Name: Verwendung Murine induzierbare Telomerase Allele in den Studien von Tissue Degeneration / Regeneration und Krebs (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 34 s
Description: Erfahren Sie die Methode zur Reaktivierung der Telomerase in murinen Modellen mittels Hydroxytamoxifen zur Untersuchung von Gewebedegeneration, Regeneration und Krebsentwicklung. Diese Technik ermöglicht wichtige Einblicke in Altern und Tumorgenese.

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J.H. wird unterstützt durch den NIH K99/R00 Pathway to Independence Award (5K99CA172700) und den NCI Brain Cancer SPORE Career Development Award (2P50CA127001).

HINWEIS: Alle Schritte in diesem Protokoll wurden von UT MD Anderson Cancer Center zugelassen. 1. Erzeugung von mTERT-ER Allel <ol><li> Einführung Knock-in-Targeting-Vektor, der die ERT2-LBD (Ligandenbindungsdomäne) vor und im Rahmen mit der mTERT genomische Sequenz (Exon 1 durch Intron 2) und eine Lox - PGK - Neo - Lox-Fragment (1A) in Maus-ES-Zellen mit Elektroporation. </li><li> Kultur die ES-Zellen in Neomycin für 6-10 Tage. Wählen Neomycin-resistenten Klone und in 48-Well-Platten erweitern. Entpacken Sie die genomischer DNA unter Verwendung eines kommerziellen Kits und bestätigen Sie die Knock-In-Allels durch Southern Blot. </li><li> Spritzen Sie zwei ES-Linien mit mehr als 95% normalen Karyotyp in C57BL / 6-Blastozysten mit einer Mikromanipulation Satz unter einem inversen Mikroskop. Implantieren die Blastozysten in die Gebärmutter der Leihmutter 23. Kamerad die hochwertigen männlichen Chimären (70-90%) auf C57BL / 6 feMänner. </li><li> Bestätigen Sie die Genotypisierung von heterozygot mTERT-ERneo Tiere durch Southern Blot. </li><li> Kamerad die heterozygot mTERT-ERneo Tiere und EIIA-Cre Tieren, die NeoR Kassette zu löschen. Kamerad die heterozygote Tiere in C57BL / 6 Tiere für mindestens drei Mal, und weitere inter Rasse heterozygot mTERT-ER Tiere Homozygotie zu generieren. </li></ol> 2. Erzeugung von LSL-mTERT Allel <ol><li> Führen Sie das Knock-in-Targeting-Vektor, der ein LoxP - Dreifach-Stopper - Neo - LoxP Fragment und die mTERT genomische Sequenz (zwischen Exon 1 und Intron 2, 1B) in Maus-ES-Zellen mit 23 Elektroporation. </li><li> Kultur die ES-Zellen in Neomycin für 6-10 Tage. Wählen Neomycin-resistenten Klone und in 48-Well-Platten erweitern. Entpacken Sie die genomischer DNA unter Verwendung eines kommerziellen Kits und bestätigen Sie die Knock-In-Allels durch Southern-Blot-23. </li><li> Inject zwei ES-Linien mit mehr als 95% normalen Karyotyp in C57BL / 6-Blastozysten mit einer Mikromanipulation Satz unter einem inversen Mikroskop. Implantieren die Blastozysten in die Gebärmutter der Leihmutter 23. Kamerad die hochwertigen männlichen Chimären (70-90%) auf C57BL / 6-Weibchen. </li><li> Bestätigen Sie die Genotypisierung von heterozygot LSL-mTERT Tiere durch Southern Blot. </li><li> Kamerad die heterozygote Tiere in C57BL / 6 Tiere für mindestens drei Mal, und weitere inter Rasse heterozygot LSL-mTERT Tiere Homozygotie zu generieren. </li></ol> 3. Reaktivierung der Telomerase in mTERT-ER und LSL-mTERT Mäusen in vivo Für mTERT-ER <ol><li> Sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente vor der Injektion. </li><li> Anesthetize der Mäuse mit Isofluran Kammer (4% zur Einleitung, 2% zur Aufrechterhaltung) in 50% (v / v) Sauerstoff / 50% (v / v) Distickstoffmonoxid Gasgemisches. Oder betäuben Mäusen durch eine Ketamin-Xylazin-Gemisch (100 mg / kg Körpergewicht + 10 mg / kg Körpergewicht). </li><li> Nach tiefer Narkose erreicht ist, entfernen Sie den narkotisierten Tier aus der Induktionskammer, und halten Sie den Kopf in der Röhre auf die Isofluran Kammer (2%) verbunden sind. </li><li> Klemmen Sie die Dämpfer der Mäuse, um sicherzustellen, das Tier tief anästhesiert. Setzen Salbe auf beiden Augen, um die Augen vor dem Austrocknen zu verhindern. Reinigen Sie die Rückseite der Mäuse, die mit PVP-Jod-Lösung. </li><li> Spritzen Sie die langsam frei 4-OHT Pellet mit Präzision Trokar (10 G) unter die Haut des Rückens und drücken Sie den Pellet bis hin zu der Mittellinie zwischen zwei Schultern. </li><li> Verschließen Sie den Schnitt mit Wundklammerapplikations und Überwachung der Mäuse aus der Narkose. Die Clips 10 Tage später entfernen. Zusätzliche Wärme ist nicht erforderlich, weil das Verfahren kurz beendet. </li><li> Zeitraum der Behandlung mit 4-OHT Pellet sollte entsprechend dem Zweck der Untersuchung optimiert werden. </li></ol> Für LSL-mTERT &lt;ol&gt; <li> Tamoxifen (10 mg / ml, in Maisöl gelöst) intraperitoneal zwei aufeinanderfolgenden Tagen injiziert (200 ul / 25 g / Tag). </li></ol> 4. Isolierung von neuralen Stammzellen und Reaktivierung der Telomerase in vitro- <ol><li> Mäuse mit Kohlendioxid getötet und die Gehirne werden entfernt. Folgen Sie dem Protokoll von handelsüblichen Nervengewebe Dissoziation Kit nach Hersteller. </li><li> Resuspendieren gefriergetrocknetes Pulver in der Flasche für Lösung 4. beschriftet Lösung 4 mit 1 ml Zellkulturmedium nicht vortexen. Diese Lösung soll dann aliquotiert und bei -20 ° C für die spätere Verwendung gespeichert werden. </li><li> Vorwärmen des Gemischs bei 37 ° C für 15 min vor der Verwendung. </li><li> Stellen Enzyme Mix 1: Lösung 1 (50 ul) und Lösung 2 (1900 ul). Stellen