Name: Funktionellen und morphologischen Bewertung der Membran Innervation durch phrenicus Motoneuronen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: Erfahren Sie die quantitative Bewertung funktioneller und morphologischer Zwerchfell-Innervation durch Phrenikus-Motoneuronen. Diese Methode kombiniert CMAP-Aufzeichnung und Ganzpräparat-Immunhistochemie für neurologische Forschung.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das NINDS (Grant #1R01NS079702 to A.C.L.) und das SURP-Programm an der Thomas Jefferson University (M.M.).

Experimentellen Verfahren wurden von der Thomas Jefferson University Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt und in Übereinstimmung mit der Europäischen Gemeinschaften Richtlinie des Rates (2010/63 / EU, 86/609 / EWG und 87 bis 848 / EWG), der NIH Leitfaden für die durchgeführt Pflege und Verwendung von Labortieren und der Society for Neuroscience der Richtlinien über die Verwendung von Tieren in der neurowissenschaftlichen Forschung. 1. Verbindung Muskelaktionspotentiale (CMAPs) <ol><li> Vorbereiten des Tieres: <ol><li> Betäuben die Ratte mit einem Inhalations (Isofluran) bei 1-2% auf Wirkung oder durch Injektion (Ketamin, Xylazin, Acepromazin) geliefert. Dosierung von injizierbaren Anästhesie ist wie folgt: 95,0 mg / kg Ketamin, 10,0 mg / kg Xylazin, 0,075 mg / kg Acepromazin. HINWEIS: Wir verwenden sowohl erfolgreich Inhalations und Injektionsanästhesie nähert sich bei der Durchführung dieses CMAP Aufzeichnungsprotokoll, ohne Präferenz. </li><li> Das Tier muss bei der entsprechenden a beibehalten werdennesthetic Tiefe vor der Operation begonnen wird, durch den Abschluss der Operation und bis zum postoperativen Buprenorphin wirksam geworden. Überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch kurze toe Prise, um festzustellen, dass ein Rückzug Reaktion nicht ausgelöst. Darüber hinaus prüfen die Kornealreflex mit einem Wattestäbchen. Der gesamten chirurgischen Prozedur zu bestimmen, dass die Herzfrequenz und Atemfrequenz nicht erhöht, was darauf hindeutet, daß die Narkosetiefe hat sich zu leicht. </li><li> Tragen Sie einen Tierarzt Salbe auf die Augen des Tieres bis zur Trockenheit während der Narkose zu verhindern. </li><li> Der Operateur sollte sie mit einem Desinfektionsmittel (Chlorhexidin-Peeling) vor Beginn der Operation waschen / Händen. Der Operateur sollte sterile Handschuhe, Gesichtsmaske, und kleid oder reinigen Laborkittel tragen. Alle Instrumente sollten gewaschen und vor der Operation autoklaviert werden. Fügen Sie einen Sterilisationsindikatorstreifen im Inneren des Instruments Kit vor dem Autoklavieren auf der Ebene der Instrumente zu überprüfen, dass die Sterilisation abgeschlossen ist. Der Operateur sollteüberprüfen, ob die gesamte Zeile auf dem Streifen ist schwarz vor Beginn der Operation. Kleben Sie die Außenseite der Box mit Angabe Autoklaven Band auch. Wenn der Operation ist es, auf mehrere Tiere am selben Tag durchgeführt werden, reinigen Sie die Geräte zwischen Operationen und Sterilisieren in einer Glasperle Sterilisator. Falls erforderlich, sterilisiert beide Enden des Instruments in der Glasperle Sterilisator indem das Handstück des Instruments im Sterilisator für die entsprechende Zeit, das Entfernen des Instrumentes mit einer sterilen Hämostatikum, Abkühlen in einem sterilen Bereich und dann Platzieren des funktionalen Ende das Instrument in die Glasperle-Sterilisator für die entsprechende Zeit. </li><li> Sobald Tier betäubt, kann am OP-Board mit Rückenfläche nach unten und Bauch nach oben, so dass die Band verwendet werden, um Tiervorderbeine, um chirurgische Platine befestigt werden. </li><li> Rasur Ventralfläche kaudal beginnend an der Basis des Schädels und sicherzustellen, dass der Bereich um den Bauch zu beiden Seiten der Mittellinie ist shaved je nachdem, welche Hemidiaphragma aufgezeichnet wird. Gelten Povidonjod auf die rasierte Hautoberfläche. </li></ol></li><li> Vorbereitung für CMAP Aufnahmen: <ol><li> Nach Tier Vorbereitung, Ort Masseelektrode subkutan in Schwanz (Abbildung 1). </li><li> Legen Sie die Referenzelektrode subkutan in die kontralaterale untere Bauchregion. </li><li> Zeigen leitendes Gel auf selbstklebende Oberfläche Band