Funktionellen und morphologischen Bewertung der Membran Innervation durch phrenicus Motoneuronen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, sowohl die funktionelle als auch die morphologische Innervation des Zwerchfells durch phrenische Motoneuronen des zervikalen Rückenmarks quantitativ zu beurteilen. Dies wird durch die Aufzeichnung des zusammengesetzten Muskelaktionspotentials aus dem Hemimembran bei anästhesierten Tieren nach supramaximaler Stimulation des ipsilateralen Nervus phrenicus erreicht. Der nächste Schritt besteht darin, eine Immunhistochemie des gesamten Zwerchfells durchzuführen, um die Innervation einzelner neuromuskulärer Verbindungen morphologisch zu beurteilen.

Letztendlich bietet die Kombination von Analysen des zusammengesetzten Muskelaktionspotenzials und der neuromuskulären Verbindung einen leistungsfähigen Ansatz für die quantitative Untersuchung der Zwerchfellinnervation in Nagetiermodellen für ZNS- und PNS-Erkrankungen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Querschnittlähmung zu beantworten, wie z.B. kann die Zwerchfellfunktion mit therapeutischen Eingriffen erfolgreich wiederhergestellt werden? Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Krankheiten wie traumatischen Rückenmarksverletzungen und ILS, da die Zwerchfellatmungsfunktion eine Schlüsselrolle für das Patientenergebnis bei diesen beiden schwächenden Zuständen spielt. Das Verfahren wird von Dr. Kali, einer Postdoktorandin in meinem Labor, Melanie Martin, einer Studentin im Labor von Dr. Wright, demonstriert. und Tamara Holla, eine Forschungstechnikerin in meinem Labor.

Nachdem Sie das Tier betäubt haben, legen Sie es mit der Rückenseite nach unten auf das Operationsbrett und befestigen Sie die Vordergliedmaßen am Brett. Rasieren Sie dann die Bauchfläche von der Schädelbasis in Richtung Bauch auf beiden Seiten der Mittellinie. Sobald die Haut gereinigt wurde, positionieren Sie die Elektroden, befestigen Sie den Boden am Schwanz und platzieren Sie die Referenzelektrode subkutan in den kontralateralen Unterbauch.

Die Aufzeichnungselektrode sollte mit leitfähigem Gel auf dem selbstklebenden Teil vorbereitet und dann entlang des einseitigen Rippenrandes befestigt werden. Platzieren Sie nun die Stimulationselektroden transkutan im Abstand von einem halben Zentimeter seitlich der Luftröhre und oberhalb des Schlüsselbeins. Sie sollten senkrecht zur Haut eindringen und etwa einen Zentimeter tief gehen.

Diese Elektroden müssen gut gesichert sein, am besten von Hand. Befestigen Sie alle Elektroden an den entsprechenden Stimulatoren und Verstärkern. Die erhobenen Daten müssen auf einem Computer aufgezeichnet werden.

Stellen Sie zur Analyse die Stimulusparameter der einpoligen Stimulation auf 0,5 Millisekunden ein, ein Hertz Supermaximalpulse. Die Amplitude kann zwischen sechs und acht Volt liegen. Stellen Sie die Stimulationszeit auf 30 Sekunden ein und mitteln Sie die Reaktion von 10 aufeinanderfolgenden Stimulationen unter Verwendung der Aufzeichnung der Ausgangs- bis Spitzenamplitude von jedem Tier etwa einmal pro Woche, falls gewünscht.

Der Umgang mit den Tieren ist im Textprotokoll detailliert beschrieben. Nachdem Sie ein Tier mit einer Überdosis injizierbarer Anästhesie eingeschläfert haben, führen Sie eine Laparotomie mit einem Skalpell oder einer Schere durch. Machen Sie einen Schnitt aus dem Xiphoid-Prozess hätscheln entlang der Mittellinie.

Trennen Sie dann mit Skalpell und Pinzette vorsichtig Haut und Bindegewebe von der Muskulatur. Entferne das Zwerchfell, indem du den Xiphoid-Prozess hochziehst und das Zwerchfell aus dem umgebenden Knochen herausschneidest. Achte darauf, den Zwerchfellmuskel nicht zu beschädigen.

Übertragen Sie die obere Seite der Membran nach oben in eine Silikon-Leitungsschale, die mit 4 % Paraformaldehyd in PBS unter einem Stereoskop gefüllt ist. Fixieren Sie das Gewebe, das das Zwerchfell umgibt, und dehnen Sie das Zwerchfell straff. Anschließend wird das Bindegewebe mit Pinzette und Schere von der oberen Oberfläche entfernt.

Lassen Sie das Fixiermittel 20 Minuten einwirken und entfernen Sie es dann mit drei 10-minütigen Wäschen in PBS. Tragen Sie anschließend 0,1 molares Glycin mit 2% BSA in PBS für 30 Minuten auf. Dann inkubieren Sie das Diaphragma 15 Minuten lang in konjugierter Alpha-Bungalow-Toin-Lösung von Rod Domine.