Enzyme Mix 2: Lösung 3 (20 ul) und Lösung 4 (10 ul). </li><li> Bereiten 1950 ul Enzymmischung 1 für bis zu 400 mg Gewebe und Wirbel. Vorheizen des Gemisches bei 37 ° C für15 min vor der Verwendung. </li><li> Nehmen Sie die 1-Tages-Gehirn der Maus, und halten Sie die Vorderhirne durch Entfernen der Riechkolben und das Kleinhirn. Halten Sie die Vorderhirngewebe in 1 ml kaltem Kulturmedium, da die Entfernung und Speicherung in 4 ° C. Achten Sie auf die Nervengewebe innerhalb 1 Stunde zu verarbeiten. </li><li> Bestimmen Sie das Gewicht des Gewebes, um sicherzustellen, dass der Grenzwert von 400 mg pro Verdauung nicht überschritten wird. Stellen Sie das Gehirn auf den Deckel eines 35 mm Durchmesser Petrischale, und quetschen Sie das Gehirn mit einem Skalpell. </li><li> Mit einer 1 ml Pipettenspitze, 1 ml HBSS (w / o Ca / Mg) und Pipetten Stücke wieder in einen 15-ml-Tube. Spülen Sie mit HBSS (w / o Ca / Mg). Zentrifugation bei 300 × g für 2 Minuten bei Raumtemperatur und saugen Sie den Überstand vorsichtig. </li><li> Hinzufügen 1.950 ul vorgewärmter Enzymmix 1 (Lösungen 1 und 2) je bis zu 400 mg Gewebe. Inkubieren in der 15-ml-Röhrchen für 15 min bei 37 ° C, Mischen durch Umdrehen oder Schütteln der Röhre im Abstand von 5 min. </li><li> Bereiten Sie 30 ul Enzymmischung 2 pro Gewebeprobe durch Zugabe von 20 &amp; #956; l Lösung 3 bis 10 &amp; mgr; l der Lösung 4. Dann auf Probe hinzuzufügen. Kehren Sie zum Mischen leicht. Nicht mit dem Vortex. </li><li> Distanzieren Gewebe mechanisch mit einer breiten bestückt, feuerpolierten Pasteur-Pipette pipettiert und ab 10-mal langsamer. Vermeiden Sie Luftblasen bilden. </li><li> Bei 37 ° C für 10 min, Umdrehen des Röhrchens alle 3 min. </li><li> Wiederholen Sie den Schritt Schritt 4.11 und 4.12, wenn die Gewebe sind größer als 200 mg. </li><li> Anwenden der Zellsuspension auf eine 70 &amp; mgr; m Zellsieb, auf einem 50-ml-Röhrchen platziert. Übernehmen 10 ml PBS durch Zellsieb. Verwerfen Zellsieb zentrifugieren Zellsuspension bei 300 g für 20 min bei Raumtemperatur. Überstand entfernen vollständig. </li><li> Die Zellen mit Stammzellmedium auf das erforderliche Volumen für weitere Anwendungen. </li><li> Um Telomerase in LSL-mTERT NSCs aktivieren, behandeln Sie die Zellen mit 100 pM 4-OHT für zwei Tage. Um Telomerase in mTERT-ER NSCs zu aktivieren, halten Sie die Zellen in Kulturmedium mit 100 &amp; mgr; M 4-OHT. </li></ol> 5. Telomere FISH <ol><li> Bereiten Sie die Metaphasechromosomen aus kultivierten Zellen. </li><li> Für FFPE (Formalin fixiert und in Paraffin eingebetteten) Gewebeschnitte entparaffinieren in Xylol und rehydrieren in Ethanolreihe für jeweils 5 Minuten (100%, 90%, 70%, 50% Ethanol) und PBS für 5 min. </li><li> Post-Update in dem Methanol: Essigsäure (3: 1) für 1-2 Std. Entwässern in kaltem Ethanol Serie 5 min jeder (70%, 90%, 100% Ethanol) und an der Luft trocknen. Waschen in 1 × PBS bei 37 ° C für 5 min. </li><li> Denaturieren Chromosomen in 4% Formaldehyd bei 37 ° C für 2 min. Entwässern in kaltem Ethanol Serie 5 min jeweils (70%, 90%, 100% Ethanol) und an der Luft trocknen. </li><li> Bewerben 12-25 ul der PNA Hybridisierungsmischung zu jeder Folie. (Hybridisierungsmischung: 70% Formamid, 0.06x SSC, 0,2% BSA, 0,5 ng / &amp; mgr; l tRNA, 0,5 ng / ul Telomer oder Centromersonden) </li><li> Dichten Sie das Deckglas mit Gummi-Zement. Post-denaturierte chromosomale Minipreps und Gewebeschnitte bei 80 ° C für 4 min. Die Hybridisierungs bei Raumtemperatur oder 37 ° C für 2-4 Stunden in der feuchten Kammer. </li><li> Bei Raumtemperatur mit Waschpuffer 2 x 15 min Waschen. (Waschpuffer: 70% Formamid, 0.06x SSC, pH 7,2). Mit PBST waschen bei Raumtemperatur 3 x 5 min. Gegenfärbung Objektträger mit DAPI oder weit rote Fluoreszenz für die mikroskopische Untersuchung. </li></ol>

<ol><li>Bass, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+sequencing+of+colorectal+adenocarcinomas+identifies+a+recurrent+VTI1A-TCF7L2+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Genomic sequencing of colorectal adenocarcinomas identifies a recurrent VTI1A-TCF7L2 fusion.</a> Nat Genet. 43, 964-968 (2011).</li>
<li>Beroukhim, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+somatic+copy-number+alteration+across+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The landscape of somatic copy-number alteration across human cancers.</a> Nature. 463, 899-905 (2010).</li>
<li>Blasco, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+shortening+and+tumor+formation+by+mouse+cells+lacking+telomerase+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomere shortening and tumor formation by mouse cells lacking telomerase RNA.</a> Cell. 91, 25-34 (1997).</li>
<li>Lee, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+role+of+mouse+telomerase+in+highly+proliferative+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Essential role of mouse telomerase in highly proliferative organs.</a> Nature. 392, 569-574 (1998).</li>
<li>Rossi, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deficiencies+in+DNA+damage+repair+limit+the+function+of+haematopoietic+stem+cells+with+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Deficiencies in DNA damage repair limit the function of haematopoietic stem cells with age.</a> Nature. 447, 725-729 (2007).</li>
