Normalen und malignen Muscle Cell Transplantation in immungeschwächten Adult Zebrafisch

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Vorbereitung und Transplantation von normalem und malignem Muskelgewebe zu demonstrieren – von transgenen spendenden Zebrafischen auf rag2-immundefiziente empfängende Zebrafische. Die Muskeltransplantation umfasst zunächst die Isolierung fluoreszenzmarkierten Muskelgewebes durch Dissektion der dorsalen Muskulatur.

Nach der Homogenisierung der Zebrafisch-Muskelzellen werden diese filtriert und zu einer Einzelzell-Suspension verarbeitet. Anschließend werden die Zellen intramuskulär in rag2-Mutanten-Zebrafische transplantiert, und die Epi-Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um die Gewebeintegration in den Empfängertieren bereits ab 10 Tagen nach der Transplantation zu verfolgen. Ebenso kann ein primäres embryonales Rhabdomyosarkom gewonnen, als Suspension hergestellt und intraperitoneal in rag2-Mutanten-Zebrafische transplantiert werden.

Anschließend wird die Geweeinheilung mittels Mikroskopie verfolgt, und die vermehrten Tumorzellen können für nachgeschaltete Anwendungen genutzt werden. Der Hauptvorteil der Verwendung adulter, immuninkompetenter Zebrafische für Zelltransplantationen liegt darin, dass sie eine universelle Plattform für die allogene Transplantation verschiedener Gewebe und Tumortypen bietet. Gewebe können von Spendern mit unterschiedlichem genetischem Hintergrund transplantiert werden, ohne dass eine Immunsuppression der Empfängerfische erforderlich ist.

Mithilfe dieser Methode lassen sich zentrale Fragen der Stammzell- und Regenerationsbiologie beantworten, beispielsweise zur Selbsterneuerungsfähigkeit von Vorläuferzellen. Wir können diese Methoden auch nutzen, um Tumore in rag2-Mutanten-Fischen zu erzeugen und anschließend neuartige Chemikalien zu identifizieren, die beispielsweise das Tumorwachstum hemmen. Die Demonstration der Vorbereitung und Transplantation normaler und maligner Muskelzellen wird chin, tang und anes übernommen, zwei talentierten Doktorandinnen im LAL-Labor. Beginnen Sie mit der Tötung von Zebrafisch-Donoren mit fluoreszenzmarkierten Muskelzellen.

Typische erwachsene Alpha-Actin-RFP-Spendertiere liefern zwischen 500.000 und 2 Millionen Muskelzellen. In unserem Beispielversuch verwenden wir 30 Spendertiere, um jeweils eine Million Zellen in 20 Empfängertiere zu transplantieren. Nach der Tötung des Spendertieres trocknen Sie das Tier ab, indem Sie es auf ein Einweg-Papiertuch legen.

Verwenden Sie eine Rasierklinge, um die dorsale Muskulatur zu entnehmen. Der Schnitt sollte in einem 45-Grad-Winkel hinter dem Anusbereich erfolgen, wobei Knochen und Hautgewebe eingeschlossen werden. Übertragen Sie 10 entnommene dorsale Muskelabschnitte in eine saubere Petrischale. Geben Sie anschließend 500 µL kalte 0,9 XPBS 5 % FBS-Suspensionspufferlösung hinzu.

Als Nächstes wird das Gewebe fein zerkleinert, bis eine gleichmäßige Suspension vollständig durch Homogenisieren des Gewebes mit einer fünf Milliliter serologischen Pipette erhalten ist. Fügen Sie zwei Milliliter Suspensionspuffer zum Homogenat hinzu und pipettieren Sie die Suspension anschließend 20-mal um. Danach wird die Suspension über einen 40-Mikrometer-Filter filtriert und die Zellen in einem 50-Milliliter-Konischkolben auf Eis gesammelt. Halten Sie die Zellen für den Rest des Verfahrens kalt.

Waschen Sie das verbleibende Gewebe im Sieb mit 2,5 Milliliter Suspension, puffern Sie es aus und filtrieren Sie es in den 50-Milliliter-Konischkolben. Zählen Sie nun die Gesamtanzahl der lebensfähigen Zellen mit Trypanblau und konzentrieren Sie sie durch Zentrifugation bei 1000 × g für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Anschließend resuspendieren Sie die Zellen in 0,9 × PBS mit 5 % FBS bei 333.000 Zellen pro Mikroliter.

Wenn die Anzahl der Donorzellen begrenzt ist, können bereits 50.000 injizierte Zellen zu einer erfolgreichen Einheilung führen. Beginnen Sie damit, zwei bis vier Monate alte rag2-defiziente Fische in Trica zu betäuben. Wenn die Kiemenbewegungen langsam sind und der Fisch still ist, bringen Sie den Fisch auf ein feuchtes Tuch, wobei die linke Seite des Fisches nach oben zeigt.

Verwenden Sie nun eine vorgereinigte 10-Mikroliter-26-S-Gauge-Mikrospritze, um drei Mikroliter der hergestellten Muskelzell-Suspension zu injizieren. Die Injektionen sollten in einem Winkel von 45 Grad durchgeführt und direkt in die dorsolaterale Muskulatur der Empfängerfische injiziert werden. Es ist wichtig zu beachten, dass bei der intramuskulären Transplantation ein Gesamtvolumen von weniger als drei Mikrolitern in den Empfängerfisch injiziert werden sollte. Überführen Sie den Empfängerfisch anschließend vorsichtig in ein Erholungsbecken, das sauberes Fischsystemwasser enthält.

