Name: Methoden zur Charakterisierung des Co-Entwicklung von Biofilm und Habitat Heterogenität (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 21 s
Description: Erfahren Sie Methoden zur Charakterisierung von Biofilm-Umwelt-Interaktionen mit einem doppelten Mikrofluidik-System. Diese Technik ermöglicht die Erzeugung chemischer Gradienten und die Analyse von Strömungsfeldern um Biofilmkolonien.

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Wir danken Matt Parsek an der University of Washington (Seattle, WA) zur Bereitstellung von P. aeruginosa und E. coli-Stämme und Roger Nokes an der University of Canterbury (Neuseeland) für den Zugriff auf Streams Software. Diese Arbeit wurde durch Zuschuss R01AI081983 von den National Institutes of Health, Nationalen Institut für Allergien und Infektionskrankheiten unterstützt. Konfokale Bildgebung wurde an der Northwestern Biological Imaging Facility (BIF) durchgeführt.

1. Durchflusszelle einrichten und Inokulation . HINWEIS: Verwenden Sie ein im Song et al Doppeleinlass mikrofluidischen Durchflusszelle, 2014 14, Biofilme wachsen. Diese Durchflusszelle ist in der Lage, gut definierte glatte chemische Gradienten erstellen. Die Durchflusszelle ist in Abbildung 1 unter Verwendung von P. gezeigt und Durchflusszellenherstellung wurde zuvor in Song et al., 2014 14. Hier werden wir ausführlich unsere Methoden aeruginosa und E. coli, Biofilme zu bilden, aber andere Arten können geeignet zu sein. Wir verwendeten P. aeruginosa PAO1- gfp, die konstitutiv exprimiert ein grün fluoreszierendes Protein (GFP), als Modellorganismus für die Biofilmentwicklung. E. Zusätzlich verwendeten wir coli DH5a zu Mischarten Biofilmen mit P. bilden aeruginosa. P. aeruginosa und E. coli-Stämme wurden auf LB-Agar-Platten gezüchtet. <ol><li> Bereiten Sie die Durchflusszelle mit Polydimethylsiloxan (PDMS) gebunden an einDeckglas über Sauerstoffplasmabehandlung, wie in 14 beschrieben. Die Abmessungen der Strömungszellenkammer sind 23 mm × 13 mm × 0,24 mm (Länge x Breite x Tiefe). </li><li> Bereiten geändert FAB Wachstumsmedium 15. Um Biofilmwachstum unter einer Nahrungsgefälle innerhalb der Durchflusszelle zu beobachten, stellen modifizierte FAB Medium 15 mit 0,6 uM Glucose in einem Einlass und FAB Medium einzuführen ohne Kohlenstoffquelle durch die andere Einlass. Filter sterilisieren (Porengröße = 0,2 um) der Glucosestammlösung (60 mM), bevor Sie die Ware in den FAB Medium. Auch Autoklavieren den FAB-Medium mit dem Zyklus 1 (Flüssigkeit, 15 min, 121 ° C, 17 psi) vor dem Gebrauch. </li><li> Sterilisieren Sie die Durchflusssystem. Vor der Beimpfung autoklaviert den gesamten Strömungsweg (mittel Flaschen, Schläuche, Luftblasenfallen, Durchflusszellen) mit Zyklus 1, mit Ausnahme der Kunststoffdreiwegeventile (Einweg- und vorsterilisiert) stromaufwärts von der Strömungszelle angeordnet ist. (Drei-Wege Ventile zum Einspritzen Zelle c verwendet,ultur, fluoreszierender Tracer und Mikrokügelchen.) Um eine Kontamination während der Montage zu vermeiden, decken alle Schläuche und Anschlussöffnungen mit Aluminiumfolie oder Autoklav Beutel vor dem Autoklavieren. </li><li> Schließen Sie das Stromsystem. Montieren Sie die Komponenten des Durchflusszellensystem sorgfältig (siehe Video zum Flusssystem Montage) und liefern Wachstumsmedium, um die Durchflusszelle über eine peristaltische Pumpe, die exakt den Durchfluss steuert. </li><li> Vorbereitung der Zellkultur zur Beimpfung durch Übertragen einer Kolonie von P. aeruginosa oder E. coli von LB-Platten zu 3 ml LB-Brühe, und schütteln Sie die Kultur O / N bei 225 rpm und 37 ° C. Verdünne die O / N-Zellkulturen in 1 ml sterilisiertem Wasser auf eine endgültige OD 600 = 0,01 als Inokulum. (Kultur und verdünnen die Bakterien in einer Steril um Verunreinigungen zu vermeiden.) </li><li> Für die Versuche mit gemischten Spezies Biofilmen, verdünnt den zwei Bakterienkulturen mit einem Verhältnis von 1: 1 in 1 ml mit einer äquivalenten OD 600 = 0,01 für jedes Bakterium. </li><li> Impfen Sie die Durchflusszelle. Injizieren 1 ml des Inokulums zu der Strömungszelleneingang von dem Dreiwegeventil. Nach der Injektion unterbrechen den Fluss für 1 Stunde, damit der Bakterienzelle an das Deckglas zu befestigen. (Stellen Sie sicher, dass die Durchflusszelle mit der Deckseite nach unten, damit suspendierten Zellen, um auf dem Deckglas absetzen gestellt.) </li><li> Nach 1 Stunde wieder die Strömung und die Pumpe des Wachstumsmediums, um die Durchflusszelle mit einer konstanten Geschwindigkeit von 0,03 ml / min für jeden Einlaß für 3 Tage. </li></ol> 2. Charakterisierung von Biofilm-Entwicklung in Reaktion auf Nährstofffarbverläufe Mit konfokale Mikroskopie HINWEIS: P. aeruginosa