Hautantigene 6-8 sind. 
T-Zellen stellen die am häufigsten vorkommende Population von Immunzellen in der Haut dar. Sie infiltrieren nicht nur die Haut während einer Infektion, sondern stellen auch eine stabile Population unter den hautresidenten Lymphozyten dar 9,10. Sowohl CD8+- als auch CD4+-residente Gedächtniszellen (rm)T-Zellen befinden sich in der Haut und können nach einer Infektion reagieren, lange bevor Effektor-T-Zellen aus dem Blut rekrutiert werden. In der Haut befindet sich auch eine Population von geweberesidenten Tregs, die in der Lage sind, die Toleranz gegenüber Hautantigenen und Gewebehomöostase aufrechtzuerhalten. Diese Zellen werden nach Exposition gegenüber ihrem verwandten Antigen schnell und potent aktiviert und wurden daher als Gedächtnis-Tregs definiert 11,12. 
Zusammen mit DCs und T-Zellen bevölkern viele angeborene Immunzellen, wie NK-Zellen, Gamma-Delta-T-Zellen, ILCs der Gruppe 2 13, Mastzellen und Makrophagen, die Haut und tragen zum Schutz des Wirts bei. Um eine solch komplexe Umgebung zu analysieren, ist es zwingend erforderlich, Einzelzellsuspensionen aus Hautproben mit hoher Effizienz zu erhalten und gleichzeitig die Expression von Oberflächenmarkern für die durchflusszytofluorimetrische Analyse oder Sortierung zu erhalten. 
Maushaut weist eine äußere epidermale Schicht auf, die hauptsächlich aus Keratinozyten, Langerhans-Zellen und dendritischen epidermalen T-Zellen besteht; und die dermale Schicht darunter. Die Dermis beherbergt die meisten Immunzellen und besteht aus einer extrazellulären Matrix, in der Kollagenfasern am häufigsten vorkommen, insbesondere Kollagen-I und Kollagen-IV. Im Gegensatz zur menschlichen Haut ist die Haut von Mäusen mit Fell bedeckt und daher stärker mit Haarfollikeln besiedelt. Es ist auch viel dünner als die menschliche Haut und enthält eine Muskelschicht, den Panniculus carnosus, der die Wundheilung unterstützt 14. Diese Eigenschaften erschweren es, das Kollagennetz der Dermis effizient zu stören, um Immunzellen herauszuholen.
In diesem Artikel stellen wir eine geeignete Methode zur Verdauung der extrazellulären Matrix vor, die auf einem Cocktail aus hochreiner Kollagenase 1 und 2 und Thermolysin beruht. Da die Analyse von Haut aus verschiedenen Regionen unterschiedliche experimentelle Verfahren erfordert, werden wir außerdem verschiedene Methoden aufzeigen, um effizient Hautproben aus dem Fußballen, dem Schwanz, dem Ohr und dem Rumpf zu gewinnen. Anschließend werden wir die Proben markieren, um das Vorhandensein von DCs (MHCII+CD11c+CD45+), Makrophagen (CD11b+F4/80+CD45+), CD8+ und CD4+ T-Zellen zu bewerten.