oder Plattenaufzeichnungselektrode (Dimensionen der Oberfläche Streifenelektrode: 0,5 x 3 cm), und legen Sie dann Oberflächenelektrode quer entlang der einseitigen Rippenbogen. </li><li> Zeigen Stimulationselektroden transkutan 0,5 cm Abstand seitlich zur Luftröhre und über dem Schlüsselbein. Legen Sie die Elektroden etwa 1,0 cm tief durch die Haut. Sichern Sie sich die Elektroden mit der Hand, so dass ihre Lage nicht mit anschließenden Stimulationen zu bewegen. HINWEIS: Winkel stimulierenden Elektroden 90 ° relativ zu der Haut an der Stelle der insertion. </li></ol></li><li> Verbindung Muskelaktionspotenzial (CMAP) Aufnahmen: <ol><li> Erhalten Sie elektrophysiologischen Ableitungen mit einem Stimulator / Verstärker gefolgt von computergestützten Datenanalyse. </li><li> Die Stimulationsparameter der einzelnen Pull-Stimulation sollte 0,5 ms, 1,0 Hz supra Impulse sein. Die Amplitude der Anregung sollte zwischen 6,0 und 8,0 V (2A) ist. HINWEIS: In einem Experiment mit einem Stimulusintensität mit der gleichen Amplitude für Tiere. Das Ziel besteht darin, die Antwortamplitude unter Verwendung des minimalen Amplitude der Stimulation zu maximieren. Es ist wichtig zu beachten, dass die erste Reaktion, die zum Zeitpunkt der Stimulation auftritt, ist ein Stimulationsartefakt. Außerdem sollte darauf geachtet werden, eine CMAP Reaktion, die von einem stabilen / Flachbasislinie nach der Stimulation Artefakt, das dann durch die schnelle Reaktion CMAP gefolgt vorausgeht erhalten. Um eine solche Reaktion zu erreichen, kann es notwendig sein, um die Stimulation zu positionieren und / oderAufzeichnungselektroden. </li><li> Warten Sie 30 s zwischen Stimulationen, und wiederholen Sie 10 Stimulationen in einer Reihe, um die durchschnittliche Antwort (2B - C) zu erhalten. Messung der Amplitude von der Grundlinie zur Spitze (2A). Führen Phrenicus Stimulation während der Phase des Atemzyklus des Tieres, wenn die Zwerchfellnerv / Membran ist nicht aktiviert. Das Verfahren kann auf dem gleichen Tier für die kontralaterale Hemidiaphragma wiederholt werden. </li><li> Nach dem letzten CMAP Aufnahme-Session, durchströmen das Tier, wenn NMJ Färbung wird durchgeführt werden. Führen CMAP Aufnahmen immer wieder auf dem gleichen Tier etwa einmal pro Woche (oder Intervall der Wahl). </li><li> Im Anschluss an das Überleben CMAP Aufnahmen ermöglichen Tier auf einem umlaufenden Warmwasserheizung Pad während der Wiederherstellung, bis wach und sternally Liegerad erholen, und kontinuierlich zu überwachen. Sie ein Tier, das der Operation an die Firma von anderen Tieren unterzogen wurde, bis vollständig erholt nicht zurück. &lt;/ Li&gt; <li> Sobald sternally Liegerad, überwachen die Tier jede 12 Stunden für die ersten 48 Stunden (einmal täglich danach). Wenn das Tier scheint dehydriert (schlaffe Haut, Lustlosigkeit) sein, zu verwalten Flüssigkeiten (Ringer-Laktat-Lösung; subkutan; 1-2 ml pro Injektion, mit den Standorten gedreht; 2 mal pro Tag) bis zum postoperativen Gewicht und Flüssigkeitsverlust stabilisiert. Bieten Tieren mit enthärtetem Essen in kleine Gerichte während der akuten postoperativen Phase bei Bedarf zu fördern essen, wenn sie den Draht bar Deckel Einzug nicht erreichen kann. </li><li> Verabreichen Buprenorphin in einer Dosis von 0,05 mg / kg bis zum Ende der Operation und dann bei 12 Stunden Intervallen für die ersten 24 Stunden (und abhängig von Anzeichen von Schmerz / Belastung danach) subkutan injiziert (site gedreht). Wenn Anzeichen von Schmerzen oder Leiden werden danach aufgefallen, behandeln Tiere mit Buprenorphin. Zeichen, die von Schmerz / Not gehören der Mangel an Aktivität, Lautäußerungen, mangelnder Essen oder Trinken (Dehydratation), übermäßiger Gewichtsverlust, Bewachung, excEssiv nagt oder Kratzen an der Stelle der Inzision. Bei der Bestimmung, Schmerzen und Leiden verwendet zusätzliche Kriterien umfassen Teilnahmslosigkeit auf äußere Reize, vorübergehende oder unprovozierten Stimmgebung, erschwerte oder abnormale Atmung, persistent rotbraune Nasen occular Entladung, markiert Piloerektion. Außerdem überwachen Beweis mangelnder Hygiene, die kranke Tiere vorschlagen würde. Wenn Tier noch beobachtet, um in Not nach 72 h der Behandlung (nach den Schmerz / Stresskriterien skizzieren oben und nach Erhalt der oben beschriebene Analgetikum-Protokoll) das Tier einschläfern. </li></ol></li></ol> 2. Membranneuromuskuläre Junction (NMJ) Analyse <ol><li> Tier Dissektion: <ol><li> Verwaltung der Tier eine Überdosis injizierbaren Narkose (: Ketamin auf 285,0 mg / kg, Xylazin bei 30,0 mg / kg, Acepromazin bei 0,225 mg / kg; intraperitoneal 3 mal Dosis oben verwendet). Nach Überdosierung sollten alle Tiere eine zweite Methode der Euthanasie (Thorakotomie) haben to sicherzustellen Tod. Der Tod sollte durch Beobachtung der Herz- und Atemstillstand und mit der Feststellung festgelegt und erweiterte Pupillen des Tieres bestätigt werden. </li><li> Führen Sie eine Laparotomie mit Skalpell oder Dissektion Schere Verlängerung der Exzision von der zyphoid Prozess kaudal entlang der Mittellinie. Sorgfältig trennen Haut und Bindegewebe von darunter liegende Muskulatur mit Skalpell und Pinzette. </li><li> , Und ziehen Sie die zyphoid Prozess verwenden Dissektion Schere gesamte Membran zu entfernen, so dass die Membran bleibt umgebenden Knochen befestigt. Dies ist wichtig, da sie eine Beschädigung der Membrane Muskels zu vermeiden, wird für die erfolgreiche Präparation der gesamten Membran zu ermöglichen und beim Reinigen Muskels zur anschließenden Färbung unterstützen. HINWEIS: An diesem Punkt kann ggf. Tier perfundiert werden. </li></ol></li><li> Reinigung und Färbung der Membran: <ol><li> Festzunageln die gesamte Membran präpariert, überlegene Seite nach oben, um Silikonkautschuk in einem Glas 100 mm Petrischale in4% Paraformaldehyd (in 1% Phosphat gepufferter Kochsalzlösung - PBS) für 20 min unter Verwendung eines Stereomikroskops. Dehnen Sie den Membran es straff zu machen, und unter Verwendung von Insekten Stifte, festzunageln das umliegende Gewebe, dass Blockieren verhindert die Membran Muskel selbst (Abbildung 3). </li><li> Sorgfältig reinigen Bindegewebe nur von der oberen Fläche Muskel mit # 5 Zangen und kleine Schere. HINWEIS: Führen Sie alle nachfolgenden Schritte dieses Färbeprotokoll langsam Schütteln bei Raumtemperatur vor Licht abgedeckt sofern nicht anders angegeben. Stellen Sie sicher, dass die Membran Muskel immer vollständig in Flüssigkeit eingetaucht, um ein Austrocknen zu verhindern out. </li><li> Vor dem Färben, bereiten alle notwendigen Reagenzien: 1x PBS, 2% Rinderserumalbumin (BSA) / PBS, 0,1 M Glycin in 2% BSA / PBS, 4% Paraformaldehyd (PFA) in 1x PBS und 0,2% TBP hergestellt (0,2 % Triton X100 in 2% BSA / PBS). Achten Sie darauf, bei -20 vorzukühlen Methanol ° C. </li><li> Wash 3x für 10 min in 1x PBS. </li><li> Inkubieren in 0,1 M Glycin (in 2 gemacht% BSA / PBS) für 30 min. </li><li> Inkubieren RBTX (Rhodamin-konjugiertem α-Bungarotoxin) -Lösung für 15 min. Lösung für RBTX ist wie folgt: Rhodamin-konjugiertem alpha Bungarotoxin 1: 400-Verdünnung in 1 × PBS. HINWEIS: In diesem Protokoll Rhodamin verwendet wird, aber jede Fluorophor der Wahl kann für die Färbung eingesetzt werden. </li><li> Wash 3x für 10 min in 1x PBS. </li><li> In -20 ° C Gefrierschrank, Inkubation mit MeOH 5 min. HINWEIS: MeOH bevor Muskel in der Tiefkühltruhe nicht hinzuzufügen, und umgehend entfernen Lösung nach der Inkubationszeit. </li><li> Wash 3x für 10 min in 1x PBS. </li><li> Block in 0,2% TBP 1 Stunde (0,2% Triton gemacht in 2% BSA / PBS). </li><li> Inkubieren mit primärer Antikörperlösung (bei 0,2% TBP) bei 4 ° C über Nacht unter Schütteln. Verdünnungen von Antikörpern wie folgt: SV2 (1:10) und SMI-312 (1: 1000). </li><li> Für 10 min mit 0,2% TBP waschen 3x. </li><li> Inkubieren mit sekundärem Antikörper unter Verwendung von 1: 100 Verdünnung FGM1 (FITC-konjugiertem Ziege-anti-Maus-IgG1; in 0,2% TBP) machte beim Schaukeln für 1 Stunde. HINWEIS: Vor Licht für den Rest des Protokolls für die Färbung. </li><li> Wash 3x für 10 min mit 1x PBS. </li><li> Re-clean umgebende Bindegewebe am überlegen (siehe oben) Oberfläche der Muskeln vor der Montage und Eindecken. HINWEIS: Es wird empfohlen, zu reinigen und dann montieren Probe unmittelbar nach der Färbung. Wenn es jedoch notwendig, Probe kann in 1x PBS bedeckt werden, in Parafilm eingewickelt, um eine Verdunstung zu verhindern und bei 4 ° C für bis zu 1 Woche