mit konstitutiv exprimierten GFP abgebildet werden, aber E. coli in Mischarten Biofilme müssen durch Gegenfärbung abgebildet werden. <ol><li> Beachten Sie die 3-Tages-Biofilmen mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie. Für die repräsentative Ergebnisse, beachten Biofilmen mit einem konfokalen Mikroskop mit 63X Ziel. Vor der Bildgebung, Markedas Doppel-Einlassströmungszelle mit einem Raster auf dem Deckglas Seite. (Der Zweck dieser Gitter ist es, dass der Experimentator die Abbildungsbereiche in dem Strömungszellenkammer zu lokalisieren.) </li><li> Zur Gegenfärbung, verdünnte 10 ul zelldurchdringenden rot fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff, wie grün fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff wie STYO 62 Stammlösung (1 mM) in 990 ul sterilisiertes Wasser und dann langsam zu injizieren die verdünnte Fleck mit einer Spritze in die Durchflusszelle Kammer von dem stromaufwärts Dreiwegeventil. Halten Sie die Durchflusszelle stagniert und im Dunkeln für 30 Minuten, dann wieder den Fluss für 15 Minuten Auswaschen der ungebundenen Fleck. </li><li> Führen konfokale Bildgebung. Aktivieren Sie die 488-nm-Argon-Laser für die Anregung und die Emission Sammelkanäle für GFP (500-535 nm) und Nukleinsäurefarbstoff (für grün fluoreszierenden Nukleinsäurefarbstoff, 650 bis 750 nm). Passen Gewinne und Offsets für beide Kanäle zu hell und sauber Bilder haben. Wählen xyz und gleichzeitige Bildgebungsmodus. Verwenden Sie die z-Drehknopf auf idenfizieren die Unterseite und die Oberseite der Biofilm auf dem Feld. Stellen Sie die z-Schritt von 0,5 &amp; mgr; m zur Erfassung eines 3-D-Bildstapel. (Um eine hohe Bildqualität zu gewährleisten, verwenden Sie eine Linie durchschnittlich vier für die Bildaufnahme.) </li><li> Um die räumlichen Muster der Biofilmentwicklung innerhalb der Flusszelle, Bild Biofilmen an drei oder mehr Längs Karte (x) Abständen entlang der Strömungszelleneingang und an drei Querrichtung (y) positioniert relativ zu dem auferlegten Nahrungs Gradienten, wie in Figur 1 gezeigt, . </li></ol> 3. Charakterisierung Interne Stofftransport durch Injektionen von Conservative Fluoreszierende Tracer HINWEIS: Eine konservative fluoreszierender Tracer, wie Cy5, kann verwendet werden, um Stofftransportmuster innerhalb des Biofilms zu charakterisieren. <ol><li> Löse Cy5 (Mono-Reactive NHS Ester) in Wasser auf eine Endkonzentration von 10 mg / ml als Stammlösung. Bewahren Sie die Cy5-Stammlösung in einem -20 ° C Tiefkühltruhe. HINWEIS: Wie Cy5 ist licht sensitive, speichern, zu verdünnen und injizieren Cy5-Lösungen in der Dunkelheit. </li><li> Vor der Injektion des fluoreszierenden Tracers, nehmen Sie ein 3-D-Bildstapel der 3-Tages-Biofilm mit der konfokalen Mikroskopie (mit einem 63X Objektiv). (Wide Regionen Biofilm Kolonien sind ideal für Zeitreihen Beobachtungen der Farbstofftransport.) Wählen, auch die Z-Ebene mit gut getrennte Kolonien zur Bildgebung (wie in 5A gezeigt). </li><li> Für jede Injektion Cy5 Experiment verdünnen 2 ul des Cy5-Stammlösung in 998 &amp; mgr; l sterilisiertem Wasser, um eine Injektionslösung mit einem Cy5-Konzentration von 20 ug / ml zu ergeben. </li><li> Stoppen der Pumpe, um den Fluß anzuhalten, und spritzen die Cy5-Lösung in die stromaufwärts von der Durchflusszelle mit einer Spritze über das 3-Wege-Ventil. (Es ist wichtig, Luftblasen in die Strömungsbahn während der Injektion zu verhindern. Blasenfallen sollten während des Hinterspritz offen gehalten werden.) </li><li> Nach dem Einspritzen des Cy5-Lösung, schließen Sie die Blasenfallen, stellen Sie die 3-Wege-Ventil, und starten Sie diezu pumpen, um den eingespritzten Cy5-Lösung in die Durchflusszelle zu liefern. </li><li> Schalten konfokalen Abbildungsmodus zu XYT. Aktivieren Cy5 und GFP-Kanälen unter gleichzeitiger Bildmodus. Passen konfokalen Einstellungen auf Cy5 Intensität (Laserintensität, Gain und Offset), um zu vermeiden Sättigung Signale, die von entscheidender Bedeutung für die Quantifizierung. (Hohe zeitliche Auflösung zur Visualisierung Farbeindringprüfung bevorzugt. Allerdings nimmt schnelle Scan-Bildqualität.) Wählen Sie die richtige Scan-Geschwindigkeit und Rauh um die Zeitauflösung der Bildverarbeitung und der Bildqualität auszugleichen. Aus diesem Protokoll eine Linie durchschnittlich vier und eine Bildrate von 0,15 Hz. </li><li> Fortsetzen der Strömung zu Cy5 in die Durchflußzelle (noch bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,03 ml / min) zu liefern. Gleichzeitig beginnen Zeitreihen konfokale Bildgebung. </li><li> Quantifizieren Cy5 Eindringen von radial durchschnittlich Cy5 Intensität innerhalb eines 2-D-Kreisbiofilmkolonie. Zu mitteln, zuerst den Rand eines Biofilms