<li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+and+Atm+deficiency+compromises+organ+homeostasis+and+accelerates+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction and Atm deficiency compromises organ homeostasis and accelerates ageing.</a> Nature. 421, 643-648 (2003).</li>
<li>Rudolph, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longevity%2C+stress+response%2C+and+cancer+in+aging+telomerase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Longevity, stress response, and cancer in aging telomerase-deficient mice.</a> Cell. 96, 701-712 (1999).</li>
<li>Wong, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+impairs+DNA+repair+and+enhances+sensitivity+to+ionizing+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction impairs DNA repair and enhances sensitivity to ionizing radiation.</a> Nat Genet. 26, 85-88 (2000).</li>
<li>Ferron, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+shortening+and+chromosomal+instability+abrogates+proliferation+of+adult+but+not+embryonic+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Telomere shortening and chromosomal instability abrogates proliferation of adult but not embryonic neural stem cells.</a> Development. 131, 4059-4070 (2004).</li>
<li>Savage, S. A., Alter, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+Oncol+Clin+North+Am%22%5BJournal%5D)">Dyskeratosis congenita.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 23, 215-231 (2009).</li>
<li>Armanios, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syndromes+of+telomere+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Syndromes of telomere shortening.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 10, 45-61 (2009).</li>
<li>Vulliamy, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RNA+component+of+telomerase+is+mutated+in+autosomal+dominant+dyskeratosis+congenita%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The RNA component of telomerase is mutated in autosomal dominant dyskeratosis congenita.</a> Nature. 413, 432-435 (2001).</li>
<li>Harley, C. B., Harley, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase%2C+checkpoints+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+surveys%22%5BJournal%5D)">Telomerase, checkpoints and cancer.</a> Cancer surveys. 29, 263-284 (1997).</li>
<li>Karlseder, J., Broccoli, D., Dai, Y., Hardy, S., de Lange, T. p53- and ATM-dependent apoptosis induced by telomeres lacking TRF2. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKarlseder%2C+J+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 283, 1321-1325 (1999).</li>
<li>Steensel, B., Smogorzewska, A., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRF2+protects+human+telomeres+from+end-to-end+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">TRF2 protects human telomeres from end-to-end fusions.</a> Cell. 92, 401-413 (1998).</li>
<li>Chin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53+deficiency+rescues+the+adverse+effects+of+telomere+loss+and+cooperates+with+telomere+dysfunction+to+accelerate+carcinogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">p53 deficiency rescues the adverse effects of telomere loss and cooperates with telomere dysfunction to accelerate carcinogenesis.</a> Cell. 97, 527-538 (1999).</li>
<li>Artandi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+promotes+non-reciprocal+translocations+and+epithelial+cancers+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction promotes non-reciprocal translocations and epithelial cancers in mice.</a> Nature. 406, 641-645 (2000).</li>
<li>Rudolph, K. L., Millard, M., Bosenberg, M. W., DePinho, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomere+dysfunction+and+evolution+of+intestinal+carcinoma+in+mice+and+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Telomere dysfunction and evolution of intestinal carcinoma in mice and humans.</a> Nat Genet. 28, 155-159 (2001).</li>
<li>Greenberg, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+dysfunctional+telomeres+impair+tumorigenesis+in+the+INK4a%28delta2%2F3%29+cancer-prone+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Short dysfunctional telomeres impair tumorigenesis in the INK4a(delta2/3) cancer-prone mouse.</a> Cell. 97, 515-525 (1999).</li>
<li>Jaskelioff, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+reactivation+reverses+tissue+degeneration+in+aged+telomerase-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Telomerase reactivation reverses tissue degeneration in aged telomerase-deficient mice.</a> Nature. 469, 102-106 (2011).</li>
<li>Hu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antitelomerase+therapy+provokes+ALT+and+mitochondrial+adaptive+mechanisms+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Antitelomerase therapy provokes ALT and mitochondrial adaptive mechanisms in cancer.</a> Cell. 148, 651-663 (2012).</li>
<li>Ding, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Telomerase+reactivation+following+telomere+dysfunction+yields+murine+prostate+tumors+with+bone+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Telomerase reactivation following telomere dysfunction yields murine prostate tumors with bone metastases.</a> Cell. 148, 896-907 (2012).</li>