gelagert, mit wechselnden PBS täglich. </li><li> Bei Montage auf Glasobjektträger, Deckglas mit nicht hardset Vectashield. Siegel Kanten der Deckglas mit klarem Nagellack, um ein Austrocknen zu verhindern out. Shop Folien flach in Karton Dia Ordner liegen in -20 ° C für die langfristige. </li></ol></li><li> Analyse und konfokale Abbildung: <ol><li> Quantitativen Analyse der Morphologie des gefärbten und montiert Hemi-Membran unter 20X und 40-facher Vergrößerung unter Verwendung eines aufrechten EpifluoreszenzMikroskop. Hinweis: Da die Membran angefärbt und in einer ganzen-mount Weise analysiert, ist ziemlich dick der Muskel. Folglich ist der größte Teil der Fluoreszenzfärbung völlig unscharf, wenn ein statisches Bild mit nicht-konfokalen Fluoreszenzmikroskopie. Aus diesem Grund ist es am besten, um die NMJ Analyse in Echtzeit auf dem Mikroskop durchzuführen, da dies ermöglicht es Ihnen, sich ständig konzentrieren &quot;up&quot; und &quot;down&quot; durch den Muskel, um die Morphologie von jedem der einzelnen NMJs richtig zu identifizieren. Mit diesem Ansatz kann man leicht folgen die Flugbahn der einzelnen Motor Axone, wie sie durch das Gewebe in räumlicher Beziehung zu den postsynaptischen Rezeptor-Cluster zu verschieben. </li><li> Durch Messung der ventral-zu-Rücken-Länge des Muskels, teilen den Muskel in 3 separate Abschnitte für die Analyse basierend auf topographische Innervationsmuster von bestimmten Rückenmarks Ebenen (Figur 4H). </li><li> Beginnend an der Bauchseite des Muskels und moving dorsal, analysieren alle en face NMJs auf Oberfläche Muskelfasern entfernt. Nicht analysieren Muskelfasern tiefer als die ersten 3-4 Fasern von der Oberfläche als Interpretation schwierig sein kann, an der schlechteren Antikörper Penetration (RBTX dringt viel tiefer in den Muskel durch die geringe Größe des Toxins im Vergleich zu den größeren Antikörper zur Markierung Neuronen). </li><li> Kennzeichnen Sie jeden NMJ als intakt, wenn die Pre-terminalen Axon des Neurons ist dick im Durchmesser und alle Regionen des Nervenende überlappen vollständig mit der zugrundeliegenden Muskelacetylcholinrezeptoren (AChRs). </li><li> Kennzeichnen Sie jeden NMJ als teilweise denervierten falls Bereich der darunter liegende Muskulatur AChRs unbesetzt ist mit entsprechenden Nervenende. </li><li> Kennzeichnen Sie jeden NMJ so vollständig denervierten, wenn die Muskel AChRs haben keine entsprechende Nervenende (es ist auch wichtig, um andere NMJs mit markierten Neuronen in dem selben Gebiet des Fokus zu haben, so dass man sicher, dass der Mangel an Nervenende ist nicht nur darauf zurückzuführen sein poor Antikörper Penetration in dem Bereich des Muskel). </li><li> Identifizierung jedes NMJ wie mehrfachinnerviert, wenn es mehr als eine präterminale Axon innervating eine individuelle NMJ (dies zeigt, dass es an dieser Verbindung war ein gewisses Maß an Denervierung und wahrscheinlich Versuche reinnervation). </li><li> Kennzeichnen Sie jeden NMJ so dünn innerviert, wenn die NMJ hat die komplette Überdeckung zwischen Nervenendigung und die zugrunde liegenden AChRs aber hat eine dünne präterminale Axon (auch dies ist ein Hinweis auf ein gewisses Maß an Denervierung und Reinnervation Versuche). </li><li> Analyse durchzuführen für jede der identifizierten Regionen 3 für alle der oben genannten Kategorien NMJ für jedes Tier. Der Mittelwert der Daten von jedem Tier mit den Ergebnissen aus anderen Tieren aus demselben Versuchsgruppe. Etwa 200-300 Gänge in Ratten Hemidiaphragma Muskel und 150-200 in Maus Hemidiaphragma sollte mindestens 3 (vorzugsweise 5-6 oder mehr) Tiere pro Versuchsgruppe quantifiziert werden. </li><li> Erhalten Sie hochauflösende konfokale Bilder, Verwendungd für die Veröffentlichung, mit einem konfokalen Mikroskop. </li><li> Erhalten Sie Z-Stapel bei 0,3 &amp; mgr; m Schrittweite für 20-40 &amp; mgr; m Tiefe, und sammeln Sie zusätzliche optische Abschnitte oberhalb und unterhalb jeder Verbindung, um sicherzustellen, dass die gesamte synaptischen Profil ist inbegriffen. </li><li> Verwenden Erfassungssoftware zur z-Serie Bilder in maximaler Intensität Projektionen zu rekonstruieren. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Wir haben nichts zu offenbaren.