Cluster zu identifizieren, dann ein Abstandskarte für ein 2-D-Teil des ClustersUnd schließlich durchschnittlichen radialen Muster von Cy5 Intensitäten einen Durchdringungskurve (siehe Figur 6) zu erzeugen. <ol><li> Um rechen realisieren Schritt 3.8, verwenden BioSPA (Biofilm Spatial Pattern Analysis) Software-Paket (unveröffentlicht, Softwarepaket und Hand auf Anfrage erhältlich) oder andere Bildanalyseprogramme. </li><li> Um BioSPA verwenden, zuerst ein Bild in BioSPA gesetzt importieren. Wählen Sie dann die richtige Schwelle für GFP und Cy5 Kanäle binäre Bilder zu machen. Bei der Analyse / Berechnung Menü wählen Sie Advanced Analysis und Diffusion Analyse. Verwenden Sie das GFP-Kanal an den Rand eines Clusters definieren und das Polygon-Werkzeug, um einen Cluster als Region of Interest (ROI) zu wählen. </li><li> Doppelklicken Sie auf das ausgewählte Biofilm-Cluster, um eine Diffusion Analyse durchzuführen. Speichern Sie die Diffusionsanalyseergebnisse und kalibrieren Cy5 Intensität Cy5 Konzentration anhand einer Eichkurve. <ol><li> Um Cy5 Konzentration Eichkurve zu erzeugen, messen Cy5 Intensitäten über einen Cy5 concentration Gradienten unter der konfokalen Mikroskopie. (Cy5 Intensität und Konzentration haben eine lineare Beziehung.) </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Charakterisierung der Umgebung Fluss Feld von Tracking-Fluorescent Particles HINWEIS: Fluoreszierende Teilchen, wie fluoreszierende Mikroperlen verwendet werden, um das Strömungsfeld herum Biofilmen zu charakterisieren. Strömungsfeld um Biofilme aus den Zeitreihenbeobachtungen Partikelpositionen mit Particle Tracking Velocimetry Software berechnet werden. Die hier gezeigten Ergebnisse wurden mit dem Streams 2.02 Softwarepaket 16 (Software-Download und Benutzerhandbuch finden Sie unter erhalten <a href="http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml">http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml</a> ). <ol><li> Verdünne die fluoreszierenden Mikrokügelchen (Durchmesser ca. 1 &amp; mgr; m) in sterilisiertem Wasser auf ein Feststoffkonzentration von 0,2% und einem Endvolumen von 0,5 ml. Vortex, um sicherzustellen, dass die Mikroperlensind gut verteilt. </li><li> Einzuspritzen und den gewünschten verdünnt fluoreszierenden Mikroperlen in die Durchflußzelle folgenden Verfahren aus den Schritten 3.3 bis 3.5. Damit eine genaue Überwachung der Partikelbahn, mit einem relativ niedrigen Flussrate (0,01 ml / h für die Partikelverfolgung Ergebnisse in diesem Dokument). </li><li> Schalten konfokalen Einstellungen XYT Modus, um Partikelbewegung an einem z-Scheibe zu verfolgen und nehmen Sie Zeitreihen-Bildern. Wiederholen Partikelinjektion und Bild an verschiedenen Stellen Z (A Frame-Rate von 1 Hz wurde für die in dieser Veröffentlichung gezeigten repräsentativen Ergebnissen verwendet.), Um 3-D-Strömungsfeld zu erzeugen. </li><li> Pre-Prozess die Zeitreihen konfokale Bilder durch Subtraktion der Hintergrundfluoreszenz Signal (das Signal in der ersten aufgenommenen Bildes der Bildsatz) mit ImageJ (Software-Download und Anleitung auf <a href="http://imagej.nih.gov/ij/">http://imagej.nih.gov/ij/</a> ) oder andere Programme. </li><li> In ImageJ, öffnen Sie das erste Bild einer Bildsatz und importieren Sie die Bildmenge. Unter Prozess / Bild Calculator subtrahieren Sie das erste Bild aus dem Bild Set. Speichern Sie die vorverarbeiteten Bildmenge. </li><li> Zur Berechnung der Strömungsvektoren, Import Zeitreihen konfokalen Bildern in Streams 2,02. Unter &quot;Open Prozesssicht&quot;, wählen Sie und führen Sie &quot;Identifizieren Partikel&quot;. Verwenden Sie die richtige Schwelle, um Partikel zu identifizieren. Verwenden Sie 0,5 und 5 &amp; mgr; m als Mindest- und Höchstdurchmesser Schwellenwerte für 1 &amp; mgr; m-Partikel. </li><li> Dann unter &quot;Open Prozesssicht&quot;, wählen Sie und führen Sie &quot;PTV Analyse-Pipeline&quot;, um Partikelbahnen zu generieren. Überprüfen Sie die Partikelbahnen zu sehen, ob sie Partikelbewegung darstellen. Schließlich wählen Sie und führen Sie &quot;Neues Geschwindigkeitsfeld&quot;, um einen Fluss Vektorkarte zu generieren. </li></ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Wir haben gezeigt, eine Reihe von Methoden, um drei wichtige Biofilm-Umwelt-Interaktionen zu charakterisieren: Biofilm Reaktion auf chemische Gradienten, Auswirkungen von Biofilmwachstum auf die umliegende Flussmikroumgebung und Biofilm Heterogenität von internen Transportbeschränkungen resultieren. Wir haben gezeigt, zuerst die Verwendung eines neuartigen Mikrofluid-Durchflusszelle, um eine gut definierte chemische Gradient für Biofilmentwicklung verhängen. Um eine gut definierte chemische ...