<li>Nagy, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNagy%2C+A+%22Manipulating+the+mouse+embryo+%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual</a>. , 3rd Edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2003).</li>
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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir berichten hier die Erzeugung von zwei induzierbare murine Telomerase Allele und wie Telomerase in vivo und in vitro zu aktivieren. Der entscheidende Schritt zur Reaktivierung mTERT-ER-Aktivität ist es, eine kontinuierliche Konzentration von Tamoxifen zu halten, so dass wir uns entscheiden, 4-OHT Zeit-Release-Pellets von Innovative Research of America hergestellt zu verwenden. Die Pellets halten Freigabe 4OHT in einem stationären Zustand Blutspiegel von 1 ng / ml für bis zu 60 Tage. In einer früheren Untersuchung wurde gezeigt, dass die Reaktivierung Telomeraseaktivität mit dieser Strategie konnte die degenerative Phänotypen wie Stammzellenerschöpfung Beeinträchtigung der Gewebeverletzung antwortet und Organversagen in mehreren Organen, die durch Telomerdysfunktion in G4 mTERT ER / ER induziert wurden, zu verbessern Mäuse 20. Andere als die Untersuchung der Funktion der Telomerase in Alterung können diese beiden induzierbaren Telomerase Allele auch verwendet, um Krebs zu untersuchen. Frühere Studien habenVorteil dieser Allele, die Rolle der Telomere Abrieb und Telomerase Reaktivierung bei der Gestaltung der Genome und Auswirkungen auf die Biologie von T-Zell Thymuslymphom 21 und Prostatakrebs 22 erkunden. Diese beiden Studien zeigten, dass Telomerdysfunktion Ende Generation G4 Atm - / - mTERT ER / ER und G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L Mäusen stellt einen Mechanismus treibt die Übernahme von Anfang mutagene Ereignisse für Tumor-Initiation, noch verhindert Progression voll bösartigen Tumoren. Wenn die Telomerase wurde im Rahmen der Telomerdysfunktion induzierte genomische Instabilität, DNA-Schaden-Checkpoints und zügellose chromosomale Instabilität reaktiviert wurden unterdrückt, was die vollständige Progression von malignen Tumoren mit neuen biologischen Eigenschaften wie Knochenmetastasen von Prostatakrebs 21 und Gehirn Infiltration Thymi erlaubtc Lymphom 21. Ähnliche Phänomene wurden auch bei anderen Krebsarten wie Darmkrebs und Bauchspeicheldrüsenkrebs (persönliche Kommunikation mit Drs. Haoqiang Ying, Adam Boutin und Ronald DePinho) beobachtet. Weil TERT-ER-Protein kann leicht zwischen Ein und Aus-Zuständen in Abhängigkeit davon, ob die Tiere mit Tamoxifen oder Vehikel behandelt umgeschaltet werden, können die Tumormodellen von mTERT-ER-Allel erzeugt verwendet werden, um anti-Telomerase-Therapie zu testen. In früheren Studie, in G4 Geldautomaten erzeugten Tumoren - / - mTERT ER / ER Tiere wurden von 4-OHT veröffentlicht; auf Telomerase Erschöpfung, Tumoren schließlich schrumpfte aufgrund der Wiedereinstellung von Telomerdysfunktion induzierten Checkpoints 21. Doch einige der erworbenen Resistenz in Reaktion Tumoren bis zur Ausrottung durch die Aktivierung eines alternativen Verlängerung von Telomeren (ALT) Mechanismus Telomerase. Die weitere Charakterisierung dieser ALT + resistenten Tumoren zeigte, dass they haben anomale Transkription von Genen im mitochondrialen Biologie und oxidative Abwehr mit einem Master-Regulator der Synthese und der mitochondrialen oxidativen Abwehr PGC-1β beteiligt. Knockdown von PGC-1β oder SOD2 (ein weiterer Regulator des oxidativen Abwehr) deutlich macht ALT + Tumorzellen, während halten Telomerase + Tumorzellen relativ intakt 21 bleiben. Eine Einschränkung dieser beiden Knock-in-Allele ist, dass sie sich nur leisten Reaktivierung Telomerase endogenen Spiegel, weil sie im nativen Locus des Telomerase-Gens sind. In den meisten Krebsarten geht Telomerase tatsächlich auf einem viel höheren Niveau überexprimiert. Um das Niveau der Telomerase zu verbessern, ist eine Modifikation können wir betrachten die mTERT-ER-Konstrukt mit einem stärkeren Promotor wie PGK (Phosphoglyceratkinase) -Promotor in Rosa26 Locus einzufügen. Abschließend die beiden neuartigen induzierbaren Maus Telomerase Allele bieten beispiellose genetic Werkzeuge, um die Funktionen der Telomerase in Alterung und Gewebshomöostase sowie die Tumorprogression insbesondere unter dem Hintergrund der zuvor erfassten Telomerdysfunktion induzierte genomische Instabilität studieren. Die mTERT-ER-Allel kann auch verwendet werden, um anti-Telomerase-Therapie durch die Kreuzung in andere tumor anfällig Maus-Modellen untersucht werden.

Telomerase ist ein für die Aufrechterhaltung der Telomere verantwortliche Enzym. Dies sind repetitive Sequenzen an den Enden der Chromosomen, die ihre Integrität zu schützen. Die Kernkomponenten von Telomerase-Holoenzym eine katalytische Untereinheit der Reversen Transkriptase (TERT) und eine RNA-Untereinheit (TERC), das als Vorlage dient zum Addieren des Telomerabschnitten 1,2. Während in der Regel in differenzierten Körperzellen unterdrückt, zeigt Telomerase robuste Aktivität und spielt eine wichtige Rolle bei der Keimzellen, Krebszellen und Stammzellen. mTERC und mTERT Knockout-Mäuse bieten große in vivo Modellsystemen, um die Funktionen der Telomerase in beiden Stammzellen und Krebs zu untersuchen. Die mTERC und mTERT Knockout-Mäusen (G1) brachte keine offensichtlichen Phänotypen