Verwendung Murine induzierbare Telomerase Allele in den Studien von Tissue Degeneration / Regeneration und Krebs

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, zwei murine induzierbare Mase-Klopf-Allele in vivo und in vitro für Studien zur Gewebedegeneration und -regeneration sowie für Krebsstudien zu manipulieren. Dies wird erreicht, indem Hydroxytamoxifen-Tabletten in Tiere implantiert werden, um Mase in vivo zu reaktivieren. In einem zweiten Schritt werden neurale Stammzellen aus Tieren isoliert, die dann mit Hydroxytamoxifen behandelt werden, um Mase in vitro zu reaktivieren.

Als nächstes wird die Telomerfluoreszenz in der C-2-Hybridisierung oder Fisch sowohl an kultivierten Zellen als auch an formalen und fixierten, in Paraffin eingebetteten Hirngeweben durchgeführt, um die Aktivität von Mase zu überprüfen. Die Ergebnisse zeigten, dass Hydroxytamoxifen-Behandlungen die Maseaktivität robust reaktivieren können, was sowohl Alterungsphänotypen lindern als auch die Tumorbildung auf der Grundlage histopathologischer Untersuchungen fördern kann. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in den Bereichen Altern und Krebs zu beantworten, z. B. ob wir den Alterungsprozess verlangsamen können, indem wir die TH-Traumaaktivität modulieren, oder wie wir Thomas gezielt zur Behandlung von Krebs ansprechen können.

Dieses Verfahren wird von dem Ausbilder Dr. Takashi Shingu und der Technikerin April Un aus meinem Labor demonstriert. Beginnen Sie dieses Verfahren mit der Erzeugung des Turt ER und lock stop locks turt Allele, wie im Textprotokoll beschrieben, sterilisieren Sie alle chirurgischen Instrumente vor der Injektion, fahren Sie mit der Anästhesie der Mäuse fort, wie im Textprotokoll beschrieben. Nachdem eine tiefe Anästhesie erreicht ist, nehmen Sie das anästhesierte Tier aus der Induktionskammer und halten Sie seinen Kopf in der Röhre, die mit der ISO-Fluorkammer verbunden ist.

Kneifen Sie die Fußballen der Mäuse zusammen, um sicherzustellen, dass das Tier tief betäubt wird. Tragen Sie auch Salbe auf beide Augen auf Um zu verhindern, dass sich die Augen herausziehen, wischen Sie den Rücken der Mäuse mit Povidon-Jod-Lösung ab. Als nächstes injizieren Sie ein langsam freisetzendes Hydroxytamoxifen-Pellet mit einem Präzisionstrokar unter die Haut des Rückens.

Und schieben Sie die Kugel bis zur Mittellinie zwischen zwei Schultern. Versiegeln Sie den Schnitt mit einem Wundclip-Applierer und überwachen Sie die Mäuse auf Genesung. Für die Anästhesie.

Nehmen Sie die Ein-Tages-Mäusegehirne heraus und behalten Sie die vier Gehirne, indem Sie die Riechkolben und das Kleinhirn entfernen. Bewahren Sie die vier Gehirngewebe in einem Milliliter kaltem Kulturmedium auf und lagern Sie sie bei vier Grad Celsius. Achten Sie darauf, dass das Nervengewebe innerhalb einer Stunde verarbeitet wird.

Bestimmen Sie das Gewicht des Gewebes, um sicherzustellen, dass die Grenze von 400 Milligramm pro Verdauung nicht überschritten wird. Legen Sie das Gehirn auf den Deckel einer Petrischale mit einem Durchmesser von 35 Millimetern und zerkleinern Sie das Gehirn mit einem Skalpell. Fügen Sie mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze einen Milliliter Hank's Balance Salt Solution oder HBSS hinzu.

Pipettieren Sie die Stücke dann zurück in ein 15-Milliliter-Röhrchen, nachdem Sie mit der HBSS-Zentrifuge bei 300-facher G-Temperatur zwei Minuten lang bei Raumtemperatur gespült haben. Nach vorsichtiger Entfernung des Überstands 1.950 Mikroliter vorgewärmtes Enzym hinzufügen. Mischen Sie eines pro bis zu 400 Milligramm Gewebe.

Inkubieren Sie die Probe im 15-Milliliter-Röhrchen für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Mischen Sie die Probe, indem Sie das Röhrchen alle fünf Minuten umdrehen oder schütteln. Bereiten Sie dann 30 Mikroliter Enzym vor Mischen Sie zwei pro Gewebeprobe, indem Sie 20 Mikroliter Lösung, drei bis 10 Mikroliter Lösung vier hinzufügen.