Mikroorganismen auf Oberflächen befestigen und bilden Biofilme - Zellaggregate in einer extrazellulären-Polymermatrix 1 umschlossen. Biofilme ganz anders verhalten als einzelne mikrobielle Zellen, da Biofilme dramatische räumliche Heterogenität aus einer Kombination von internen Stofftransportbeschränkungen und räumlichen Veränderungen im Zellstoffwechsel 2,3 resultiert. Sauerstoff und Nährstoffkonzentration drastisch an der Grenzfläche zwischen den Biofilm und die umgebende Flüssigkeit und innerhalb der Biofilm-2 weiter abgereichert erhalten verringern. Räumliche Variationen Biofilm Atmung und Proteinsynthese kann auch als Reaktion auf die lokalisierten Sauerstoff und Nährstoffverfügbarkeit 2 auftreten. In Gewässern und Boden-Umgebungen, wohnen die meisten Bakterien in Biofilmen. Natürliche Biofilme die wichtigen biogeochemische Prozesse wie Radfahren Kohlenstoff und Stickstoff und reduzierende Metalle 4,5. Klinisch ist die Bildung von Biofilmen responsIVK längere Lungen- und Harnwegsinfektionen 6. Biofilm-assoziierten Infektionen sind sehr problematisch, weil Zellen in Biofilmen im Vergleich zu ihren Pendants Plankton 6 haben extrem hohe Resistenz gegen antimikrobielle Mittel. Da Biofilme sind in verschiedenen Einstellungen wichtig, ist ein wesentlicher Teil der Forschung auf das Verständnis der Umweltfaktoren, die Biofilm-Aktivitäten und die räumliche Heterogenität in Biofilmen und die umliegende Mikroumgebung steuern konzentriert. Frühere Studien haben festgestellt, dass Biofilmentwicklung wird stark durch eine Reihe von Umweltfaktoren reguliert: Biofilme entwickeln unterschiedliche Morphologien unter unterschiedlichen Strömungsbedingungen; Sauerstoff- und Nährstoffverfügbarkeit Einfluss Biofilm Morphologie; und hydrodynamische Schubspannung wirkt sich auf die Befestigung der planktonischen Zellen auf Oberflächen und die Ablösung von Zellen von Biofilmen 7-9. Darüber hinaus beeinflusst externen Strömungsbedingungen die Lieferung von Substraten into und in Biofilmen 10. Das Wachstum von Biofilmen verändert auch umgebenden physikalischen und chemischen Bedingungen. Beispielsweise führt das Biofilmwachstum zu lokalen Verarmung an Sauerstoff und Nährstoffen, 2; Biofilme akkumulieren anorganischen und organischen Verbindungen aus der Umgebung 11; und Biofilm Cluster umleiten Flusses und Erhöhung der Oberflächenreibung 12,13. Da Biofilme interagieren mit ihrer Umgebung auf sehr komplexe Weise, ist es entscheidend, um gleichzeitig Informationen über die Biofilmeigenschaften und Umgebungsbedingungen, und multidisziplinäre Ansätze müssen verwendet werden, um umfassend zu charakterisieren Biofilm-Umwelt-Interaktionen werden. Hier stellen wir eine Reihe von integrierten Methoden räumliche Muster in mikrobiellen Wachstums innerhalb mono-Arten und Zwei-Spezies Biofilmen unter einem auferlegten Nahrungs Gradienten zu charakterisieren, und die resultierende Änderung der lokalen chemischen und Flüssigkeitsmikroumgebung zu beobachten. Wir Tannest beschreiben die Verwendung eines kürzlich entwickelten Doppeleinlaß mikrofluidischen Flusszelle, um die Biofilmwachstum unter definierten chemischen Gradienten zu beobachten. Dann zeigen die Verwendung dieser Mikrofluid-Durchflusszelle, um das Wachstum von zwei Arten von Bakterien, Pseudomonas aeruginosa und Escherichia coli, in Biofilmen unter verschiedenen Ernährungsbedingungen beobachten. Wir zeigen, wie in situ Visualisierung von fluoreszierenden Tracers Ausbreitung in Biofilmkolonien verwendet werden, um quantitativ zu erfassen Muster der Stofftransport in Biofilmen werden. Schließlich zeigen wir, wie Mikropartikelverfolgung Geschwindigkeitsmessung unter der konfokalen Mikroskopie durchgeführt wird, kann zur lokalen Strömungsfeld um den wachsenden Biofilmen zu erhalten.