<table><tbody><tr><td colspan="4"><stark>Reagenzien</stark></td></tr><tr><td>Ergänzt RPMI 1640 mittel&nbsp;</td><td></td><td></td><td>RPMI1640 supplementiert mit L-Glu, Pen-Strepto-Strepto-Präparat ohne Beta-Mercapto-Ethanol</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM (Enzym-Mix)</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>resuspendiert [2,5&nbsp; mg/ml] in dH2O; Lagern Sie Aliquots bei -20&nbsp; &deg; C</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>D4263-1VL</td><td>resuspendiert in RPMI 1640 ohne Serum [1.000&nbsp; U/ml]</td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>Chirurgische Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgische Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chirurgisches Skalpell</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>35 mm Petrischalen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>66 mm Petrischalen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm Petrischalen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>70 & Mikro; m Zellsiebe</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td><stark>Verdauungscocktail</stark></td><td></td><td></td><td>Verdünnt in RPMI 5% FBS</td></tr><tr><td>LIberase TM</td><td></td><td></td><td>300 & Mikro; g/ml</td></tr><tr><td>DNAse1</td><td></td><td></td><td>50 U/ml</td></tr><tr><td colspan="4">Antikörper</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Clone</td><td>><Label</td></tr><tr><td>aCD45.2</td><td></td><td>104</td><td>PE-Cy5.5</td></tr><tr><td>aCD11c</td><td></td><td>N418</td><td>PE-Cy7</td></tr><tr><td>CD11b</td><td></td><td>M1/70</td><td>FITC</td></tr><tr><td>F4/80</td><td></td><td>A 3-1</td><td>APC-Cy7</td></tr><tr><td>aCD4</td><td></td><td>Gk1.5</td><td>APC-Cy7</td></tr><tr><td>aCD8</td><td></td><td>53-6.7</td><td>PE</td></tr><tr><td>aCD64</td><td></td><td>X54-5/7.1</td><td>PE-Cy7</td></tr><tr><td>aCD207</td><td></td><td>4C7</td><td>APC</td></tr></tbody></table>

herstellung von einzelzellsuspensionen für cytofluorimetric analyse von verschiedenen mäusehaut regionen

Preparation of Single-cell Suspensions for Cytofluorimetric Analysis from Different Mouse Skin Regions

Die Haut ist ein Barriereorgan, das mit der äußeren Umgebung interagiert. Da die Dermis und Epidermis ständig einer potenziellen mikrobiellen Invasion ausgesetzt sind, beherbergen sie eine Vielzahl von Immunzellen sowohl bei homöostatischen als auch bei entzündlichen Erkrankungen. Werkzeuge zur Erlangung der Freisetzung von Hautzellen für zytofluorimetrische Analysen sind daher sehr nützlich, um das komplexe Netzwerk von Immunzellen in der Haut und ihre Reaktion auf mikrobielle Reize zu untersuchen. Hier beschreiben wir eine effiziente Methode für die Verdauung von Maushaut, um schnell und effizient Einzelzellsuspensionen zu erhalten. Dieses Protokoll ermöglicht die Aufrechterhaltung einer maximalen Zellviabilität, ohne die Expression von Oberflächenantigenen zu beeinträchtigen. Wir beschreiben auch, wie man Hautproben von verschiedenen anatomischen Stellen wie Ohr, Rumpf, Schwanz und Fußballen entnimmt und verdaut. Die erhaltenen Suspensionen werden dann gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert, um zwischen verschiedenen Leukozytenpopulationen zu unterscheiden.

Haut von anderen Bereich des Körpers wurde gemäß dem Protokoll, verdaut mit den angegebenen Antikörpern beschrieben und fleckig. Die Gating - Strategie ist in Abbildung 1. Wählen Sie zuerst lebende Zellen (DAPI- Zellen), dann Tor auf Singuletts (FSC-A gegen FSC-W) und auf Zellen mit Lymphozytenmorphologie (FSC-A vs. SSC-A) dargestellt. Wenn angegeben, werden CD45 + Zellen aus hämatopoetischen Ursprungs ausgewählt. <p class="jove_content" fo:keep-together.w...

Die Haut beherbergt ein komplexes Immunzellnetzwerk. Wir beschreiben eine effiziente Methodik für die Verdauung von Maushaut aus verschiedenen Körperteilen des Tieres, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten und die verschiedenen Leukozytenpopulationen, die in der Haut leben, mittels Durchflusszytometrie zu analysieren.

Herstellung von Einzelzellsuspensionen für Cytofluorimetric Analyse von verschiedenen Mäusehaut Regionen

The skin is a barrier organ that interacts with the external environment. Being continuously exposed to potential microbial invasion, the dermis and ...