Als Atemfunktion wird sowohl traumatischen SCI und ALS beeinträchtigt, die Entwicklung von Therapien, die Atmung und speziell Membran Innervation Ziel sind klinisch relevante 5,6. Um die Atemfunktion umfassend zu studieren, sollte ein kombinierter Ansatz Methode verwendet werden. CMAPs messen den Grad der funktionellen Innervation des Zwerchfells durch externe Zwerchfellnervenstimulation, aber nicht endogenen bulbospinal Atemantrieb 8. Hinzu kommt, dass diese Aufnahmen nicht zur Untersuchung von mo...

Amyotrophe Lateralsklerose (ALS) ist eine schwächende Erkrankung der Motoneuronen mit dem Verlust der beiden oberen und unteren motorischen Neuronen und damit Muskellähmung. Nach der Diagnose, ist das Überleben des Patienten auf nur 2-5 Jahren durchschnittlich 1. Zwerchfell Motor Neuron (PhMN) Verlust ist ein wichtiger Bestandteil der Pathogenese der ALS. Patienten sterben schließlich durch den Verlust von PhMN Innervation der Membran, dem primären Muskelinspirations 2,3. Traumatische Rückenmarksverletzungen (SCI) ist auch ein ernstes Problem im Zusammenhang mit Atembeschwerden. Etwa 12.000 neue Fälle von SCI treten jedes Jahr 4 aufgrund traumatischer Schädigung des Rückenmarks. Trotz Krankheit Heterogenität in Bezug auf Standort, Art und Schwere, die Mehrheit der SCI Fälle betreffen Trauma des zervikalen Rückenmarks, die oft zu einer schwächenden und anhaltenden Atem Kompromiss. Neben der ALS und SCI, anderen zentralen Nervensystems (ZNS) Erkrankungen können w zugeordnet werdenith Zwerchfellatemstörungen 5,6. Die Zwerchfellnerv ist ein efferenten motorischen Nerven, die die ipsilateral Hemi-Diaphragma innerviert und stammt aus PhMN Zellkörper in den C3-C5 Ebenen des ipsilateralen Halsmark entfernt. PhMN Ausgang durch absteigend bulbospinal Eingang aus dem Hirnstamm in einem Gebiet wie dem rostralen ventralen respiratorischen Gruppe (rVRG) 7 bekannt gesteuert. Die rVRG-PhMN Membran Schaltung ist zentral für die Steuerung der inspiratorischen Atmung, sowie andere nicht-Ventilationsmembran Verhaltensweisen. Verschiedene traumatischen Verletzungen und neurodegenerativen Erkrankungen, die diese Schaltungen beeinflussen können, um eine tiefgreifende Rückgang der Lungenfunktion und Lebensqualität der Patienten führen. Nder Eingabe in PhMNs vom rVRG, PhMN Überleben, Phrenicus Integrität und korrekte Innervation am Diaphragma neuromuskulären Synapse (NMJ) sind alle für den normalen Membran-Funktion notwendig. Es ist daher wichtig, Techniken zu verwenden, dassquantitativ zu bewerten diese Schaltung in vivo in Tiermodellen von ALS, SCI und anderen ZNS-Erkrankungen. Mit diesem Protokoll ist das Ziel, experimentelle Instrumente zur Bewertung PhMN Innervation des Zwerchfells sowohl auf der elektrophysiologischen und morphologischen Ebenen zu beschreiben. Verbindung Muskelaktionspotentiale (CMAPs) werden durch die Stimulierung alle efferenten motorischen Neurons Axone eines bestimmten motorischen Nerven und dann die Analyse der hervorgerufenen Depolarisation Reaktion der Ziel Muskelfasern aufgezeichnet. Dieses Verfahren kann in vivo bei anästhesierten Ratten und Mäuse verwendet werden, um funktionelle Innervation des Hemidiaphragma durch PhMNs 8 quantifizieren. Aufgrund der Tatsache, dass CMAPs repräsentieren gleichzeitige Aufnahme aller (oder zumindest viele / die meisten) der Muskelfasern der gesamte Hemi-Membran ist es sinnvoll, auch die Phänotypen der einzelnen Motor Axonen und Muskelfasern an der Membran NMJ untersuchen, um Krankheit zu verfolgen - und therapierelevanten morphologischen Veränderungen, wie beispielsweise Teil und complete Denervierung, regenerative Sprießen und Reinnervation. Dies kann über ganze-mount Immunhistochemie (IHC) der Membran erreicht werden, gefolgt von detaillierten morphologischen Bewertung der einzelnen NMJs ganzen Muskel 9. Die Kombination CMAPs und NMJ Analyse bietet eine leistungsstarke Ansatz zur quantitativen Studium Zwerchfell Innervation in Nagetiermodellen von ZNS und PNS Krankheit.