<table><tbody><tr><td>Schlauchpumpe</td><td>Gilson</td><td>Miniplus 3</td><td>Durchflusszelleneinrichtung und Inokulation</td></tr><tr><td>Pumpenschlauch 0,50&nbsp; mm OVC, Orange/Gelb</td><td>Gilson</td><td>F117934</td><td>Aufbau und Inokulation</td></tr><tr><td>Drei-Wege-Absperrhahn mit drehbarem Luer-Lock</td><td>Smiths Medical</td><td>MX9311L</td><td>Einrichtung und Inokulation von Durchflusszellen</td></tr><tr><td>Sylgard 184 Solarzellenverkapselung zur Herstellung von Solarmodulen</td><td>ML Solar LLC</td><td></td><td>Einrichtung und Inokulation von Durchflusszellen</td></tr><tr><td>Pyrex Medium Flasche, 1&nbsp; L, GL45 VWR</td><td></td><td>16157-191</td><td>Einrichtung und Inokulation von Durchflusszellen</td></tr><tr><td>C-FLEX Schlauch</td><td>Cole-Parmer</td><td>06422-02</td><td>Einrichtung und Inokulation von Durchflusszellen</td></tr><tr><td>1 ml TB Spritze</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Einrichtung und Inokulation von Durchflusszellen</td></tr><tr><td>Polymerschläuche</td><td>IDEX</td><td>1520G</td><td>Einrichtung und Inokulation von Durchflusszellen</td></tr><tr><td>Steriler Intramedic Luer Stub Adapter</td><td>Clay Adams</td><td>427564</td><td>Einrichtung und Inokulation von Durchflusszellen</td></tr><tr><td>PrecisionGlide Needle</td><td>BD</td><td>305195</td><td>Einrichtung und Inokulation von Durchflusszellen</td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>HACH</td><td></td><td>Einrichtung und Inokulation von Durchflusszellen</td></tr><tr><td>Spritzenfilter - steril (0,2 &mu; m)</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719A</td><td>Einrichtung und Inokulation der Durchflusszelle</td></tr><tr><td>MAXQ Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Einrichtung und Inokulation der Durchflusszelle</td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4418</td><td>Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisch wasserfrei</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RES20908-A7</td><td>Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>Monobasisches Kaliumphosphat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5655</td><td>Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>Magnisiumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td>Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5670</td><td>Wachstumssubstrate</td></tr><tr><td>Calciumsulfat-Dihydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3771</td><td>Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>Eisen(II)-sulfat-Heptahydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>215422</td><td>Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>Mangan(II)-sulfat-Monohydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td>Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>Kupfer(II)-sulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>451657</td><td>Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>Zinksulfat-Heptahydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z0251</td><td>Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>Kobalt(II)-sulfat-Heptahydrat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6768</td><td>Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>Natriummolybdat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>243655</td><td>Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6768</td><td>Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>Dextrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>Luria Bertani Bouillon</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3022</td><td>Wachstumsmedien</td></tr><tr><td>TCS SP2 Konfokalmikroskopie</td><td>Leica</td><td></td><td>Fluoreszenzbildgebung</td></tr><tr><td>SYTO 62</td><td>Life Technology</td><td>S11344</td><td>Fluoreszenzbildgebung</td></tr><tr><td>Cy5</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>PA15100</td><td>Fluoreszenzbildgebung</td></tr><tr><td>Rot fluoreszierend (580/605) FluoSphere</td><td>Life Technology</td><td>F-8801</td><td>Fluoreszenzbildgebung</td></tr><tr><td>BioSPA</td><td>Packman Lab</td><td></td><td>Bildverarbeitung</td></tr><tr><td>BildJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bildverarbeitung Volocity</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td>Bildverarbeitung</td></tr><tr><td>Streams 2.02</td><td>Bildverarbeitung der Universität Cantebury</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methoden zur charakterisierung des co-entwicklung von biofilm und habitat heterogenität

