Methoden zur Charakterisierung des Co-Entwicklung von Biofilm und Habitat Heterogenität

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die Wechselwirkungen von Biofilmen mit der Umwelt mit integrierten Methoden zu charakterisieren. Es wird ein mikrofluidisches Durchflusszellensystem mit doppeltem Einlass aufgebaut, bei dem glukosehaltige und glukosefreie Medien über eine Durchflusszelle gepumpt werden, wodurch ein Glukosegradient erzeugt wird. Dem System werden Bakterien zugeführt und Biofilme können sich über mehrere Tage bilden.

Die Biofilme werden dann durch konfokale 3D-Mikroskopie abgebildet, um den Solu-Transport zu charakterisieren. Innerhalb von Biofilmen werden fluoreszierende Tracer in das Flusssystem injiziert und es wird eine Zeitrafferbildgebung durchgeführt, um das Strömungsfeld um Biofilmkolonien herum zu charakterisieren, fluoreszierende Mikrokügelchen werden injiziert und es wird eine Zeitrafferbildgebung durchgeführt. Die Analyse des Stofftransports und der Partikelverfolgung der resultierenden Daten zeigen die Nützlichkeit dieser Methode bei der Bewertung von Biofilmprozessen unter verschiedenen chemischen Umgebungen innerhalb eines einzigen Geräts und in einer Reihe von Experimenten.

Der Hauptvorteil dieser Methoden besteht darin, dass sie die gleichzeitige Bewertung mehrerer Aspekte der Wechselwirkungen zwischen Biofilm und Umwelt ermöglichen. Die hier vorgestellten Methoden können dazu beitragen, wichtige Fragen zur Biofilmbildung in natürlichen Umgebungen oder bei biofilmbedingten Infektionen zu beantworten. Bei der Arbeit in einer Laminar-Flow-Haube wird eine Kolonie von Posa, PAO, einem GFP und einer Kolonie von e coli, DH, fünf alpha von einer LB-Platte in getrennte Röhrchen mit drei Millilitern lb Brühe übertragen.

Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius und schütteln Sie sie bei 225 U/min. Dieses Strömungssystem basiert auf einer mikrofluidischen Zelle mit doppeltem Einlass, die die Beobachtung des Biofilmwachstums unter einem genau definierten chemischen Gradienten ermöglicht, der durch Mischen von zwei Lösungen in der Durchflusskammer gebildet wird. Während der Strömung bildet sich ein glatter Konzentrationsgradient in Querrichtung.

Infolge der Diffusion ist das Konzentrationsprofil in der Nähe des Einlasses steil und stromabwärts entspannter. Bauen Sie am Tag des Experiments das Strömungssystem vorsichtig zusammen. Klemmen Sie zuerst den Schlauch in die Schlauchpumpe und befestigen Sie dann ein Ende des Schlauchs an einer Mediumflasche mit 900 Millilitern FAB-Medium mit Glukose und das andere Ende an einer Blasenfalle.

Wiederholen Sie diesen Vorgang, um eine zweite mittelgroße Flasche mit 900 Millilitern Fab ohne Glukose an eine zweite Blasenfalle anzuschließen. Setzen Sie als Nächstes Dreiwegeventile direkt vor den Einlässen der Durchflusszelle ein und verbinden Sie jede der Blasenfallen mit der Durchflusszelle. Verbinden Sie abschließend den Auslass der Durchflusszelle mit einer Abfallflasche.

Stellen Sie sicher, dass die Durchflusszelle mit dem Deckglas nach unten platziert wird, damit sich die suspendierten Zellen auf dem Deckglas absetzen können. Nachdem das Durchflusssystem zusammengebaut ist, schalten Sie die Schlauchpumpe mit einer Durchflussrate von 10 Millilitern pro Stunde für jeden Einlass ein, um das System zu füllen. Mit dem Medium wird das Medium in die beiden Einlässe eingeführt, wobei nur in einem Einlass Glukose bereitgestellt wird. Als nächstes verdünnen Sie die beiden Bakterienkulturen in der Haube auf ein Verhältnis von eins zu eins zu einem Milliliter sterilem Wasser mit einem äquivalenten OD 600 von 0,01 für jedes Bakterium, um die Durchflusszelle zu impfen, und injizieren Sie mit einer sterilen Kunststoffspritze 500 Mikroliter des Inokulums über das Dreiwegeventil in jeden der Einlässe der Durchflusszellen.

Stoppen Sie nach der Injektion die Pumpe und lassen Sie die Bakterienzellen eine Stunde lang am Deckglas haften, nachdem sich die Zellen anheftet haben, stellen Sie die Pumpe für jeden Einlass auf 0,03 Milliliter pro Minute ein und lassen Sie das System drei Tage lang bei Raumtemperatur fließen, während derer sich unter einem Gradienten der Glukoseexposition ein Biofilm entwickelt. Nach Ablauf von drei Tagen. Zeichnen Sie mit einem Marker und einem Lineal ein Gitter auf die Deckglasseite der Durchflusszelle, um die Bildgebung vorzubereiten.

Dies hilft bei der Lokalisierung der Bildgebungsbereiche, um Flecken für die Betrachtung von E-coli entgegenzuwirken. Schalten Sie zunächst das Licht aus, um den Arbeitsbereich abzudunkeln, da der Thekenfleck lichtempfindlich ist. Verwenden Sie eine Spritze, um langsam einen Milliliter verdünnte zellpermeierte rot fluoreszierende Nukleinsäurefärbung in das Dreiwegeventil vor der Durchflusskammer zu injizieren.