Das allgemeine Ziel dieses Verfahrens besteht darin, eine Einzelzell-Suspension aus der Maushaut herzustellen, um die verschiedenen Populationen der dort ansässigen Immunzellen mittels zytofluorimetrischer Analyse zu identifizieren und zu isolieren. Mithilfe dieser Technik können Forscher Proben aus verschiedenen Regionen der Maushaut leicht verdauen, ohne die für die Untersuchung relevanten Oberflächenmarker der Immunzellen zu beschädigen.Um Hautproben vom Mauseohr zu gewinnen, schneiden Sie die haarlosen Teile der Ohren ab und ziehen Sie mit einer Pinzette die dorsalen und ventralen Seiten der Organe auseinander. Danach kratzen Sie vorsichtig das Innere des Ohrs, um verbleibenden Knorpel zu entfernen. Um Gewebestücke der Haut zu erhalten, rasieren Sie das gesamte Fell des Tieres mit einem Haarschneider ab und tragen anschließend Enthaarungscreme auf.Reinigen Sie nach einigen Minuten die Lotion ab und führen Sie einen vertikalen Schnitt in der Mitte des Rückens der Maus durch, wobei Sie den Schnitt entlang der Ränder der rasierten Bereiche des Mauskörpers fortsetzen. Halten Sie die Haut mit einer Pinzette fest und trennen Sie die Probe vorsichtig mit den geschlossenen, abgerundeten Spitzen eines chirurgischen Skalpells oder einer Schere vom Peritoneum und den Rückenmuskeln ab. Tauchen Sie die Haut anschließend in eine 100-mm-Zellkulturplatte mit 10 ml kalter PBS-Lösung (ice cold PBS) und entfernen Sie mit der Pinzette das subkutane Fettgewebe.Um eine Schwanzhautprobe zu gewinnen, schneiden Sie den Schwanz ab und führen mit einer chirurgischen Schere einen vertikalen Schnitt vom Ansatz des Schwanzes bis zur Spitze aus. Greifen Sie mit einer Pinzette den Schnittrand am Schwanzansatz und fassen Sie mit einer weiteren Pinzette den Schwanzkörper, um die Haut vorsichtig in Richtung der Schwanzspitze abzuziehen. Entfernen Sie überschüssiges Fett, indem Sie die Hautprobe vorsichtig abstreichen.Der Fuß der Maus wird abgeschnitten, und um eine Hautprobe von der Fußsohle zu erhalten, schneiden Sie mit einer Schere die Haut des Fußes von der Ferse bis zum Anfang der Zehen entlang der Längsachse auf, wobei darauf zu achten ist, keine Haare zu verletzen. Dann greifen Sie mit einer Pinzette die Knochen des Sprunggelenks, während Sie mit der anderen Hand die Haut fassen und diese in Richtung der Zehen ziehen, wie beim Ausziehen eines Handschuhs. Um die Hautzellen zu markieren, überführen Sie für jede Probe das Gewebe nacheinander in eine 35-Millimeter-Petri-Schale, die 2 Milliliter frisch zubereitete Digestionslösung enthält.Unter Verwendung einer Schere wird die Probe in kleine Stücke zerkleinert und die Gewebefragmente für 90 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert, wobei während der Inkubationszeit ein bis zwei sanfte Schüttelbewegungen durchgeführt werden. Anschließend wird das verdauete Hautgewebe auf einen 70-Mikron-Zellsieb in einer 66-Millimeter-Petrischale, die 1 Milliliter RPMI 1640 ergänzt mit FBS pro Schale enthält, gegossen. Der Sieb wird mit fünf Milliliter frischem Medium gewaschen, dann wird mit einem Spritzenstößel das Probenmaterial durch die Siebmaschen gepresst.Spülen Sie den Kolben, die Schale und das Sieb mit 20 Milliliter frischem Medium und überführen Sie die Gewebesuspension in eine 50-Milliliter-Konischentube. Nachdem alle Proben verarbeitet wurden, zentrifugieren Sie die Zellen und resuspendieren Sie die Pellets in jeweils 100 Mikroliter pro Probe einer Lösung mit zwei Mikrogramm pro Milliliter Anti-CD16-CD32-Blockierantikörper in PBS mit 1 % FBS. Nach 15 Minuten bei vier Grad Celsius geben Sie 100 Mikroliter Antikörper gemäß der Tabelle zu den entsprechenden Proben hinzu und inkubieren diese 30 Minuten bei vier Grad Celsius, lichtgeschützt. Am Ende der Inkubation die Zellen mit einem Milliliter PBS plus FBS waschen und die Pellets in 300 Mikrolitern FBS-PBS resuspendieren. Anschließend die Zellen mit 2 Mikrogramm pro Milliliter DAPI für 10 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln markieren. Um die Leukozyten zu isolieren, zuerst die DAPI-positive Population auswählen, um tote Zellen auszuschließen.Danach die Singuletts im Streulichtbereich durch ein Streulichtbreiten-Diagramm auswählen und die Zellen basierend auf Größe und Granularität der gewünschten Leukozyten eingrenzen. Anschließend die CD45-positiven Zellen auswählen und für jede Probe die Populationen der kutanen dendritischen Zellen anhand ihres CD11C- und MHC-Klasse-II-Expressionsmusters identifizieren. Makrophagen anhand ihres CD64- und F480-Expressionsmusters identifizieren, B-Zellen anhand ihres CD19- und MHC-Klasse-II-Expressionsmusters und T-Zellen anhand ihres CD4- oder CD8-Expressionsmusters.Die Isolierung von Haut-Immunzellen, wie soeben gezeigt, ergibt eine Population von mehr als 50 % vitalen Zellen aus allen Hautregionen, zwischen 5.000 und 15.000 pro Quadratzentimeter, von denen CD45-positiv sind. Eine ausreichende Anzahl an dendritischen Zellen, Makrophagen, B-Zellen und T-Zellen kann ebenfalls aus einem Quadratzentimeter Maushaut für die nachgeschaltete Analyse gewonnen werden, wie angegeben. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein nicht entzündetes Hautgewebe verdaut und die Leukozyten für die FACS-Analyse isoliert.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Krebs Fibroblasten (CAF) zu erleichtern Tumorinitiation, Wachstum und die Progression durch signalisiert, dass es fördert die Proliferation, Angiogenese und Entzündung. Hier beschreiben wir ein Verfahren, um reine Populationen normalen Fibroblasten und CAF aus frischen Maus und menschlichen Geweben isolieren durch Zellsortierung unter Verwendung PDGFRα als Oberflächen-Marker.