Methods for Characterizing the Co-development of Biofilm and Habitat Heterogeneity

Biofilme sind oberflächengebundenen mikrobiellen Gemeinschaften, die komplexe Strukturen aufweisen und signifikante räumliche Heterogenitäten. Biofilm Entwicklung wird stark von der umgebenden Strömung und Ernährungsumwelt geregelt. Biofilmwachstum steigt auch die Heterogenität der lokalen Mikroumgebung durch die Generierung komplexer Strömungsfelder und Stofftransport Mustern. Um die Entwicklung von Heterogenität in Biofilmen und Wechselwirkungen zwischen Biofilmen und ihre lokalen Mikrolebensraum zu untersuchen, wuchsen wir Mono-Arten Biofilme von Pseudomonas aeruginosa und Zwei-Spezies-Biofilmen von P. aeruginosa und Escherichia coli unter Ernährungs Gradienten in einer mikrofluidischen Flusszelle. Wir stellen ausführliche Protokolle für die Erstellung von Nährstoff Gradienten innerhalb der Flusszelle und zum Züchten und Visualisierung Biofilmentwicklung unter diesen Bedingungen. Wir weisen das Protokolle für eine Reihe von optischen Verfahren, um räumliche Muster in Biofilmstruktur Quantifizierung fließen distriträge über Biofilme und Massentransport um und in Biofilmkolonien. Diese Methoden unterstützen umfassende Untersuchungen der Co-Entwicklung von Biofilm und Habitatheterogenität.

Der Doppeleinlaß mikrofluidischen Flusszelle ermöglicht die Beobachtung von Biofilmwachstum unter einer gut definierten chemischen Gradienten durch Mischen von zwei Lösungen innerhalb der Durchflusskammer gebildet. Die sich ergebende chemische Gradienten wurde früher von Farbstoff Injektion beobachtet und detailliert charakterisiert von Song et al. 14. Glatten Konzentrationsgradienten wurden in der Querrichtung ausgebildet sind, wie in 1 gezeigt. Das Konzentrationsprofil war steil na...

Biofilme haben komplexe Wechselwirkungen mit ihrer Umgebung. Um Biofilm-Umwelt-Wechselwirkungen umfassend zu untersuchen, stellen wir hier eine Reihe von Methoden vor, um eine heterogene chemische Umgebung für die Biofilmentwicklung zu schaffen, die lokale Strömungsgeschwindigkeit zu quantifizieren und den Stofftransport in und um Biofilmkolonien zu analysieren.