Fahren Sie mit der Injektion der verbleibenden Fische fort und geben Sie sie in einen Wiederherstellungstank. Bewerten Sie später die Einwachsraten 10, 20 und 30 Tage nach der Transplantation mithilfe von Hellfeld- und Epifluoreszenzmikroskopie. Verarbeiten Sie jeden Tumor separat.

Opfern Sie einen Fisch mit einem embryonalen Rhabdomyosarkom. Legen Sie den Fisch in eine saubere Petrischale und dissezieren Sie den Tumor mit einem Rasierklingenblatt und feinen Pinzetten von dem nicht malignen Gewebe. Eine sorgfältige Dissektion rund um den Tumor führt zu einer höheren Reinheit der erhaltenen Zellsuspension mit minimaler Kontamination durch umliegendes Muskelgewebe. Überführen Sie den präparierten Tumor in eine neue Schale und geben Sie 100 Mikroliter präkonditioniertes 0,9 XPBS 5 % FBS Suspensionspuffer hinzu.

Anschließend das Gewebe mit einer Rasierklinge fein hacken, bis eine gleichmäßige Suspension erhalten wird. Danach mit einer Ein-Milliliter-Pipette weitere 900 Mikroliter Puffer hinzufügen, gefolgt vom mehrmaligen Auf- und Abpipettieren der Suspension, um die Zellen zu dissoziieren.

Filtrieren Sie die Zellen nun durch einen 40-Mikron-Zellfilter. Spülen Sie die Platte aus, indem Sie zwei bis vier Milliliter zusätzliche Suspension oder Puffer hinzufügen und erneut durch denselben Zellfilter filtrieren. Konzentrieren Sie die Zellen wie zuvor.

Halten Sie die Zellen auf Eis. Resuspendieren Sie die Zellen anschließend in 100 Mikroliter Puffer und zählen Sie die lebensfähigen Zellen mit Trypanblau. Stellen Sie die Konzentration der Zellsuspension auf 5.000 Zellen pro Mikroliter ein.

Anschließend anästhesieren Sie zwei immuninkompetente Empfänger-Zebrafische und legen Sie sie mit der Bauchseite nach oben auf ein sauberes Papiertuch. Mit einer gereinigten 26-S-Gauge-Spritzennadel injizieren Sie hier das gewünschte Volumen in die Bauchhöhle der Empfänger-Zebrafische.

25.000 Zellen werden in fünf Mikrolitern injiziert. Es können jedoch bis zu 10 Mikroliter erfolgreich injiziert werden. Lassen Sie die injizierten Fische in einem Erholungsbecken regenerieren, bevor Sie sie in das Hauptsystem zurückbringen.

Später die Empfängerfische mittels Epifluoreszenzmikroskopie auf die Engraftment überwachen und die Zellen für nachgeschaltete Untersuchungen gewinnen. Unter Verwendung des beschriebenen Verfahrens wurden Skelettmuskelzellen von Alpha-Aktin-RFP-transgenen Spendern in immuninkompetente homozygote rag2-Mutanten-Zebrafische transplantiert. Das Skelettmuskelgewebe ergab eine Einzelzell-Suspension mit 84,3 % vitalen Zellen, wie durch Ausschluss von DPI bestimmt.

Nach der Durchflusszytometrie-Analyse machten RFP-positive Zellen 35,3 % dieser Spendertzellsuspension aus. Die Transplantation von Zellen in den dorsalen Skelettmuskel von RAG2-homozygoten mutierten Empfängerfischen führte zu einer konsistenten und starken Einheilung. Dies wurde durch die Bildung mehrkerniger fluoreszierender Muskel­fasern in den Empfängerfischen bestätigt; Wildtyp-Empfängerfische hingegen wiesen keine einwachsenden Muskel­fasern auf.

Jedoch wiesen neun von 14 mutierten Zebrafischen zehn Tage nach der Transplantation RFP-positive Muskel­fasern in der Nähe der Injektionsstelle auf. Wichtig ist, dass die eingewachsenen RFP-positiven Muskel­fasern bis zu mindestens 30 Tage nach der Transplantation erhalten blieben. In ähnlicher Weise wurde eine starke Einwanderung beobachtet, nachdem RAG2-mutierte Fische mit embryonalem Rhabdomyosarkom oder ERMS transplantiert worden waren.

Die engrafteten ERMS wiesen histologische Merkmale auf, die mit dem primären ERMS-Tumor übereinstimmten, und die zelluläre Heterogenität wurde, wie durch Fluoreszenzanalyse beurteilt, erhalten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die muskuläre Transplantation und intraperitoneale Transplantation von normalem und malignem Gewebe unter Verwendung erwachsener immundefizienter Empfängerfische durchführt. Im Anschluss können weitere Methoden wie die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung, die limitierende Verdünnungs-Transplantationsanalyse und die Echtzeit-PCR durchgeführt werden, um funktionelle und molekulare Unterschiede zwischen verschiedenen Tumorsubpopulationen zu untersuchen.

Insgesamt ermöglicht unser Ansatz die robuste und langfristige Einpflanzung von fluoreszierendem Muskel- und malignem Gewebe in immundefiziente RAG-Zwei-Mutanten-Fische. Der Vorteil dieses Ansatzes besteht darin, dass die Einpflanzung ohne vorherige Immunsuppression der Empfängerfische erfolgt und keine immunologische Übereinstimmung zwischen Spender- und Empfängertieren erforderlich ist.