<table><tbody><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Fisher</td><td>T353-500</td><td>10%ige Lösung zuerst in entionisiertem destilliertem Wasser herstellen; 4% mit 1x PBS herstellen, pH-Wert auf 7,4 einstellen</td></tr><tr><td>1x Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4</td><td>Invitrogen</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>2% Rinderserumalbumin (2% BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059-100g</td><td>2 g BSA in 100 ml 1x PBS</td></tr><tr><td>0,2% Triton X100 in 2% BSA/PBS auflösen (Blockierungspuffer)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-100 ml</td><td>Lösen 0,2 ml/100 ml, 2 % BSA/PBS</td></tr><tr><td>0,1 M Glycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-7126</td><td>0,185 g bis 25 ml 2 % BSA/PBS</td></tr><tr><td>&alpha;-Bungarotoxin</td><td>Invitrogen</td><td>T1175</td><td>Konzentration 1:400</td></tr><tr><td>SMI-312</td><td>Sternberger Monoklonale</td><td>SMI312</td><td>Konzentration 1:1.000</td></tr><tr><td>SV2</td><td>Entwicklungsstudien Hybridom Bank</td><td>SV2-Überstand</td><td>Konzentration 1:10</td></tr><tr><td>FITC Ziege Anti-Maus IgG1</td><td>Roche</td><td>3117731001</td><td>Konzentration 1:100</td></tr><tr><td>Silikonkautschuk</td><td>Sylgard, Dow Corning</td><td>Teil # 184</td><td>Befolgen Sie die Anweisungen, die mit dem Kit geliefert werden: kann je nach Bedarf eine Kulturschale in mehreren Größen (30 mm, 60 mm, 100 mm) verwenden</td></tr><tr><td>Vectashield fluoreszierendes Eindeckmedium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td>Dies ist kein fest festgelegtes Medium. Sie müssen das Deckglas mit klarem Nagellack sichern.</td></tr><tr><td>Kleine Federschere</td><td>Fine Science Tools</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>Präparierzange</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Software für CMAP-Aufnahmen</td><td>Scope 3.5.6; ADI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disk-Oberflächenelektroden</td><td>Natus Neurologie</td><td>019-409000</td><td></td></tr><tr><td>Subdermale Nadelelektroden</td><td>Natus Neurologie</td><td>019-453100</td><td></td></tr><tr><td>Leitfähiges Gel</td><td>Aquasonic</td><td>122-73720</td><td></td></tr><tr><td>Stimulator/Aufnahmesystem für CMAP-Aufnahmen</td><td>ADI Powerlab 8SP Stimulator</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Verstärker für CMAP-Aufnahmen</td><td>BioAMP</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

funktionellen und morphologischen bewertung der membran innervation durch phrenicus motoneuronen

Functional and Morphological Assessment of Diaphragm Innervation by Phrenic Motor Neurons

Dieses Protokoll konzentriert sich speziell auf Werkzeuge zur Beurteilung der Innervation des Zwerchfells des phrenischen Motoneurons (PhMN) sowohl auf elektrophysiologischer als auch auf morphologischer Ebene. Die CMAP-Aufzeichnung (Compound Muscle Action Potential) nach Stimulation des Nervus phrenicus kann verwendet werden, um die funktionelle Zwerchfellinnervation durch PhMNs des zervikalen Rückenmarks in vivo bei anästhesierten Ratten und Mäusen quantitativ zu beurteilen. Da es sich bei CMAPs um die gleichzeitige Erfassung aller Myofasern des gesamten Hemi-Zwerchfells handelt, ist es sinnvoll, auch die Phänotypen einzelner motorischer Axone und Myofasern am Zwerchfell-NMJ zu untersuchen, um krankheits- und therapierelevante morphologische Veränderungen wie partielle und vollständige Denervierung, regenerative Keimung und Reinnervation zu verfolgen. Dies kann durch eine ganzheitliche Immunhistochemie (IHC) des Zwerchfells erreicht werden, gefolgt von einer detaillierten morphologischen Beurteilung einzelner NMJs im gesamten Muskel. Die Kombination von CMAP- und NMJ-Analysen bietet einen leistungsstarken Ansatz für die quantitative Untersuchung der Zwerchfellinnervation in Nagetiermodellen für ZNS- und PNS-Erkrankungen.

Erwachsene Sprague-Dawley Ratten erhielten entweder nur Laminektomie (unverletzt Kontrolle) oder einseitige Hemi-Prellung SCI an der C4 Rückenmarksebene 10-12. 5 Wochen nach der Operation, Spitzen CMAP Amplitude von aufgezeichneten die Hemi-Membran ipsilateral zur Laminektomie / Verletzungsstelle war maßgeblich an SCI-Ratten (2C) reduziert im Vergleich zu nur Laminektomie-Kontrolle (2B). Alle NMJs in der Hemi-Membran waren in Kontrolle nicht erkrankten Wildtyp-Ratten ...

Die Aufzeichnung des zusammengesetzten Muskelaktionspotentials bewertet quantitativ die funktionelle Zwerchfellinnervation durch phrenische Motoneuronen. Die Immunhistochemie der Ganzragenmembran beurteilt die morphologische Innervation an einzelnen neuromuskulären Verbindungen. Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie diese beiden leistungsstarken Methoden in verschiedenen Nagetiermodellen für Rückenmarkserkrankungen eingesetzt werden können.