Methoden zur Charakterisierung des Co-Entwicklung von Biofilm und Habitat Heterogenität

Biofilms are surface-attached microbial communities that have complex structures and produce significant spatial heterogeneities. Biofilm development is ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die Wechselwirkungen von Biofilmen mit der umgebenden Umwelt mithilfe integrierter Methoden zu charakterisieren. Ein mikrofluidisches Flusskammersystem mit zwei Zulauföffnungen wird aufgebaut, bei dem Medien mit und ohne Glukose durch die Flusskammer gepumpt werden, wodurch ein Glukosegradient erzeugt wird. Anschließend werden Bakterien dem System hinzugefügt, und die Biofilme können über mehrere Tage hinweg wachsen.Die Biofilme werden anschließend mittels 3D-Konfokalmikroskopie abgebildet, um den Transport von Lösungen zu charakterisieren. Innerhalb der Biofilme werden fluoreszierende Tracer in das Durchflusssystem injiziert, und es werden Zeitrafferaufnahmen durchgeführt, um das Strömungsfeld um die Biofilmkolonien zu charakterisieren; außerdem werden fluoreszierende Mikroperlen injiziert und erneut Zeitrafferaufnahmen angefertigt. Die Analyse des Lösungstransports und die Partikelverfolgung anhand der gewonnenen Daten zeigen den Nutzen dieser Methode zur Untersuchung von Biofilmprozessen unter verschiedenen chemischen Bedingungen innerhalb eines einzigen Geräts und in einem einzigen Experiment. Der Hauptvorteil dieser Methoden liegt darin, dass sie die gleichzeitige Beurteilung mehrerer Aspekte der Wechselwirkungen zwischen Biofilmen und ihrer Umgebung ermöglichen. Die hier beschriebenen Methoden können helfen, zentrale Fragen zur Biofilmbildung in natürlichen Umgebungen oder bei biofilmbedingten Infektionen zu beantworten. Übertragen Sie unter einer laminaren Luftströmung eine Kolonie von posa PAO1 GFP sowie eine Kolonie von E. coli DH5α von einer LB-Platte in separate Röhrchen, die jeweils drei Milliliter LB-Brühe enthalten.Inkubieren Sie die Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius unter Schütteln mit 225 U/min. Dieses Flusssystem basiert auf einer mikrofluidischen Zelle mit doppeltem Inlet, die die Beobachtung des Biofilmwachstums unter einem gut definierten chemischen Gradienten ermöglicht, der durch die Vermischung zweier Lösungen in der Flusskammer entsteht. Während des Flusses bildet sich in transversaler Richtung ein gleichmäßiger Konzentrationsgradient aus.Aufgrund der Diffusion ist das Konzentrationsprofil nahe dem Einlass steil und stromabwärts flacher. Am Tag des Experiments bauen Sie das Flusssystem sorgfältig auf. Befestigen Sie zunächst den Schlauch in der Rollerpumpe, verbinden Sie dann ein Ende des Schlauchs mit einer Mediumflasche, die 900 Milliliter FAB-Medium mit Glukose enthält, und das andere Ende mit einer Blasenfalle.Wiederholen Sie diesen Vorgang, um eine zweite Medium-Flasche mit 900 Milliliter Fab ohne Glukose an eine zweite Blasenfalle anzuschließen. Bringen Sie anschließend Dreiweghähne direkt vor den Zulaufstutzen der Durchflusszelle an und verbinden Sie jeweils eine der Blasenfallen mit der Durchflusszelle. Schließen Sie abschließend den Auslass der Durchflusszelle an eine Abfallflasche an.Stellen Sie sicher, dass die Flusszelle mit der Deckglasseite nach unten platziert wird, damit sich die suspendierten Zellen auf dem Deckglas absetzen können. Nachdem das Flusssystem zusammengebaut ist, schalten Sie die peristaltische Pumpe mit einer Flussrate von 10 Milliliter pro Stunde für jeden Inlet ein, um das System mit dem Medium zu füllen; dabei wird fab-Medium über die beiden Inlets zugeführt, wobei Glukose nur über einen Inlet zugegeben wird. Verdünnen Sie anschließend im Sicherheitswerkbank die beiden Bakterienkulturen im Verhältnis eins zu eins in einem Milliliter steriler Wasser, jeweils mit einem äquivalenten OD 600 von 0,01, um die Flusszelle zu beimpfen. Verwenden Sie eine sterile Plastikspritze, um jeweils 500 Mikroliter des Inokulums über das Dreiwegventil in jeden Inlet der Flusszelle einzuspritzen.Nach der Injektion stoppen Sie die Pumpe und lassen Sie die Bakterienzellen eine Stunde lang an das Deckglas andocken. Nachdem die Zellen angeheftet sind, stellen Sie die Pumpe auf 0,03 Milliliter pro Minute für jeden Inlet ein und lassen Sie das System drei Tage lang bei Raumtemperatur fließen, wobei sich ein Biofilm unter einem Gradienten der Glukoseexposition entwickelt. Nach Ablauf von drei Tagen verwenden Sie einen Marker und ein Lineal, um ein Gitter auf der Seite des Deckglases der Flusszelle einzuzeichnen, um die Bildgebung vorzubereiten.Dies erleichtert die Lokalisierung der Bildgebungsregionen für die Gegeneinfärbung zur Betrachtung von E. coli. Dimmen Sie zunächst das Licht, um den Arbeitsbereich abzudunkeln, da die Gegeneinfärbung lichtempfindlich ist. Geben Sie mithilfe einer Spritze langsam ein Milliliter verdünntes, zellpermeables, rot fluoreszierendes Nukleinsäurefarbstoff in das Drei-Wege-Ventil stromaufwärts der Flusskammer.Stoppen Sie den Fluss. Lassen Sie die Flusszelle 30 Minuten lang im Dunkeln stehen. Nach Ablauf von 30 Minuten.Setzen Sie den Fluss mit 0,03 Milliliter pro Minute fort und spülen Sie die nicht gebundene Färbung 15 Minuten lang aus. Stoppen Sie anschließend den Fluss und untersuchen Sie die Biofilme mittels konfokaler Mikroskopie mit einem 63x-Objektiv. Wählen Sie ein Bildfeld, das eine ausreichende Biomassemenge mit gut getrennten Biofilmkolonien enthält, wie hier gezeigt.Erstellen Sie anschließend 3D-Bildstapel in den geeigneten Kanälen, um die räumlichen Muster der Biofilmbildung innerhalb des Flusskammerbilds abzubilden, und zwar an drei oder mehr longitudinalen oder X-Positionen entlang des Einlasses der Flusskammer sowie an drei transversalen oder Y-Positionen relativ zum vorgegebenen Nährstoffgradienten. Um die Muster des Stofftransports innerhalb des Biofilms zu charakterisieren, beginnen Sie mit der Flusskammer. Nach drei Tagen Biofilmbildung arbeiten Sie erneut im Dunkeln.Stoppen Sie die Pumpe, um den Fluss zu unterbrechen, und öffnen Sie die Entlüftungshähne, um den Injektionsdruck abzulassen. Injizieren Sie dann mit einer Spritze ein Milliliter verdünnte sci-fi-Tracer-Lösung in eines der Dreiwegventile vor der Durchflusszelle. Schließen Sie nach der Injektion der sci-fi-Lösung die Entlüftungshähne.Stellen Sie das Drei-Wege-Ventil ein und starten Sie die Pumpe erneut mit 0,03 Milliliter pro Minute, um die Sci-Fi-Lösung in die Durchflusszelle zu leiten. Schalten Sie anschließend den konfokalen Bildmodus auf XYT mit einer Bildrate von 0,15 Hertz um. Eine hohe zeitliche Auflösung wird bevorzugt, um das Eindringen des Farbstoffs nachverfolgen zu können; schnelles Scannen verringert jedoch die Bildqualität.Stellen Sie daher die Abtastgeschwindigkeit und den Zeilenmittelwert so ein, dass ein Ausgleich zwischen der zeitlichen Auflösung der Bildgebung und der Bildqualität erreicht wird. Sobald die Bildgebungsparameter festgelegt sind, starten Sie die Pumpe erneut, um die Strömung fortzusetzen. Mit einer Rate von 0,03 Milliliter pro Minute wird sci five gleichzeitig in die Durchflusszelle eingeleitet.Beginnen Sie die zeitraffende konfokale Bildgebung. Sobald die zeitraffende Bildgebung abgeschlossen ist, führen Sie die Diffusionsanalyse gemäß den Anweisungen im beigefügten Dokument durch.Um das Strömungsfeld um Biofilme zu charakterisieren, verdünnen Sie die fluoreszierenden ein Mikrometer großen Mikroperlen in sterilisiertem Wasser auf eine endgültige Feststoffkonzentration von 0,2 % und ein Endvolumen von 0,5 Millilitern. Anschließend wirbeln Sie die Probe um sicherzustellen, dass die Mikroperlen gleichmäßig verteilt sind, halten die Strömung an und injizieren sowie applizieren die verdünnten fluoreszierenden Mikroperlen in die Durchflusszelle. Wie zuvor stellen Sie die Strömungsgeschwindigkeit auf 0,01 Milliliter pro Stunde ein.Die niedrige Flussrate ermöglicht eine genaue Verfolgung der Partikelbahn. Wechseln Sie die Konfokaleinstellungen in den XYT-Modus und weisen Sie die Software an, die Partikelbewegung in einer Z-Schicht zu verfolgen. Erfassen Sie wie zuvor Zeitschrittbilder mit einer Bildrate von einem Hertz. Wiederholen Sie den Partikelinjektionsvorgang und nehmen Sie Bilder an verschiedenen Z-Positionen auf. Nach Abschluss der Bildaufnahme befolgen Sie die Anweisungen im beigefügten Dokument, um Strömungsvektoren zu berechnen und bakterielle Wechselwirkungen in einem Biofilm unter einem Glukosegradienten zu untersuchen. Posa GFP und E coli wurden in duospezifischen Biofilmen durch Gegenfärbung unterschieden.Bei Cyto 62 wurden in jedem der neun Bildgebungsregionen auf der Durchflusskammer jeweils 2 Bilder aufgenommen. In den hier gezeigten Überlagerungen erscheint posa GFP grün oder gelb und e coli rot. posa dominierte die Biofilmbiomasse in Regionen mit hohen Glucosespiegeln, während e coli in Regionen mit niedrigen Glucosespiegeln dominierte.Daher besetzten die beiden Arten unterschiedliche ökologische Nischen. Diese Ergebnisse zeigen den Nutzen der Doppelinlet-Mikrofluidik-Flusszelle für die Untersuchung der Biofilmbildungsaktivität und von Interaktionen in komplexen Umgebungen. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Doppelinlet-Mikrofluidik-Flusszelle verwendet, um Biofilme unter chemischen Gradienten zu kultivieren, und wie man Umweltparameter für die Biofilmbildung durch Injektion fluoreszierender Partikel oder Marker („Chaser“) nach der Entwicklung erhält.Diese Methoden ebneten den Weg für Forscher in den Bereichen Umwelt- und klinische Mikrobiologie, um komplexe Wechselwirkungen zwischen mikrobiellen Gemeinschaften und ihrer Umgebung zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Wir bieten eine einfache, semi-quantitative Methode zur Biofilm-Bildung zu...