aufgrund der langen Rücklage der Telomere bei Mäusen 3 zeigen. Allerdings seriell Kreuzung mTERC und mTERT Knockout-Mäusen zu spät Generation (G5-G6) führteprogressive Erosion der Telomere und schließlich provoziert schwere Degeneration der hoch proliferativen Gewebe 4. Späten Generation (G5-G6) mTERC - / - Mäuse sind unfruchtbar aufgrund der hohen Raten von Apoptose in Hoden und Keimzellverarmung. G5-G6 mTERC - / - Mäusen degenerative Phänotypen in hoch proliferativen Geweben wie Knochenmark, Darm und Haut weisen auch aufgrund der hohen Raten von Apoptose und defekte Selbsterneuerungsfähigkeit in Gewebe Stammzellen / Vorläuferzell Fächer 4. Hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark in der letzten Generation mTERC - / - Mäuse weisen Verlust der Teilungsfähigkeit, beeinträchtigt Selbsterneuerungsfähigkeit, verstärkte Apoptose und schließlich funktionale Erschöpfung 5,6. - / - Mäusen 7,8 Ebenso wurden schrittweise erhöht apoptotische Körper in Darmkrypten in jeder neuen Generation von G1-G6 mTERC beobachtet. Ter schädliche Wirkung von dysfunktionalen Telomeren scheint nicht zu einer hohen Fluktuation Gewebe, da sowohl die Proliferation von adulten neuralen Stammzellen in vitro und der Neurogenese in vivo wurden Ende Generation (G4-G5) stark beeinträchtigt begrenzt mTERC - / - Mäuse 9 . Die Rolle der Telomerase in Stammzellen wird durch die Ergebnisse in einem seltenen menschlichen Erbkrankheit Dyskeratosis congenita (DKC), die in gewisser Weise ähnelt vorzeitiger Alterung 10,11 unterstützt. DKC wird durch Mutationen im TERC, TERT, und Gene, die Dyskerin, einen Kern Telomerase-Untereinheit und andere Dyskerin assoziierte Proteine ​​codieren 12 verursacht. Im Durchschnitt Telomere in DKC Patienten sind kürzer als 99% der bei gleichaltrigen Kontrollen. Der Hauptmorbiditäts liegt an aplastischer Anämie, die durch mangelhafte Wartung von hämatopoetischen Stammzellen verursacht wird. Andere Aspekte der Krankheit, wie oralen Leukoplakie, Nageldystrophie, geistige retardatiauf, Hoden-Atrophie und Lungenkomplikationen alle schlagen Ende Generation von Telomerase-Knockout-Mäusen Funktionsstörungen von Gewebestammzellen und Vorläuferzellen 10, Erkenntnisse in enger Abstimmung mit diesen. DKC Patienten neigen zu myelodysplastischem Syndrom und haben eine erhöhte Prävalenz von malignen Neoplasmen Schleimhaut. So Mangel der Telomerase in menschlichen Patienten rekapituliert die Mängel der Stammzellfunktionen und Tumor Veranlagung, die Ende Generation Telomerase-Knockout-Mäusen beobachtet. Kurze Telomere und eine hohe Telomerase-Aktivität sind die Markenzeichen von Krebs. Als normal oder prämalignen Zellen teilen, die langsam oder gar nicht Telomerase-Aktivität führt zu eventuellen Erosion der Telomere und Aktivierung von zellulären Kontrollpunkten ähnlich denen von DNA-Doppelstrang-Brüche (DSBs) 13 ausgelöst. Wie klassische DSBen hat Telomerdysfunktion wurde gezeigt, dass p53 zu induzieren und zugehörige zelluläre Antworten, wie zum Beispiel Alterung und / oder apoptosis 14,15. Bei Mutations Inaktivierung von p53, sind Zellzyklus und das Überleben der Zellen in Zellen mit Telomer-Dysfunktion, die eine pro-karzinogene Mutator Mechanismus gekennzeichnet durch Translokationen und regionalen Amplifikationen und Deletionen 16,17 bietet verbesserte. Gleichzeitig weiterhin Telomerdysfunktion und zugehörige grassiert chromosomale Instabilität (auch in p53 Nullzellen) scheinen Voll malignen Progression derartiger Krebs beschränken. So spät Generation G4-G5 mTERC - / - Ink4a / Arf - / - Mäuse zeigten im Vergleich zu Ink4a / Arf-null-Mäusen durch Telomer-Abrieb erheblich reduziert Lymphoma-Inzidenz. In einer anderen Studie erweiterte adenomatöse Läsionen in G4 mTERT - / - APC min Mäusen wurden stark im Vergleich zu APC min Mäuse aufgrund erheblicher Wachstumsarrest und Apoptose 18,19 drückt. DieBeobachtung, dass Telomerdysfunktion induzierte genomische Instabilität hemmt Tumorprogression fordert den Spekulationen, dass die Aktivierung der Telomerase kann maligne Progression teilweise durch Niederschlagung genomische Instabilität auf ein Niveau mit Krebszelllebensfähigkeit und / oder Neutralisations p53-abhängige oder -unabhängige Checkpoint Mechanismen, zu ermöglichen. Um zu untersuchen, ob Telomerase Reaktivierung kann stoppen oder sogar umkehren Alterung von Stammzellen, und ob Telomerase Reaktivierung können die Tumorentstehung vor dem Hintergrund der genomische Instabilität fördern erzielten wir zwei induzierbaren Maus Telomerase-Allele. Die erste ist 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) -induzierbaren TERT-Estrogen Receptor (mTERT-ER) Fusion Knock-in-Allel. In Abwesenheit von 4-OHT, Mäuse, die homozygot für mTERT-ER (bezeichnet mTERT ER / ER) Telomerase-Aktivität defizient und aufrechtzuerhalten gleichen zytogenetischen und zellulären Phänotypen als herkömmliche mTERT oder mTERC Knockout-Modell. Nach 4-OHT Behandlung kann TERT-ER-Protein-Aktivität auf ein Niveau vergleichbar mit dem nativen Protein TERT 20, 21 wieder hergestellt werden. Die zweite Allel ist eine neuartige induzierbaren TERT Knock-in-Allel, das eine intro LoxP-Stopper-LoxP Kassette (LSL- mTERT); nach Cre-vermittelte Exzision LSL, mTERT unter endogene Expression Kontrollmechanismen 22 erneut zum Ausdruck gebracht.