Isolation von Normal und Krebs-assoziierte Fibroblasten von Fresh Gewebe durch Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)

Dieses Video beschreibt die schnelle Methode, die Melanozyten und Fibroblasten gleichzeitig aus der Haut des postnatalen Mauswelpen zu isolieren und zu kultivieren. Diese Zellen können in vitro erhalten und manipuliert werden, um die Zellbiologie der Haut, die Wundheilung und das Melanom zu untersuchen.

Schnelle Kultivierung primärer melanischer Melanozyten und Fibroblasten: Isolierung von Melanozyten und Fibroblasten aus einer ganzen Maushautprobe

Das Video zeigt die Herstellung einer Einzelzellsuspension von Immunzellen aus einem murinen Gehirngewebe. Es beinhaltet eine enzymatische Verdauung, um Zellen aus dem Gehirngewebe freizusetzen, gefolgt von einer Dichtegradientenzentrifugation, um die Immunzellen basierend auf ihrer Dichte zu isolieren und die Einzelzellsuspension zu erhalten.

Herstellung einer einzelligen Suspension von Immunzellen aus murinem Hirngewebe

Wir beschreiben ein Protokoll zur effizienten Isolierung von hautresidenten T-Zellen aus menschlichen Hautbiopsien. Dieses Protokoll liefert eine ausreichende Anzahl lebensfähiger Lymphozyten in der menschlichen Haut für die durchflusszytometrische Analyse und die Ex-vivo-Kultur.