Ein semi-quantitativer Ansatz, um die Biofilmbildung Mit Wrinkled Colony Entwicklung zu bewerten

Quelle: Miquel Guennoc, C., et al. Neue Methode zur qualitativen multiskaligen Analyse bakterieller Biofilme auf filamentösen Pilzkolonien mittels Konfokal- und Elektronenmikroskopie. J. Vis. Exp. (2017)Dieses Video zeigt die Herstellung einer Pilzkultur auf behandelten Zellophanmembranen zur Unterstützung der Koloniebildung und des radialen Wachstums. Anschließend zeigt es die Kultivierung und Vorbereitung von bakteriellen Bodenzellen für Interaktionstests. Abschließend zeigt sie, wie...

Etablierung einer pilzbakteriellen Kokultur zur Biofilmbildung

Es wird ein Protokoll für die gleichzeitige Quantifizierung und den Vergleich von drei zellulären und extrazellulären Komponenten innerhalb von Biofilmen vorgestellt. Die Methodik umfasst den Einsatz von konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie, Biofilm-Strukturanalyse- und Visualisierungssoftware sowie statistischer Analysesoftware.

Gleichzeitige Quantifizierung zellulärer und extrazellulärer Bestandteile von Biofilmen

Das Ziel dieser Verfahren ist es, die Papier Verwendung eines mikrofluidischen Systems für die Entwicklung von Mehrarten Biofilmen, die typischerweise bei humanen supragingivale Plaque identifiziert Arten enthalten beschreiben. Methoden, um die Biofilmarchitektur Biofilm Lebensfähigkeit und ein Konzept für die Ernte Biofilm für kulturabhängig oder kulturunabhängige Analysen hervorgehoben zu beschreiben.

Verwendung eines Hochdurchsatz-<em&gt; In-vitro-</em&gt; Mikrofluidik-System auf die mündliche Multi-Spezies-Biofilme entwickeln

Die Rolle des Sortiments (räumliche Trennung) in evolutionären Szenarien können mit einfachen mikrobiellen Systemen im Labor untersucht werden, die eine Anpassung der räumlichen Verteilung gesteuert ermöglichen. Durch eine Modifikation können die Gründer Zelldichte, verschiedene Sortiment Ebenen fluoreszenzmarkierte Bakterienstämme in der Kolonie Biofilme von Bacillus subtilis verwendet werden sichtbar gemacht .

Überwachung räumliche Trennung in Oberflächen Colonizing mikrobiellen Populationen

Dieses Protokoll beschreibt ein neues Verfahren zu wachsen und qualitativ bakteriellen Biofilmen auf Pilzhyphen durch konfokale und Elektronenmikroskopie analysiert.

Eine neue Methode zur qualitativen Mehrskalige Analyse von bakteriellen Biofilmen auf filamentösen Pilzkolonien mittels konfokaler und Elektronenmikroskopie

Durchflusszytometrie in Kombination mit visuellen clustering bietet eine einfach zu bedienende und schnelle Methode zur Untersuchung von aquatischer Biofilms. Biofilm-Charakterisierung, Erkennung von Veränderungen in der Struktur der Biofilm-Gemeinschaft und die Detektion von abiotischen Partikeln eingebettet im Biofilm einsetzbar.

Charakterisierung der aquatischen Biofilme mit Durchflusszytometrie

Mikrobielle Biofilme bilden komplexe Architekturen an Interphasen und entwickeln sich zu stark maßstabsabhängigen Raummustern. Hier stellen wir ein experimentelles System (Hard- und Software) zur automatisierten Erfassung von 3D-Datensätzen zur optischen Kohärenztomographie (OCT) vor. Dieses Toolset ermöglicht die nichtinvasive und multiskalige Charakterisierung der Biofilmmorphogenese in Raum und Zeit.

Automatisierte 3D-Optische Kohärenztomographie zur Aufklärung der Biofilmmorphogenese über große räumliche Skalen

Antimikrobiell induzierte Veränderungen der Biofilmarchitektur von Pseudomonas aeruginosa unterscheiden sich zwischen klinischen Isolaten, die von Patienten mit Mukoviszidose und chronischer Lungeninfektion kultiviert wurden. Nach der konfokalen Mikroskopie kann die COMSTAT-Software verwendet werden, um Variationen in der Biofilmarchitektur (z. B. Oberfläche, Dicke, Biomasse) für einzelne Isolate zu quantifizieren und so die Wirksamkeit von Antiinfektiva zu bewerten.

Quantifizierung der Auswirkungen von Antibiotika auf die In-vitro-Biofilmarchitektur mit der COMSTAT-Software

Hier wird ein schnelles und standardisiertes Verfahren zur Etablierung synergistischer Multispezies-Biofilmgemeinschaften aus verschiedenen Rhizosphärenböden vorgestellt. Es handelt sich um ein einzigartiges Protokoll, das entwickelt wurde, um die komplexe Bodenmikrobiota der Rhizosphäre zu untersuchen und zu simulieren.

Ein Ansatz zur Konstruktion von Multispezies-Biofilmgemeinschaften aus Rhizosphärenböden

Erfahren Sie Methoden zur Charakterisierung von Biofilm-Umwelt-Interaktionen mit einem doppelten Mikrofluidik-System. Diese Technik ermöglicht die Erzeugung chemischer Gradienten und die Analyse von Strömungsfeldern um Biofilmkolonien.

Methoden zur Charakterisierung des Co-Entwicklung von Biofilm und Habitat Heterogenität

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