Funktionellen und morphologischen Bewertung der Membran Innervation durch phrenicus Motoneuronen

This protocol specifically focuses on tools for assessing phrenic motor neuron (PhMN) innervation of the diaphragm at both the electrophysiological and ...

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, sowohl die funktionelle als auch die morphologische Innervation des Zwerchfells durch phrenikale Motoneurone des zervikalen Rückenmarks quantitativ zu bewerten. Dies wird erreicht, indem man die Ableitung des komplexen Muskelaktionspotentials vom halben Zwerchfell bei anästhesierten Tieren nach supramaximaler Stimulation des ipsilateralen phrenikalen Nervs durchführt. Der nächste Schritt besteht darin, eine Ganzpräparat-Immunhistochemie des Zwerchfells durchzuführen, um die morphologische Innervation einzelner neuromuskulärer Endplatten zu beurteilen.Letztlich bietet die Kombination von Analysen der zusammengesetzten Muskelaktionspotentiale und der neuromuskulären Junction eine leistungsstarke Methode, um die Innervation des Zwerchfells bei Nagetiermodellen von Erkrankungen des zentralen und peripheren Nervensystems quantitativ zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Rückenmarkverletzung zu beantworten, beispielsweise, ob therapeutische Maßnahmen erfolgreich zur Wiederherstellung der Zwerchfellfunktion eingesetzt werden können. Die Bedeutung dieser Technik erstreckt sich auf die Therapie von Erkrankungen wie traumatischen Rückenmarkverletzungen und ILS, da die respiratorische Funktion des Zwerchfells bei beiden schwerwiegenden Erkrankungen eine Schlüsselrolle für den Patientenverlauf spielt. Den Versuchsaufbau werden Dr. Kali, eine Postdoktorandin in meinem Labor, Melanie Martin, eine Studentin in Ausbildung im Labor von Dr. Wright, sowie Tamara Holla, eine wissenschaftliche Technikerin in meinem Labor, demonstrieren.Nach der Anästhesie des Tieres legen Sie es mit der Bauchseite nach unten auf das Operationsbrett und befestigen die Vordergliedmaßen am Brett. Rasieren Sie dann die ventrale Fläche von der Schädelbasis bis zum Abdomen beidseits der Mittellinie. Sobald die Haut gereinigt ist, positionieren Sie die Elektroden, befestigen Sie die Erdung am Schwanz und platzieren Sie die Referenzelektrode subkutan im kontralateralen unteren Abdomen.Die Ableitelektrode sollte mit leitfähigem Gel auf dem selbstklebenden Teil vorbereitet und dann entlang des einseitigen Rippenbogens angebracht werden. Platzieren Sie nun die stimulierenden Elektroden transkutan einen halben Zentimeter voneinander entfernt seitlich der Luftröhre und oberhalb der Schlüsselbeine. Sie sollten senkrecht zur Haut eingebracht und etwa einen Zentimeter tief platziert werden.Diese Elektroden müssen gut befestigt werden, am besten von Hand. Befestigen Sie alle Elektroden an den entsprechenden Stimulatoren und Verstärkern. Die gesammelten Daten müssen auf einem Computer aufgezeichnet werden.Stellen Sie für die Analyse die Reizparameter der Einzelpolstimulation auf 0,5 Millisekunden und supramaximale Pulse von einem Hertz ein. Die Amplitude kann zwischen sechs und acht Volt liegen. Legen Sie die Reizdauer auf 30 Sekunden fest und mitteln Sie die Antwort aus 10 aufeinanderfolgenden Stimulationen, wobei die Aufzeichnung von der Basis bis zur Spitzenamplitude verwendet wird; dies kann bei Bedarf einmal pro Woche pro Tier erfolgen.Die Tierversuche werden im Textprotokoll ausführlich beschrieben. Führen Sie nach der Tötung eines Tieres durch eine Überdosis injizierbarer Anästhetika eine Laparotomie mit Skalpell oder Schere durch. Setzen Sie einen Schnitt vom Processus xiphoideus ausgehend vorsichtig entlang der Mittellinie an.Verwenden Sie dann ein Skalpell und eine Pinzette, um die Haut und das Bindegewebe vorsichtig von der Muskulatur zu trennen. Entfernen Sie das Zwerchfell, indem Sie den Xiphoidfortsatz anheben und das Zwerchfell aus dem umgebenden Knochen herausschneiden. Achten Sie darauf, die Zwerchfellmuskulatur nicht zu beschädigen.