<table><tbody><tr><td>Leica AM6000 Mikromanipulations-Kit</td><td>Leica</td><td>Pro Zitat</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI6000 B Inverses Mikroskop</td><td>Leica</td><td>Pro Zitat</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>Life Technologies</td><td>21810031</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran-Verdampfer</td><td>Veterinär-Anästhesiesysteme</td><td>911103</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Henry Schein</td><td>1005796</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin-Xylazin-Gemisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K113-10ML</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT Pulver</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7904-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxfien</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5648-1G</td><td></td></tr><tr><td>4-OHT Pellet</td><td>Innovative Research of America</td><td>Custermized</td><td></td></tr><tr><td>Precision Trochar (10 Gauge)</td><td>Innovative Research of America</td><td>MP-182</td><td></td></tr><tr><td>gewickelter Clip applier</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804</td><td></td></tr><tr><td>clip</td><td>Fischer Scientific</td><td>01-804-5</td><td></td></tr><tr><td>Dissoziationskit für neurales Gewebe</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Fischer Scientific</td><td>X3P-1GAL</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>A-433S4</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäure</td><td>Fischer Scientific</td><td>A38-500</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fischer Scientific</td><td>22-032-104</td><td></td></tr><tr><td>Formamid</td><td>Fischer Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>PNA Telomersonde</td><td>Panagene</td><td>F1001-5</td><td></td></tr><tr><td>PNA Zentromersonde</td><td>Panagene</td><td>F3003-5</td><td></td></tr><tr><td>20X SSC</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP1325-4</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153-10G</td><td></td></tr><tr><td>tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5636-1ML</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>Gummizement</td><td>Walmart</td><td>Elmer's</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

verwendung murine induzierbare telomerase allele in den studien von tissue degeneration / regeneration und krebs

Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Telomerdysfunktion bedingte Verlust der Genomintegrität und die damit verbundenen DNA-Schäden Signalisierung und Checkpoint Reaktionen sind gut etablierte Treiber, die Gewebedegeneration während der Alterung verursachen. Krebs, mit Inzidenzraten stark mit dem Alter zunimmt, wird durch kurze Telomerlängen und hohe Telomerase-Aktivität aus. Um die Rolle von Telomerdysfunktion und Telomerase-Reaktivierung in Alterung und Krebs zu untersuchen, zeigt das Protokoll, wie man zwei Mäuse induzierbaren Telomerase erzeugen Knock-in-Allele 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) -induzierbaren TERT-Estrogen Receptor (mTERT-ER) und Lox -Stopper-Lox TERT (LSL-mTERT). Das Protokoll beschreibt die Verfahren zur Telomerdysfunktion induzieren und zu reaktivieren Telomerase-Aktivität in mTERT-ER und LSL-mTERT Mäusen in vivo. Die repräsentativen Daten zeigen, dass die Reaktivierung der Telomerase-Aktivität kann die Gewebe degenerative Phänotypen von Telomerdysfunktion induzierte verbessern. In order, um die Auswirkungen der Telomerase Reaktivierung auf die Tumorentstehung zu bestimmen haben wir einen Prostatatumor-Modell G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L und Thymus-T-Zell-Lymphom-Modell G4 Atm - / - mTERT ER / ER . Die repräsentativen Daten zeigen, dass die Telomerase-Reaktivierung in der Kulisse der genomische Instabilität durch Telomerdysfunktion induzierte eine wesentlich bessere Tumorgenese. Das Protokoll beschreibt auch verwendet werden, um neurale Stammzellen (NSCs) aus mTERT-ER und LSL-mTERT Mäusen zu isolieren und zu reaktivieren Telomerase-Aktivität in NSCs in vitro Verfahren. Die repräsentativen Daten zeigen, dass die Reaktivierung der Telomerase kann die Selbsterneuerungsfähigkeit und Neurogenese in vitro zu verbessern. Schließlich beschreibt das Protokoll der Modalitäten für die Durchführung der Telomere FISH (Fluoreszenz in situ Hybridisierung) auf beiden Maus FFPE (Formalin fixiert und Paraffin Embedded) Hirngewebe und Metaphasechromosomen von kultivierten Zellen.

Die Strategien murine mTERT-ER zu erzeugen und LSL-mTERT-Knock-in-Allele wurden in 1A und 1B beschrieben. Insbesondere wird ein LoxP - Dreifach Stopper - Neo - LoxP Fragment wurde zwischen Exon 1 und 2 von mTERT Locus eingefügt, um LSL-mTERT Allel zu generieren. Um mTERT-ER-Allel zu erzeugen, wurde ERT2-LBD-Domäne im Leseraster mit dem mTERT-Gen in den N-Terminus des Exons 1 eingeführt Wir haben gezeigt, dass, wenn die Telomerase wurde transient in Telomerdysfunktion Mäusen durch Behandlung mit 4-OHT-Pellets für 4 reaktiviert Wochen konnten die degenerative Phänotyp in mehreren Organen, wie Gehirn (2A) und Hoden (2B) gelindert werden. Um die Auswirkungen der Telomerase Reaktivierung auf Zellen in vitro kultiviert bestimmen isolierten wir neurale Stammzellen (NSC) von Ende Generation G4 LSL-mTERT und G4 mTERT-ER Mäusen. Wir haben gezeigt, dass, wenn die Telomerase wurde in Telomer dysfunktionalen NSC reaktiviert wurde das Selbsterneuerungsfähigkeit des NSC stark erhöht (Figur 3A) und in vitro-Neurogenese wurde ebenfalls signifikant verbessert (Abbildung 3B). Um die Wirkung der Telomerase Reaktivierung auf die Tumorgenese im Rahmen Telomerdysfunktion bestimmen erwirtschafteten wir PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L (Prostata-Tumor-Modell) und Geldautomaten - / - mTERT ER / ER (Thymus-T-Zell-Lymphom-Modell) späten Generation Kohorten. Wenn die Telomerase wurde durch Tamoxifen-Behandlung dieser Mäuse mit Injektion (Figur 4A) oder 4-OHT-Pellets für 8 Wochen (4B) reaktiviert wurde die Tumorgenese stark sowohl in Prostata-Tumormodell (4A) und Thymus-T-Zellen-Lymphom-Modell verbessert ( <strong&gt; 4B). Schließlich berichteten wir, die Protokolle zur Durchführung der Telomere FISH auf FFPE Maus Hirngewebe (Abbildung 5) und Metaphasechromosomen (Abbildung 5, Einschub). <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig1.jpg" /> Abbildung 1: (A) mTERT-ER Knock-in-Strategie. TV, Targeting-Vektor; WT, Wildtyp-Allel; KI, Knock-in-Allel; LA, linken Arm; RA, den rechten Arm; E1, Exon 1; E2, Exon 2; neo, pgk Promotor getriebene Neomycin-Resistenzgen; ER, modifizierten Östrogenrezeptor (ERT2) Ligandenbindungsdomäne; DT, dyphteria Toxin-Gen. (B) LSL-mTERT Knock-in-Strategie. TV, Targeting-Vektor; WT, Wildtyp-Allel; KI, Knock-in-Allel; LA, linken Arm; RA, den rechten Arm; E1, Exon 1; E2, Exon 2; neo, pgk Promotor getriebene Neomycin-Resistenzgen; STOPPER, drei sich wiederholenden Transkriptionsstoppsequenzen; DT, dyphteria Toxin-Gen. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig2.jpg" /> Abbildung 2: Repräsentative Daten zur Telomerase Reaktivierung zeigen bessert degenerative Phänotypen von Organen Vertreter Bilder von Gehirnen (links). und Hoden (rechts) von G0 und G4 mTERT-ER-Mäusen mit Placebo oder 4-OHT für 4 Wochen behandelt. Maßstabsbalken zeigen 50 um. Re-Print mit Genehmigung von 20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52599/52599fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig3.jpg" /> Abb. 3: Repräsentative Daten zur Telomerase Reaktivierung zeigen, steigert Selbsterneuerung und Neurogenese von neuralen Stammzellen in vitro (A) Repräsentative Bilder von neuronalen Stammzellens von G4 LSL-mTERT isoliert (oberes Bild) und G4 mTERT-ER (unteres Bild) wächst in der Stammzellmedium mit Fahrzeug oder 4-OHT behandelt. (B) Repräsentative Bilder der in vitro-Neurogenese (TuJ1 +) von neuronalen Stammzellen aus G4 mTERT-ER in Differenzierungsmedium kultiviert isoliert (mit 1% FBS) mit Fahrzeug-oder 4-OHT behandelt. Maßstabsbalken zeigen 100 um. <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig4.jpg" /> Abb. 4: Repräsentative Daten zur Telomerase Reaktivierung zeigen verbessert Tumorentstehung vor dem Hintergrund der genomische Instabilität (A) Repräsentative Bilder von Prostatatumoren von G0 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT seziert +/-, G4 PB Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT- / - Und G4 PB-Cre4 Pten L / L p53 L / L LSL-mTERT L / L mit Tamoxifen behandelt. Re-Print mit Genehmigung von 22. (B) Repräsentative Bilder der Thymus-T-Zell-Lymphome aus G0 Atm seziert - / - mTERT + / ER, G4 Atm - / - mTERT ER / ER mit Vehikel und G4 Atm - / - mTERT ER / ER mit 4- behandelt 8 Wochen OHT. Maßstabsbalken zeigen 1 cm. <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52599/52599fig5.jpg" /> Abbildung 5: Repräsentative Bilder der Telomer und Zentromer-FISH auf FFPE Maus Hirngewebe und Metaphase (kleines Bild). Rot bedeutet, DNA, grün zeigt Telomer-Färbung und Cyan zeigt centromere Färbung. Maßstabsbalken zeigen 1 mm.

Telomer und Telomerase spielen eine wesentliche Rolle beim Altern und bei der Tumorentstehung. Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie zwei murine induzierbare Telomerase-Knock-in-Allele erzeugt und wie sie in den Studien zur Gewebedegeneration/-regeneration und Krebs verwendet werden können.

Verwendung Murine induzierbare Telomerase Allele in den Studien von Tissue Degeneration / Regeneration und Krebs

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, zwei murine induzierbare Mase-Klopf-Allele in vivo und in vitro für Studien zur Gewebedegeneration und -regeneration sowie für Krebsstudien zu manipulieren. Dies wird erreicht, indem Hydroxytamoxifen-Tabletten in Tiere implantiert werden, um Mase in vivo zu reaktivieren. In einem zweiten Schritt werden neurale Stammzellen aus Tieren isoliert, die dann mit Hydroxytamoxifen behandelt werden, um Mase in vitro zu reaktivieren.Als nächstes wird die Telomerfluoreszenz in der C-2-Hybridisierung oder Fisch sowohl an kultivierten Zellen als auch an formalen und fixierten, in Paraffin eingebetteten Hirngeweben durchgeführt, um die Aktivität von Mase zu überprüfen. Die Ergebnisse zeigten, dass Hydroxytamoxifen-Behandlungen die Maseaktivität robust reaktivieren können, was sowohl Alterungsphänotypen lindern als auch die Tumorbildung auf der Grundlage histopathologischer Untersuchungen fördern kann. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in den Bereichen Altern und Krebs zu beantworten, z. B. ob wir den Alterungsprozess verlangsamen können, indem wir die TH-Traumaaktivität modulieren, oder wie wir Thomas gezielt zur Behandlung von Krebs ansprechen können.Dieses Verfahren wird von dem Ausbilder Dr. Takashi Shingu und der Technikerin April Un aus meinem Labor demonstriert. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Erzeugung des Turt ER und lock stop locks turt Allele, wie im Textprotokoll beschrieben, sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente vor der Injektion, fahren Sie mit der Anästhesie der Mäuse fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Nachdem eine tiefe Anästhesie erreicht ist, nehmen Sie das anästhesierte Tier aus der Induktionskammer und halten Sie seinen Kopf in der Röhre, die mit der ISO-Fluorkammer verbunden ist.Kneifen Sie die Fußballen der Mäuse zusammen, um sicherzustellen, dass das Tier tief betäubt wird. Tragen Sie auch Salbe auf beide Augen auf Um zu verhindern, dass sich die Augen herausziehen, wischen Sie den Rücken der Mäuse mit Povidon-Jod-Lösung ab. Als nächstes injizieren Sie ein langsam freisetzendes Hydroxytamoxifen-Pellet mit einem Präzisionstrokar unter die Haut des Rückens.Und schieben Sie die Kugel bis zur Mittellinie zwischen zwei Schultern. Versiegeln Sie den Schnitt mit einem Wundclip-Applierer und überwachen Sie die Mäuse auf Genesung. Für die Anästhesie.Nehmen Sie die Ein-Tages-Mäusegehirne heraus und behalten Sie die vier Gehirne, indem Sie die Riechkolben und das Kleinhirn entfernen. Bewahren Sie die vier Gehirngewebe in einem Milliliter kaltem Kulturmedium auf und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Achten Sie darauf, dass das Nervengewebe innerhalb einer Stunde verarbeitet wird.Bestimmen Sie das Gewicht des Gewebes, um sicherzustellen, dass die Grenze von 400 Milligramm pro Verdauung nicht überschritten wird. Legen Sie das Gehirn auf den Deckel einer Petrischale mit einem Durchmesser von 35 Millimetern und zerkleinern Sie das Gehirn mit einem Skalpell. Fügen Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze einen Milliliter Hank's Balance Salt Solution oder HBSS hinzu.Pipettieren Sie die Stücke dann zurück in ein 15-Milliliter-Röhrchen, nachdem Sie mit der HBSS-Zentrifuge bei 300-facher G-Temperatur zwei Minuten lang bei Raumtemperatur gespült haben. Nach vorsichtiger Entfernung des Überstands 1.950 Mikroliter vorgewärmtes Enzym hinzufügen. Mischen Sie eines pro bis zu 400 Milligramm Gewebe.Inkubieren Sie die Probe im 15-Milliliter-Röhrchen für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Mischen Sie die Probe, indem Sie das Röhrchen alle fünf Minuten umdrehen oder schütteln. Bereiten Sie dann 30 Mikroliter Enzym vor Mischen Sie zwei pro Gewebeprobe, indem Sie 20 Mikroliter Lösung, drei bis 10 Mikroliter Lösung vier hinzufügen.Geben Sie dann die Probe vorsichtig um, um sie zu mischen, dissoziieren Sie das Gewebe mechanisch mit einer feuerpolierten Pastenpipette mit breiter Spitze, indem Sie 10 Mal langsam auf und ab pipettieren und dabei die Bildung von Luftblasen vermeiden. Inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und drehen Sie das Röhrchen alle drei Minuten um. Tragen Sie anschließend die Zellsuspension auf ein 70-Mikron-Zellsieb auf, das auf ein 50-Milliliter-Röhrchen gestellt wird.Tragen Sie 10 Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS durch das Zellsieb auf. Anschließend das Zellsieb verwerfen und die Zellsuspension bei 300 mal G 20 Minuten lang zentrifugieren. Bei eingestellter Raumtemperatur nach der Zentrifugation wird der Überstand vollständig abgesaugt.Resuspendieren Sie die Zellen mit Stammzellmedium auf das erforderliche Volumen für weitere Anwendungen zur Aktivierung des Tele-Arrays in Schlössern, Stopp-Schlössern. Turt neurale Stammzellen. Behandeln Sie die Zellen zwei Tage lang mit 100 mikromolaren Hydroxytamoxifen, um Emase zu aktivieren und neurale Stammzellen zu aktivieren.Halten Sie die Zellen in Kulturmedium mit 100 mikromolaren Hydroxytamoxifen, um Telomerfische durchzuführen. Bereiten Sie zunächst die Metaphase-Chromosomen aus kultivierten Zellen für Formalin-fixierte und in Paraffin eingebettete oder FFPE-Gewebeschnitte vor. Die Probe wird in Xylol depariert und in einer Ethanolreihe jeweils fünf Minuten und fünf Minuten lang in PBS rehydriert.Dann die Abschnitte in einem Verhältnis von drei zu eins von Methanol zu Essigsäure für ein bis zwei Stunden postfixieren. Dehydrieren Sie die Abschnitte in einer kalten Ethanol-Serie für jeweils fünf Minuten und waschen Sie sie fünf Minuten lang in einem XPBS bei 37 Grad Celsius an der Luft. Als nächstes in der Natur werden die Chromosomen in 4%igem Formaldehyd bei 37 Grad Celsius für zwei Minuten eingeflößt.Dehydrieren Sie die Abschnitte in einer kalten Ethanolserie wie zuvor und trocknen Sie sie an der Luft, sobald sie getrocknet sind, tragen Sie 12 bis 25 Mikroliter des Peptid-Nukleinsäure-Hybridisierungsgemisches auf jeden Objektträger auf. Versiegeln Sie den Deckglas mit Gummizement, der Naturchromosomenpräparationen und Gewebeschnitte bei 80 Grad Celsius für vier Minuten aufsetzt. Hybridisieren Sie dann bei Raumtemperatur oder 37 Grad Celsius für zwei bis vier Stunden in einer Feuchtkammer.Waschen Sie anschließend die Proben zweimal bei Raumtemperatur mit Waschpuffer 15 Minuten lang. Waschen Sie sie dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit PBS und tween Sie 23 Mal. Zum Schluss wird die Objektträger mit DPI oder dunkelroter Fluoreszenz für die mikroskopische Untersuchung gegengefärbt.Wenn Telomer in telomerdysfunktionalen Mäusen vorübergehend reaktiviert wurden, konnten die degenerativen Phänotypen in mehreren Organen wie dem Gehirn und den Hoden verbessert werden, um die Auswirkungen der Telomerreaktivierung auf die Zellen zu bestimmen. In vitro kultivierte neurale Stammzellen wurden aus G-Vier-Lock-Stopp-Mäusen der späten Generation, TURT und G 4 turt ER-Mäusen isoliert. Bei der Reaktivierung des Telomers in telomerdysfunktionalen neuralen Stammzellen wurde die Selbsterneuerungsfähigkeit stark erhöht.In vitro wurde die Neurogenese ebenfalls signifikant verbessert, um den Einfluss der Mase-Reaktivierung auf die Tumorgenese im Rahmen der Telomerdysfunktion zu bestimmen, die Mase-Reaktivierung durch Tamoxifen-Behandlung wurde in einem Prostatatumormodell durchgeführt. Endot thic T-Zell-Lymphom-Modell. Die Behandlung führte in beiden Modellen zu einer stark verbesserten Tumorgenese.Schließlich wurden Telomerfische an FFPE, Mausgehirngeweben und Metaphase-Chromosomen untersucht. In diesen Bildern zeigt Rot die DNA-Färbung an, Grün die Telomerfärbung und Cyan die Zentromerfärbung. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Traumaaktivität in mTOR ER- und Lock-Stop-Schlössern, mTOR-Tieren und Zelllinien aktivieren und wie Sie sie verwenden können, um Ihre Fragen zu Krebs und Erregern zu untersuchen.

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