Waschen Sie das Bungalow-Gift mit PBS ab, wie es für das Fixiermittel verwendet wird. Wechseln Sie dann das Bad auf kaltes Methanol und kühlen Sie das Tuch fünf Minuten lang bei minus 20 Grad Celsius. Entfernen Sie nach fünf Minuten umgehend das Methanol und waschen Sie das Tuch wie zuvor mit PBS.

Wenden Sie nun eine Stunde lang einen Block mit einer Lösung von 0,2 % TBP an. Wechseln Sie die Lösung zum Primärantikörper in 0,2 %TBP und lassen Sie das Gewebe über Nacht bei vier Grad Celsius unter leichtem Rühren inkubieren. Am nächsten Tag verwenden Sie drei 10-minütige Waschungen in 0,2 % TBP, um den primären Antikörper zu entfernen, und inkubieren Sie dann das Gewebe eine Stunde lang in der sekundären Antikörperlösung unter Schaukeln und später im Dunkeln verwenden Sie drei Waschgänge in PBS, um den sekundären Antikörper zu entfernen, und halten Sie das Gewebe im Dunkeln.

Entfernen Sie dann unter einem Stereoskop mehr Bindegewebe auf der oberen Oberfläche des Muskels. Nach der Reinigung wird das Gewebe unter einem aufrechten Epi-Fluoreszenzmikroskop unter einem aufrechten Epi-Fluoreszenzmikroskop quantitativ analysiert, um die Morphologie des gefärbten Hemi-Diaphragmas zu analysieren. Verwenden Sie eine 20- und 40-fache Vergrößerung, da die Blende als ganzes Montierung analysiert wird.

Der größte Teil der Fluoreszenzfärbung ist unscharf. Mit einem Standardmikroskop ist es am besten, die Analyse in Echtzeit durchzuführen. Um die Morphologie der einzelnen NM js richtig zu bewerten, unterteilen Sie den Muskel in drei Abschnitte für die Analyse basierend auf den topographischen Innervationsmustern des Rückenmarks.

Beginnend in der ventralen Mosts-Region, analysieren Sie alle sichtbaren njs entlang der Muskelfasern, analysieren Sie nicht tiefer als die ersten drei bis vier Fasern von der Oberfläche, da die Penetration der Antikörper nie vollständig ist. Ein intaktes NMJ hat ein präterminales Axon, das dick ist, und alle Regionen der Nervenendigung überlappen sich vollständig mit den darunter liegenden Acetylcholinrezeptoren des Muskels. Bei einem teilweise entnervten NMJ sind einige Regionen der zugrundeliegenden Acetylcholinrezeptoren unbesetzt.

Ein vollständig denerviertes NMJ zeigt keine Korrespondenz mit den Acetylcholinrezeptoren an der Nervenendigung. Andere NJs in der Region müssten eine andere Morphologie aufweisen, sonst wäre der Erfolg der Antikörperpenetration fraglich, wenn mehr als ein präterminales Axon ein NMJ innerviert. Der NMJ ist multipliziert.

In diesem Fall kann eine innervierte Denervation aufgetreten sein, gefolgt von einer Reinnervation. Wenn es an der Nervenendigung eine Überlappung mit den darunter liegenden Acetylcholinrezeptoren gibt und das präterminale Axon sehr dünn ist, dann ist das NMJ dünn innerviert. Auch das ist ein Indiz für eine Erholung.

In einem Experiment mit adulter Spra erhielten Dolly-Rattenkontrollen eine Laminektomie, während andere eine einseitige Hemi-Contusion erhielten. Bei C vier. Fünf Wochen später wurde die maximale Cmap-Amplitude vom Hemi-Zwerchfell ipsilateral bis zur Laminektomie oder Verletzungsstelle aufgezeichnet.

Es war bei den SCI-Ratten im Vergleich zu den nur laminektomierten Kontrollratten in einem anderen Experiment signifikant reduziert, an dem Ratten beteiligt waren, die mutiertes menschliches, also D-ein-Protein, exprimierten, um als Modell für ein LS zu dienen. Die NMJ-Morphologie im Hemi-Zwerchfell war bei Wildtyp-Kontrolltieren vollständig intakt. Bei den transgenen Ratten zeigten die njs jedoch eine signifikante Pathologie. Einige zeigten eine vollständige Denervierung, die durch die Pfeilspitze gekennzeichnet war.

Andere njs waren teilweise denerviert, wie durch die Pfeilspitze markiert, und wie im NMJ rechts zu sehen, waren andere njs mehrfach innerviert, und andere hatten dünne präterminale Axone, die hier mit einer Pfeilspitze markiert waren. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie sowohl die funktionelle als auch die morphologische Innervation des Zwerchfells durch phrenische Motoneuronen quantitativ beurteilt werden kann. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Erfolg bei all Ihren Experimenten.