Überführen Sie das Zwerchfell mit der oberen Seite nach oben in eine Silikonbeschichtungsschale, die mit 4 % Paraformaldehyd in PBS unter einem Stereomikroskop gefüllt ist. Befestigen Sie das umliegende Gewebe des Zwerchfells, wodurch das Zwerchfell straff gezogen wird. Entfernen Sie anschließend das Bindegewebe von der oberen Oberfläche mithilfe von Pinzette und Schere.Lassen Sie das Fixierungsmittel 20 Minuten lang wirken und entfernen Sie es anschließend durch drei Waschungen mit jeweils 10 Minuten in PBS. Anschließend wenden Sie 0,1 molare Glycinlösung mit 2 % BSA in PBS 30 Minuten lang an. Danach inkubieren Sie das Zwerchfell 15 Minuten lang in einer mit Rod-Domine konjugierten Alpha-Bungalow-Toin-Lösung.Spülen Sie das Bungalow-Toxin wie beim Fixansatz mit PBS ab. Danach wechseln Sie das Bad in kaltes Methanol und kühlen das Gewebe fünf Minuten bei minus 20 Grad Celsius. Entfernen Sie nach fünf Minuten umgehend das Methanol und waschen Sie das Gewebe erneut wie zuvor mit PBS. Tragen Sie nun mithilfe einer 0,2 %igen TBP-Lösung einen Block für eine Stunde auf. Wechseln Sie die Lösung zum Primärantikörper in 0,2 %iger TBP und lassen Sie das Gewebe über Nacht bei vier Grad Celsius unter sanfter Agitation inkubieren. Am nächsten Tag verwenden Sie drei 10-minütige Waschschritte in 0,2 %iger TBP, um den Primärantikörper zu entfernen, und inkubieren das Gewebe anschließend eine Stunde lang in der Sekundärantikörper-Lösung mit Schütteln und im Dunkeln. Danach verwenden Sie drei Waschschritte in PBS, um den Sekundärantikörper zu entfernen, und bewahren Sie das Gewebe im Dunkeln auf.Danach unter einem Stereomikroskop weiteres Bindegewebe von der Oberfläche des Muskels entfernen. Nach der Reinigung das Gewebe montieren und unter einem aufrechten Epi-Fluoreszenzmikroskop abbilden, um die Morphologie des gefärbten halben Zwerchfells quantitativ zu analysieren. Dabei die 20- und 40-fache Vergrößerung verwenden, da das Zwerchfell als Ganzpräparat analysiert wird.Der größte Teil der fluoreszierenden Färbung ist unscharf. Bei Verwendung eines Standardmikroskops ist es am besten, die Analyse in Echtzeit durchzuführen. Um die Morphologie der einzelnen NMjs korrekt zu bewerten, teilen Sie den Muskel in drei Abschnitte für die Analyse basierend auf den topographischen Innervationsmustern des Rückenmarks auf.Beginnend im ventralsten Bereich analysieren Sie alle sichtbaren NMJs entlang der Muskelfasern; analysieren Sie nicht tiefer als die ersten drei bis vier Fasern unterhalb der Oberfläche, da die Penetration der Antikörper niemals vollständig ist. Ein intaktes NMJ weist ein präterminales Axon auf, das dick ist, und alle Bereiche des Nervenendes überlappen vollständig mit den darunterliegenden muskulären Acetylcholinrezeptoren. Ein teilweise denerviertes NMJ weist einige Bereiche der darunterliegenden Acetylcholinrezeptoren auf, die nicht besetzt sind.Eine vollständig denervierte NMJ zeigt keine Übereinstimmung mit den Acetylcholinrezeptoren an der Nervenendigung. Andere NMJs im Bereich sollten eine andere Morphologie aufweisen, oder der Erfolg der Antikörperpenetration wäre fraglich, wenn mehr als ein präterminales Axon eine NMJ innerviert. Die NMJ ist multipliziert.Eine innervierte Denervierung könnte in diesem Fall aufgetreten sein, gefolgt von einer Reinnervierung. Wenn eine Überlappung am Nervenendig mit den darunterliegenden Acetylcholinrezeptoren besteht und das präterminale Axon sehr dünn ist, dann ist die neuromuskuläre Verbindung schwach innerviert. Dies ist ebenfalls ein Hinweis auf Reinnervation.In einem Experiment an erwachsenen Spra-Dolly-Ratten erhielten die Kontrolltiere eine Laminektomie, während andere eine einseitige halbseitige Kontusions-Verletzung der Rückenmarkverletzung (SCI) erhielten. C vier. Fünf Wochen später wurde die maximale CMAP-Amplitude vom zum Laminektomie- oder Verletzungsort kontralateralen Zwerchfell aufgezeichnet.Es war bei den SCI-Ratten im Vergleich zu den Kontrollratten mit alleiniger Laminektomie in einem anderen Experiment mit Ratten, die mutiertes menschliches SOD1-Protein exprimierten, um als Modell für ALS zu dienen, signifikant vermindert. Die NMJ-Morphologie im halben Zwerchfell war bei Wildtyp-Kontrolltieren vollständig intakt. Bei den transgenen Ratten hingegen wiesen die NMJs eine signifikante Pathologie auf. Einige zeigten eine vollständige Denervierung, gekennzeichnet durch den Pfeil.Andere NMJs waren teilweise denerviert, wie durch den Pfeilspitzen markiert, und wie beim NMJ rechts zu sehen ist, waren andere NMJs mehrfach innerviert, während wieder andere dünne präterminale Axone aufwiesen, die hier mit einer Pfeilspitze markiert sind. Nach dem Anschauen dieses Videos sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man die funktionelle und morphologische Innervation des Zwerchfells durch phrenische Motoneuronen quantitativ beurteilen kann. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei all Ihren Experimenten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

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