Geben Sie dann die Probe vorsichtig um, um sie zu mischen, dissoziieren Sie das Gewebe mechanisch mit einer feuerpolierten Pastenpipette mit breiter Spitze, indem Sie 10 Mal langsam auf und ab pipettieren und dabei die Bildung von Luftblasen vermeiden. Inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius und drehen Sie das Röhrchen alle drei Minuten um. Tragen Sie anschließend die Zellsuspension auf ein 70-Mikron-Zellsieb auf, das auf ein 50-Milliliter-Röhrchen gestellt wird.

Tragen Sie 10 Milliliter phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder PBS durch das Zellsieb auf. Anschließend das Zellsieb verwerfen und die Zellsuspension bei 300 mal G 20 Minuten lang zentrifugieren. Bei eingestellter Raumtemperatur nach der Zentrifugation wird der Überstand vollständig abgesaugt.

Resuspendieren Sie die Zellen mit Stammzellmedium auf das erforderliche Volumen für weitere Anwendungen zur Aktivierung des Tele-Arrays in Schlössern, Stopp-Schlössern. Turt neurale Stammzellen. Behandeln Sie die Zellen zwei Tage lang mit 100 mikromolaren Hydroxytamoxifen, um Emase zu aktivieren und neurale Stammzellen zu aktivieren.

Halten Sie die Zellen in Kulturmedium mit 100 mikromolaren Hydroxytamoxifen, um Telomerfische durchzuführen. Bereiten Sie zunächst die Metaphase-Chromosomen aus kultivierten Zellen für Formalin-fixierte und in Paraffin eingebettete oder FFPE-Gewebeschnitte vor. Die Probe wird in Xylol depariert und in einer Ethanolreihe jeweils fünf Minuten und fünf Minuten lang in PBS rehydriert.

Dann die Abschnitte in einem Verhältnis von drei zu eins von Methanol zu Essigsäure für ein bis zwei Stunden postfixieren. Dehydrieren Sie die Abschnitte in einer kalten Ethanol-Serie für jeweils fünf Minuten und waschen Sie sie fünf Minuten lang in einem XPBS bei 37 Grad Celsius an der Luft. Als nächstes in der Natur werden die Chromosomen in 4%igem Formaldehyd bei 37 Grad Celsius für zwei Minuten eingeflößt.

Dehydrieren Sie die Abschnitte in einer kalten Ethanolserie wie zuvor und trocknen Sie sie an der Luft, sobald sie getrocknet sind, tragen Sie 12 bis 25 Mikroliter des Peptid-Nukleinsäure-Hybridisierungsgemisches auf jeden Objektträger auf. Versiegeln Sie den Deckglas mit Gummizement, der Naturchromosomenpräparationen und Gewebeschnitte bei 80 Grad Celsius für vier Minuten aufsetzt. Hybridisieren Sie dann bei Raumtemperatur oder 37 Grad Celsius für zwei bis vier Stunden in einer Feuchtkammer.

Waschen Sie anschließend die Proben zweimal bei Raumtemperatur mit Waschpuffer 15 Minuten lang. Waschen Sie sie dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit PBS und tween Sie 23 Mal. Zum Schluss wird die Objektträger mit DPI oder dunkelroter Fluoreszenz für die mikroskopische Untersuchung gegengefärbt.

Wenn Telomer in telomerdysfunktionalen Mäusen vorübergehend reaktiviert wurden, konnten die degenerativen Phänotypen in mehreren Organen wie dem Gehirn und den Hoden verbessert werden, um die Auswirkungen der Telomerreaktivierung auf die Zellen zu bestimmen. In vitro kultivierte neurale Stammzellen wurden aus G-Vier-Lock-Stopp-Mäusen der späten Generation, TURT und G 4 turt ER-Mäusen isoliert. Bei der Reaktivierung des Telomers in telomerdysfunktionalen neuralen Stammzellen wurde die Selbsterneuerungsfähigkeit stark erhöht.

In vitro wurde die Neurogenese ebenfalls signifikant verbessert, um den Einfluss der Mase-Reaktivierung auf die Tumorgenese im Rahmen der Telomerdysfunktion zu bestimmen, die Mase-Reaktivierung durch Tamoxifen-Behandlung wurde in einem Prostatatumormodell durchgeführt. Endot thic T-Zell-Lymphom-Modell. Die Behandlung führte in beiden Modellen zu einer stark verbesserten Tumorgenese.

Schließlich wurden Telomerfische an FFPE, Mausgehirngeweben und Metaphase-Chromosomen untersucht. In diesen Bildern zeigt Rot die DNA-Färbung an, Grün die Telomerfärbung und Cyan die Zentromerfärbung. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Traumaaktivität in mTOR ER- und Lock-Stop-Schlössern, mTOR-Tieren und Zelllinien aktivieren und wie Sie sie verwenden können, um Ihre Fragen zu Krebs und Erregern zu untersuchen.