Lymphocyte Isolierung von menschlicher Haut für phänotypische Analyse und<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Zellkultur

Das Verhalten von Fibroblasten liegt einem Spektrum klinischer Entitäten zugrunde, aber sie bleiben schlecht charakterisiert, hauptsächlich aufgrund ihrer inhärenten Heterogenität. Die traditionelle Fibroblastenforschung beruht auf In-vitro-Manipulation, um das Verhalten von Fibroblasten in vivo zu maskieren. Wir beschreiben ein FACS-basiertes Protokoll für die Isolierung von Hautfibroblasten der Maus, das keine Zellkultur erfordert.

Murine Hautfibroblasten-Isolation durch FACS

Ein ideales Modell für das Studium der adulten Stammzellbiologie ist der Haarfollikel der Maus. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung verschiedener Populationen von Haarfollikeln, Stammzellen und epidermalen Keratinozyten vor, wobei die enzymatische Verdauung der Rückenhaut von Mäusen mit anschließender FACS-Analyse zum Einsatz kommt.

Isolieren von Haarfollikelstammzellen und epidermalen Keratinozyten von Dorsal Mäusehaut

Dieser Bericht beschreibt ein kubischer Protokoll voller Dicke Maus Hautbiopsien zu klären und Proteinexpressionsmuster, wuchernden Zellen und Sebozyten auf Einzelzell Auflösung in 3D visualisieren. Diese Methode ermöglicht eine genaue Beurteilung der Haut Anatomie und Pathologie und abnormer epidermalen Phänotypen in genetisch veränderten Mauslinien.

CUBIC Protokoll Visualisiert Expression Protein bei Single Cell Resolution in Ganze Berge Vorbereitung der Haut

Dieses Protokoll beschreibt, wie Hautkeratinozyten von Mausmodellen isoliert werden, mit metallmarkierten Antikörpern gefärbt werden und wie man gefärbte Zellen durch Massenzytometrie analysiert, um das Expressionsmuster von Proteinen zu profilieren, die in den verschiedenen Zellzyklusphasen von Interesse sind.

Isolierung und Färbung der Maushaut Keratinozyten für Zellzyklus spezifische Analyse der zellulären Proteinexpression durch Massenzytometrie

Hier wird ein effizientes Protokoll für die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) von Muskelsatellitenzellen der Mausgliedmaße vorgestellt, das für die Untersuchung der Transkriptionsregulation in Muskelfasern durch Spaltung unter Targets und Freisetzung unter Verwendung von Nuklease (CUT&amp;RUN) geeignet ist.

Ein effizientes Protokoll für die CUT&amp;RUN-Analyse von FACS-isolierten Maus-Satellitenzellen

Wir beschreiben Protokolle für die Herstellung einer Einzelzellsuspension von Thymusepithelzellen der Maus und die Färbung intrazellulärer Moleküle für die durchflusszytometrische Analyse.

Herstellung einer Einzelzellsuspension von Thymus-Epithelzellen der Maus und Färbung intrazellulärer Moleküle für die durchflusszytometrische Analyse

Dieses Protokoll stellt eine detaillierte Methode zur Isolierung hochwertiger Einzelzell-Suspensionen sowohl aus gesundem als auch tumortragendem Mauslungengewebe vor. Dieses Protokoll kann auf scRNA-Seq, Durchflusszytometrieanalyse und primäre Zellisolation angewendet werden.

Optimierte Vorbereitung von ganzem, tumortragendem Lungengewebe der Maus für Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung

Erfahren Sie die Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus Mäusehaut für die zytofluorimetrische Analyse. Diese Methode ermöglicht die Identifizierung von Immunzellpopulationen ohne Beschädigung der Oberflächenmarker.

Herstellung von Einzelzellsuspensionen für Cytofluorimetric Analyse von verschiedenen Mäusehaut Regionen

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