Stoppen Sie den Fluss. Lassen Sie die Durchflusszelle 30 Minuten lang im Dunkeln stehen. Nach Ablauf von 30 Minuten.

Setzen Sie den Fluss bei 0,03 Millilitern pro Minute fort und waschen Sie den ungebundenen Fleck 15 Minuten lang aus. Stoppen Sie dann den Fluss und beobachten Sie die Biofilme mit der konfokalen Mikroskopie mit einem 63-fach-Objektiv. Finden Sie ein Sichtfeld mit einer guten Menge an Biomasse mit Biofilmkolonien, die gut voneinander getrennt sind, wie hier gezeigt.

Erfassen Sie dann 3D-Bildstapel in den entsprechenden Kanälen, um die räumlichen Muster der Biofilmentwicklung innerhalb des Flusszellenbildes abzubilden, die Biofilme in drei oder mehr Längs- oder X-Abständen entlang des Flusszelleneinlasses und in drei Quer- oder Y-Positionen relativ zum auferlegten Nährstoffgradienten. Um die Solu-Transportmuster innerhalb des Biofilms zu charakterisieren, beginnen Sie mit der Durchflusszelle. Nach drei Tagen Biofilmentwicklung wieder im Dunkeln arbeiten.

Stoppen Sie die Pumpe, um den Durchfluss zu unterbrechen, öffnen Sie die Blasenfallen, um den Einspritzdruck abzulassen. Verwenden Sie dann eine Spritze, um einen Milliliter verdünnte Sci-Fi-Tracerlösung in eines der Dreiwegeventile vor der Durchflusszelle zu injizieren. Nachdem Sie die Science-Fiction-Lösung injiziert haben, schließen Sie die Blasenfallen.

Stellen Sie das Dreiwegeventil ein und starten Sie die Pumpe mit 0,03 Millilitern pro Minute neu, um die Science-Fiction-Lösung in die Durchflusszelle zu fördern. Schalten Sie anschließend den konfokalen Bildgebungsmodus auf XYT mit einer Bildrate von 0,15 Hertz um. Für die Verbalisierung der Farbstoffpenetration wird eine hohe zeitliche Auflösung bevorzugt, jedoch verringert schnelles Scannen die Bildqualität.

Stellen Sie also die Scangeschwindigkeit und den Zeilendurchschnitt ein, um die Zeitauflösung der Bildgebung und die Bildqualität auszugleichen. Sobald die Bildgebungsparameter eingestellt sind, starten Sie die Pumpe neu, um den Durchfluss fortzusetzen. Mit einer Geschwindigkeit von 0,03 Millilitern pro Minute werden fünf gleichzeitig in die Durchflusszelle gefördert.

Starten Sie die konfokale Bildgebung im Zeitraffer. Sobald die Zeitraffer-Bildgebung abgeschlossen ist. Durchführung der Diffusionsanalyse gemäß den Anweisungen im Begleitdokument.

Um das Strömungsfeld um Biofilme zu charakterisieren, verdünnen Sie die fluoreszierenden Mikrometer-Mikrokügelchen in sterilisiertem Wasser auf eine feste Endkonzentration von 0,2 % und ein Endvolumen von 0,5 Millilitern. Wirbeln Sie dann vortexen, um sicherzustellen, dass die Mikrokügelchen gut dispergiert sind, unterbrechen Sie den Fluss und injizieren Sie dann die verdünnten fluoreszierenden Mikrokügelchen und geben Sie sie in die Durchflusszelle ab. Ändern Sie wie zuvor die Durchflussmenge auf 0,01 Milliliter pro Stunde.

Die niedrige Durchflussrate ermöglicht eine genaue Verfolgung des Partikelwegs. Schalten Sie die konfokalen Einstellungen in den XYT-Modus und weisen Sie die Software an, die Partikelbewegung in einer Z-Schicht zu verfolgen. Nehmen Sie Zeitreihenbilder wie bisher mit einer Bildrate von einem Hertz auf.

Wiederholen Sie den Partikelinjektionsvorgang und das Bild an verschiedenen Z-Positionen. Befolgen Sie nach Abschluss der Bildgebung die Anweisungen im Begleitdokument zur Berechnung von Flussvektoren, um bakterielle Wechselwirkungen in einem Biofilm unter einem Glukosegradienten zu untersuchen. Posa, GFP und E. coli wurden durch Gegenfärbung in Dualspezies-Biofilmen differenziert.

Mit cyto wurden 62 Bilder in jeder der neun Bildgebungsregionen auf der Strömungskammer aufgenommen. In den hier gezeigten Overlays erscheint posa GFP grün oder gelb und e coli erscheint rot. Posa-dominierte Biofilm-Biomasse in Regionen mit hohen Glukosekonzentrationen und E-coli dominierte in Regionen mit niedrigen Glukosekonzentrationen.

Damit besetzten die beiden Arten unterschiedliche ökologische Nischen. Diese Ergebnisse zeigen den Nutzen der mikrofluidischen Durchflusszelle mit doppeltem Einlass bei der Untersuchung der Biofilmentwicklungsaktivität und der Wechselwirkungen in komplexen Umgebungen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine mikrofluidische Durchflusszelle mit doppeltem Einlass verwenden, um Biofilme unter chemischen Gradienten zu züchten, und wie Sie Umweltparameter für die Biofilmentwicklung mithilfe der Injektion von fluoreszierenden Partikeln oder Chasern nach der Entwicklung erhalten.

Diese Methoden ebneten Forschern aus dem Bereich der Umwelt- und klinischen Mikrobiologie den Weg, um komplexe Wechselwirkungen zwischen mikrobiellen Gemeinschaften und ihrer Umgebung zu erforschen.